La présente invention concerne le domaine de la radiothérapie. Elle a notamment pour objet l'utilisation de nanoparticules de diamant particulières (ou nanodiamants), pour générer localement des radicaux libres.

La radiothérapie est une technique courante pour traiter des tumeurs cancéreuses, utilisée clans environ 50% des cas, Elle consiste à créer des radicaux libres dans les cellules par irradiation localisée ; ces radicaux libres provoquent, des ruptures de S'ADN des cellules irradiées, conduisant à leur mort. L'efficacité des traitements par radiothérapie est actuellement limitée par la résistance de certaines tumeurs aux rayonnements ionisants, par rapport aux cellules saines. Une radiosensibilisation sélective et efficace des cellules tumorales permettrait d'améliorer sigmficativement l'efficacité de ces traitements et de réduire les effets secondaires sur les tissus sains.

Dans ce but, différentes approches ont été décrites, telles que l'utilisation de nanoparticules capables de générer localement des radicaux libres, ou l'utilisation de radiosensibilisants.

La première approche consiste à générer localement, au sein de la tumeur, des radicaux libres en utilisant des nanoparticules. Les méthodes de ce type décrites à ce jour sont basées sur des propriétés physiques., liées aux nanoparticules, permettant de générer efficacement des espèces radiealaires à leur surface sous irradiation. Les nanoparticules utilisées sont généralement constituées d'atomes ayant un numéro atomique (Z) élevé, afin d'absorber plus efficacement les rayons X, mais qui sont généralement des matériaux coûteux (or, platine, terres rares), et/ou pouvant induire une toxicité, et/ou peu stables dans un milieu biologique. A titre d'exemple, on peut citer la demande de brevet IJS2008/0003183 (Ting Guo), qui propose d'utiliser des nanoparticules constituées d'éléments lourds comme l'or, capables d'émettre des électrons Auger localement sous irradiation. Cette génération d'électrons peut être induite en utilisant des rayons X ayant une énergie que les molécules d'eau n'absorbent que faiblement, afin de générer les radicau libres essentiellement à proximité des nanoparticules. Cependant, pour améliorer la stabilité colloïdale et la biocompatibilité de ces nanoparticules, le greffage de molécules est souvent nécessaire, ce qui peut atténuer la dose d'électrons secondaires ou Auger transmis à l'environnement de la nanopartieule, et réduit donc la dose de radicaux libres générés.

Selon la deuxième approche citée plus haut, de nouvelles molécules radiosensibilisantes sont actuellement en cours d'étude, dont le but est de cibler les défenses biologiques propres aux cellules tumorales (C. Begg et al, 20.1 .1 ). Malheureusement, ces molécules ne peuvent, pas toujours être délivrées dans les cellules tumorales in vivo, ce qui limite leur utilisation thérapeutique. C'est notamment le cas des A Ns interférants de POLQ, qui ont montré récemment une grande sélectivité dans la radiosensibilisation de cellules tumorales in vitro (Higgins et al, 2010). Ces ARNs interférents pourront difficilement être utilisés in vivo sans moyen de vectorisation, car leur biodisponibilité est limitée.

Différentes applications biotechnologiques sont actuellement connues pour les nanodiamants., telles que la vectorisation et la délivrance de médicaments et d'ARN interférents dans les cellules tumorales. Dans ces applications, les nanodiamants sont utilisés uniquement comme vecteurs passifs. A titre d'exemple, on peut citer la demande de brevet US 2010/0305309 (Ho et al), portant sur différents procédés pour délivrer des médicaments avec des nanodiamants. Dans ce cas particulier, les nanodiamants utilisés comme vecteurs sont oxydés en surface, ce qui leur donne une charge de surface négative et rend nécessaire l'ajout de polymères pour permettre de vectoriser des brins d'AD ou d'ARN ayant aussi une charge négative. Ces polymères peuvent induire une toxicité supplémentaire et augmentent sigmficativement la taille des nanodiamants, ce qui peut induire une plus grande rétention dans les organes comme le foie ou les reins pour des applications in vivo,

La présente invention repose sur la mise en évidence, par les inventeurs, d'une propriété jusqu'ici ignorée des nanodiamants. Le terme "nanodiamant" désigne ici toute nanoparticule principalement constituée d'atomes de carbone hybridé sp ^J , ayant une taille inférieure à 250 nm. Ces nanopartieuies peuvent être, entre autres, synthétisées par broyage de diamant de synthèse ou par détonation. Dans ce dernier cas, les nanodiamants ont généralement une taille Inférieure à 10 nm. Le terme "nanodiamant" désigne également des agrégats de taille nanoparticulaire constitués de nanopartieuies de diamant primaires. Les inventeurs ont observé que les nanodiamants ont des propriété physiques particulières qui leur permettent de générer efficacement des radicaux libres sous rayonnement, notamment sous rayonnement ionisant. Les nanodiamants sont en effet constitués d'une très grande concentration d'atomes de carbone (1.8 x 10 ^2j atomes/cm ³ ), ce qui permet d'absorber plus efficacement les rayonnements que les tissus biologiques environnants, malgré un numéro atomique équivalent. De plus, les nanodiamants ont une très bonne stabilité colloïdale, même sans fonctionnalisation qui atténuerait le transfert des électrons générés à leur environnement. Enfin, l'excellente conductivité thermique du diamant assure une libération très efficace de la chaleur résultant de l'irradiation (par exemple par un rayonnement ionisant) à la surface des nanodiamants. Les nanodiamants permettent donc de générer efficacement des radicaux libres dans les cellules tumorales, et/ou de la chaleur, tout en utilisant un matériau à base de carbone peu coûteux, biocompatible et stable en milieu biologique sans fonctionnalisation nécessaire,

La présente invention porte donc, en premier lieu, sur l'utilisation d'un nanodiamant pour générer des radicaux libres à visée thérapeutique et/ou diagnostique. Selon, une mise en œuvre particulière de l'invention, une production de chaleur est couplée à la production de radicaux libres. L'utilisation de nanodiamant comme médicament et/ou comme outil de diagnostic générant des radicaux libres découle des propriétés mises en évidence par Dans le cadre de la présente invention, i 'action thérapeutique des nanodiamants est le fait des dommages causés, directement ou indirectement, par les radicaux libres généré à [a surface des. nanodiamants, aux molécules situées aux alentours immédiats des nanopartieules, et en particulier à moins de 10 nm de la surface des nanopartieules. Dans les applications visant la destruction de cellules, il est donc préférable que les nanopartieules pénètrent dans les cellules, pour que les radicaux libres causent des dommages aux acides nucléiques cellulaires (ADN et ARN nucléaires et/ou ARNs cytoplasmîque et/ou ADN mitochondrîal, etc.). Pour cela, des nanodiamants dont le diamètre moyen est inférieur à 100 nm, voire inférieur à 50 nm ou même inférieur à 10 nm.. sont préférés pour mettre en œuvre l'invention.

