Abwehrstoff gegen die Bildung von Haustorien als Pflanzenschutzmittel gegen Pflanzenparasiten

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Peptid-Inhibitor einer pflanzlichen Cysteinprotease, der die Ausbildung von Haustorien bei Pflanzenpathogenen hemmt und dessen Verwendung als Pflanzenschutzmittel, insbesondere bei Tomate oder Sojabohne.

Die Familie der Cuscutaceae (manchmal wird diese Familie auch zu den Convolvulaceae gezählt) umfasst ca. 150 Spezies der Gattung Cuscuta, die alle parasitisch auf anderen Angiospermen leben. Alle Cuscuta-Aήen bestehen aus einem gewundenen Spross, besitzen keine Wurzeln und nur rudimentäre, schuppenförmige Blätter. In hiesigen Breiten ist Cuscuta euro- paea, auch Teufelszwirn oder Springseide genannt, heimisch und vor allem an Flußauen anzutreffen, wobei meist die Brennnessel als Wirtspflanze dient.

Mit speziellen Organen, den sog. Haustorien, stellen Cwscttta-Pflanzen Kontakt zum Gefäßsystem der Wirtspflanzen her und entziehen diesen organische und anorganische Nährstoffe. Doch werden durch diese Haustorien nicht nur Nährstoffe geschleust. Cuscuta dient ebenso als effektiver Vektor zur übertragung von verschiedenen Viren, und auch die übertragung von RNAs bzw. RNA-Protein Komplexen kann nicht ausgeschlossen werden.

Der pflanzliche Parasit Cuscuta reflexa infiziert nahezu jede Pflanze und entzieht den Wirtspflanzen wichtige Nährstoffe, welches zu einem Absterben der infizierten Pflanzen führen kann. Ganze Felder von Nutzpflanzen können auf diese Art vernichtet werden. Vor allem beim Sojabohnen- und Tomatenanbau in Amerika und im südostasiatischen Raum hat dies verheerende Folgen. Da es sich bei Cuscuta reflexa um eine höhere Pflanze handelt, bereitet es besondere Schwierigkeiten den Parasiten wirksam zu bekämpfen ohne die Nutzpflanzen zu schädigen.

Heutzutage werden die Samen von Cuscuta und Nutzpflanzen aufwendig getrennt, um zu vermeiden, dass es einer unkontrollierten Ausbreitung des Schädlings kommt. In vielen Ländern besteht ein striktes Verbot Samen zu verkaufen, welche mit Cuscuta Samen infiziert sind. Falls es zu einem Cuscuta-Befall kommt werden die Pflanzen, bei kleinerem Befall, per

ERSAT^BLATT (REGEL 26)

Hand entfernt Bei größerem Befall wird das Feld unter Umständen abgebrannt um eine Epidemie zu verhindern. (Quelle: http://www.ipm.ucdavis.edulPMGIPESTNOTESlpn7496.html) Als Alternative verwendet man das Spritzmittel Glyphosat („RoundUp"®)

Die Entwicklung von Haustorien ist für Cuscuta überlebenswichtig und stellt den zentralen Schritt für eine erfolgreiche Infektion dar. Bei der Ausbildung von Haustorien spielen zelluläre Faktoren eine essentielle Rolle.

Albert et al (in Albert M, Werner M, Proksch P, Fry SC, Kaldenhoff R. The cell wall- modifying xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase LeXTHl is expressed during the de- fence reaction of tomato against the plant parasite Cuscuta reflexa. Plant Biol (Stuttg). 2004 Jul;6(4):402-7.) beschreiben die Identifizierung von Genen, die im Frühstadium der Infektion mit Cuscuta induziert werden. Ein identifiziertes Gen war eine Hydrolase, XTH.

