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CAMPO TÉCNICO La presente invención tiene su campo de aplicación en el área biotecnología, particularmente para el uso de N-vanilliloleamida que tiene una afinidad sobresaliente hacia el receptor vanilloide del subtipo 1 (receptor VR1/TRPV1) siendo de gran utilidad para el tratamiento de la obesidad y el sobrepeso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En ios últimos años, l a obesidad se ha convertido en la enfermedad metabólica de mayor preocupación en el mundo, considerándose un problema de Salud Pública a nivel mundial debido a que disminuye la longevidad, la calidad de vida y la productividad económica de las personas que la padecen, sobre todo en los casos de obesidad mórbida. México ocupa eí primer iugar en obesidad infantil y ei segundo lugar en obesidad en adultos a nivel mundial.

Se ha descrito a la obesidad como la inflamación que sufre el tejido adiposo a consecuencia de una respuesta al exceso de nutrientes, los cuales funcionan como señales que generan una serie de desórdenes metabóíicos, como la resistencia a la insulina y otras patologías relacionadas, donde ios adipocitos juegan un papel central (Trayhurn, 2007). En investigaciones recientes se sugiere que los mecanismos clave para reducir la incidencia de obesidad son la disminución de la diferenciación y proliferación de preadipocítos, así como la disminución de la lipogénesis.

Una de las alternativas más utilizada para combatir la obesidad es la farmacoterapia, que constituye una herramienta complementaria a la dieta y demás tratamientos, ya que sin medicamentos la enfermedad tiende a progresar y empeorar la situación y pronóstico del paciente. Hoy en día, se conocen tres tipos de fármacos, los que reducen el apetito, los que alteran la absorción de nutrientes y los que incrementan el gasto energético. No obstante, estos tipos de fármacos pueden tener efectos secundarios no deseables por ejemplo causar dependencia, tolerancia, insomnio, somnolencia, irritabilidad, y/o depresión. Por lo que existe la necesidad de ofrecer un producto que inhiba o module la acumulación de grasa en el tejido adiposo de manera segura, efectiva y sin tener efectos colaterales no deseados.

En los últimos años, los estudios relacionados con la obesidad se han enfocado en la búsqueda de moléculas naturales (principios bioactivos) que inhiban la acumulación de grasa corporal, Estas moléculas derivadas de fuentes naturales, han demostrado tener efectos benéficos sobre esta vía, mediante la inhibición de la adipogénesis y la estimulación de la lipólisis. Algunos de estos componentes son el epigaiocatequina-3- galato del té verde, que ha demostrado reducir la masa grasa, incrementar el gasto energético y prevenir la obesidad in vitro; y más recientemente, la capsaicina de los chiles del género Capsicum, para la cual se ha demostrado un efecto en el catabolismo lipldico e inhibición de la adipogénesis, reduciendo el peso y la grasa corporal (Kim y Park, 201 1 ; Lee y col., 201 1 ).

La capsaicina es el principio activo pungente de los frutos del género Capsicum, responsable de la sensación picante que los caracteriza. La capsaicina es y ha sido objeto de estudio de gran interés en todo el mundo. Enl os últimos años se han publicado alrededor de 3,900 artículos de investigación clínica, en los cuates se describen los múltiples efectos que este compuesto tiene. Szallasi y Blumberg (1999), fueron los primeros en demostrar que la capsaicina provoca su acción ardiente mediante la activación del canal catiónico TRPV1 que se expresa sobrel as terminaciones nerviosas sensoriales (Szallasi y Blumberg, 1999; Cioffi, 2007). Haanpaa y Treede (2012), reportan todols os estudios que se llevaron a cabo para demostrar que la capsaicina, al actuar sobre el sistema nervioslo ogra un efecto analgésico, ya que reduce la sustancia P, un péptido que lleval os mensajes de dolor desde las terminaciones nerviosas de la piel hasta el sistema nervioso central. Estos resultados fueron muy prometedores y l levaron a estimular el uso de la capsaicina como analgésico para el tratamiento del dolor en afecciones comol a artritis reumatoide, dolor muscular, lumbalgia y neuropatía diabética (Wong y Gawa, 2008; Haanpaa y Treede, 2012).