Les inventeurs ont observé que des nanodiamants ayant subi un traitement de surface particulier pour créer des fonctions CH _X (x = 1. 2 ou 3) et/ou du carbone sous forme graphitique en surface (par plasma hydrogène, recuits à haute température sous vide ou sous hydrogène par exemple) sont particulièrement efficaces. L'expression "nanodiamant graphitisé" désigne ici tout nanodiamant contenant, en surface, des atomes de carbone hybridé sp". Bien entendu, la présence d'atomes de carbone hybride sp en surface du nanodiamant n'exclut pas la présence d'autres groupements chimiques à la surfa.ee de ces nanodiamants. De même, l'expression "nanodiamant hydrogéné" désigne tout nanodiamant contenant des fonctions de type C-H,€¾ ou C% en surface. Les nanodiamants dont la surface a été {partiellement ou totalement) graphitisée et/ou hydrogénée, quand ils sont exposés â l'air ou dispersés en milieu aqueux, présentent des propriétés de conduction de surface qui leur donnent, une affinité électronique négative. En parallèle, leur surface devient favorable à radsorption préférentielle des molécules étant à l'origine des radicaux libres en milieu biologique {¾0, (¾ et NC principalement), permettant ainsi un transfert d'électrons du nanodiamant vers ces molécules, qui s'effectue spontanément. Sous rayonnement ionisant, ce transfert d'électrons est amplifié et crée des radicaux libres de manière particulièrement efficace. En. outre, l'adsorption préférentielle de molécules comme L¾0, <¼ et NO ₂ à la surface de ces nanodiamants modifiés permet, en apportant ces molécules dans les cellules, de surmonter une des causes principales de la radiorésistance des cellules tumorales, qui est le manque d'oxygène dans ces cellules (hypoxie), limitant la génération de radicaux libres oxygénés.

Les nanodiamant ayant des fonctions CHx et/ou du carbone sous forme graphitique en surface ont de plus une permittivité diélectrique très importante, qui permet de les utiliser comme source de chaleur sous un champ électromagnétique oscillant à des fréquences entre 100 et I Q ⁶ Hz (Batsanov et al., 2012). Ces nanodiamants possèdent aussi des propriétés d'absorption des rayonnements infrarouges, comme les autres nanomatériaux carbonés, induisant aussi une libération de chaleur (Yang et al, 2010). Pour obtenir une production de chaleur par les nanodiamants, des infrarouges de longueur d'onde comprise entre 600 et 1400 nm seront préférentiellement utilisés, cette gamme correspondant aux infrarouges absorbés par les tissus biologiques. Les propriétés de génération de radicaux libres peuvent alors être couplée à dé i'hyperthermie.

Selon une mise en œuvre préférée, la présente invention porte donc sur un nanodi amant dont la surface a été au moins partiellement graphitîsée et/ou hydrogénée, pour utilisation pour générer des radicaux libres à visée thérapeutique eî/ou diagnostique, éventuellement couplés à de la chaleur. En particulier, la présente invention porte sur un nanodiamant pour utilisation en combinaison avec un rayonnement, comme médicament et/ou comme outil de diagnostic générant des radicaux libres,

Parmi les rayonnements susceptibles de provoquer la génération de radicaux libres à la surface des particules de nanodiamant, on peut citer les rayonnements ionisants, parmi lesquels des ondes électromagnétiques telles que les rayons X, les rayons gamma et les ultra- iolets, ainsi que des rayonnements particulaires, notamment u rayonnement constitué de protons, de badrons ou de particules béta (β ⁺ ou β ^" ). Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention porte donc sur un nanodiamant tel que ceux décrits plus haut, pour utilisation en combinaison avec un rayonnement ionisant, comme médicament eî/ou comme outil de diagnostique.

L'homme du métier adaptera les paramètres du rayonnement utilisé (nature, énergie, puissance et durée d'irradiation) en fonction de la profondeur du tissu à atteindre et d'autres paramétres cliniques et techniques, A titre purement indicatif, certaines valeurs sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous.

Toutefois, d'autres rayonnements peuvent être utilisés, à la place ou en combinaison avec les rayonnements cités ci-dessus. Parmi ces rayonnements de natures diverses, on peut citer les rayonnements visible, infrarouge, micro-ondes, neutrons, notamment pour obtenir une production de chaleur. Les irradiations peuvent être multiples, tant par la nature des rayonnements utilisés que par l'application des rayonnements en plusieurs fois.

Tableau 1 Selon une mise en œuvre particulière de P invention, au moins une partie des radicaux libres générés sont des radicaux libres oxygénés. Les inventeurs ont également montré que azote pouvait s'adsorber à la surface des nanodianiants. Aussi, selon une mise en œuvre de l'invention, au moins une partie des radicaux libres générés sont des radicaux libres azotés.

Les radicau libres provoquant des ruptures de l'AD . les nanodiamanîs décrits plus haut trouvent une application avantageuse dans la destruction de cellules cibles telles que des cellules cancéreuses. Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne donc P utilisation d'un nanodiamant tel que décrit ci-dessus pour traiter une tumeur solide, ladite utilisation étant basée sur la propriété intrinsèque du nanodiamant de générer des radicaux libres sous irradiation.

Selon une mise en œuvre particulière de l'invention, les particules de nanodiamant sont fonctionnalisées. En particulier, un nanodiamant selon l'invention peut être lié à une molécule de ciblage, par liaison covalente ou non. Plusieurs techniques de greffage de molécules à la surface de nanodiamanîs ont été décrites dans Part antérieur, et P homme du métier est en mesure de choisir, en fonction notamment du type de molécule de ciblage, celle qui lui convient le mieux. A titre d'exemples non limitatifs de méthodes de greffage de molécules de ciblage à la surface de nanodianiants, on peut citer :

un couplage type peptidique via la formation d'une fonction amide ou ester entre le nanodiamant et la molécule de ciblage (Huang et Chang, 2004)

un couplage direct de la molécule de ciblage sur le nanodiamant par la création d'une liaison C-C entre les deux entités (Girard et ai., 201 1)

un couplage de type cycloaddition via la présence de carbones à l'état d ^' hybridation s ^* ou sp sur le nanodiamant et/ou sur la molécule de ciblage (Jarre et al., 2011)

un couplage de type silanisation via la présence de fonction silanes sur la surface du nanodiamant et/ou sur la molécule de ciblage ( ruger et ah, 2006)

un couplage non covalent, basé sur des interactions électrostatiques et/bu la formation de liaisons hydrogène entre le nanodiamant et la molécule cible (Chen et «/., 2010).

