La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique ou cosmétique contenant, en tant qu'agent actif, au moins un composé aminothiolester de formule (t), dans un excipient physiologiquement acceptable.

Par le terme"apoptose", on entend le phénomène de mort cellulaire tel que décrit entre autres par KERR J. F. R. et al., J. Cancer, 265,239 (1972). L'apoptose qui est une forme hautement sélective de suicide cellulaire, se caractérise par des phénomènes morphologiques et biochimiques aisément observables. Ainsi, on observe une condensation de la chromatine associée ou non à une activité endonucléasique, la formation de corps apoptotiques et une fragmentation de l'acide désoxyribonucléique (ADN) du fait de l'activation d'endonucléases, en fragments d'ADN de 180-200 paires de base donnant un profil facilement reconnaissable par électrophorèse sur gel d'agarose.

L'apoptose est impliquée dans le développement, la différentiation et le renouvellement tissulaire.

L'induction d'apoptose présente donc un grand intérêt d'un point de vue thérapeutique, mais également d'un point de vue cosmétique.

Une très grande variété de médicaments anticancéreux naturels ou synthétiques actuellement disponibles sont des composés inducteurs d'apoptose.

Parmi ces médicaments antinéoplasiques, on peut citer les agents alkylants tels que la cyclophosphamide, les nitrosourées tels que le 1,3-bis (2-chloroéthyl)-l-nitrosourée (BCNU), les agents intercalants tels que l'actinomycine D ou l'adriamycine, les analogues de bases puriques ou pyrimidiques tels que la 6-thioguanine et la 5-fluorouracile, les inhibiteurs de la synthèse de novo des

bases puriques tels que le méthotrexate et enfin les inhibiteurs de la polymérisation de la tubuline tels que le TaxolO.

Par ailleurs, il a déjà été proposé par la demanderesse, notamment dans la demande de brevet W096/20701, d'utiliser un composé inducteur d'apoptose choisi parmi le méthional, le malonaldéhyde et tout facteur permettant d'augmenter le taux intracellulaire de ces composés, c'est-à-dire ayant une action sur le métabolisme du méthional représenté pour mémoire à la Figure 1 (QUASH et al., Biochem. J. 305,1017 (1995)).

Il a également été décrit dans cette même demande de brevet, à titre de facteur augmentant le taux intracellulaire du méthional, des inhibiteurs de l'acide 4-méthylthio 2-oxobutanoique (MTOB) transaminase, composés d'esters de L-méthionine et de pyridoxal. La MTOB transaminase étant une enzyme impliquée dans la conversion de l'acide 4-méthylthio 2- oxobutanoïque en méthionine, l'utilisation de ces composés favorise l'accumulation de MTOB, précurseur direct du méthional (Figure 1) (ROCH et al., Biochem. J. 313,973 (1996)).

Un des principaux inconvénients de l'utilisation de ces substances est l'absence d'une activité apoptotique sélective des cellules tumorales. Ainsi, il reste nécessaire de disposer de molécules qui induisent une apoptose maximale dans le tissu tumoral tout en lésant le moins possible et de façon réversible les tissus sains de l'organisme.

En vue de remédier à cette absence de sélectivité, la demanderesse a décrit dans la demande de brevet WO-98/44919, l'utilisation de dérivés aminothiolesters, dont le thioampal, en tant qu'inhibiteurs de l'enzyme aldéhyde déshydrogénase (ALDH), enzyme impliquée dans la conversion du méthional en acide méthylthiopropionique, favorisant ainsi l'accumulation de riiéthional. Ces composés sont des inhibiteurs sélectifs de la croissance des cellules transformées résistantes à l'apoptose du fait de la surexpression du gène bel2, De tels composés sont donc plus spécifiquement destinés à traiter les pathologies caractérisées par une surexpression du gène bcl2 telles que les cancers du sein, les lymphomes des cellules B, les leucémies, les neuroblastomes, les adénocarcinomes de la prostate, les prolactinomas et autres adénomes pituitaires.

Cependant ces dérivés aminothiolesters sont délicats à préparer. En effet, leurs procédés de préparation présentent un rendement ne dépassant pas 20%. De plus ces composés présentent des problèmes de stabilité et doivent être conservés à des températures d'environ-20°C pour éviter leur dégradation.

Il était donc souhaitable de mettre au point de nouveaux composés qui soient stables et aisés à préparer avec de bons rendements et permettant d'inhiber de façon sélective la croissance des cellules transformées résistantes à l'apoptose du fait de la surexpression du gène bcl2.

C'est l'objet de la présente invention qui concerne de nouveaux composés aminothiolesters qui peuvent être représentés par la formule générale (I) suivante : 0 danslaquelle : -RI représente : -R2 et R3, indépendamment, représentent un radical alkyle ayant de 1 à 7 atomes de carbone, saturé ou insaturé, cyclique, linéaire ou ramifié ou un radical aryle ayant de 1 à 7 atomes de carbone, ou un radical aralkyle ayant de 1 à 12 atomes de carbone ou pris ensemble forment un cycle alkyle saturé ayant de 3 à 7 atomes de carbone, -R4représente un radical alkyle ayant de 1 à 7 atomes de carbone saturé ou insaturé, cyclique, linéaire ou ramifié ou un radical aryle ayant de 1 à 7 atomes de carbone ou un radical aralkyle ayant de 1 à 12 atomes de carbone, -P,., et R6, indépendamment, représentent un radical alkyle ayant de 1 à 7 atomes de carbone saturé ou insaturé, cyclique, linéaire ou ramifié ou un radical aryle ayant de 1 à 7 atomes de carbone, ou un radical aralkyle ayant de 1 à 12 atomes de carbone ou pris ensemble forment avec l'atome d'azote un hétérocycle azoté saturé ou insaturé ayant de 2 à 6 atomes de carbone, éventuellement substitué par un oxygène, un soufre ou par un atome d'azote éventuellement substitué par un radical alkyle ayant de 1 à 7 atomes de carbone saturé ou insaturé, cyclique

linéaire ou ramifié ou un radical aryle ayant de 1 à 7 atomes de carbone ou un radical aralkyle ayant de 1 à 12 atomes de carbone, -R7 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle ayant de 1 à 7 atomes de carbone saturé ou insaturé cyclique, linéaire ou ramifié ou un radical aryle ayant de 1 à 7 atomes de carbone ou un radical aralkyle ayant de 1 à 12 atomes de carbone, et -X représente un ion halogénure, ou un anion nitrate, sulfate, sulfonate, carboxylate, thiocyanate, ou phosphate.

Parmi les radicaux alkyles cycliques ayant de 3 à 7 atomes de carbone, on peut citer notamment les radicaux cyclopropyle, cyclopentyle, cyclohexyle ou cycloheptyle.

Parmi les radicaux alkyles saturés linéaires ayant de 1 à 7 atomes de carbone, on peut citer notamment les radicaux méthyle ; éthyle, n-propyle, n-butyle, n-pentyle, n-hexyle ou n- heptyle.

Parmi les radicaux alkyles saturés et ramifiés ayant de 1 à 7 atomes de carbone, on peut citer notamment les radicaux i-propyle, t-butyle, 2-butyle, 2-pentyle, i-pentyle, 2-hexyle, 3-hexyle, 2-heptyle, 3-heptyle ou i-heptyle.

Parmi les radicaux alkyles insaturés ayant de 1 à 7 atomes de carbone, on peut citer notamment le radical allyle ou vinyle.