Actualmente las investigaciones se enfocan hacia el efecto anti-obesídad de este compuesto y diversos estudios han reportado resultados interesantes al respecto. Kang y colaboradores (2010), demostraron que la dieta suplementada con capsaicina en munnos obesos resulta en la disminución de peso causado por trastornos metabólicos como la resistencia a la insulina y esteatosis hepática. Estos efectos están relacionados con la disminución de la expresión de genes como PPAR -y y la activación del canal TRPV1 , Joo y colaboradores (2010), evidenciaron que la aplicación de un tratamiento de capsaicina en ratas con una dieta alta en grasas, regula la adipogénesis y disminuye el peso corporal en un 8 %, además de disminuir significativamente el peso del tejido adiposo blanco. Lee y colaboradores (2010), reportaron que la capsaicina ejerce una acción lipolftica en células adiposas de ratón 3T3-L1 , por el incremento de la hidrólisis de triglicéridos en los adipocitos, la cual es regulada por la expresión de múltiples genes que están involucrados en las vías catabólicas de Sos lípidos, como lo son HSL, CPT-1a y UCP2. Hasta el momento no se ha esclarecido completamente el mecanismo por el cual la capsaicina ejerce su efecto anti-obesidad; sin embargo, en estudios recientes se proponen dos posibles modelos: el receptor de la capsaicina es conocido como VR1 (Receptor Vanilloide subtipo 1), el cual es un canal de intercambio catiónico, no selectivo, con alta permeabilidad al calcio, que se localiza en las membranas plasmáticas de varias células, entre ellas los adipocitos. Este receptor forma parte de la familia de canales iónicos que son llamados canales con potencial transitorio de receptor tipo 1 (TRPV1), los cuales pueden ser estimulados por calor o por estímulos químicos, como la capsaicina y la resiniferatoxina, productos de la clase vanilloide. El primer modelo descrito por Zhang y colaboradores (2007), propone quel a capsaicina se une al receptor VR1 de la membrana celular de los adipocitos, activando el canal TRPV1 para desencadenar el incremento de calcio citosólico. La acumulación de calcio libre en el citosol podría activar a la enzima calcineurina, la cual podría desencadenar alguna vía de señalización intracelular que condujera a la inhibición de importantes factores de transcripción pro-adipogénicos como PPAR -γ y C/EBP - α (Zhang y coi., 2007).

En el segundo modelo, se plantea que la capsaicina estimula la expresión de la caspasa-3 en una manera dosis-dependiente, que conlleva a la escisión de PPAR-y. La capsasa-3 es un tipo de enzima miembro de la familia de las caspasas que al activarse dirige a las células hacia la apoptosis (muerte celular programada); en este modelo se sugiere que, al ser activada puede además provocar la escisión de una gran cantidad de proteínas celulares clave, una de las cuates es la proteína PPAR -y (Poder y Janicke, 1999). La proteína PPAR-y se encuentra presente en gran cantidad en los adipocitos y es esencial para que la adipogénesis se lleve a cabo, por lo que la escisión de esta proteína provocaría su inactivación, y por consiguiente, la inhibición de la adipogénesis (Hsu y Yen, 2007).

Además, el uso de la capsaicina para el tratamiento de la obesidad se ha divulgado también en diversos documentos de patente. Por ejemplo, en el documento KR20100012912 (A) "Composición para el tratamiento de la obesidad", se refiere una composición que contiene ingredientes para quemar la grasa incluyendo asparagina, ácido aspártico, ácido giufámico, glutamina y extracto de Poria cocos; y contiene además ingredientes para quemar la grasa como puede ser la capsaicina, el extracto de canela, el extracto de ajo, el extracto de cebolla, el extracto de chile, o la pimienta negra. Y, en el documento KR20100120082 (A) "Composiciones de uso externo sobre la piel contra la obesidad, que comprenden capsaicina o compuestos similares a la capsaicina como ingrediente activo", se describe el uso de la capsaicina y de compuestos derivados de la capsaicina: dihidrocapsaicina, nordihidrocapsaicina, nonivamida, capsiato, dihidrocapsiato, norhidrocapsiato, y las sales de los mismos, como ingrediente activo de una composición uso externo, vía tópica, para el tratamiento de la obesidad. Sin embargo, un inconveniente que no es mencionado en estos documentos es el hecho de que la alta pungencia de la capsaicina y sus derivados puede ocasionar efectos no deseables. Se sabe por ejemplo, que el uso tópico de la capsaicina puede provocar una sensación de quemazón o escozor cutáneo en la zona de aplicación.