Ces couplages peuvent s'effectuer soit directement à la surface des nanodiamanîs, soit par l'intermédiaire de molécules préalablement greffées ou adsorbées à la surface des nanodiamanîs. Pour les nanodianiants hydrogénés, le couplage direc par la création d'une liaison C-C est le plus efficace. Pour les nanodiamanîs graphitisés, le couplage par cycloaddition est le plus approprié.

Selon un mode de réalisation préféré des nanodianiants ciblés selon l'invention, le ciblage est assuré par au moins un ligand biologique reconnu par un récepteur surexprimé à la surface de certaines celluies. Les ligands biologiques permettant cle cibler spécifiquement certaines cellules peuvent être :

des peptides, par exemple le peptide RGD, ou leurs dérivés ou leurs analogues (ex : le peptide octéotraie, analogue de la somatostatine, un analogue de la bombésine, de la neurotensine, l'EGF, le VIP...),

des protéines, des anticorps, ou leurs dérivés ou leurs analogues, des sucres, notamment des monosaccharides (ex : glucose, galactose _. , glucosamine ou gaîactosarnme), des oiigosaccharides, des polysaceharid.es. ou leurs dérivés ou leurs analogues,

des oligonucléotides, ADN, ARN. leurs dérivés ou leurs analogues, des molécules organiques (telles que le fol aie ou le pamidronate biphosphonaté).

des complexes organoniétailiques.

Leur activité de ciblage est due à la reconnaissance moléculaire de ces ligands par des récepteurs surexprimés à la surface des cellules de la zone d'intérêt.

Des ligands particulièrement préférés pour mettre en œuvre l'invention sont des ligands de molécules fréquemment surexprimées à la surface des cellules tumorales. Par exemple des peptides comportant le motif RGD. tels que le cyclo(RGDfK), le cyclo(RGDyK) ou le cyc!o(RGDfV), peuvent avantageusement être utilisées. Ces peptides reconnaissent l ^' intégrine α _ν β3, qui est surexprimée à la surface des cellules tumorales et des cellules endothéliales lors de la néoangiogénèse tumorale. L'utilisation de ces ligands dans les nanodiamants selon l'invention pennet donc de cibler les tumeurs et leur vascularisation, pour les détruire par la production de radicaux libres, éventuellement couplée à la production de chaleur. Un autre iigand préféré est. par exemple un peptide comportant le motif NGR décrit par Curnis et. al. (2002), lequel cible également les néo-vaisseaux.

Bien entendu, d'autres molécules peuvent êtres greffées à la surface des nanodiamants utilisés dans le cadre de la présente invention, par exemple pour augmenter leur stabilité en milieu biologique, ou pour en effectuer un marquage (fluorop ore, marqueur radioactif, av. ) (Figure 1 7).

De manière avantageuse, les nanodiamants selon la présente Invention peuvent être suivis par des méthodes d'imagerie utilisant la luminescence intrinsèques des centres colorés dans les nanodiamants (centres N-V ou autre) (Chang et ai, 2008). Des méthodes de spectroscopies peuvent aussi être utilisées, notamment la spectroscopie Raman (Chao et al., 2007). Le praticien peut donc vérifier la présence des nanodiamants au niveau cle la zone ciblée, par exemple au niveau d'une tumeur solide, avant de soumettre cette zone à Γ irradiation qui entraînera la génération de radicaux libres. Ceci permet de diminuer encore les effets secondaires du traitement. Comme mentionné plus haut, les nanodiamants sont connus pour leur capacité à vectoriser des molécules. Selon un mode de réalisation particulier _» la présente invention propose d'utiliser des nanodiamants à la fois pour leurs propriétés de vectorisation (fonction passive) et pour leurs propriétés de génération de radicaux libres sous irradiation (fonction active). Le principe de fonctionnement de cet aspect de l'invention est illustré à la Figure 18. Le couplage des propriétés de vectorisation des nanodiamants à ses propriétés de génération de radicaux libres est particulièrement avantageux dans le cadre de complexes multi modaux nanodiarnants/radiosensibilisants. En effet, les radiosensibilisants permettent- une réponse sélective en attaquant des voies biologiques spécifiques aux cellules tumorales tandis que les nanodiamants augmentent ta quantité de radicaux libres générés. L'association de ces deux composantes permet d'augmenter significatîvement l'efficacité et la sélectivité par rapport à l'utilisation de manière isolée de nanoparti eûtes ou de molécules radiosensibilîsantes : d'une part, l'utilisation de nanodiamants permet de transporter les radiosensibilisants dans les cellules tumorales de manière ciblée et de les libérer progressivement dans ces cellules, si bien que la biodisponibiîité des radiosensibilisants est améliorée et, d'autre part, les radiosensibilisants vont inactiver les défenses des cellules tumorales, donc les radicaux générés par les nanodiamants vont provoquer davantage de ruptures d'ADN dans les cellules tumorales. Ce couplage permet a priori d'augmenter les concentrations de radiosensibilisants délivrés dans les cellules tumorales et de réduire la dose de radiation nécessaire pour éliminer ces cellules.

Selon cette approche, la présente invention concerne une composition comprenant un nanodiamant tel que décrit ci-dessus, fonctionnalisé ou non par une molécule de ciblage, ainsi qu'une molécule radiosensibilisante. Cette molécule radiosensibilisante peut être liée audit nanodiamant par Liaison covaîente, ou simplement adsorbée à sa surface.

Différents types de molécules radiosensibilîsantes, aussi appelés "radiosensibilisants", ont été décrits et peuvent être utilisés pour mettre en œuvre la présente invention. A ce titre, o peut notamment citer des radiosensibilisants de type chimique, dont une liste non exhaustive comprend le misonidazole, le metronidazoie, l'etanidazole, le pimonidazole, les phenyipropanoides et l'acide monoiodoacétique. Ces molécules peuvent être fixées sur les nanodiamants de façon covaîente, éventuellement via des bras clivables en milieu cellulaire, permettant la libération de ces molécules après rinternalisation du nanodiamant. À titre d'exemple de bras clivables, on peut citer un polymère PEG poly-lysine, un bras pepiidique clivé par une enzyme surexprimée dans le type de tumeur ciblé (par exemple la MMP2 ou la cathepsine D), ou encore un bras comprenant un pont disulfure, lequel sera clivé par les thiorédoxines dans les lysosomes et endosomes des cellules. Alternativement, le radiosensibi lisant chimique peut être lié au nanodiamant par des liaisons faibles (adsorplion électrostatique soit directe, soit par l'intermédiaire d'un polymère chargé). Comme évoqué plus haut, un nouvel axe de recherche dans le domaine de la radiosensibilisation concerne Γ utilisation d'acides nucléiques capables de moduler l'expression de certaines protéines impliquées dans la réparation de FADN. La présente invention porte donc également sur une composition comprenant un nanodiamant tel que décrit plus haut et une molécule radiosensibilisante constituée d'une molécule d'acide nucléique adsorbée à la surface du nanodiamant Les acides nucléiques préférés pour mettre en œuvre cet aspect de l'invention sont des ARN interférenis capables d'inhiber l'expression d'un gène responsable de la réparation de l'ADN, comme par exemple un ARN interfèrent inhibant l'expression du gène POLQ.