Nadler-Hassar et al. (Nadler-Hassar T, Goldshmidt A, Rubin B, Wolf S. Glyphosate inhibits the translocation of green fluorescent protein and sucrose from a transgenic tobacco host to Cuscuta campestris Yunk. Planta. 2004 Sep;219(5):790-6. Epub 2004 Jun 2.) beschreiben die Wirkung von Glyphosat auf Cuscuta campestris an Tabak.

Torres et al. (Torres MJ, Tomilov AA, Tomilova N, Reagan RL, Yoder JI. Pscroph, a parasitic plant EST database enriched for parasite associated transcripts. BMC Plant Biol. 2005 Nov 16;5:24.) beschreiben eine Haustorien-relevante EST-Datenbank.

Tada et al. (Tada Y, Wakasugi T, Nishikawa A, Furuhashi K, Yamada K. Developmental regulation of a gene coding for a low-molecular-weight heat shock protein during haustorium formation in the seedlings of a holoparasitic plant, Cuscuta japonica. Plant Cell Physiol. 2000 Dec;41(12):1373-80.) beschreiben die Identifizierung eines Gens, das an der Bildung von Haustorien in Cuscuta japonica beteiligt ist.

Die Sequenznummer AF 138265 betrifft eine bestimmte Cysteinprotease (papain-like cysteine Proteinase isoform II) aus der Süßkartoffel (Ipomoea batatas). Diese wurde am 26. März 1999 in der Datenbank hinterlegt. Die Sequenznummer Q9M7D5 IPOBA betrifft ebenfalls eine bestimmte Cysteinprotease. Diese wurde im Oktober 2000 in der Datenbank hinterlegt.

US 6,451,604 beschreibt ebenfalls eine bestimmte Cysteinprotease (Sequenz 165). WO 02/22675 betrifft eine bestimmte Cysteinprotease (Sequenz 500) aus Arabidopsis thaliana.

US 4,915,726 betrifft ein Verfahren zur Kontrolle von Cuscuta, wobei die Pflanze mit einer Pilzkultur als Mycoherbizid besprüht wird.

Valueva und Mosolov (RoIe of inhibitors of proteolytic enzymes in plant defense against phy- topathogenic microorganisms. Biochemistry (Mose). 2004 Nov;69(l l):1305-9) beschreiben verschiedene Verwendungen von Proteinasen und deren Inhibitoren.

Im Hinblick auf die oben genannten Nachteile des Standes der Technik ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues und Umwelt-schonendes Verfahren von Haustorien- bildenden Pflanzenpathogenen zur Verfügung zu stellen. Das Verfahren soll auf einem Wirkstoff beruhen, der wirksam, unbedenklich und kostengünstig herzustellen ist.

Gemäß eines ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe durch ein Polypeptid einer Cystein-Protease, umfassend ein Inhibitor-Peptid gemäß SEQ ID Nr. 1 oder eine Peptidsequenz mit mindestens 80% und bevorzugt 90% Aminosäure-Identität zu SEQ ID Nr. 1 gelöst. Bevorzugt ist eine Cystein-Protease, die ein Inhibitor-Peptid mit mindestens 95% Aminosäure-Identität zu SEQ ID Nr. 1 umfaßt. Erfindungsgemäß bevorzugte Peptide umfassen das Inhibitor-Peptid gemäß SEQ ID Nr. 2, gegebenenfalls mit einer N- oder C- terminalen Aminosäure- Verlängerung, bevorzugt mit einer Länge von 5, weiter bevorzugt 10, noch weiter bevorzugt 20, 50 oder 100 Aminosäuren Länge, entweder aus einer entsprechenden Protease oder als Fusionsprotein. Bestandteile des Fusionsproteins können zum Beispiel Enzymmarker sein. Das erfindungsgemäße Peptid kann jede Länge aufweisen, solange das Peptid die Haustorien-Bildung unter geeigneten Bedingungen inhibiert. Bevorzugt sind jedoch erfindungsgemäße Inhibitor-Peptide, die nicht die vollständige Proteasesequenz umfassen. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 2. Das erfindungsgemäße Peptid kann auch sein Homolog oder Ortholog des Peptids der SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 sein.