Es asimismo conocido que, la capsaicina y sus derivados causan irritación en mucosas orales, nasales, respiratorias y otro tipo de tejidos cuando se incluye como ingrediente en composiciones destinadas a ser administradas vía oral, Este efecto se refiere por ejemplo en ios documentos WO2008033351 (A2) "Formulaciones de liberación prolongada, multimodales, resistentes al abuso", y WO2008027442 (A2) "Formulaciones farmacéuticas orales disuasivas de abuso, basadas en agonistas de opioides, y el método para su uso", en donde se describe la preparación de composiciones que disuadan al usuario del abuso y/o del uso no médico de fármacos de prescripción que contienen opioides, depresores del sistema nervioso central (SNC), o estimulantes. Se menciona en estos casos que, en dichas composiciones se incluye un elemento que desanima al usuario de caer en el uso excesivo o innecesario de los medicamentos de prescripción; siendo por ejemplo un efecto disuasivo la irritación causada en las mucosas nasales, orales, respiratorias y en otros tejidos, y que los agentes causantes de irritación son agonistas del receptor TRPV1 como la capsaicina y otros capsaicinoides.

Una propuesta para evitar los efectos indeseables del uso de la capsaicina, se refiere por ejemplo en el documento WO2014159884 (A1) "Uso de capsaicina encapsulada y análogos de la misma para controlar el consumo de calorías", en el que se describe un alimento de tipo refrigerio sin calorías, que cuando se consume causa una sensación de saciedad. El refrigerio lleva a cabo su efecto mediante la estimulación de las terminaciones del nervio vago en el tracto gastrointestinal por la capsaicina encapsulada. Se menciona que, en las terminaciones deí nervio vago en ei tracto gastrointestinal se expresa el receptor TRPV1 , que es el sitio diana de la capsaicina encapsulada para ejercer el efecto inhibidor del apetito. En este caso, la encapsulación de la capsaicina y/o de compuestos análogos a esta, evita la sensación de ardor debida a la pungencia. Sin embargo, los procesos de encapsulacsón necesarios para tal efecto son de manera general complejos, demandantes de condiciones controladas de temperatura, presión, humedad, etc.. y que se requiere así también de equipos muy costosos.

Una opción más consiste en la caracterización de otros capsalcinoides así como en la generación de moléculas derivadas de la capsaicina medianamente o nada pungentes. A la fecha se conocen alrededor de 20 capsalcinoides, sin embargo, hoy en día se sabe que más del 90 % del contenido total de ios capsaicinoides en el chite lo representan en primer lugar, la capsaicina y en segundo lugar, la dihidrocapsaicina, que se diferencian por la longitud de su cadena, presencia o ausencia de doble enlace, el punto de ramificación y su picor relativo (Rodríguez y col., 2010; Chinn y col , 2010). En cuanto a los derivados de la capsaicina, se trata de compuestos que se obtienen a través de una o varias modificaciones estructurales de la capsaicina por síntesis química o enzimática, lo que puede aumentar o disminuir su pungencia. La síntesis química de estos análogos, ha sido motivada para la búsqueda de moléculas aisladas de la capsaicina natural, que puedan actuar como sustitutos picantes, fármacos y otras sustancias útiles que sean medianamente o nada pungentes para el humano (Wang y col., 2009; Wang y col., 2011).

En el documento US2013178534 (A1) "N-nonanoilvanilliamina como un agente para reducir el apetito, como un agente para proporcionar una sensación de saciedad, y como un agente estimulante", se describe el uso de un análogo sintético de la capsaicina, la N-nonanoilvanillilamina, para la elaboración de productos comestibles en los cuales, la N-nonanoilvansílilarnina inhibe el apetito, causa una sensación de saciedad, y/o ejerce un efecto estimulante. Refieren que se obtiene la actividad esperada sobre el receptor TRV1 para alcanzar Sos efectos deseados, teniendo una menor pungencia que la capsaicina.

En vista dei gran impacto que ha tenido la modificación química de los capsaicinoides, se ha incrementado el interés en la generación, identificación y evaluación de otras moléculas análogas de la capsaicina, con propiedades mejoradas, que pueden ser medianamente o nada pungentes. Asi, la presente invención está relacionada con derivados de la capsaicina menos pungentes, como olvanil y VAMC8, los cuales mantienen el efecto de la propia capsaicina y pueden ser empleados como fármacos naturales para favorecer la disminución de peso y mejorar la calidad de vida de las personas que padecen obesidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Estructura y propiedades químicas de olvanil y capsaicina.

