L'invention concerne des nouveaux composés utiles pour lier de façon covalente des amino-acides à des supports solides et les procédés de préparation de ces nouveaux composés. Elle concerne également le procédé de couplage de ces composés sur les supports solides. La synthèse des peptides en phase solide est une méthode d'obtention de peptides connue depuis 1963. L'étape critique de cette synthèse est le lien covalent ou "ancrage" du premier amino-acide, au moyen de la fonction acide, sur le support solide. Plusieurs méthodes ont été proposées. Une de celles-ci consiste à lier la fonction acide de l'amino-acide au support solide tel qu'une hydroxyméthylphénoxyrésine appelée aussi résine Wang, en transformant celle-ci en ester benzylique. Cette méthode cependant ne donne pas satisfaction. Les différents réactifs de couplage utilisés entraînent une racémisation partielle de l'amino-acide. De plus le taux de racémisation dépend des amino-acides et est difficile à contrôler. II existait donc un besoin pour de nouveaux moyens qui permettent de façon économique et générale l'ancrage d'un amino-acide sur un support solide, sans racémisation et qui en conséquence facilitent la préparation des peptides. L'objet de l'invention concerne un composé de formule (I)

(R3)n / R4

O— C- C-OH

dans laquelle P représente le groupe protecteur de la fonction aminé de l'amino-acide choisi dans le groupe constitué par le 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc), le 2-(4-nitrophénylsulfonyl)éthoxycarbonyle (Nsc) et l'allyloxycarbonyle (Alloc), A est le reste d'un amino-acide, en particulier D ou L, possédant des chaînes latérales protégées ou non, R1 et R2, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par l'atome d'hydrogène, les groupes alkyles et les groupes aryles, le ou les substituants R3, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par l'atome d'hydrogène, les groupes alkyles et les groupes alkyloxy, n est un nombre entier de 1 à 4, m est un nombre entier de 2 à 5, R4 et R5, identiques ou différents et pouvant varier d'un atome de carbone à l'autre, sont choisis dans le groupe constitué par l'atome d'hydrogène, les groupes alkyles et les groupes aryles. De préférence, le groupe protecteur P est le groupe 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc) et les radicaux R1 à R5 sont des atomes d'hydrogène. L'invention concerne également le procédé de préparation du composé de formule (I) précédemment décrit. Selon ce procédé, on fait réagir le composé de formule (I I) RI (R3)n I R4\

HO-C-

R2 \ l v~ /m dans laquelle R1 et R2, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par l'atome d'hydrogène, les groupes alkyles et les groupes aryles, le ou les substituants R3, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par l'atome d'hydrogène, les groupes alkyles et les groupes alkyloxy, n est un nombre entier de 1 à 4, m est un nombre entier de 2 à 5, R4 et R5, identiques ou différents et pouvant varier d'un atome de carbone à l'autre, sont choisis dans le groupe constitué par l'atome d'hydrogène, les groupes alkyles et les groupes aryles, R6 est le groupe trichloroéthyle ou phénacyle, avec un amino-acice de formule P-A-OH dans laquelle P représente le groupe protecteur de la fonction aminé de l'amino-acide choisi dans le groupe constitué par le 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc), le 2-(4- nitrophénylsulfonyl)éthoxycarbonyle (Nsc) et l'allyloxycarbonyle (Alloc), A est le reste d'un amino-acide possédant des chaînes latérales protégées ou non, au moyen d'un réactif de couplage choisi dans le groupe constitué par le N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), le N.N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) et le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC), et en présence de diméthylaminopyridine (DMAP) pour obtenir le composé de formule (III) Ri (R3)n / R4\

P-A-O-C — < ( J )-O- C- C — O— R6 II R2 5/m ° dans laquelle P, A, R1 à R6 ont les significations indiquées précédemment, puis on fait réagir le composé de formule (III) avec du zinc en présence d'acide acétique pour obtenir le composé de formule (I). Le composé de formule (I) est isolé en le faisant précipiter dans un mélange d'éther-oxyde aliphatique, d'eau et d'acide acétique. Le rapport de ces trois solvants dépend de la nature du reste de l'amino -acide, A. L'éther-oxyde est de préférence Ie diisopropyléther. Le procédé selon l'invetion est un procédé simple. Il permet d'obtenir les nouveaux composés de formule (I) à l'échelle industrielle, avec un excellent rendement et une très grande pureté aussi bien chimique qu'optique. Le composé de formule (I) peut ensuite être facilement lié à un support solide fonctionnalisé et la synthèse de peptides en phase solide pourra être réalisée à partir de ce support modifié. En raison de la très grande pureté des composés de formule (I), les peptides pourront être formés sans que la pureté du reste du premier amino-acide soit un problème comme dans l'art antérieur. L'invention concerne aussi les composés de formule (II) Ri (R3)n / R4\