Bien entendu, les compositions de l'invention seront avantageusement utilisées en combinaison avec un rayonnement, notamment comme médicament anticancéreux, et de préférence dans des conditions telles que le rayonnement, induit la production, à la surface des nanodiamants, de radicaux libres et/ou de chaleur. Le terme "en combinaison" indique que l'effet recherché est obtenu lorsque les cellules, tissus ou organes d'intérêt, ayant incorpor en partie lés nanoparticules de l'invention, sont excités par le rayonnement. Toutefois, il n'est pas nécessaire que les particules et les rayons soient administrés simultanément ni selon le même protocole.

Un autre objet particulier de l'invention réside dans une méthode pour induire ou causer la lyse ou la destruction de cellules cancéreuses, in vitro, ex vivo ou in vivo, comprenait la mise en contact de cellules cancéreuses avec un ou des nanodiamants ou compositions tels que décrits précédemment, pendant une période de temps suffisante pour leur permettre de pénétrer dans les cellules cancéreuses et. le cas échéant, pour permettre la libération des radiosensibilisants, suivie de l'exposition des cellules à des rayons tels que définis ci-dessus, ladite exposition induisant la génération de radicaux libres et/ou de chaieur à la surface des nanodiamants et provoquant la lyse ou la mort desdites cellules. Le cas échéant, une étape intermédiaire de détection des nanodiamants, par exemple par speciroscopie Raman, est effectuée avant l'étape d'exposition aux rayons, afin de contrôler la locali ation des nanodiamants.

L'invention concerne également une méthode de traitement du cancer, comprenant l'administration à un patient atteint d'un cancer d'une composition comprenant des nanodiamants tels que définis précédemment, de préférence fonctionnalisés par une molécule de ciblage, dans des conditions permettant aux nanodiamants ou agrégats nanoparticui aires de pénétrer dans les cellules cancéreuses, et le traitement ultérieur du patient en. présence d'une source d'excitation, par exemple choisie parmi les rayons X, les rayons gamma, les UV, les protons et les hadrons, conduisant à une altération, une perturbation ou une destruction fonctionnelle de cellules cancéreuses du patient, traitant ainsi le cancer.

Le terme "traitement" désigne ici toute amélioration des signes cliniques, comme notamment une diminution de la taille ou du développement d'une tumeur ou d'une zone tissuiaire pathologique, la suppression ou la destruction de cellules ou tissus pathologiques, un ralentissement de la progression de la pathologie, une réduction de la formation de métastases, une régression ou une rémission complète, etc. Les nanodi amants et compositions de l'invention peuvent également être utilisées in vitro ou ex vivo.

L'in e tion est utilisable pour traiter tout type de cancer, notamment les tumeurs solides, métastasées ou non, par exemple choisies parmi les cancers du poumon, foie, rein, vessie, sein, tête-et-cou, cerveau, ovaires, prostate, peau, intestin, colon, etc. Les rayons peuvent être appliqués à tout moment après l'administration des particules, en une ou plusieurs fois, en utilisant tout système de radiothérapie ou de radiographie déjà disponible. Les nanodi amants et compositions de l'invention peuvent être administrés par différentes voies, de préférence par injection, systémique ou locale, ou d manière orale. Des injections ou. administrations répétées peuvent être envisagées, si nécessaire.

Les exemples suivants et les figures annexées illustrent V invention sans toutefois limiter son étendue.

Légendes des figures

Figttre I : Schéma du montage d'hydrogénation des nanodiamants (NDs) par plasma d'hydrogène (¾) assisté par micro-ondes.

Figure 2 : Clichés par Microscopie Electronique en Transmission Haute Résolution (METHR) de NDs initiaux (a), NDs après I h (b) et 8h (c) de recuit sous vide à 75Û°C Les plans diamants (1 1 1) et graphitiques (001) sont indiqués par les lignes blanches et grises, respectivement. Les reconstructions de surface graphitiques sont indiquées par des flèches blanches. La barre d'échelle est de 5 nm.

Figure 3 : Spectres de Spectroscopie de Photoéiectrons X (XPS) du niveau de cœur du carbone (Cl ) des NDs initiaux (ND-înitial), NDs après lh (ND-î h), 5h (ND~5h) et 8h (ND-Sii) de recuit sous vide à 750°C.

Figure 4 : Evolution du potentiel Zeta des NDs-lh, ND-5h, ND-8h et NDs hydrogénés ( D-H) dans l'eau uitrapure en fonction du pH.

Figure 5 : Distribution en taille des protéines du milieu DME + 10% de sérum de veau fœtal (S VF) (noir), des NDs-5h dans l'eau déionisée (bleu), dans le E juste après ajout (vert) et après 5h (rouge). Les mesures sont effectuées à 37°C.

Figure 6 ; Cliché METHR de nanodiamants hydrogénés (a) et graphitisés en surface (b). Les plans (11 1) du diamant sont surlignés en plan et les reconstructions graphitiques de surface sont indiquées par les flèches blanches. La barre d'échelle est. de 5 nm.

Figure 7 ; Spectres XPS du niveau de cœur du carbone (Cl s) de nanodiamants hydrogénés après dispersion dans l'eau (a) et après une heure de recuit sous vide à 400°C (b). Fi re 8 : Spectres de Speetroseopie infrarouge à Transformée de Fourier (FTiR) de NDs initiales ( D initial), NDs-G après Ih (ND-lh) et 8h (ND-8h) de recuit sous vide.

Figure 9 : Réponse cellulaire de la lignée Oaki-Ï après exposition, aux NDs- COOH sans irradiation.

Figure 10 : Réponse cellulaire de. la lignée Caki-1 après exposition aux NDs-COOH après une irradiation de 4 Gy,

Figure 11 : Réponse cellulaire de la lignée Caki-1 après exposition aux NDs- H sans irradiation.

Figure 12 : Réponse cellulaire de la lignée Caki-1 après exposition aux NDs-H après une irradiation de 4 Gy.

Figure 13 : Evolution des cellules Caki-1 après exposition aux NDs-COOH et NDs-H , sans irradiation.

Figure 14 : Evolution des cellules Caki-1 après exposition aux NDs-COOH et NDs-H, après une irradiation de 4 Gy.