Figura 2. Cuantificación de la acumulación de Sípidos totales en los adipocitos tratados con olvani!, y capsaicina a diferentes concentraciones. Los dos tratamientos disminuyeron la acumulación de triglicéridos de manera dependiente de la concentración. Asimismo mostraron diferencias estadísticamente significativas respecto al grupo control, sin embargo, el mayor efecto se observa con capsaicina a 200 uM, que disminuyó hasta en un 35 % los triglicéridos acumulados. Los datos se muestran en media ± DE (triplicados). Figura 3. Efecto de olvanil y capsaicina en la disminución dei contenido de triglicéridos intracelular en un modelo in-vitro de obesidad. Se observa claramente que la disminución de triglicéridos acumulados en las células 3T3-L1 , es dependiente de la concentración de las moléculas. Dicho efecto se comienza a observar a una concentración de 100 μΜ y aumenta en los dos casos a una concentración de 200 μΜ. Los datos se muestran en media ± DE (triplicados). Figura 4, Efecto de olvanil y capsaicina a diferentes concentraciones sobre el proceso de lipólisis in-vitro. Los adipocitos fueron tratados por 48 h con 50, 100 y 200 μΜ de los compuestos, y un grupo control sin estímulo. Se observa que el efecto es dependiente de la concentración. Ei tratamiento con las dos moléculas resultó en un incremento significativo en la cantidad de gíicerol liberado al medio, lo cual nos indica que hubo una estimulación de la lipólisis. Los datos se muestran en media ± DE.

Figura 5. Cuantificación de la acumulación de lípidos totales en los preadipocitos tratados con olvanil, y capsaicina a diferentes concentraciones, durante el proceso de adipogénesis. Los dos tratamientos disminuyeron la acumulación de lípidos de manera dependiente de la concentración. Asimismo mostraron diferencias estadísticamente significativas respecto al grupo control, sin embargo a pesar de que olvanil es una molécula sin pungencia y las concentraciones probadas fueron menores, el efecto es mayor si se compara con lo encontrado para capsaicina. Los datos se muestran en media ± DE (triplicados). Figura 6. Cuantificación de triglicéridos intracelulares acumulados en los adipocitos al día nueve de diferenciación, estimulados con olvanil y capsaicina a diferentes concentraciones, en un modelo in-vitro de obesidad. Se observa que únicamente la concentración de 100 uM y 150 uM de capsaicina disminuye Sos TG acumulados, mientras que en el caso de olvanil, las tres concentraciones claramente disminuyen la acumulación de triglicéridos durante ei proceso de diferenciación a adipocitos. La disminución de triglicéridos acumulados en las células tratadas con olvanil fue dependiente de la concentración. Los datos se muestran en media ± DE.

Figura 7. Cuantificación de mRNA de PPARY en un modelo in-vitro de obesidad. Se observa que capsaicina no disminuye significativamente los niveles de mRNA de PPAR Y a ninguna de las concentraciones evaluadas, sin embargo, olvanií disminuyó significativamente 2.67 veces los niveles de mRNA de PPAR gamma a una concentración de 50 μΜ. Figura 8, Cuantificación de mRNA de PREF-1 en un modelo in-vitro de obesidad. La figura muestra que para el caso de capsaicina no se observaron cambios en la expresión del marcador de preadipociíos PREF-1 con respecto al control, sin embargo para olvanil se puede observar que mantiene los niveles de PREF-1 , por lo que se infiere que un tratamiento con 50μΜ de olvanil inhibe la diferenciación de preadipociíos a adipocitos en células 3T3-L1.

Figura 9. Glucosa y colestero!. A) Gráfica de glucosa, se observa una reducción significativa mediada por el tratamiento con Olvanil. B) Gráfica de colesterol total. Se observa una disminución significativa en el tratamiento con Olvanil. ANOVA de una vía, post-Test de comparación múltiple de Tukey. Se muestra el promedio ± DE.