O-- C C — O — R6

- O dans laquelle R1 et R2, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par l'atome d'hydrogène, les groupes alkyles et les groupes aryles, le ou les substituants R3, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par l'atome d'hydrogène, les groupes alkyles et les groupes alkyloxy, n est un nombre entier de 1 à 4, m est un nombre entier de 2 à 5, R4 et R5, identiques ou différents et pouvant varier d'un atome de carbone à l'autre, sont choisis dans le groupe constitué par l'atome d'hydrogène, les groupes alkyles et les groupes aryles, R6 est le groupe trichloroéthyle ou phénacyle. Ils sont nouveaux et utiles comme composés de départ. Les groupes R1 à R5 sont de préférence des atomes d'hydrogène. R6 représente de préférence le groupe phénacyle. Ils peuvent notamment être préparés à partir de composés de formule

CO9H,

m

dans laquelle R1 à R5 ont les significations indiquées précédemment, et en particulier lorsque ces radicaux sont des atomes d'hydrogène à partir de l'acide 3-(4'-hydroxyméthylphénoxy)-propionique, composé obtenu comme indiqué dans l'article de F. Abericio and G. Barany, Int. J. Peptide Protein Res. 26, 1985, 92-97, par exemple par réacti on avec un halogénure de formule R6X, X représentant un atome d'halogène. Grâce aux composés de formule (II), on peut obtenir de façon beaucoup plus simple les dérivés des d ifférents amino-acides de formule (III) qui sont de plus ainsi beaucoup plus facilement purifiables. Les amino-acides de formule P-A-OH que l'on peut faire réagir sur les composés de formule (II) sont tous les amino-acides naturels ou synthétiques connus. Les chaînes latérales peuvent être protégées ou non comme il est connu. Le groupe P protecteur de la fonction aminé de l'amino-acide est de préférence le groupe 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc). Les amino-acides peuvent être sous forme de leurs stéréo- isomères purs, tels que D ou L puisque la stéréochimie est conservée pendant le procédé de préparation. On a trouvé que l'addition des amino-acides protégés de formule P-A-OH pouvait être facilement réalisée grâce à un réactif de couplage, tel que le DCC, le DIC et de préférence le chlorhydrate de 1 -(3- diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC) en association avec la diméthylaminopyridine (DMAP). La réaction a lieu généralement dans un milieu solvant. Comme solvants, on peut citer en particulier le diméthylformamide et le dichlorométhane. La température de couplage est généralement de 0° à 40C. Le composé de formule (III) est récupéré selon des méthodes connues, généralement par précipitation. Les rendements bruts sont élevés, souvent supérieurs ou égaux à 90 %. Les composés de formule (III) obtenus comme précédemment indiqués sont des composés intermédiaires nouveaux et constituent un autre objet de la présente invention. Ils donnent accès à des composés de formule (I) très purs. Pour obtenir le composé de formule (I), le clivage de la fonction ester du composé de formule (III) est réalisé au moyen du zinc dans une solution aqueuse d'acide acétique. La réaction est très exothermique et l'ajout de zinc est effectué de préférence progressivement. Le composé de formule (I) est de préférence récupéré de la manière suivante. Après avoir éliminé les sels de zinc du milieu à base de la solution aqueuse d'acide acétique, celui-ci est mélangé à un mélange d'éther-oxyde aliphatique, en particulier de diisopropyléther, et d'eau pour faire précipiter le composé de formule (I). Le volume du mélange éther- oxyde-eau est de préférence égal ou supérieur à 10 fois le volume du milieu auquel il est mélangé. Le rapport de l'éther-oxyde à l'eau dans le mélange éther-eau est compris entre 1/2 et 1/5 en volume ou égal à ces valeurs. Le mélange peut éventuellement contenir deux ou plusieurs éthers-oxydes différents. On obtient le composé de formule (I) avec une pureté, déterminée par HPLC, très élevée généralement supérieure ou égale à 95 %. Les composés de formule (I) peuvent ensuite être directement condensés avec un support solide fonctionnalisé, en présence d'un réactif de couplage pour former un support solide modifié de formule (IV) R1 (R3)n