Figure 15 : Stress oxydant induit par les NDs-H avec ou sans irradiation. Le témoin sans sonde illustre le fond de luminescence n'étant pas lié aux radicaux libres. L'autre témoin est exposé à la soude fluorescente mais pas aux NDs-H. Les barres grises représentent l'intensité du stress oxydant dans les cellules non irradiées, et les barres blanches l'intensité du stress oxydant dans les cellules ayant subi un rayonnement de 4 Gy, une heure après cette irradiation.

Figure 16 : întemalisation d'une sonde d'acide nucléique peptidique marquée avec le fluorophore Cy3 (AN?-Cy3) adsorbée à la surface de ND-H. Les observations ont été réalisées après 24h (A) ou 72h (B) d'incubation de cellules Caki en présence d'un mélange ND-H/ANP-Cy3. Les noyaux cellulaires ont été marqués au bisbenzimide Hoechst 33342.

Figure 17 : Complexe nanoparticule de diamant radiosensibilisant.

Figure 18 : Principe de fonctionnement, a) incorporation du complexe nanodiamants (NP)/radiosensibiIisants dans une cellule, b) libération des radiosensibilisants et inhibition des défenses de la cellule, c) génération d'électrons et formation de radicaux libres sous irradiation.

EXEMPLES

Production de nanodiamants avant des econstructions de su face graphitiques ou des fonctions hydrogénées en surface

Les NDs ayant des propriétés utiles pour la adiosensibilisation de cellules tumorales ont été modifiés par des traitements particuliers permettant la formation de reconstructions graphitiques (grapbitisation) ou de fonctions hydrogénées de type CH.» avec x~l, 2 ou 3 (hydrogénation). Des NDs comportant une combinaison de ces deux types de terminaisons de surface peuvent également être utilisés dans le cadre de la présente invention. Les méthodes décrites ci-dessous sont celles utilisées par- les inventeurs pour l'hydrogénation (par plasma d'hydrogène assisté par micro-ondes) et ia graphitisation (par recuit sous vide à haute température ou par exposition au micro-ondes SOIÎS vide de NDs hydrogénés), mais ces terminaisons de surface particulières peuvent a priori être obtenues également par d'autres méthodes, il est à noter que les conditions exposées sont à adapter en fonction de la chimie de surface initiale des NDs, qui peut varier d'un fournisseur de nanodiaraants à l'autre. Les traitements décrits ici ont été optimisés pour des NDs de détonation produits par le Nanoearbon Institute au Japon (Prof, Eijî Osawa).

1 ,1 , H ^y drogénation par plasma hydrogène assisté par micro-ondes

/../. /. Mode opératoire

La méthode utilisée pour conférer des terminaisons hydrogénées aux NDs est décrite dans la référence de Girard et al., 2010. Les NDs (environ 50-100 mg) sont introduits en voie sèche dans une cartouche en quartz, ou bien directement dans un tube en quartz, qui est inséré de façon, perpendiculairedans un guide d'onde connecté à un générateur de micro-ondes à 2.45 GHz (Sairem), comme présenté sur la figure 1. Le guide d'onde est refroidi à l'eau et le tube est refroidi à l'air comprimé. Ce tube est relié à un dispositif de pompage primaire et d'approvisionnement, en hydrogène haute pureté N9.0 et argon gazeux.

Dans un premier temps, une série de purges sont réalisées via un pompage primaire dans le tube (pression < 0.1 mbar) et remise sous pression par de l'hydrogène haute pureté, puis l'hydrogène haute pureté est i jecté jusqu'à atteindre une pression stabilisée à 12 mbar. Cette pression est soit maintenue tout au long du processus d'hydrogénation par isolation du tube (mode statique), soit maintenue par l'association d'un flux continu d'hydrogène et d'une vanne de régulation de pression sous consigne (mode dynamique). Une puissance micro-ondes de 300 W est utilisée pour induire la création d'un plasma dans le tube. La géométrie des micro-ondes dans le guide d ^' ondes est adaptée pour obtenir une puissance absorbée par le plasma maximale et une puissance réfléchie nulle au niveau du générateur. Le tube est régulièrement tourné et translaté manuellement afin de s'assurer que la majorité des NDs sont exposés au plasma. La durée normale d'exposition est de 20-30 min. Afin d ^' obtenir une hydrogénation complète, il est important d'effectuer une purge après 5 min de traitement afin d ^' évacuer des espèces oxydées désorbées de la surface des NDs : après arrêt des micro-ondes, le tube est pompé en vide primaire, puis de l'hydrogène pur est réintroduit dans le tube pour initier de nouveau la formation d'un plasma. Cette purge intermédiaire n'est pas utile dans le cas d'une hydrogénation sous flux dynamique d'hydrogène. A la fin du traitement, le tube est refroidi sous hydrogène jusqu'à ce qu'il soit à la température ambiante, puis le gaz résiduel est pompé. Le tube est remis à pression ambiante par introduction d'argon, puis les NDs peuvent être récupérés. i. 1.2. Caraciérisation

Des caractérisations détaillées des propriétés de surface des NDs hydrogénés préparés de cette manière ont été publiées (Girard et al, 2010 ; Girard et al., 201 1 ; Arnault et al., 201 1 ). La chimie de surface y est étudiée par spectroscopies d'électrons (XPS), infrarouge (FTÎR) et Raman. De plus, trois greffages dont la sélectivité sur films de diamant hydrogénés est connue ont été appliqués à ces nanodiamants hydrogénés ; une sélectivité équivalente vis-à-vis de la présence des terminaisons hydrogénées des nanodiamants a été démontrée. Ceci montre en particulier que ces NDs présentent des propriétés d'affinité électronique négative (Girard et al, 201 1 ). Ces propriétés sont à P rigine de leur utilisation pour générer des radicaux libres dans l'eau (voir exemple 2).

1.2. Graphitisation de NDs hydrogénés par _^ exppsition .micro-ondes

Les NDs hydrogénés selon le procédé décrit ci-dessus peuvent être graphitisés à la suite de leur hydrogénation, in itu, par une simple ré-exposition à des microondes sous vide primaire. E effet, les inventeurs ont observé que les NDs hydrogénés ont la capacité d'absorber les micro-ondes sous vide. Ainsi, en adaptant la géométrie de la cavité micro-onde, la plupart de la puissance micro-onde (les inventeurs ont utilisé 300 W pour 100 mg de NDs) est absorbée par les NDs et est convertie e chaleur. Une exposition de quelques secondes es suffisante pour permettre une élévation très rapide de la température des NDs. induisant la formation de reconstructions graphitiques en surface, comme cela se produit dans un procédé de graphitisation classique par recuit à haute température (voir ci-dessous). Une exposition supérieure à \ minute, en revanche, conduit à la formation de nanoparticuies entièrement graphitiques où le cœur diamant a totalement disparu. Cette méthode peut, être une alternative aux recuits sous vide à haute température dont le protocole expérimental est détaillé dans le paragraphe qui suit.