Durch die vorliegende Erfindung wird ein Weg aufgezeigt, der einen Parasitenbefall von Wirtspflanzen durch Haustorien-bildenden Pflanzenpathogene, bevorzugt Cuscuta, pathogene Pilze und besonders bevorzugt C. reflexa verhindert und bereits befallene Pflanzen vom Para-

siten befreit. Durch die Anwendung eines erfindungsgemäßen ungefährlichen Peptids in einer z.B. wässrigen Lösung, das zudem biologisch abbaubar ist, wird ein Eindringen von Infektionsorganen des Parasiten (Haustorien), verhindert bzw. löst sich der Parasit von der behandelten Pflanze ab. Auf diese Weise wird eine Ausbreitung des Parasiten auf landwirtschaftlich genutzten Anbauflächen unterbunden.

Die erfindungsgemäße Proteinase (SEQ ID Nr. 2) wird als so genanntes Pra-Pro-Protein vom Parasiten hergestellt und dann mittels Prä-Peptid nach außen in die Nahe des potentiellen Wirtes geschleust. Durch Abspalten des Pro-Peptids, welches als Inhibitor der Proteinase- funktion wirkt, wird die eigentliche Proteinase aktiviert. Ist die Proteinase gehemmt, wird dadurch die erfolgreiche Infektion verhindert und eine Verbreitung des Parasiten unterbunden.

EP 1,637,607 beschreibt Promotoren zur Aktivierung von Pflanzengenen nach Infektionen mit Pathogenen, wie Bakterien, Viren, Pilzen, Einzellern. Die betreffenden Promotoren sollen in der Lage sein, durch Interaktion mit Pathogenen bzw. Elicitoren die Transkription spezieller Gene der Wirtspflanze zu regulieren. Im Gegensatz dazu wird in der vorliegenden Patentanmeldung ein Peptid aus dem Parasiten Cuscuta zur Abwehr des Parasiten verwendet. Eine Reaktion der Wirtspflanze auf die Infektion mit dem Pathogen ist nicht vorgesehen. Im Gegenteil, eine Interaktion von Wirt und Parasit durch Etablierung chimärer Zellwände soll gerade verhindert werden. Darüber hinaus bezieht sich auch das Verfahren in EP 1,637,607 zur Identifikation von Genen, die durch Pathogene induziert werden, ausschließlich auf die Gene des Wirtes.

Rooney et al (in Rooney HC, Van't Klooster JW, van der Hoorn RA, Joosten MH, Jones JD, de Wit PJ. Cladosporium Avr2 inhibits tomato Rcr3 protease required for Cf-2-dependent disease resistance. Science. 2005 Jun 17;308(5729): 1783-6. Epub 2005 Apr 21.) beschreiben, daß durch die Komplexbildung einer extrazellulären Cystein-Protease aus der Tomate (Rcr3) mit einem inhibitorischen Protein aus dem Pathogen Cladosporium fuhum (Avr2) das Cf-2- Protein der Tomate eine HR-Reaktion auslösen kann. Es handelt sich also um das interessante Phänomen, daß durch die Inhibition einer wirtsspezifischen Protease mit einem pathogen- spezifischen Inhibitor eine Abwehrreaktion der Wirtspflanze induziert wird. Die Funktion der in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebenen Cystein-Protease unterscheidet sich demgegenüber grundlegend. Durch Inhibition einer Parasit-spezifischen Protease mit einem

Parasit-spezifischen Inhibitor soll ein Parasit-spezifischer Infektionsmechanismus, die Hau- storienbildung, verhindert werden.