Par radical aralkyle ayant de 1 à 12 atomes de carbone, on entend ou un radical phényle éventuellement substitué par des radicaux alkyles linéaires ou ramifiés ayant de 1 à 5 atomes de carbone lié à une chaîne alkyle linéaire saturée ayant de 1 à 5 atomes de carbone tels que le radical benzyle éventuellement substitué par un radical alkyle ayant de 1 à 5 atomes de carbone, les radicaux 1-phényl éthyle, 1-phényle propyle, 1-phényle butyle, 1-phényle pentyle.

Parmi les radicaux aryles ayant de 1 à 7 atomes de carbone, on peut citer notamment les radicaux phényle, tolyle, chlorophényle, nitrophényle, méthoxyphényle, thiophène ou furane.

Parmi les hétérocycles azotés on peut notamment citer la pyrrolidine, la pipéridine, la morpholine, la thiamorpholine, la pipérazine, l'homopipérazine ou la N-méthyl pipérazine.

Parmi les halogénures on peut citer les fluorures, chlorures, bromures et en particulier les iodures.

Parmi les composés de formule (I) entrant dans le cadre de la présente invention, on peut notamment citer les suivants : ? Composés 1-4-Diméthylamino-4-méthyle-pent-2-ynethioate de S-méthyle 2-lodure de 4-méthyle-4-triméthylammonium-pent-2-ynethioate de S-méthyle 3-4-Di-n-propylamino-4-méthyle-pent-2-ynethioate de S-méthyle 4-4-Méthyl-4-pyrrodin-1-yl-pent-2-ynethioate de S-méthyle 5-4-Méthyl-4-morpholin-4-yl-pent-2-ynethioate de S-méthyle Selon la présente invention, les composés de formule (I) plus particulièrement préférés sont ceux pour lesquels l'une au moins des conditions ci-dessous est respectée : -R2 et R3, représentent un radical méthyle ; -R4 représente un radical méthyle ; -R5 et R6, indépendamment, représentent un radical alkyle ayant de 1 à 3 atomes de carbone ou pris ensemble forment avec l'atome d'azote un hétérocycle azoté choisi parmi la pyrrolidine, la pipéridine ou la morpholine ; -R7 représente un radical méthyle ou un atome d'hydrogène -et X représente un ion iodure, un ion formiate ou un ion carboxylate.

La présente invention a également pour objet les procédés de préparation des composés de formule (I).

Les composés de formule (I) (Rl = N (RSR6)) selon l'invention peuvent être obtenus selon le schéma réactionnel présenté sur la figure 2. Le procédé de synthèse consiste à faire réagir le butyllithium sur une amine propargylique de formule (III) dans du THF. Le lithien acétylénique intermédiairement formé est mis en réaction avec de l'oxysulfure de carbone (COS) puis avec l'iodure R4I. Le thiolester de formule a) (Rl = N (R5R6)) est ainsi obtenu avec un rendement voisin de 70%.

On peut également envisager, comme cela est présenté sur la figure 3, la réaction du lithien acétylénique directement sur un dialkyl ou diaryl dithiocarbonate de formule (IV). Ces

composés sont abondamment décrits, par exemple lorsque R4 représente un radical méthyle [DOUGLASS, I. B., WARNER, G. H., 78,6070-6071, (1956)].

La préparation des amines propargyliques de formule (III) peut être réalisée selon la méthode de HENNIN, G. F., BOISELLE, A. P., J. Am. Chem. Soc., 26,725-727, (1961). Comme cela est présenté dans la figure 4, cette méthode consiste en une chloration de l'alcool tertiaire de formule (V) en milieu acide chlorhydrique en présence de cuivre et chlorure cuivreux avec un rendement voisin de 70%.

L'alcool peut être préparé par exemple à partir de la cétone de formule R2COR3 et d'un acétylure.

Le chlorure propargylique de formule (VI) est ensuite soumis à l'action de l'amine de formule R5NHR6 selon [HENNION, G. F., NELSON, K. W., J. Am. Chem. Soc., 79,2142-2144, (1957) et HENNIN, G. F., HANZEL, R. F., J. Am. Chem. Soc., 82,4908-4912, (1960)].

Les rendements généralement obtenus se situent entre 20% et 60%.

Les composés de formule (I) (Rl = N+ (R5R6R7), X') selon l'invention peuvent être synthétisés selon le schéma réactionnel de la figure-5. Le procédé de synthèse consiste à faire réagir l'halogénure RgX (de préférence l'iodure) ou bien l'acide minéral ou organique (R7 = H) sur le composé de formule (I) (Rl = N (R5R"). Les rendements sont voisins de 70%.

Ainsi, alors que la synthèse des composés de la demande de brevet WO-98/44919 nécessitait une étape délicate de déprotection de l'amine propargylique qui empêchait une préparation à grande échelle de ces composés, la synthèse des composés de la présente invention présente l'avantage d'être plus simple et de pouvoir'être développée à grande échelle, avec de meilleurs rendements.

Ces nouveaux composés présentent en outre l'avantage d'être plus stables et surtout beaucoup plus actifs dans l'inhibition de la croissance des cellules transformées résistantes à l'apoptose du fait de la surexpression du gène bcl2 que ceux décrits dans la demande de brevet WO- 98/44919, tels que le thioampal.

Les composés selon l'invention ont également l'avantage d'être actifs dans l'inhibition de la croissance des cellules transformées résistantes à l'apoptose non seulement du fait de la

surexpression du gène bel, mais également du fait de l'expression des enzymes ALDH (ALDH1, ALDH2, et/ou ALDH3), la surexpression du gène MDR « Multi Drug Resistant » ou du gène BCL-XL, ce qui élargit leur champ d'utilisation.

Ainsi, la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un dérivé aminothiolester de formule (I) pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à lever l'inhibition d'un caractère résistant à l'induction d'apoptose de cellules transformées, ce caractère étant dû au gène bel2, au gène MDR ou au gène BCL-XL présent dans ces cellules, ou à l'activité de ALDH.

La présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un dérivé aminothiolester de formule (I) pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à lever l'inhibition du caractère résistant à la chimiothérapie, ou à la radiothérapie ou aux antiandrogènes de cellules transformées.

Plus particulièrement, le caractère résistant à la chimiothérapie ou aux antiandrogènes de cellules transformées est dû au gène bcl2, au gène BCL-XL ou au gène MDR présent dans ces cellules ou à l'activité de l'enzyme ALDH. Plus particulièrement, le caractère résistant à la radiothérapie de cellules transformées est dû à la présence du gène bcl2 ou au taux élevé de glutathion dans ces cellules.

En effet, les enzymes aldéhyde déshydrogénases (ALDH) catalyse l'oxydation de différents aldéhydes aliphatiques et aromatiques en leur acide carboxylique correspondant en présence du cofacteur NAD ou NADP. Ces enzymes de différentes sous-familles et notamment ALDH1, ALDH2 ou ALDH3, sont présentent dans différents organes et jouent un rôle dans la détoxification des xenobiotiques. L'augmentation de l'activité de ces enzymes provoque une résistance aux agents anticancéreux tel que le cyclophosphamide [MAGNI et al., Blood, 87 1097-1103, (1996)].

Comme indiqué dans la demande de brevet W098/44919, l'utilisation d'un inhibiteur de l'activité de l'enzyme ALDH1 permet de lever l'inhibition du caractère résistant à la chimiothérapie ou aux antiandrogènes induit par ALDH1.

Il existe, au sein d'une tumeur cancéreuse, certaines cellules cancéreuses dites Multi Drug Resistant (MDR) qui ont un caractère résistant aux agents chimiothérapeutiques. Parmi celles- ci, les cellules R7 surexprimant le gène MDR ont été décrites comme étant résistantes à la daunorubicine [JEANNESSON, P. et al., Cancer Res., 50,1231-1236, (1990)].