Figura 10. Grasa abdominal. Se observa una disminución de la grasa abdominal, aunque dicha disminución no es estadísticamente significativa en el grupo tratado con Olvanil al compararse con el grupo HFD. ANOVA de una vía, post-Test de comparación múltiple de Tukey. Se muestra el promedio ± DE. Figura 1 1. Perfil de lípidos. Se observa una disminución significativa (p<0.05) en LDL para el grupo tratado con Olvanil con respecto al grupo de animales HFD (obeso) sin tratamiento, así como un aumento en los niveles de HDL del grupo tratado con Olvanil al compararlo con el grupo de animales obesos (HFD), no se observó una diferencia significativa en los demás parámetros determinados. ANOVA de una vía, post-Test de comparación múltiple de Tukey. Se muestra el promedio ± DE.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Olvanil es un análogo sintético de la capsaicina que no tiene pungencia, el cual surge como una alternativa en la búsqueda, identificación y evaluación de nuevas moléculas o compuestos bioactivos que pudieran ampliar la posibilidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el control de la obesidad (Figura 1). La capsaicina provoca dolor transitorio por la estimulación del receptor de potencial transitorio vaniloide tipo 1 (TRPV1) (LaMotte et al, 1991 ; Caterina et al, 2000), TRPV1 se expresa principalmente en las neuronas sensoriales de mamíferos y es un canal de cationes con alta permeabilidad al Ca ² (Caterina et al., 1997). TRPV1 juega un papel importante en la nocicepción térmica y dolor inflamatorio (Caterina eí ai, 2000; Davis et al., 2000), Paradójicamente, la activación de TRPV1 con capsaicina puede producir un deterioro funcional de larga duración, pero reversible de las neuronas sensoriales y la supresión de la neurotransmisión sensorial, comúnmente denominado desensibilización (LaMotte et al, 1991 ; Szallasi y Blumberg, 1999). La desensibilización de los nociceptores con capsaicina se ha utilizado para el tratamiento de varias condiciones de dolor crónico (Beydoun et al, 1996). Sin embargo, un inconveniente importante para el uso terapéutico de la capsaicina es el dolor. Olvanil ((Nvanillyl)~9- oSeamida) es un análogo de la capsaicina no- pungente, que carece de Sos efectos secundarios de irritación aguda de la capsaicina (Brand et al, 1987; Dray et al, 1990). Olvanil ha mostrado buenos resultados en la desensibilización de los nociceptores, con efectos no solo sobre el dolor térmico sino también sobre el dolor por estímulos mecánicos y químicos (Sietsema etal, 1988; Dray etal, 1990; Dray y Dickenson, 1991), Aunque la desensibilización de los nociceptores por olvanil es mediada a través de la activación de TRPV1 , Sos mecanismos celulares y de señalización que subyacen a esta acción siguen sin estar claros. Olvanil representa una nueva clase de agentes terapéuticos por vía oral (Brand et al, 1987; Sietsema et al, 1988: Dray et al, 1990).

La entrada de calcio a través de los canales de Ca ² activados por voltaje (VACCs) esta críticamente involucrada en la liberación de neurotransmisores y la transmisión sináptica (jun etal, 1999; Kim et al, 2,001). Se ha demostrado que la capsaicina inhibe los canales de calcio activados por alto voltaje (HVACCs) (Hagenacker et al, 2005; Wu et al, 2005), y este efecto es mediado por la fosfatasa Ca ²⁺ dependiente de serina/treonina y caicineurina (proteína fosfatasa 2B) (Wu etal, 2005). Aunque tanto la capsaicina y olvanil aumentan el Ca ^2÷ intracelular, sus mecanismos celulares son diferentes. En ganglio trigerminal neural de la rata, !a capsaicina induce una corriente interna rápida, mientras que olvanil produce una señal retardada y sostenida (Liu et ai, 1997). Como resultado, la capsaicina y oSvanil pueden actuar sobre diferentes subtipos de TRPV1 (Liu et a!, 1997) y pueden activar diferentes vías de fransducción de señales. Sin embargo hasta el momento poco o nada se habla reportado respecto a un posible efecto anís-obesidad que o!vanil pudiera tener, como el ya conocido para la capsaicina. En la presente invención se ha encontrado que el olvanil es un análogo no pungente de la capsaicina, que constituye una opción efectiva para el control metabólico de la obesidad y algunas complicaciones relacionadas. Por lo que un objeto de la invención consiste en el uso de olvanil, conocido también como N-vanilliloleamida para la preparación de composiciones útiles en el tratamiento trastornos alimentarios como son la obesidad y sobrepeso.