1.3. Graphitisation de surface des nanodiamants par recuit sous vide

7.5. /. Mode opératoire

La surface des nanodiamants peut être graphitisée par recuit sous vide à haute température (entre 700°C et 90Ô°C) (Petit et al, 20! 1 ). Ces recuits sous vide sont effectués dans une chambre à parois métalliques dédiée, équipée d'un élément chauffant en carbure de silicium permettant d'atteindre des températures supérieures à 1000°C et un système combiné de pompage primaire et turbornoiéc laire permettant l'obtention d'un vide secondaire dans la chambre (de P ordre de 1.0 ^' ' mbar).

Entre 50 et 100 mg de NDs en voie sèche sont déposés dans un creuset en alumine muni d'un couvercle du même matériau, qui est alors placé sur l'élément chauffant à l'intérieur de la chambre. Durant le recuit, la température du creuset est mesurée par taie caméra infrarouge (FUR SC300) au préalable calibrée d'après Pémissivité du creuset tandis que la température de l'élément chauffant est estimée avec un thermocouple. La chambre est ensuite pompée à température ambiante jusqu'à l'obtention d'une pression inférieure à 5 ^χ 10 ^* ' rabar), puis la température de l'élément chauffant est progressivement augmentée jusqu'à l G00 ^t; C (correspondant à 750°C pour le creuset), en maintenant la. pression dans la chambre- inférieure à 5 * 10 ^'6 mbar. Une fois la température stabilisée, le creuset est laissé à température constante pour une durée déterminée, puis la température de l'élément chauffant est progressivement réduite jusqu'à la température ambiante. Le creuset est ainsi refroidi sous vide. Une fois ramené à température ambiante, l'enceinte du réacteur est remise à pression atmosphérique sous air, permettant la sortie du creuset. Les NDs peuvent alors être récupérés pour être remis en suspension.

1.3, 2. Caractérisations

Typiquement, un recuit à 750°C pendant tare heure est suffisant pour obtenir la formation de reconstructions graphitiques en surface, mais des recuits plus longs peuvent être utilisés pour augmenter le taux de couverture de la surface par ces reconstructions graphitiques. Des températures supérieures à 900°C induisent une graphitisaiion du cœur diamant, la graphitisatkm limitée à la surface des NDs est donc difficilemen contrôlable au- dessus de 900°C.

La graphitisaiion des NDs est validée par microscopie électronique en transmission haute résolution (METH ) après lli et 8h de recuits sous vide à 750X, correspondant à la température du creuset (Figure 2). Les clichés permettent d'observer les modifications de la structure atomique induites par les recuits. Cette graphitisaiion est aussi validée par l 'analyse de la chimie de surface par spectroscopie de photo-électrons X (XPS). En effet, une composante liée au carbone hybridé sp ^~ apparaît après recuit sous vide à basse énergie de liaison par rapport au carbone hybridé sp ^J (Figure 3).

Exemple 2 : Mise en suspension des NDs modif és d& Feao

Les NDs hydrogénés et/ou graphitisés sont ensuite mis en suspension colloïdale dans de l'eau uitrapure (18.2 ΜΩ.αη à 25°C) en utilisant une sonde plongeante de sonificaîion (Hielscher IJP400S) de 300 W fonctionnant à une fréquence de 24 kHz. Les NDs sont initialement introduits dans une solution d'eau uitrapure à une concentration de Tordre de 5 à 10 mg/ml pour être ensuite exposés aux ultrasons pendant au minimum 2h. A la suite du procédé de sonification, et afin de séparer de la suspension les plus gros agrégats non dispersables, les suspensions sont centrifugées à 4800 tours/minute pendant I h. Seul le surnageant est récupéré. Le diamètre hydrodynamique des NDs en suspension est mesuré par diffusion dynamique de la lumière (DDL) par un équipement dédié. La mesure du potentiel Zeta caractéristique de la charge de surface des nanodiamants en solution est effectuée sur le même équipement (Nanosizer ZS. Maivern) complété d'un module de titration automatique (M.PT-2, Maivern) afin d'effectuer des mesures en fonction, du pH.

Les suspensions ainsi obtenues sont constituées d'agrégats de NDs dont le diamètre hydrodynamique est inférieur à 50 nra et présentent un potentiel Zeta positif dans l'eau ultrapure sur une large gamme de pH, comme indiqué pour des NDs recuits sous vide I h (ND-lh), 5h (ND-51Y) et 8h (ND-8h) sur la figure 4. Une évolution similaire de la charge de surface est observée sur les NDs hydrogénés. En particulier, le potentiel Zeta élevé à pE physiologique permet d'assurer une bonne stabilité colloïdale des NDs modifiés dans cette gamme de pH.

Ces NDs sont stables plusieurs mois dans l'eau mais aussi en milieu biologique comme, l'illustre l'évolution du diamètre hydrodynamique des NDs-5h dans un milieu constitué de MEM (Minimal Essentiel Media) et de 10% de sérum de veau fœtal, mesuré par DDL (Figure 5). Après plus de 6 mois dans l'eau, un diamètre moyenne de 35 nra est détecté pour les NDs-5h. Après ajout clans le milieu [MEM + sérum] à une concentration de 0.5 mg/m! environ, le diamètre augmente à 144 nm, ce qui est attribué à l'adsorption de protéines du sérum chargées négativement sur la surface positive des NDs. Après 5h d'incubation à 37°C, le diamètre est réduit à 121 nm, ce qui montre qu'il n'y a pas d'effet significatif d'agrégation au cours du temps en milieu biologique.

Exemple 3 ; Génération de . radicaux libres à partir des nanodiamants (NDs) hydrogénés (NDs-H) /graphitisés .( I)s-.G)

L'effet d'amplification de la génération de radicaux libres à proximité des NDs-H/G est basé sur deux propriétés physiques : la forte densité d'atomes de carbone (de l'ordre de 10000 atomes pour un nanodiamant de 5 nra de diamètre) dans les NDs, permettant d'absorber efficacement les rayonnements, et leur capacité à transférer efficacement les électrons du cœur diamant à des espèces oxygénées fixées en périphérie des NDs.