La lignée cellulaire LY-ar, cellules de lymphomes de souris, a été décrite comme étant résistante aux radiations, contrairement aux cellules LY-as qui elles sont sensibles à la radiothérapie [MIRKOVIC, N. et al., Oncogene, 15,1461-1470, (1997)]. Cette résistance est due à la surexpression du gène bcl2.

Ces composés présentent en outre l'avantage d'induire l'apoptose d'une grande variété de cellules transformées, ce qui permet de les utiliser dans la préparation de compositions pharmaceutiques destinées au traitement d'un grand nombre de pathologies cancéreuses mais également d'autres maladies, plus particulièrement les maladies liées à une hyperprolifération cellulaire, telles que les maladies auto-immunes ou les allergies.

Bien qu'induisant sélectivement l'apoptose des cellules transformées, ces composés présentent en outre, dans certaines gammes de concentrations plus élevées, des propriétés d'induction d'apoptose dans des cellules normales, telles que les cellules MRC5. Ceci permet de les utiliser dans la préparation de compositions cosmétiques destinées notamment à la prévention ou au traitement du vieillissement chronologique ou photo-induit.

L'objet de la présente invention concerne également les composés de formule (I) ci-dessus à titre de médicament. Les composés selon l'invention conviennent particulièrement bien dans les domaines de traitement suivants : 1) dans le traitement ou la prévention des états cancéreux ou précancéreux, 2) pour traiter les affections dermatologiques liées à un désordre de la kératinisation portant sur la différenciation, et sur la prolifération notamment pour traiter les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, rosacées, les acnés nodulokystiques, conglobata, les acnés séniles, les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle,

3) pour traiter les ichtyoses, les états ichtyosiformes, les kératodermies palmoplantaires, les leucoplasies et les états leucoplasiformes.

4) pour traiter des affections dermatologiques avec une composante immuno-allergique inflammatoire, avec ou sans trouble de la prolifération cellulaire, et notamment toutes les formes de psoriasis, qu'il soit cutané, muqueux ou unguéal, et même le rhumatisme psoriasique, ou encore l'atopie cutanée, telle que l'eczéma ou l'atopie respiratoire ou encore l'hypertrophie gingivale, 5) pour traiter les proliférations dermiques ou épidermiques qu'elles soient bénignes ou malignes, qu'elles soient ou non d'origine virale telles que verrues vulgaires, les verrues planes et l'épidermodysplasie verruciforme, les papillomatoses orales ou florides, le lymphome T, et les proliférations pouvant être induites par les ultra-violets notamment dans le cas des épithélioma baso et spinocellulaires, ainsi que les lésions précancéreuses cutanées telles que les kératoacanthomes, 6)'pour traiter les dermatoses immunes telles le lupus érythémateux, les maladies immunes bulleuses et les maladies du collagène, telle la sclérodermie, 7) dans le traitement d'affections dermatologiques ou générales à composante immunologique, 8) pour lutter contre les troubles de la fonction sébacée tels que l'hyperséborrhée de l'acné ou la séborrhée simple, 9) dans le traitement de désordres cutanés dus à une exposition aux rayonnements U. V. ainsi que pour réparer ou lutter contre le vieillissement de la peau, qu'il soit photo-induit ou chronologique ou pour réduire les pigmentations et les kératoses actiniques, ou toutes pathologies associées au vieillissement chronologique ou actinique, 10) pour prévenir ou traiter les troubles de la cicatrisation ou pour prévenir ou pour réparer les vergetures,

11) dans le traitement d'affections inflammatoires telles que l'arthrite, 12) dans le traitement de toute affection d'origine virale au niveau cutané ou général, telle que le syndrome de Kaposis ou les hépatites, et 13) pour traiter certains troubles ophtalmologiques, notamment les cornéopathies.

Dans les domaines thérapeutiques mentionnés ci-dessus, les composés selon l'invention peuvent être avantageusement employés en combinaison avec des composés 3- méthylthiopropanoylthio-esters de l'acide thioctique, le méthional, de nombreux agents antinéoplasiques, des rétinoides, avec des corticostéroïdes ou des oestrogènes, en association avec des anti-oxydants, avec des a-hydroxy ou a-céto acides ou leurs dérivés, avec des bloqueurs de canaux potassiques, en association avec d'autres médicaments connus pour interférer avec le système immunitaire (par exemple la cyclosporine, le FK 506, les gluco- corticoïdes, les anticorps monoclonaux, les cytokines ou les facteurs de croissance), en association avec des dérivés de la vitamine D ou avec des composés analogues de la vitamine D.

Parmi les agents antinéoplasiques, on peut notamment citer la dexamethasone, la cyclophosphamide, le cisplatin, l'étoposide et le BCNU (N, N-Bis (2-chloroéthyl)-N- nitrosourea), qui sont également capables d'induire l'apoptose.

Parmi les 3-méthylthiopropanoylthio-esters de l'acide thioctique on peut notamment citer les composés décrits dans la demande de brevet EP 947503 et plus particulièrement le composé 21, c'est à dire l'iodure de 6-S, 8-S bis (3-méthylthiopropanoyl) octanoate de (2'- triméthylammonium éthyle) désigné ci-après par Metmetlico.

Il a en effet été mis en évidence un effet de synergie des composés de l'invention dans leur activité anti-tumorale lorsqu'ils sont utilisés en association avec un agent thérapeutique antitumoral tel que décrit dans la demande de brevet EP 947503.

Par rétinoides, on entend des ligands des récepteurs RAR ou RXR, de type agonistes ou antagonistes, naturels ou synthétiques.

Parmi les vitamines D ou leurs dérivés, on peut notamment citer les dérivés de la vitamine Do ou D3 et en particulier la 1,25-dihydroxyvitamine D3, les composés analogues de la vitamine D choisi parmi les composés décrits dans les demandes de brevet FR 98/13747, FR 99/14783 ou FR 99/14781.

Parmi les antioxydants, on peut notamment citer l'a-tocophérol, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chélatants de métaux.

Parmi les a-hydroxy ou a-céto acides ou leurs dérivés, on peut notamment citer la cétoleucine, la cétoisoleucine, la cétovaline, le 2-oxobutyrate, l'acide 4-méthylthio-2- oxobutanoïque, les acides lactique, malique, citrique, glycolique, mandélique, tartrique, glycérique, ou leurs sels, amides ou esters.

Parmi les bloqueurs de canaux potassiques, on peut notamment citer le Minoxidil (2,4- diamino-6-pipéridino-pyrimidine-3-oxyde) et ses dérivés.

La demanderesse a également constaté de façon inattendue et surprenante une activité synergique due à l'association de deux composés selon l'invention.

La présente invention a également pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques ou cosmétiques contenant, en tant qu'agent actif, une quantité efficace d'au moins un nouveau composé objet de l'invention dans un excipient physiologiquement acceptable.

La présente invention a donc aussi pour objet une telle composition pharmaceutique destinée notamment au traitement des affections susmentionnées.

La présente invention concerne également de nouvelles compositions pharmaceutiques pour le traitement, la régression et la prévention du cancer contenant, en tant qu'agent thérapeutique antitumoral, une quantité efficace d'au moins un nouveau composé objet de la présente invention seul ou en association avec un agent thérapeutique antitumoral choisi parmi ceux décrits dans la demande de brevet EP 947503.

L'administration des composés selon l'invention peut être effectuée par voie entérale, parentérale, topique ou oculaire.