Bei der Erfindung handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform um einen Cystein- proteinase-Inhibitor, ein Peptid aus dem Parasiten Cuscuta reflexa, das dem Pflanzenschutz dienen soll. Dieses Peptid lässt sich einfach mit gängigen biotechnologischen Methoden herstellen. Durch Aufsprühen dieses Peptids auf Wirtspflanzen für den Parasiten C. reflexa lässt sich eine Parasitierung erfolgreich verhindern. Die vorliegende Erfindung ist aus mehreren Gründen innovativ: Sie ist leicht herzustellen, leicht anzuwenden und umweltverträglich.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es synthetisch hergestellt worden ist. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bestens bekannt und in der Literatur beschrieben. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Peptide auch als retro- inverse Peptide oder Peptidomimetika vorliegen, die sich insbesondere durch den Aufbau des Peptidrückgrats von herkömmlichen Peptiden unterscheiden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Optimierung eines erfindungsgemäßen Inhibitor-Peptids, bei dem das Inhibitor-Peptid in seiner Aminosäuresequenz durch Standardverfahren verändert wird (z.B. durch konservative oder nicht-konservative Aminosäure-Austausche) und das so veränderte Peptid auf seine Eigenschaften hin untersucht wird, die normalerwiese Effektivität bei der Inhibierung der Hautorien und Stabilität in Zusammensetzungen, aber auch eine reduzierte Toxizität oder Abbaubarkeit einschließen können. Entsprechend veränderte Inhibitor-Peptide sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt und weisen ebenfalls zu mindestens 80% und bevorzugt 90% Aminosäure- Identität zu SEQ ID Nr. 1 auf.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert. Die Nukleinsäure ist dadurch gekennzeichnet, daß sie eine DNA, RNA, mRNA, cDNA, CNA, PNA, vorzugsweise eine DNA, insbesondere eine doppelsträngige DNA ist mit einer Länge von mindestens 24 Nukleotiden ist. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können aber auch länger sein. Weiter bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz der Nukleinsäure mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäße Nukleinsäure in Form ihrer komplementären "antisense"-Sequenz.

Erfindungsgemäß kann die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet sein, daß sie synthetisch hergestellt worden ist. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bestens bekannt und in der Literatur beschrieben. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann einen Vektor, vorzugsweise in Form eines Plasmids, Shuttle Vektors, Phagemids, Cosmids, Expressionsvektors, retroviralen Vektors, adenoviralen Vektors oder Partikels und/oder gentherapeutisch wirksamen Vektors, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure.

Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichteten Antikörpers, vorzugsweise eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers zur Inhibierung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, wobei ein Antikörper produzierender Organismus mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Teilen davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren immunisiert wird. Diese Antikörper können als Werkzeuge bei der Untersuchung der Funktion der erfindungsgemäßen Peptide dienen. Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Antikörper, insbesondere monoklonalen Antikörper, hergestellt wie oben, der gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet ist. Es können auch Antikörper-Fragmente hergestellt werden, wie zum Beispiel rekombinante scFv-Antikörperfragmente oder Fab.

Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanzenschutz-Zusammensetzung gelöst, umfassend Mischen eines erfindungsgemäßen Polypeptids mit einem geeigneten Träger. Bevorzugt kann der Träger eine wäßrige Lösung, eine Kombination mit einem herkömmlichen Pflanzenschutzmittel oder ein Zellysat sein. Weiter bevorzugt ist eine erfindungsgemäß hergestellte Pflanzenschutz-Zusammensetzung, umfassend ein erfindungsgemäßes Polypeptid eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder einen erfindungsgemäßen Antikörper, gegebenenfalls mit einem geeigneten Träger wie oben.

Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung einer transgene Pflanze gelöst, umfassend Transformation einer Pflanzenzelle mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure. Bevorzugt wird die Zelle mit einem Expressionskonstrukt transformiert, so dass sie ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimiert.

Bevorzugt ist ein Verfahren, wobei der Nukleinsäure eine Exportsequenz vorgeschaltet ist, so daß das Peptid aus der Zelle exportiert wird.