P-A — O— C — \Cj)— °-Γ~ ' C-Y-F-S

R2 \ ^ /m O <IV> dans laquelle S représente le support solide, F est le reste du groupe fonctionnel fixé sur le support S et qui était terminé par une fonction réactive avec la fonction acide du composé de formule (I), telle qu'une fonction aminé ou hydroxyle, Y est un atome d'oxygène ou le groupe -NH-, éventuellement substitué, P représente le groupe protecteur de la fonction aminé de l'amino-acide choisi dans le groupe constitué par le 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc), le 2-(4-nitrophénylsulfonyl)éthoxycarbonyle (Nsc) et l'allyloxycarbonyle (Alloc), A est le reste d'un amino-acide, en particulier D ou L, possédant des chaînes latérales protégées ou non, R1 et R2, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par l'atome d'hydrogène, les groupes alkyles et les groupes aryles, le ou les substituants R3, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par l'atome d'hydrogène, les groupes alkyles et les groupes alkyloxy, n est un nombre entier de 1 à 4, m est un nombre entier de 2 à 5, R4 et R5, identiques ou différents et pouvant varier d'un atome de carbone à l'autre, sont choisis dans le groupe constitué par l'atome d'hydrogène, les groupes alkyles et les groupes aryles. Les supports solides fonctionnalisés de formule S-F-Y-H dans laquelle S, F et Y ont les significations précédemment indiquées sont les supports que l'on utilise habituellement dans la synthèse peptidique et que l'on trouve dans le commerce. On peut notamment citer les aminométhyl- (co)polystyrènerésines, les 4-méthylbenzhydrylamine(co)polystyrènerésines (résines MBHA). Les composés de formule (I) se fixent facilement sur ces supports fonctionnalisés en présence de réactifs de couplage, sans racémisation du reste de l'amino-acide, pour former les composés de formule (IV). Les réactifs de couplage sont les réactifs utilisés habituellement. Ces composés de formule (IV), supports modifiés possédant un premier amino-acide chimiquement et optiquement très pur sont très utiles pour former des peptides ou allonger la chaîne peptidique. Les peptides sont préparés soit par synthèse manuelle ou par synthèse automatique, comme il est connu. A la fin de la synthèse des peptides, on enlève généralement simultanément les groupes protecteurs et le support par traitement avec un acide tel que l'acide trifluoroacétique en présence de pièges de carbocations. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Exemple 1 : Préparation de l'ester phéπylacétyle de l'acide 3-(4'-Fmoc-L-Val- oxyméthylphénoxy)propionique (abréviation Fmoc-L-Val-MPP-QPac), composé de formule III (m=2)

O

\\ /r°

R = (CHs)2-CH- Fmoc-L-Val-MPP-OPac

Dans un ballon de 2 I équipé et agité, 100 g (318,12 mmol, 1 éq.) de l'ester phénylacétyle de l'acide 3-(4'-hydroxyméthylphénoxy)propionique obtenu comme à l'exemple 26, 105,8 g (311,75 mmol, 0,98 éq.) de N-9-fluorénylméthyloxycarbonyl-L-valine et 1 ,4 g (11 ,45 mmol, 0,036 éq.) de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) sont mélangés dans 800 ml de dichlorométhane. Le mélange est refroidi à 0°-4°C par un bain de glace et 64,13 g (334,02 mol) de chlorohydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3- éthylacarbodiimide (EDC) sont introduits progressivement. L'agitation du mélange est poursuivi pendant 24 h à la température ambiante. On concentre le milieu en dichlorométhane. Le mélange résiduel est dissous dans du diméthylformamide (300 ml) puis on fait précipiter le produit dans 3 I d'une solution saturée de bicarbonate de sodium (NaHCO3). On le filtre. On le lave plusieurs fois à l'eau et on répète l'opération. On obtient ainsi 197,3 g du produit attendu (rendement 97,48 %) contenant 5 % de l'isomère D dont les caractéristiques sont les suivantes : pureté par HPLC :79,5 % poids moléculaire : théorique : 635,71 , trouvé par spectrographie de masse (+ NH3) : 653,3 Exemple 2 : Préparation de l'acide 3-(4'-Fmoc-L-Val-oxyméthylphénoxy)- propioπiαue (abréviation Fmoc-L-Val-MPP-OH). composé de formule (I) (m=2) On dissout 197,3 g (310,35 mmol, 1 éq.) de Fmoc-L-Vai-MPP- OPac obtenu précédemment dans une solution de 952,6 ml d'acide acétique et de 161 ,5 ml d'eau puis on ajoute petit à petit 95,37 g (1458,64 mmol) de zinc en poudre. Au bout de 5 h, on élimine les sels de zinc par filtration et on les lave avec du dichlorométhane. On concentre le milieu restant pour éliminer uniquement le dichlorométhane. On fait précipiter le produit en mélangeant le milieu avec 10 1 d'un mélange de diisopropyléther/H2O (1/3, v/v) et on laisse le milieu sous agitation pendant 3 h. On filtre le précipité et on le lave à l'eau. On recueille 123 g (rendement 72,7 %) du dérivé de l'acide propionique attendu dont les caractéristiques sont les suivantes : pouvoir rotatoire : [α]D20 = -18° (C = 1 , DMF) pureté déterminée par HPLC : 97,04 % (s/s) taux d'isomère D : 0,2 %