Par voie entérale, les compositions pharmaceutiques peuvent se présenter sous forme. de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granulés, d'émulsions, de microsphères ou nanosphères ou vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée.

Par voie parentérale, la composition peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection.

Les composés de formule (I) selon l'invention sont généralement administrés à une dose journalière d'environ 0,001 mg/kg à 100 mg/kg en poids corporel en 1 à 3 prises.

Par voie topique, la composition cosmétique ou pharmaceutique à base de composés selon l'invention est plus particulièrement destinée au traitement de la peau du cuir chevelu et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions.

Elle peut également se présenter sous forme de microsphères ou nanosphères ou vésicules lipidiques ou polymériques ou de patches polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Elle peut en variante se présenter sous la forme de shampoing ou d'après- shampoing ou de savon.

Ces compositions par voie topique peuvent se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous forme d'émulsion selon l'indication thérapeutique.

Par voie oculaire, ce sont principalement des collyres.

Pour une application pharmaceutique, les composés de formule (I) sont utilisés par voie topique ou oculaire à une concentration généralement comprise entre 0,0001 % et 10 % en poids, de préférence entre 0,001 et 1 % en poids, par rapport au poids total de la composition.

Les composés de formule (I) selon l'invention trouvent également une application dans le domaine cosmétique, en particulier dans l'hygiène corporelle et capillaire et notamment pour

le traitement des peaux à tendance acnéique, pour le traitement ou la prévention des vergetures, dans la protection contre les effets néfastes du soleil, pour prévenir et/ou lutter contre le vieillissement photo-induit ou chronologique, ou pour lutter contre l'aspect gras de la peau ou des cheveux..

La concentration en composé de formule (I) dans les compositions cosmétiques peut être comprise entre 0,001 et 3 % en poids par rapport au poids total de la composition.

Les compositions pharmaceutiques ou cosmétiques selon l'invention peuvent, en outre, contenir des additifs inertes ou même pharmacodynamiquement ou cosmétiquement actifs ou des combinaisons de ces additifs et notamment : des agents mouillants ; des agents dépigmentants tels que l'hydroquinone, l'acide azelaique, l'acide cafeique ou l'acide kojique ; des émollients ; des agents hydratants comme le glycérol, le PEG 400, la thiamorpholinone et ses dérivés ou l'urée ; des agents antiséborrhéiques ou antiacnéiques, tels que la S- carboxyméthylcystéine, la S-benzyl-cystéamine, leurs sels et leurs dérivés, ou le peroxyde de benzoyle ; des antibiotiques comme l'érythromycirte et ses esters, la néomycine, la clindamycine et ses esters, les tétracyclines ; des agents antifongiques tels que le kétoconazole ou les polyméthylène-4, 5 isothiazolinones-3 ; des agents favorisant la repousse des cheveux, comme le Minoxidil (2,4-diamino-6-pipéridino-pyrimidine-3-oxyde) et. ses dérivés, le Diazoxide (7-chloro 3-méthyl 1,2,4- benzothiadiazine 1,1-dioxyde) et le Pliénytoïn (5,4- diphényl-imidazolidine 2,4-dione) ; des agents anti-inflammatoires non stéroïdiens ; des caroténoïdes et, notamment le P-carotène ; des agents anti-psoriatiques tels que l'anthraline et ses dérivés et enfin, les acides eicosa-5,8,11,14- tétraynoïque et eicosa-5,8,11-trynoïque, leurs esters et les amides.

Les compositions selon l'invention peuvent également contenir des agents d'amélioration de la saveur, des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoique, les agents stabilisants, des agents régulateurs d'humidité, des agents régulateurs de pH, des agents modificateurs de pression osmotique, des agents émulsionnants, ou des filtres UV-A et UV-B.

Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir le ou les éventuels composés à ajouter à ces compositions de telle manière que les propriétés avantageuses attachées intrinsèquement à la présente invention ne soient pas ou substantiellement pas altérées par l'addition envisagée.

On va maintenant donner, à titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif, plusieurs exemples d'obtention de composés actifs de formule (I) selon l'invention ainsi que des exemples de tests d'évaluation de l'activité biologique des composés de formule (I) selon l'invention.

A. EXEMPLES DE COMPOSES EXEMPLE 1 Procédé de préparation du 4-diméthvlamino-4-méthyle-pent-2-ynethioate de S-méthyle A une solution de 0.855g de 3-diméthylamino-3-méthyl-but-1-yne [HENNION, G. F., NELSON, K. W. (1957) J. Am. Chem. Soc., 79,2142-2144] (2.80 mmol) dans 14 ml de tétrahydrofuranne, on ajoute en 5 minutes à-70°C 4.07 ml (9. 24 mmol) d'une solution 2.27 M de nbutyllithium dans l'hexane. Après 5 minutes le milieu réactionnel est ramené à 0°C et agité encore 30 minutes à cette température. Après retour à-70°C, on cannule 2 ml d'oxysulfure de carbone préalablement condensé et on agite 30 minutes à-70°C. Le milieu réactionnel est ensuite porté à 0°C en 30 minutes puis on ajoute 0.575 ml (9.24 mmol) d'iodure de méthyle et on poursuit l'agitation pendant 2 heures à 0°C. On dilue dans 250 ml d'éther, on lave par une solution saturée de chlorure de sodium (3x30 ml), on sèche sur sulfate de sodium. Après évaporation sous vide et purification par chromatographie sur gel de silice (élution par un mélange éther de pétrole/acétate d'éthyle = 70/30) on isole 1.16g du composé exemple 1 sous forme d'huile incolore (rendement : 81 %) 'H RMN (300 MHz, CDC13) : v= 1.42 (s, 6H, (CH3) 2C), 2.31 (s, 6H, (CH3) 2N), 39 (s, 3H, CH3S).

EXEMPLE 2 Procédé de préparation de l'iodure de 4-méthyle-4-trirriethylammonium-pent-2-vnethioate de S-méthyle

A 0. 184 g (0. 99 mmol) du composé obtenu à l'exemple 1 dans 10ml d'acétate d'éthyle à température ambiante est ajouté 0.25 ml (4.02 mmol) d'iodure de méthyle. Le mélange est laissé pendant 4 jours à l'obscurité. On évapore sous vide et on purifie par chromatographie sur gel de silice (élution par un mélange dichlorométhane/méthanol = 90/10). On isole ainsi 0.229 g du composé exemple 2 (rendement 70%) sous forme de solide.

'H RMN (300 MHz, CDCl3) : v = 1.96 (s, 6H, (CH3) 2C), 2.46 (s, 3H, CH3S), 3.62 (s, 6H, (CN).

EXEMPLE 3 Procédé de préparation du 4-di-nropylamino-4-méthyle-pent-2-ynethioate de S-methyle Préparation identique à celle décrite à l'exemple 1 en utilisant la 3-di-n-propylamino-3- méthyl-but-1-yne [HENNION, G. F., HANZEL, R.F., J. Am. Chem. Soc., 82, 4908-4912, (1960) à la place de la 3-diméthylamino-3-méthyl-but-1-yne. Echelle : 2.8 mmol, purification par chromatographie sur gel de silice (éluant éther de pétrole / acétate d'éthyle = 95 / 5), rendement : 75%. Huile incolore.

'H RMN (300 MHz, CDCl3) : v = 0.86 (t, J = 7. 36,6H, CH3-CH2) 1. 46 (s, 6H, (CH3) 2C), 1.47 (m, 4H, CH3-CH2) 2. 38 (s, 3H, CH3S), 2.52 (m, 4H, CH2N).