Una modalidad de la invención consiste en el uso de la N-vanilliloleamida, particularmente de la N-Vanilli!-9-oleamida, N-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)oleamide, o, N-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methyl]-9Z-octadecenamíde, para la preparación de composiciones complementarias a la alimentación, es decir como suplemento alimenticio, y que puede presentarse en la forma de una pastilla, una cápsula, una tableta, una emulsión o un jarabe.

Otra modalidad de la invención consiste en el uso de la N-vanilliloleamida para la preparación de composiciones farmacéuticas en la forma de un medicamento para ser administrado vía tópica en la forma de presentación de una crema, de un ge!, de una loción, de una pomada, de un spray o parches transdérmicos.

Otra modalidad de la invención consiste en el uso de la N-vanilliloleamida para la preparación de composiciones farmacéuticas en la forma de un medicamento para ser administrado vía oral, en la forma de presentación de una pastilla, de una cápsula, de una tableta, de una emulsión, o de un jarabe. Otra modalidad de la invención consiste en el uso de la N-vanilfiloleamida para la preparación de composiciones farmacéuticas en la forma de un medicamento para administración inyectable.

El novedoso uso de olvanil para tratar la obesidad se demuestra mediante las actividades que se describen a continuación.

La síntesis de los derivados de capsaicinoides se realizó en medio orgánico empleando la lipasa comercial Novozyme 435 (CALB) según lo reportado por Reyes-Duarte et al, 2002 y Castillo et a!, 2007. Las reacciones se llevaron a cabo empleando como sustratos la vainillilamina (VAM) y el ácido oleico (G18:1) para la obtención del olvanil. Después de 72 horas de reacción, se extrajo el producto y se realizó un análisis de Sos productos de reacción. Posteriormente, se llevó a cabo la purificación de la amida vainillínica sintetizada empleando la técnica de cromatografía flash. Para esto, se propuso emplear una fase móvil compuesta por cloroformo:metanol (90:10). Finalmente el compuesto purificado se recuperó y se secó. Se obtuvo un compuesto no pungente, con apariencia polvorosa blanquecina, que de acuerdo al análisis de CCF realizado, se presume por lo menos un 95% de pureza de los compuestos sintetizados.

Para verificar el efecto lipolítico se utilizaron los compuestos olvanil y capsaicina disueltos en dimetil sulfóxido (DIVISO). Para demostrar el efecto se probaron cultivos de adipocítos estimulados al día nueve de diferenciación a las concentraciones de 50, 100 y 200 μΜ de cada molécula con un tiempo de exposición de 48 h (Hsu y Yen, 2007), Todos los tratamientos se hicieron por triplicado, incluyendo una muestra sin ningún tratamiento como control negativo y una muestra con DMSO al 2 % para descartar posible interferencia con los resultados obtenidos. Se determinó el contenido de lípidos totales mediante la tinción de Rojo Oleoso. La diferenciación celular se realizó en placas de doce pocilios. Una vez pasadas las 48 h de exposición a las moléculas, las células se fijaron con solución de paraformaldehfdo al 4 % durante 15 min a temperatura ambiente y se lavaron con isopropanol al 80 %. Posteriormente, se les adicionó solución de Rojo Oleoso (SIGMA No de Cat. 09755; 5 mg/mL de isopropanol) por 20 min. Por último, la placa se lavó dos veces con PBS, la extracción del colorante rojo se realizó con isopropanol al 60 % (600 μί. por pocilio) y se midió espectrofotométricamente a una longitud de onda de 520 nm. El contenido de lípidos totales se expresa por medio del cociente de la absorbancia de la muestra sobre el blanco multiplicado por cien, para obtener el porcentaje de lípidos presentes en cada muestra. Una vez que los adipocitos fueron estimulados por 48 h, los cultivos fueron fijados y teñidos con una solución saturada de rojo oleoso, el cual se une específicamente a triglicéridos. Se determinó el porcentaje de lípidos totales presentes en las células de cada tratamiento. Se evidenció que existe una disminución en eí porcentaje de colorante cuantificado (Figura 2), y por tanto, en la acumulación de lípidos totales en el citoplasma de los adipocitos con 100 y 200 μΜ de los tres compuestos, sin embargo se observa una mayor disminución de lípidos en las células tratadas con capsaicina, la cual es dependiente de la concentración.