Exemples 3 à 12 : Préparation de différents composés de formule (III) (m=2) En opérant comme à l'exemple 1 , on prépare les dérivés de différents amino-acides. Les résultats sont rassemblés dans le tableau suivant : Ex Dérivés Fmoc-L-A-MPP-Opac, Poids moléculaire Pureté à partir de l'amino-acide sous Théorique Trouvé par (par forme L suivant : SM (+NH3) HPLC) 3 GIy 593,6 611,1 94,5 4 AIa 607,7 625,1 84,7 5 Leu 649,7 667,2 - 6 Ile 649,7 667,2 75,1 7 Phe 683,8 701,2 - 8 Met 667,8 685,2 73,6 g Asp (OtBu) 707,8 725,2 91 ,1 10 Ser (tBu) 679,8 697,2 97,4 11 Tyr (tBu) 755,9 773,2 78,1 12 D-Lys (Boc)* 764,9 782,2 82,7 * Le dérivé D a été obtenu à partir du composé de départ correspondant sous forme D SM : spectrométrie de masse

Exemples 13 à 24 : Préparation de différents composés de formule (I) (m=2) En opérant de la même façon qu'à l'exemple 1 puis à l'exemple 2, on prépare différents dérivés d'amino-acides et d'acide propionique de formule (I) O

-O' ^ OH w // Fmoc-A— O Fmoc-A-MPP-OH Les résultats sont rassemblés dans le tableau suivant «« Ex Dérivés Fmoc-L-A-MPP-OH, à Rendement % Poids moléculaire Pureté Pouvoir rotatoire [α]D partir de l'amino-acide sous Théorique Trouvé (par HPLC) (C=1 ,8, DMF) forme L suivant : par SM/ES+ 13 GIy 74,7 475,6 476,1 97,1 - 14 AIa 85,3 489,4 507,2 99,6 - 14,8 15 Leu 76,9 531,7 532,5 97,1 - 14,8 16 Ile 58,4 531,8 532,5 96,7 - 13,6 (si 17 Phe 82,6 565,8 567 95,6 - 18,6 18 Met 95,2 549,4 550,1 98,1 - 20,5 19 Asp (OtBu) 72,9 589,8 590,4 95,6 - 8,4 20 Glu (OtBu) 62,9 603,8 604,7 96,6 - 12,8 21 Ser (tBu) - 560,7 562,1 99 - 14,7 22 Thr (tBu) 91 575,6 576,9 97 + 6,9 23 Tyr (tBu) 72,8 637,9 638,3 95,1 - 13,7 24 D-Lys (Boc)* 59,6 646,7 647,6 96,6 + 9,8 ES+ : "électrospray" * Le dérivé Fmoc-D-A-MPP-OH a été obtenu à partir du composé de départ sous forme D. Les abréviations utilisées pour les groupes protecteurs des chaînes latérales sont les suivantes : Boc : t-butyloxycarbonyle t-Bu : t-butyle

Exemple 25 : Couplage de Fmoc-L-Val-MPP-QH sur la résine MBHA La résine MBHA (1 éq.) vendue par la Société SENN Chemicals est mise en suspension dans un mélange de dichorométhane et de diméthylformamide. Le composé de l'exemple 2, Fmoc-L-Val-MPP-OH (1,3 éq.), du 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) (1 éq.) et du N1N'- diisopropylcarbodiimide (1 ,3 éq.) sont ajoutés dans la suspension. Le mélange est agité jusqu'à ce que le test à la ninhydrine soit négatif. On filtre et on lave la résine modifiée avec du dichlorométhane et du diméthylformamide. On constate qu'il n'y a pas eu de racémisation de l'amino-acide.