EXEMPLE 4 Procédé de préparation du 4-méthyl-4-pyrrodin-1-vl-pent-2-ynethioate de S-méthyle Préparation identique à celle décrite à l'exemple 1 en utilisant la 3-méthyl-3-pyrrodin-1-yl- but-1-yne [HENNION, G. F., NELSON, K. W., J. Am. Chem. Soc., 79, 2142-2144, (1957)] à la place de la 3-dimethylamino-3-méthyl-but-1-yne. Echelle : 2.8 mmol, purification par chromatographie sur gel de silice (éluant éther de pétrole/acétate d'éthyle-70 l 30), rendement : 85%. Huile incolore.

1H RMN (300 MHz, CDCl3) : v = 1.45 (s, 6H, (CH3) 2C), 1.81 (m, 4H, NCH2-CH2) 2. 39 (s, 3H, CH3S), 2.72 (m, 4H, CH2N).

EXEMPLE 5 Procédé de préparation du 4-méthyl-4-morpholin-4-yl-pent-2-nethioate de S-méthyle Préparation identique à celle décrite à l'exemple 1 en utilisant la 3-di-n-propylamino-3- méthyl-but-1-yne [HENNION, G. F., HANZEL, R. F., J. Am. Chem. Soc., 82, 4908-4912,

(1960)] à la place de la 3-méthyl-3-morpholin-4-yl-but-1-yne. Echelle : 1.5 mmol, purification par chromatographie sur gel de silice (éluant éther de pétrole/acétate d'éthyle = 60/40), rendement : 77%. Solide blanc.

'H RMN (300 MHz, CDCl3) : v = 1.43 (s, 6H, (CH3) 2C), 2.40 (s, 3H, CH3S), 2.65 (m, 4H, CH20), 3.97 (m, 4H, CH2N).

B. EXEMPLES DE TESTS D'EVALUATION DE L'ACTIVITE BIOLOGIQUE DES COMPOSES DE L'INVENTION Exemple 1-Effet des composes sur la croissance des cellules transformées ou non transformées a) Effet des composés sur la croissance des cellules DU145 et BAF3 bel2 Les cellules utilisées correspondent à deux lignées cellulaires : des cellules métastatiques de cancer de la prostate humaine (DU145), et des cellules lymphoïdes murines transfectées par le gène bcl2 humain (BAF3 bcl2).

Le mode opératoire utilisé pour les tests sur le DU145 est le suivant : 105 cellules sont incubées dans les différents puits d'une microplaque dans 1mI de milieu de culture.

Les composés sont ajoutés 4 heures après dépôt des cellules dans les puits.

Après 72 heures, les cellules sont prélevées à différents temps. Les cellules DU145 sont lavées deux fois au PBS et récupérées directement avec du chlorure de sodium à 0.1 M.

L'effet sur la croissance des cellules DU145 est mesurée par le dosage des protéines selon la méthode de Lowry (LOWRY, O. H., ROSENBROUGH, N. J., FARR, A. L. and RANDALL, J. Biol. Chem. 193,265-275, (1951)) et de l'ADN par la méthode de Hoechst (WEST, D. C., SATTAR, A. and KUMAR, S., Anal. Biochem. 147,289-295, (1985)).

Le mode opératoire utilisé pour les tests sur les cellules BAF3 bcl2 est le suivant : 105 cellules sont incubées dans les différents puits d'une microplaque dans lml de milieu de culture. Après 4 heures d'incubation, les composés à tester sont ajoutés dans les puits contenant les cellules BAF3 bcl2.

Pour les cellules BAF3 bcl2, la croissance est mesurée par le dénombrement des cellules viables en présence de Bleu Trypan à 0.1%. Le témoin est constitué par le thioampal, décrit dans la demande de brevet WO-98/44919.

Les résultats sont rassemblés dans le tableau I ci-dessous : Tableau I IC50 (, iiM) DU145 BAF3 bcl2 Exemple comparatif Thioampal 650 100 Composés de Exemple 1 5. 9 0.25 l'invention Exemple 3 8 2. 7 Exemple4 7. 2 2. 7 Exemple5 8. 8 12. 0 La concentration IC50 est la concentration correspondant à une inhibition de 50% de la croissance des cellules.

Ces résultats montrent que les valeurs de IC50 des composés de l'invention sont très inférieures à celle obtenue pour le thioampal. Ainsi, l'inhibition de la croissance des cellules DU145 et des cellules BAF3 bel, obtenue avec les composés selon l'invention est plus forte que l'inhibition obtenue avec le thioampal.

Cette inhibition de la croissance des cellules DU145 et des cellules BAF3 bc12 est due au moins en partie à une augmentation des phénomènes d'apoptose de ces cellules.

Ainsi, ces résultats suggèrent que les composés de l'invention induisent davantage l'apoptose des cellules DU145 et des cellules BAF3 bcl2 que le thioampal. b) Effet des composés sur la croissance des cellules L1210 L1210T, B16 et MRC5 Les cellules utilisées correspondent à différentes lignées cellulaires : des fibroblastes embryonnaires normaux de poumon humain (MRC5), des cellules de mélanome de souris

(B16), des cellules de leucémie lymphocytaire de souris (L1210) et des cellules L1210T obtenues par infection des cellules L1210 par un vecteur retroviral portant le ADNc humain ALDH1.

Le mode opératoire utilisé pour les tests sur les cellules L1210 est le suivant : 105 cellules sont incubées dans les différents puits d'une microplaque dans lml de milieu de culture. Après 4 heures d'incubation, les composés à tester sont ajoutés dans les puits contenant les cellules L1210.

Pour les cellules L1210, la croissance est mesurée par le dénombrement des cellules viables en présence de Bleu Trypan à 0.1%.

Le mode opératoire utilisé pour les tests sur les cellules B 16 et MRC5 est le suivant : Les composés à tester sont ajoutés 4 heures après dépôt des cellules dans les puits. Après 72 heures, les cellules sont prélevées à différents temps. Les cellules B16 et MRC5 sont lavées deux fois au PBS et récupérées directement avec du chlorure de sodium à 0. 1 M.

L'effet sur la croissance des cellules B16 et MRC5 est mesurée par le dosage des protéines selon la méthode de Lowry (LOWRY, O. H., ROSENBROUGH, N. J., FARR, A. L. and RANDALL, J. Biol. Chem. 193,265-275, (1951)) et de l'ADN par la méthode de Hoechst (WEST, D. C., SATTAR, A. and KUMAR, S., Anal. Biochem. 147, 289-295, (1985)).

Les résultats sont rassemblés dans le tableau II ci-dessous : Tableau II IC50(, iM) L1210 L1210T B16 MRC5 Exemple comparatif Thioampal 90 140 NT >600 Composé de Exemple 1 1. 2 1. 6 0. 8 8. 4 l'invention NT signifie non testé La concentration IC50 est la concentration correspondant à une inhibition de 50% de la croissance des cellules.

Ces résultats montrent que les valeurs de IC50 des composés de l'invention sont très faibles et très inférieures à celles obtenues pour le thioampal. Ainsi, l'inhibition de la croissance des cellules L1210, L1210T, B16 et MRC5 obtenue avec les composés selon l'invention est importante et beaucoup plus forte que l'inhibition obtenue avec le thioampal.

Cette inhibition de la croissance des cellules L1210, L1210T, B16 et MRC5 est due au moins en partie à une augmentation des phénomènes d'apoptose de ces cellules. Ainsi, ces résultats suggèrent que les composés de l'invention induisent davantage l'apoptose des cellules L1210, L1210T, B16 et MRC5 que le thioampal.