EJEMPLO 1

Cyantifjcación del contenido de Triglicéridos intraceSular

Para esta determinación se utilizó el kit cuantificación de triglicéridos ABCAM® (No. de Cat. ab85338), en el cual los triglicéridos son convertidos en ácidos grasos y giícerol al momento de adicionar la enzima Sipasa. El glicerol producido es oxidado y reacciona con un reactivo que genera color, dicha reacción se cuantificó a 570 nm en el espectrofotómetro. La Figura 3, muestra el efecto de los compuestos, en la disminución del contenido de triglicéridos intracelular acumulados en los adipocitos. Los resultados demuestran que la disminución ocurre en una manera dependiente de dosis cuando las células son expuestas a las moléculas a las concentraciones de 0-200 μΜ. Nuevamente, el mayor efecto se observa en el tratamiento con capsaicina, disminuyendo el contenido de triglicéridos hasta en un 50 % con respecto ai grupo control, ya que el promedio del contenido de triglicéridos en las células sin tratamiento (control) fue de 4,20 nmol, mientras que el del tratamiento con capsaicina a 200 μΜ fue de 2.12 nmol de triglicéridos. El tratamiento con olvanil, mostró una diferencia estadísticamente significativa con respecto al grupo control, lo que significa que ambas moléculas disminuyen, aunque en menor grado, la cantidad de triglicéridos acumulados en los adipocitos.

EJEMPLO 2

Cuantificación del contenido de Giicerol libre, Para este ensayo se utilizó el sobrenadante de cada pocilio para cuaníificar el giicerol que las células liberaron al medio. Para este ensayo, se utilizó el kit de cuantificación de giicerol ABCAM® (No. de Cat. Ab65337), en el cual el giicerol es enzimáticamente oxidado para reaccionar con un reactivo que genera color, la reacción se cuantificó a 570 nm en el espectrofotómetro. Se examinó el efecto lipolítico de olvanil y capsaicina midiendo la liberación de giicerol en el medio. Para este experimento, se colectó el sobrenadante de cada pozo de la placa y se hicieron diluciones 1 :10 de cada muestra con agua destilada. La cantidad de giicerol en el medio incrementó de manera dependiente de dosis, a mayor concentración del compuesto, mayor giicerol liberado al medio (Figura 4), Los dos compuestos tuvieron un efecto significativo a una concentración de 200 \iU con respecto al grupo control. El tratamiento con capsaicina incrementó el contenido de giicerol en el medio casi el doble con respecto al grupo control; en cuanto olvanil mostró un efecto menor con respecto a la capsaicina.

EJEMPLO 3

Efecto sobre la adipogénesis en células 3T3-L1 Para evaluar este efecto se utilizól a Sínea celular de preadipocitos murinos 3T3-L1. Los grupos de estudio fueron capsaicina y olvanil a dosis de 100, 125 y 150 μΜ para capsaicina y de 25, 50 y 75 μΜ para olvanil. Las células fueron inducidas a diferenciación de acuerdo a io descrito por Tang y Lañe (2012) y expuestas a !as diferentes concentraciones de las moléculas desde el día 0 ai día 9 de diferenciación. Se cuantsficó la cantidad de íípidos totales mediante la tinción con rojo oieoso y triglicéridos i ntracel ufares mediante el kít cuantificación de triglicéridos ABCAM® (No. de Caí. ab65336). Así mismo, se anaüzó el patrón de expresión del factor de transcripción PPARy y factor PREF-1 mediante RT-PCR.

En cuanto a la cuantificación de Iípidos intracelulares por la tinción con rojo oleoso, el contenido de Iípidos totales intracelulares disminuyó en una manera dependiente de dosis en 53.6 y 80 % en presencia de 50 y 75 μΜ de olvanil, respectivamente, encontrando un efecto mayor al de la capsaicina que disminuyó un 16.3 % a una concentración de 150 μΜ.

La acumulación de triglicéridos también disminuyó significativamente de 707.9 (control) a 483.53 nmol/mg de proteína con 150 μΜ de capsaicina, Olvanil tuvo un mayor efecto disminuyendo los triglicéridos 258.57 y 197.53 nmol/mg de proteína con 50 y 75 μΜ, respectivamente. Estos resultados concuerdan con los datos obtenidos en la cuantificación de Iípidos totales.