Exemple 26 : préparation du dérivé de formule (II) suivant (HO-MPP-Opac) fm=2)

1 ,09 kg d'acide 3-(4'-hydroxyméthylphénoxy)-propionique (HO- MPP-OH) (5,5 mol, 1 éq.) et 1 ,09 kg (5,5 mol, 1 éq.) de 2-bromo- acétophénone sont mis en suspension dans 10,9 1 d'acétone. 3,27 1 de diisopropyléthylamine (19,2 mol, 3,5 éq.) sont ensuite introduits lentement dans la suspension. Le mélange réactionnel est agité à la température ambiante pendant 20 h. 10 I de cyclohexane et 2,2 I d'éther de méthyle et de t-butyle (MTBE) sont ensuite ajoutés dans Ie mélange puis 33 I d'eau et 17 I d'une solution de KHSO4 (1M). Le mélange est agité à 1O0C pendant 1 h. le solide obtenu est filtré et lavé deux fois avec du cyclohexane et quatre fois avec de l'eau. Après séchage, on obtient 1 ,57 kg du dérivé attendu HO-MPP-OPac (rendement 90 %) dont les caractéristiques sont les suivantes : pureté par HPLC > 99 % point de fusion : 61-640C poids moléculaire : théorique : 314,3, trouvé par spectrographie de masse (+ NH3) : 332,1

Exemple 27 : Préparation de l'acide 6-(4'-formylphénoxy)hexanoïque

H v — y Ô 0,7 g de Kl (0,004 mol, 0,05 éq.) et 10,4 g de 4-hydroxybenzaldéhyde (0,085 mol, 1 éq.) sont mis en suspension dans une solution de Na2CO3 aqueux. Une solution d'acide 6-bromohexanoïque 50 g (0,256 mol, 3 éq.) dans une solution Na2CO3 aqueux est introduite. Le mélange réactionnel est agité à 400C pendant trois jours. Le produit est isolé par l'extraction d'acétate d'éthyle puis précipité dans le dichloroéthane/diisopropyléther. On obtient 8 g de solide (rendement 39,6 %).

Exemple 28 : Préparation de l'acide 6-(4'- hvdroxyméthylphénoxy)hexanoïαue (HO-MPH-OH)

MU \\ /r° 8 g de l'acide 6-(4'-formylphénoxy)hexanoïque (0,034 mol, 1 éq.) sont mis en suspension dans une solution de la soude aqueuse. 1 ,34 g de NaBH4 solide (0,036 mol, 1 ,05 éq.) sont introduits par portions et le mélange est agité à température ambiante pendant 2 h. Le produit est isolé par précipitation dans l'eau acide. On obtient 7 g de solide (rendement 86 %).

Exemple 29 : Préparation du dérivé de formule II avec m=5 suivant (HO- MPH-OPac) O .O.

7 g de l'acide 6-(4'-hydroxyméthylphénoxy)hexanoïque (0,029 mol, 1 éq.) et 5,73 g de 2-bromoacétophénone (0,0288 mol, 0,98 éq.) sont mis en suspension dans 70 ml d'acétone. 17,7 ml de diisopropyléthylamine (0,103 mol, 3,5 éq.) sont introduits lentement dans la suspension. Le mélange est agité à température ambiante pendant 1 h. Le mélange est filtré et concentré. Le produit est précipité dans un mélange d'eau, cyclohexane et éther de méthyle et t-butyle (MTBE). On obtient 9,4 g de solide (rendement 89,8 %).

Exemple 30 : Préparation de l'acide 6-(4'-Fmoc-amino-acide- oxyméthylphénoxy)hexanoïαue (abréviation Fmoc-A-MPH-OH). composé de formule I avec m=5

fmoc— A— O En opérant de la même façon qu'à l'exemple 1 puis à l'exemple 2, on prépare différents dérivés d'amino-acides et d'acide hexanoïque de formule I avec m=5 Les résultats sont rassemblés dans le tableau suivant

Dérivé Fmoc-(L)-A-MPH à Rendement Poids moléculaires Pureté Taux partir de Fmoc amino- % Théorique Trouvé (par d'isomère acide sous forme L par HPLC) D suivant : SM/ES+ a Val 34,3 559,7 560,3 96,2 % <0,3 % b Lys(Boc) 63,5 688,8 689,1 96,9 % <0,3 %