L'absorption des rayonnements ionisants est beaucoup plus importante dans les NDs que dans les tissus environnants à cause de la forte densité atomique du diamant (=1.8x10'" atcm ^"" ). En effet, la distance entre deux plans atomiques d'orientation (3 1 1) de la maille diamant est de 0.206 nm, comme l'illustre le cliché de microscopie électronique en transmission haute résolution (MËTHR) présenté sur la figure 6. Sous rayonnement, une forte concentration de photoélectrons et d'électrons secondaires sont crées et sont libérés localement à îa surface des NDs. En effet, la surface des NDs-H et NDs-G se comporte respectivement comme la surface de films de diamant hydrogénés ou celle d'un plan de graphème. Ces deux surfaces sont connues pour permettre un transfert d'électrons très efficace vers des molécules adsorbées en surface (Chakrapani et ai, 2007 ; yu et ai, 2010),

En parallèle, les NDs-H et NDs-G ont la possibilité d'adsorber efficacement des espèces oxygénées à leur surface. Ainsi, une forte concentration d'oxygène a été mesurée à la surface des Ds~H et NDs-G, représentant jusqu'à 6 % atomique d'après les spectres XPS, après dispersion dans l'eau ultra-pure. L'oxygène provient d'adsorpiion par des liaisons non covalentes de molécules d'eau (¾0) et de dioxygène (<¾) ainsi que de liaisons covaientes C-0 simple liaison pouvant être liées à des fonctions hydroxyîes, éthers, époxydes ou endoperoxides. Cet oxygène, lié de manière covaiente à la surface des NDs. est caractérisé par la présence d'un épauiement à haute énergie de liaison sur les spectres du niveau de cœur du carbone Cl s par spectroscopie d'électrons X (XPS) présenté sur la figure 7a. En revanche, cet oxygène est faiblement lié puisque un recuit sous vide à 400°C permet de désorber la plupart de cet oxygène (Figure 7b). Par spectroscopie infrarouge (FTÎR), après désorption des espèces adsorbées de manière non covaiente par un recuit sous vide à 200°C, une importante bande à 1 100 cm ¹ a été observée, qui peut être lié à des fonctions de type éthers, époxydes ou endoperoxides (Figure 8), validant les résultats obtenus par XPS.

Ainsi, les électrons générés par irradiation sont transférés à ces molécules adsorbées sur la surface des NDs. Ces molécules étant des précurseurs de radicaux libres oxygénés (Oy, HO , ¾<¾, ...)» le transfert, d'électrons venant des NDs induit une forte production de radicaux libres à la surface des NDs. H est à noter qu de l'azote a aussi été mesuré par XPS ;. il est donc possible que des molécules azotées soient aussi adsorbées à la surface des NDs, impliquant la génération de radicaux libres azotés.

L'adsorption d'oxygène sur la surface induit un potentiel Zeta positif des NDs-I-1 et NDs-G, assurant une bonne stabilité colloïdale par stabilisation électrostatique, même en milieu biologique. L'environnement biologique où se trouvent les NDs est donc directement exposé aux radicaux libres générés à la surface des NDs.

Exemple 4 : Index cellulaire et stress _. o yda if..mésuré dans la liguée tumorale Caki-3 , sous Irradiation gamma en présence de NI)s-CQOH et Ds-H

L'effet radiosensibilisant des nanodiamants a été étudié sur une Lignée tumorale du rein Caki-L connu pour être particulièrement radiorésistante. Des cellules exposées à des NDs-COOH et NDs-Fi à 3 concentrations (10. 100 et 500 pg/ml), ainsi que des cellules sans NDs ont subi à un rayonnement de 4 Gray (Gy).

L'évolution de l'index cellulaire, caractéristique de réponse globale des cellules (morphologie, adhésion, viabilité, , .. ), a été suivi en temps réel sur 120h après irradiation par impédance-métrie en utilisant le système xCELLigence (Roche).

Le stress oxydatif a ensuite été évalué par observation des cellules par microscopie optique et quantifié par cytométrie en flux.

4.1. Résultais sur les NDs-COOH

Après exposition aux NDs-COOH, l'index cellulaire évolue de manière équivalente jusqu'à 48h pour les concentrations de 10 et 1.00 pg ml (Figure 9), Une très faible décroissance est observée à 100 pg/rnl pour des temps plus longs. En revanche, l'index cellulaire est fortement diminué pour la concentration 500 pg mi.

Ces résultats montrent que les NDs-COOH ne sont pas toxiques pour des concentrations inférieures à 100 pg/ml, mais qu'une certaine toxicité peut être observée à plus forte concentration. La toxicité dépend donc de la dose. Après irradiation de 4 Gy, la croissance de l'index, cellulaire du témoin montre que cette irradiation est trop faible pour créer mie toxicité significative sans nanoparticules (Figure 10). En revanche, l'index cellulaire est divisé par 2 par rapport au témoin après une exposition aux NDs-COOH à une concentration de 10 pg ral, voire pius pour les concentrations plus élevées.

Les NDs-CQOH ont. donc bien un effet radiosensibiHsant, qui dépend de la dose de NDs-COOH injectée dans les cellules. De plus, ces NDs ne sont pas toxiques à des concentrations inférieures à 100 pg/ml

4.2. Résultats sur les NDs-H

Le même protocole a été appliqué avec des NDs-H (Figures 1 1 et 12), Il est à noter que la toxicité des NDs-H est encore plus faible que les ^' NDs-COOH puisqir aucune toxicité n'est détectée même pour la concentration de 500 pg/nil, ce qui se serait traduit par une diminution de l'index cellulaire. La décroissance observée après 90h est probablement due à une saturation du signal détecté par impédance-métrie. due à la forte concentration de NDs-H utilisés. On observe en revanche une augmentation significative de l'index cellulaire, qui peut résulter, par exemple, d'une augmentation de taille des cellules après incorporation des NDs-H.

Après irradiation, le témoin suit la même croissance que dans le cas précédent. En revanche, avec la présence de NDs-H, la toxicité est très importante. L'index cellulaire est ainsi divisé par 3,4 pour une concentration de 10 pg rnL La toxicité ne semble pas dépendre de la dose de NDs-H puisque une évolution similaire de l'index cellulaire est observée à des concentrations plus élevées. Ce résultat est cohérent avec une toxicité induite par un stress oxydatîf à très faible concentration en NDs-H _» uniquement sous irradiation.

4.3. Résultats liés au stress oxydatif

Dans un premier temps, le stress oxydatif a été évalué en observant la morphologie des cellules par microscopie optique.

Il n'y a pas d'évolution particulière au niveau des cellules témoins sans/avec irradiation. Après ajout de nanodiamants, on observe la formation de vacuoles (apparaissant avec un contraste blanc), caractéristiques d'une toxicité induite par stress oxydatif (Figure 13). Le nombre de vacuoles augmente avec le temps.

La concentration de vacuoles augmente signifîcativement après irradiation dans les cellules exposées aux NDs (Figure 14) _f ce qui est en accord avec les résultats précédents.