EJEMPLO 4

Expresión del factor de transcripción PPARY y factor PREF-1 Los niveles de mRNA de PPARYno fueron modificados por capsaicina a ninguna de las concentraciones evaluadas. Caso contrario olvanil disminuyó los niveles de expresión a las tres concentraciones evaluadas, con un efecto mayor a la concentración de 50 μΜ, ya que disminuyo 2.67 veces los niveles de mRNA de PPARYcorroborando con ello que la disminución del número de adipocitos diferenciados y la cantidad de Iípidos acumulados es consecuencia de una disminución de la expresión de PPARy, gen maestro regulador del metabolismo iipfdico, necesario para la síntesis y almacenamiento de lípidos (Medina et ai, 2007).

Para corroborar la hipótesis de una inhibición o disminución de la diferenciación, se cuantificó la expresión del marcador de preadipocitos PREF-1 (Factor de preadipocitos 1). Como se observó en la gráfica, únicamente el tratamiento con 50 uM de olvanil aumentaron los niveles de mRNA de PREF-1 , por lo que se infiere que dicha molécula inhibe la diferenciación de pre-adipocitos a adipocitos, ya que según lo reportado por Wang (2006), una alta expresión de PREF-1 inhibe el proceso de adipogénesis.

EJEMPLO 5 Disminución de la glucosa, el colesterol total, grasa abdominal y LDL en un rrsodell© ín-vivo de obesidad.

En este estudio se emplearon ratones machos de la cepa C57BL/6 de 4-5 semanas de edad al inicio del estudio (NN15). Después de dos semanas de aclimatación en bioterio (cuarentena), los animales fueron distribuidos al azar en los grupos experimentales. Se utilizaron dos dietas comerciales: (SD) dieta estándar de Tekland Harlan Cat, 20128S (grupo A, 5) y (HFD) dieta alta en grasa de Tekland Harlan Cat. TD.6414 (grupo B, n=1Q) para la inducción de obesidad.

Tras 10 semanas, los animales del grupo B con inducción de obesidad fueron nuevamente aleatorizados en 2 subgrupos de B (n~5 cada uno), de ios cuales el subgrupo B2 recibió el tratamiento con olvanil (25 mg/kg/dia) durante un periodo de 3 semanas. Al sacrificio se tomaron muestras de sangre y tejido adiposo para evaluar los parámetros de obesidad y dislipidemia,

Al término del periodo de inducción de obesidad por dieta (10 semanas), se contó con un total de 10 ratones con dieta alfa en grasas con un peso promedio de 27 g (27.3± 3.1) y una ganancia de significativa p<0.05 de peso 10 g. Mientras que eí grupo de animales con dieta estándar alcanzó un peso promedio de 25 g (25,3 ±1.3) y únicamente una ganancia de 2.2 g. Se realizaron mediciones de glucosa y colesterol (dispositivos Accu-Check y AccuTrend respectivamente). Se encontró un incremento significativo p <0.05 tanto de glucosa como de colesterol para el grupo de animales con HFD sin tratamiento (símbolo "**" respecto al sano). Mientras que en el grupo de tratamiento, se encontró una disminución significativa p≤0.05 tanto de la glucosa como del colesteroi total mediado por Oivanil (Figura 9).

Una yez anestesiados los animales se realizó la disección de la cavidad torácica para exponer el corazón y realizar la punción cardíaca. La muestra de sangre se colocó en tubo rojo para ser centrifugada y obtener suero, el cual se alicuotó y almacenó a - 20°C. Finalmente se realizó la remoción de la grasa y su pesaje. Se encontró un incremento significativo p<0.05 de grasa acumulada para el grupo de animales con HFD sin tratamiento (símbolo "*" respecto al sano), mientras que en eí grupo de tratamiento no se encontró una disminución significativa de la grasa acumulada mediada por Oivanil, sin embargo se observa una disminución con respecto al grupo con HFD (Figura 10).

Perfil de Hipidos

Se realizaron mediciones de trigHcéridos, colesterol total, HDL, LDL y VLDL dei suero obtenido. Se encontró un incremento significativo (p≤0.05) en el perfil de lípidos para eí grupo de animales HFD sin tratamiento (símbolo "*" respecto al sano). No se encontró una disminución significativa de la concentración de colesterol y trigHcéridos circulantes (Figura 11 A, 11 B), HDL (Figura 11C) y VLDL (Figura 11 E) en el grupo tratado con Oivanil con respecto al grupo de animales con HFD. Únicamente se encontró una disminución significativa (p<0.05) del LDL para eí grupo tratado con Oivanil (Figura 11 D).