2-Mesure d'induction d'apoptose dans les cellules BAF3-bO et BAB3-bel2 par les composés de l'invention Les cellules BAF3-bcl2correspondent à des cellules BAF3 (cellules lymphocytaires de souris) transfectées par le gène bcl2. Parmi celles-ci, quatre lignées appelées H16, G18, B14 et G21 surexpriment le gène bcl2.

Dans la suite, les cellules dénommées BAF3-bO correspondent à des cellules BAF3 non transfectées par le gène bcl2.

Alors que les cellules BAF3-bO subissent l'apoptose (plus de 80% des cellules) en l'absence l'interleukine 3 (IL3) en 16 heures [d'après COLLINS, M. K. L., MARVEL, J., MALDE, P. & LOPEZ-RIVAS, A., J. Exp. Med. 176, 1043-1051, (1992)], les cellules BAF3-bcl2 ne présentent aucun signe d'apoptose en l'absence d'IL3. Elles sont donc résistantes à l'apoptose.

Le mode opératoire qui a été utilisé est le suivant : Les cellules BAF3-bO ou BAF3-bcl2, mises en culture en présence d'IL3, ont été marquées par une méthode adaptée de celle décrite dans WRIGHT, S. et al., J. of Cell. Biochem. 48, 344- 355, (1992).

105 cellules/ml ont été incubées avec 4.62 KBq. ml'' [3H]-thymidine pendant 40 heures à 37°C. Après deux lavages avec un milieu de culture, 2,5.106 cellules ont été mises en culture en présence du composé à tester.

Après incubation pendant 24 heures, ces cellules ont été récupérées par centrifugation à 400g pendant 5 minutes et lavées 3 fois dans un tampon PBS. Les cellules récupérées dans le culot

ont été lysées dans 2ml de 0,1% de Triton X-100,20mM EDTA, 5mM Tris pH8 et centrifugées à 30000g à 4°C pendant 30 minutes.

Les surnageants ont été récupérés et les culots dissous dans 0,3 ml de 0,5 N NaOH.

Des aliquots du milieu de culture (lml), du surnageant (0,3ml) et du culot solubilisé (O, lml) ont été mis à doser dans un compteur à scintillation.

Le pourcentage de fragments d'ADN est calculé de la façon suivante : % de fragments = dpm du milieu de culture + dpm du surnageant d'ADN dpm du milieu de culture + dpm du surnageant + dpm du culot solubilisé dpm = désintégration par minute) Le pourcentage de fragmentation de l'ADN est une mesure directe de l'apoptose subie par les cellules.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau III.

Tableau III Clonesbel, Exemple 1 (, uM) bO G21 G18 B14 H16 % expression de 0 0 6. 4 22.1 50.8 72 bcl2 dans cellules BAF3 1 5. 0 0 0.6 0 2.9 Fragmentation de 2 10. 6 5.8 7. 3 2.0 6.3 1'ADN (%) 4 46. 4 29.3 52.7 44.1 65. 3 8 71. 1 71.8 84.3 90. 0 94.2 Les cellules BAF3-bO servent de témoins. L'apoptose de ces cellules est induite par ajout du composé exemple 1 et ce phénomène augmente de façon dose-dépendante.

Ces résultats montrent que la présence d'un composé selon l'invention permet de lever l'inhibition d'apoptose due au gène bel, dans les lignées cellulaires H16, G18, B14 et G21 qui surexpriment le gène bel2.

Le mode opératoire de l'essai présenté dans le tableau IV ci-dessous est identique au précédent à la seule différence que le temps d'incubation est de 6 heures au lieu de 24 heures : Tableau IV % fragmentation de 1'ADN des cellules bcl2 H16 Conc (M) Thioampal Exemple 1 50 0 2, 15 100 1, 6 0 200 7,6 30,4 400 16,4 83,8 600 26,5 81, 5 L'apoptose de ces cellules est induite de manière beaucoup plus importante avec le composé exemple 1 qu'avec le thioampal, et ceci de façon dose-dépendante.

Ces résultats montrent que la présence du composé selon l'invention permet de lever l'inhibition d'apoptose due au gène bel.. et ceci de manière beaucoup plus forte que les composés de l'art antérieur.

Exemple 2 : Effet des composés sur l'activité de ALDH1 Le mode opératoire utilisé est indiqué ci-dessous : 260 mU de ALDH de levures de boulanger sont préincubées à 37 ou 0°C dans un mélange de 1 mM EDTA, 100 mM KCI, dans 60 mM de tampon phosphate de sodium pH 6 dans un volume final de 200. ul.

Dans chaque tube contenant les 200 p. l de mélange, le composé à tester est ajouté à la concentration de 400 pM, à l'exception d'une série de contrôle qui ne contient pas de composé à tester.

L'incubation effectuée à 0°C ou à 37°C est stoppée par l'addition de 100 llg de BSA (Bovin serum albumine) et de l'acétone à-20°C à une concentration finale de 80% pour précipiter les protéines (ALDH et BSA). Les tubes sont laissés à-20°C pendant 1 heure, puis centrifugés à 10000 rpm pendant 10 minutes, lavés avec de l'acétone à 80%.

Les protéines précipitées sont dissoutes dans 358, ul d'eau et ajoutées immédiatement au complexe réactionnel constitué 1 mM EDTA, 100 mM KC1, 2.35 mM NAD dans 60 mM de tampon phosphate de sodium pH 8.5.

La réaction est démarrée par l'addition de 2 mM de propanal et la densité optique (OD) est mesurée à 340 nm à T=0 et à T= 5,10,20 et 30 minutes.

L'activité de l'enzyme est mesurée par la variation de densité optique A OD par minute (QUASH G. et al., Enzymology and molecular biology of carbonyl metabolism, Weiner et al. eds., Kluwer Academic/Plenum Publishers, New-York, 97-106).

Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 6.

Le pourcentage d'activité (A%) de l'enzyme ALDH1 obtenu à différents temps de préincubation au composé exemple 1 à 0°C (représenté par) ou 37°C (représenté par &) ou bien sans préincubation au composé exemple 1 à 0°C (représenté par CI) ou à 37°C (représenté par A) est mesuré en fonction du temps t (exprimé en minutes).

Lorsque la préincubation par le composé exemple 1 est effectuée à la température de 0°C, il n'y a pas d'effet d'inhibition du composé exemple 1 sur l'activité de l'enzyme. En effet les deux courbes obtenues avec ou sans préincubation au composé exemple 1 sont superposables.

Ceci s'explique par le fait qu'à cette température, le composé exemple 1 n'a pas pu être métabolisé par l'ALDH1. De ce fait, la formation de liaisons covalentes entre le principe actif formé après clivage et l'enzyme n'a pas pu s'établir.

En revanche, lorsque la préincubation par le composé exemple 1 est effectuée à la température de 37°C, l'enzyme ALDH1 métabolise le composé exemple 1 et se lie à lui par des liaisons covalentes, et on observe un effet d'inhibition de l'activité de l'enzyme. Cet effet augmente en fonction du temps de préincubation par le composé exemple 1.

Ces résultats montrent que les composés selon l'invention permettent de diminuer l'activité de ALDH, et présentent l'avantage d'être de type"suicide" (liaison covalente irréversible avec 1'enzyme ALDH), permettant ainsi de lever la résistance aux agents anticancéreux.

Exemple 3 : Effet des composés sur les cellules R7 surexprimant le séné MDR Les cellules K562 utilisées dans ce test ne surexpriment pas le gène MDR et servent de témoin, ce sont des cellules de leucémie myéloïde humaine. Contrairement aux cellules R7, cellules cancéreuses qui elles surexpriment le gène MDR.