Des mesures quantitatives du stress oxydatif ont été effectuées en mesurant la fluorescence d'une sonde sensible aux radicaux libres oxygénés (2',7'-dichloro.fluorescein) par cytométrie en flux. Une fois exposées aux différentes conditions expérimentales (NDs-H. irradiation, NDs-H + irradiation), les cellules ont été détachées de leur support de culture, remises en suspension, puis incubées 10 minutes en présence de cette sonde. Une fois entrée dans les cellules, la sonde peut rester sous forme réduite non fluorescente ou s'oxyder et donc émettre un signal fluorescent. L'intensité de fluorescence est directement liée à la quantité de radicaux libres oxygénés, ce qui permet une quantification relative sur stress oxydatif (Chen et ai, .2010). Cette méthode permet 3a mesure de radicaux libres oxygénés total intracellulaire, contrairement à la mesure de protéines oxydées par exemple.

Les résultats obtenus sur la Figure 1.5 montrent que :

Pour les cellules exposées aux NDs-H et non irradiées, le stress oxydant induit dépend de la concentration. I ! est doublé pour une concentration en NDs-H de 100 pg/ml.

Pour les cellules irradiées et non exposées aux NDs-H, le stress oxydant est, à I h après irradiation, identique à celui des cellules non irradiées, non exposées aux NDs-H.

Pour les cellules exposées aux nanoparticul.es et irradiées, le stress oxydant est triplé par rapport à la référence sans NDs-H mais cette augmentation n'est pas dépendante de la dose de NDs-H.

Il y a donc apport de radicaux libres dans les cellules après incorporation des NDs-H, mais ces radicaux libres induisent une toxicité significative par stress oxydant uniquement après irradiation d'après révolution de l'index cellulaire. La génération de radicaux libres est entretenue par les NDs-H puisque même une heure après irradiation, le stress oxydant est plus élevé que sans irradiation, ce qui n'est pas le cas du témoin.

4.4. Conclusions

Les nanodiamants ont donc un effet radiosensibilisant qui permet d'amplifier l'effet des radiations en générant une création plus importante de radicaux libres. Une simple exposition à une dose normalement insuffisante pour induire la mort des cellules tumorales permet une mort par stress oxydatif quand les cellules ont été préalablement exposées aux NDs. Les cellules exposées aux NDs peuvent donc être traitées sélectivement. Les NDs sont particulièrement intéressants car ils ne génèrent pas de toxicité en absence de rayonnement et les cellules non irradiées ne seront pas affectées par la présence de NDs. La toxicité initiale est réduite et l'effet radiosensibilisant amplifié pour des NDs-H, qui sont donc particulièrement intéressants.

Exemple 5 : Utilisation de _. n _. anoiliamants hydrogénés pour .yeçtQrîser des molécules bi ol ogiq «es d ans les celi les

Afin de vérifier la capacit des nanodiamants hydrogénés (ND-H) à lier et transporter des molécules d'intérêt biologique dans les cellules, des particules de ND-H ont été mélangées à un volume égal d ^' une sonde télomérique constituée d'acide nucléique peptidique (ANP, ou Protein Nuclelc acid Analogue, PNA, en anglais) _. , marquée avec le fluorophore Cy3. Les concentrations finales dans le mélange étaient de 64,52 pg/cm pour les ND-H et 0,5645 μ.Μ pour la sonde ANP-Cy3. La sonde ANP-C 3 a été dénaturée par chauffage à 80°C pendant 5 minutes avant d'être mélangée aux ND-H. Après une incubation de 10 minutes à température ambiaate, le mélange de Ds-H et de sonde ANP-Cy3 a été exposé à des cellules Caki-1 en culture (dans des plaques 8 puits Labtek). Les cellules ont été maintenues en présence du mélange pendant 24h et 72h, dans des conditions standard de culture cellulaire. Les noyaux cellulaires ont ensuite été marqués avec un marqueur fluorescent (Hoechst 33342), ei les plaques ont été observées directement, à l'aide d'un microscope à .fluorescence inversé. Pour le marquage nucléaire, le filtre d'excitaiion/émission était ~350nm/460nm, et pour le marquage du ANP-Cy3, de 550mn/57ihxrn.

L'internaiisation de la sonde de A.NP-Cy3 a été observée uniquement dans le cas où les particules de ND-H avaient été mélangées avec cette sonde. En l'absence de ND- H. la sonde ANP-Cy3 n'a pas été mternaJisée (Figure! 6).

Ces résultats démontrent la capacité des ND-H à lier une sonde ANP-Cy3 et à la transporter dans les cellules. La molécule internalisée ici n'a pas d'activité cytotoxique majeure, mais elle est chimiquement similaire à des molécules cytotoxiques telles que celle utilisée à l'exemple 6 ci-dessous, qui permettra d'obtenir une synergie avec l'activité cytotoxique des ND-H soumis à des radiations. En outre, cette sonde est moins chargée (négativement) que les molécules cytotoxiques d'intérêt thérapeutique qui pourront être utilisées en clinique. Ces molécules plus chargées négativement s'adsorberont plus facilement & la surface des ND-H et seront plus efficacement vectorisées dans les cellules. Ces résultais démontrent donc la capacité des ^' ND-H à vecioriser à l'Intérieur des cellules des molécules cytotoxiques d'intérêt thérapeutique telles que des acides nucléiques ou des ANP.

Exemple 6 : Ut lisation de complexes nanodiamants/ARN jnteriereBts r¾diosensIbiilsaBtg poiir le traitement de tumeurs

Des nanodiamants (taille primaire de 5 nm) sont préparés afin d'avoir un potentiel Zeta positif selon les procédés décrits ci-dessus. Pour les NDs ^' hydrogénés et/ou graphitisés, une étape de sonification dans l'eau permet à la fois de disperser les nanodiamants et d'adsorber efficacement des molécules (H ₂ 0, 0 _% et O; princi alement) sur leur surface, leur conférant ainsi une charge de surface positive.

Des ARNs interférents POLQ, ayant la capacité d'inhiber les ARN messagers codant pour la poiymérase thêta, permettant la éparation de Γ ADN ^' dans certaines cellules tumorales (le gêne POLQ est surexprimé dans les cancers du sein les plus agressifs par exemple) sont adsorbés sur la surface des nanodiamants. Les ARNs ayant une charge négative de surface, peuvent être adsorbés par interaction électrostatique sur la surface des nanodiamants chargés positivement par simple addition des ARNs dans la suspension de nanodiamants.

Ces complexes nanodiamants/ ARNs sont ensuite injectés dans des cellules tumorales, où ils rentrent préférentiel! ement du fait de la perméabilité accrue des membranes des cellules tumorales. Les ARNs interférants POLQ sont libérés progressivement dans les cellules tumorales et inhibent la synthèse des polymérases thêta. Les cellules tumorales sont rendues plus sensibles aux radiations.

Les cellules tumorales sont irradiées par des rayons X, entraînant la libération de radicaux libres dans les cellules ayant intemalisé les nanodiamants.

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