L'objet du présent test est de mettre en évidence l'effet des composés de l'invention sur ces cellules R7.

Le mode opératoire utilisé est indiqué ci-dessous : 105 cellules ont été incubées dans les différents puits d'une microplaque dans lml de milieu de culture. Il s'agit d'une part de cellules R7 et d'autre part de cellules K562.

Après 4 heures d'incubation, le composé à tester (l'exemple 1 selon l'invention d'une part et la Daunorubicine d'autre part) a été ajouté dans les puits contenant les cellules.

Après 72 heures, les cellules ont été prélevées à différents temps.

La croissance des cellules a été mesurée par le dénombrement des cellules viables en présence de Bleu Trypan à 0. 1%.

Les résultats sont présentés sur les figures 7 et 8.

Les figures 7 et 8 représentent respectivement le pourcentage d'inhibition (I%) par la daunorubicine et le composé exemple 1 de la croissance des cellules R7 et K562, obtenu à concentrations C croissantes. Les résultats obtenus avec les cellules K562 sont symbolisés par + et ceux obtenus avec les cellules R7 par A.

Ces résultats montrent que le daunorubicine n'a aucun effet d'inhibition sur la croissance des cellules R7 surexprimant le gène MDR à des concentrations auxquelles elle inhibe la croissance des cellules K562.

En revanche, le composé exemple 1 inhibe de façon très importante la croissance des cellules R7. L'effet d'inhibition sur la croissance des cellules R7 est même supérieur à l'effet d'inhibition obtenu aux mêmes concentrations sur la croissance des cellules K562.

Ces résultats montrent que les composés selon l'invention permettent de lever la résistance à la chimiothérapie due au gène MDR.

Exemple 4 : Effet de l'association d'un composé selon l'invention et d'un composé choisi parmi ceux décrits dans la demande de brevet EP 947503 sur la croissance des cellules DU145 Dans la demande de brevet EP 947503, il a été décrit que des dérivés du méthional comprenant le méthional couplé par liaison thio-ester à l'acide thioctique présentaient une forte activité apoptotique sélective pour les cellules transformées et tumorales. Parmi ces composés, on peut citer l'iodure de 6-S, 8-S-bis (3-methylthiopropanoyl) octanoate de (2'-trimethylammonium éthyle) (composé 21 de ce document) désigné par metmetlico.

Le mode opératoire utilisé est indiqué ci-dessous : Les cellules utilisées correspondent à des cellules métastatiques de cancer de la prostate humaine DU145.

105 cellules DU145 sont incubées dans les différents puits d'une microplaque dans 1ml de milieu de culture.

Les composés à tester sont ajoutés 4 heures après dépôt des cellules dans les puits. Après 72 heures, les cellules sont prélevées à différents temps. Les cellules sont lavées deux fois au PBS et récupérées directement avec du chlorure de sodium à O. 1M.

L'effet sur la croissance des cellules DU145 est mesurée par le dosage des protéines selon la méthode de Lowry (LOWRY, O. H., ROSENBROUGH, N. J., FARR, A. L. and RANDALL, J. Biol. Chem. 193, 265-275, (1951)) et de l'ADN par la méthode de Hoechst (WEST, D. C., SATTAR, A. and KUMAR, S., Anal. Biochem. 147, 289-295, (1985)).

Les produits testés sont le composé exemple 1, le metmetlico et leur mélange.

Les résultats sont rassemblés dans le tableau V.

Tableau V Composé (concentration) % inhibition de la croissance des cellules DU145 Exemple 1 (2, uM) 5. 8 Exemple 1 (3M) 161 Exemple 1 (4M) 224 Metmetlico (25µM) 0 Metmetlico (50pLM) Exemple 1 (2µM)+Metmetlico (25µM) 14.7 Exemple 1 (2llM) + Metmetlico (50) 1M) 20. 7 Exemple 1 (3 1M) + Metmetlico (25pLM) 26. 9 Exemple 1 (3 1M) + Metmetlico (50µM) 36.9 Exemple 1 (4µM)+Metmetlico (25µM) 44.4 Exemple 1 (4llM) + Metmetlico (50µm) 41.3

Les résultats montrent que le composé exemple 1 seul inhibe la croissance des cellules DU145. En revanche, le Metmetlico seul n'a pas d'effet inhibiteur sur la croissance de ces cellules DU145 aux concentrations utilisées dans cet exemple.

L'association d'un composé selon l'invention et d'un composé décrit dans la demande de brevet EP947503 inhibe de façon synergique la croissance des cellules DU145. Ces résultats démontrent la possibilité d'utiliser ces composés en association à des doses nettement inférieures de celles utilisables lorsqu'ils sont utilisés seuls.

Exemple 5 : Effet de l'association de deux composés selon l'invention sur la croissance des cellules DU145 ou des cellules normales 105 cellules normales de prostate humaine ou 105 cellules cancéreuses de prostate humaine (DU145) sont incubées dans les différents puits d'une microplaque dans lml de milieu de culture.

Les composés sont ajoutés 4 heures après dépôt des cellules dans les puits.

Après 72 heures, les cellules sont prélevées à différents temps. Les cellules DU145 ou les cellules normales sont lavées deux fois au PBS et récupérées directement avec du chlorure de sodium à O. 1M.

L'effet sur la croissance des cellules DU145 ou des cellules normales est mesurée par le dosage des protéines selon la méthode de Lowry (LOWRY, O. H., ROSENBROUGH, N. J., FARR, A. L. and RANDALL, J. Biol. Chem. 193, 265-275, (1951)) et de l'ADN par la méthode de Hoechst (WEST, D. C., SATTAR, A. and KUMAR, S., Anal. Biochem. 147, 289- 295, (1985)).

Tableau VI Produit à tester % Inhibition des cellules % Inhibition des (concentration) normales de prostate humaine cellules DU145 Exemple 1 (2Ln 3. 7 21. 3 Exemple 5 (2µM) 1.3 25.2 Exemple 5 (luM) 0 14. 3 Exemple 1 (2µM) + Exemple 5 (2, uM) 6. 1 67. 7 Exemple 1 (2µM) + Exemple 5 (lllM) 2. 8 53. 8

L'association de deux composés selon l'invention inhibe de façon synergique la croissance des cellules cancéreuses sans incidence notable sur la croissance des cellules normales, ce qui permet d'augmenter encore l'activité et la sélectivité des composés selon l'invention vis à vis des cellules transformées. Ces résultats démontrent la possibilité d'utiliser ces composés en association à des doses inférieures de celles utilisables lorsqu'ils sont utilisés seuls.

C. EXEMPLES DE FORMULATION 1) VOIE ORALE (a) On prépare la composition suivante sous la forme d'un comprimé de 0,2 g Composé de ltexemple 1 ; 0, 005 g Amidon prégélatinisé............................................ .................. 0,065 g Cellulose microcristalline............................................ ........... 0,075 g Lactose, 0,050 g Stéarate de magnésium 0,005 g (b) On prépare une suspension buvable, destinée à être conditionnée en ampoules de 5 ml Composé de l'exemple 2 0,001 g <BR> <BR> <BR> Glycérine.................................................. ...............................0,500 g<BR> Sorbitol à 70 % ............................................................ ...........0,500 g Saccharinate de sodium 0, 010 g Parahydroxybenzoate de méthyle 0, 040 g Arôme q. s.

Eau purifiée q. s. p........................................................... ........ 5 ml (c) On prépare la formulation suivante destinée à être conditionnée en gélules : Composé de l'exemple 1 ......................................................... 0.01 mg

Composé de l'exemple 5 0,01 mg Cyclosporine................................................ ........................... 0,050 g Amidon de maïs....................................................... ............... 0,060 g Lactose q. s. p........................................................... ............... 0,300 g Les gélules utilisées sont constituées de gélatine, d'oxyde de titane et d'un conservateur.

2) VOIE TOPIQUE (a) On prépare la crème Eau-dans l'Huile non ionique suivante : Composé de 1 exemple l...................................,....................... ..... 0, 100 g Mélange d'alcools de lanoline émulsifs, de cires et d'huiles raffinés, vendu par la Société BDF sous la dénomination "Eucérine anhydre"39, 900 g Parahydroxybenzoate de méthyle 0,075 g Parahydroxybenzoate de propyle................................................... 0, 075 g Eau déminéralisée stérile q. s. p................................................... 100,000 g (b) On prépare un gel en réalisant la formulation suivante : Composé de l'exemple 1........................................................... .... 0,001 g Erythromycine base 4,000 g Butylhydroxytoluène........................................ ............................. 0, 050 g Hydroxypropylcellulose vendue par la société Hercules sous le nom de"KLUCEL HF"2, 000 g Ethanol (à 95°) q. s. p........................................................... ...... 100,000 g (c) On prépare une lotion en procédant au mélange des ingrédients suivants : Composé de l'exemple 2........................................................... ..... 0,030 g Propylène glycol 5,000 g Butylhydroxytoluène 0, 100 g Ethanol (à 95°) q. s. p t 100,000 g (d) On prépare une composition cosmétique contre les effets néfastes du soleil en procédant au mélange des ingrédients suivants : Composé de l'exemple 1........................................................... ..... 1,00 g Benzylidène camphre..................................................... ................ 4,00 g Triglycérides d'acides gras 31, 00 g Monostéarate de glycérol 6,00 g Acide stéarique 2,00 g Alcool cétylique.................................................. ........................... 1,20 g Lanoline.................................................... ..................................... 4,00 g Conservateurs............................................... .................................. 0,30 g Propylène glycol 2,00 g Triéthanolamine............................................ ................................. 0,50 g Parim 0, 40 g Eau déminéralisée q. s. p........................................................... . 100,00 g

(e) On prépare la crème Huile dans l'Eau non ionique suivante : Composé de l'exemple 3........................................................... ..... 0,500 g Acide rétinoique................................................. ............................ 0, 020 g Alcool cétylique.................................................. ........................... 4,000 g Monostéarate de glycérol ; 2,500 g Stéarate de PEG 50.......................................................... .............. 2,500 g Beurre de Karité 9,200 g Propylène glycol ; 2,000 g Parahydroxybenzoate de méthyle ; 0,075 g Parahydroxybenzoate de propyle................................................... 0, 075 g Eau déminéralisée stérile q. s. p................................................... 100, 000 g (f) On prépare un gel topique en procédant au mélange des ingrédients suivants : Composé de l'exemple 4........................................................... ..... 0,050 g Ethanol : 43,000 g -tocophérol 0,050 g Polymère carboxyvinylique vendu sous la dénomination "Carbopol 941"par la société"Goodrich"..................................... 0, 500 g Triéthanolamine en solution aqueuse à 20 % en poids.................. 3,800 g Eau 9,300 g Propylène glycol qsp......................................................... ......... 100,000 g (g) On prépare une crème huile dans l'eau en réalisant la formulation suivante : Composé de l'exemple 4........................................................... ....... 0,020 g 17-valérate de bétamethasone 0, 050 g S-carboxyméthyl cystéine.............................................. :................. 3,000 g Stéarate de polyoxyéthylène (40 moles d'oxyde d'éthylène) vendu sous le nom de"Myrj 52"par la société"ATLAS".............. 4, 000 g Monolaurate de sorbitan, polyoxyéthylène à 20 moles d'oxyde d'éthylène vendu sous le nom de"Tween 20"par la société "ATLAS"1, 800 g Mélange de mono et distéarate de glycérol vendu sous la dénomination de"Géléol"par la société"GATTEFOSSE"............ 4, 200 g Propylène glycol 10,000 g Butylhydroxyanisole......................................... ............................... 0,010 g Butylhydroxytoluène........................................ ............................... 0,020 g Alcool cétostéarylique ; 6,200 g Conservateurs q. s.

Perhydrosqualène 18,000 g Mélange de triglycérides caprylique-caprique vendu sous la dénomination de"Miglyol 812"par la société"DYNAMIT NOBEL"4,000 g Triéthanolamine (99 % en poids)..................................................... 2,500 g Eau q. s. p........................................................... ............................... 100,000 g (h) On prépare la crème de type huile dans l'eau suivante : Acide lactique.................................................... .............................. 5,000 g Composé de l'exemple 2 0,020 g Stéarate de polyoxyéthylène (40 moles d'oxyde d'éthylène)

vendu sous le nom de"Myrj 52"par la société"ATLAS".............. 4, 000 g Monolaurate de sorbitan, polyoxyéthylène à 20 moles d'oxyde d'éthylène vendu sous le nom de Tween 20"par la société "ATLAS"1, 800 g Mélange de mono et distéarate de glycérol vendu sous la dénomination de"Geleol"par la société"GATTEFOSSE"............ 4, 200 g Propylène glycol...................................................... ........................ 10, 000 g Butylhydroxyanisole......................................... ............................... 0,010 g Butylhydroxytoluène ; ; 0,020 g Alcool cétostéarylique 6,200 g Conservateurs............................................... .................................... q. s.

Perhydrosqualène........................................... ............................... 18,000 g Mélange de triglycérides caprylique-caprique vendu sous la dénomination de"Miglyol 812"....... par la société"DYNAMIT NOBEL"..........,........................................... .................................. 4 000 g Eau q. s. p........................................................... ............................. 100,000 g (i) On prépare l'onguent anhydre suivant : Composé de l'exemple 1 5,00 g Huile de vaseline 50,00 g Butylhydrotoluène ............................................................ ............. 0,05 g vaseline blanche qs 100 g 3) VOIE INTRALESIONNELLE (a) On prépare la composition suivante : Composé de l'exemple 3 ............................................................ .... 0,002 g Oléate d'éthyle qs 10 g (b) On prépare la composition suivante : Composé de l'exemple 1 ............................................................ .....0.05 % Polyethylene glycol 20% SolutiondeNaClàO. 9% ; qs 100 (c) On prépare la composition suivante : Composé de l'exemple 3 2.5 % Polyethylene glycol 400......................................................... ............... 20% Solution de NaCl à 0. 9% qs 100 4) VOIE INTRAVEINEUSE (a) On prépare le composition injectable suivante : Composé de l'exemple 1 0.001 % Metmetlico 0. 01% Polyethylene glycol 400 20 % Solution de NaCl à 0.9%........................................................ .........qs 100

(b) On prépare le composition injectable suivante : Composé de l'exemple 2 0.01% Polyethylene glycol 400 : 20% Solution de NaCl à 0.9% qs 100 (c) On prépare la composition de cyclodextrine suivante : Composé de l'exemple 3........................................................... ..... 0, lmg cyclodextrine ; 0, 10 g Eau pour injectable q. s. p........................................................... ... 10,00 g (d) On prépare la composition de cyclodextrine suivante : Composé de l'exemple 4 0,01 g 2-hydroxypropyl cyclodextrine............................................... ....... 0 ; 10 g Eau pour injectable q. s. p............................... 10, 00