Durch Expression des Polypeptids durch die Wirtspflanze selbst ist diese in der Lage, den Parasiten direkt abzuwehren. Bevorzugt sind zwei Möglichkeiten: a) Integration der das erfindungsgemäße Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz(en) in das Genom der Wirtspflanze, und b) Integration der das erfindungsgemäße Polypeptid kodierenden Nukleinsäure- sequenz(en) in das Genom der Wirtspflanze einschließlich einer vorgeschalten Exportsequenz, so daß das Peptid nach außen und in direkten Kontakt mit dem Parasiten gebracht wird. Eine bevorzugte Exportsequenz ist die Präsequenz der Cystein-Protease (AS 1 bis 31 der SEQ ID Nr. 2).

Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird die Aufgabe durch eine transgene Pflanze, hergestellt nach einem erfindungsgemäßen Verfahren wie oben, gelöst. Die transgenen Pflanzen können alle Pflanzen sein, die durch Haustorien-bildende Pflanzenpathogene befallen werden, besonders jedoch Pflanzen ausgewählt aus Tomate (So- lanum lycopersicum L.), Sojabohne {Glycine max (L.)), Zuckerrübe (Beta vulgaris), Luzerne (Alfalfa, Medicago sativa), Klee (Trifolium spp.), Wein (Vitis spp.), Paprika (Capsicum spp.), Zwiebel (Allium cepa), dicke Bohne (Viciafaba), Salat (Lactuca spp.), Spinat (Spinacia spp.), Bonsai-Baum und Zitruspflanze.

Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Bekämpfung von Haustorien-bildenden Pflanzenpathogenen, umfassend Aufbringen einer Pflanzenschutz-Zusammensetzung wie oben auf eine Pflanze gelöst. Durch die erfindungsgemäß bevorzugte äußere Applikation des Inhibitor-Peptids, bevorzugt des ProPeptids (PIN, SEQ ID Nr. 1), das von der Vorläufersequenz der Cysteinproteinase abstammt, die z.B. in E. coli hergestellt wird und entweder aufgereinigt oder sogar im E. coli Lysat aufgetragen werden kann, kann die Ausbildung von Haustorien gezielt verhindert werden. In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können auch mehrere erfindungsgemäße Cysteinproteinase Inhibitor-Peptide vorhanden sein.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bekämpfung von Haustorien-bildenden Pflanzenpathogenen kann grundsätzlich für alle Pflanzenpathogene verwendet werden, die Haustorien aubilden, da angenommen wird, dass die vorliegenden Cysteinproteinase Inhibi-

tor-Peptide einen zentralen Angriffspunkt auf die Haustorienbildung darstellen, da die Effektivität in den im Rahmen der Erfindung durchgeführten Experimenten bei 100% lag. Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bekämpfung von Haustorien-bildenden Pflanzenpathogenen, wobei die Pflanzenpathogene ausgewählt sind aus Cuscuta, pathogenen Pilzen, Rostpilzen, Mehltau und Parasiten der Familie der Orobranchaceae.

Die zu behandelnden Pflanzen sind alle Pflanzen, die durch Haustorien-bildende Pflanzenpathogene befallen werden, besonders jedoch Pflanzen wie Tomaten (Solarium lyco- persicum L.), Sojabohnen (Glycine max (L.)), Zuckerrüben (Beta vulgaris), Luzerne (Alfalfa, Medicago sativa), Klee (Trifolium spp.), Wein (Vitis spp.), Paprika (Capsicum spp.), Zwiebel (Allium cepa), dicke Bohnen (Vicia fabä), Salat (Lactuca spp.), Spinat (Spinacia spp.), Bon- sai-Bäumen und Zitruspflanzen. Unter Bonsai-Bäumen werden insbesondere alle verholzenden, kleinblättrigen (bzw. kleinnadligen) Baum- und Straucharten verstanden, wobei traditionell Kiefern, Wacholder, Ahorne, asiatische Ulmenarten, Azaleen, Fruchtbäume wie Kulturapfel oder japanische Aprikose verwendet werden, aber auch kleinblättrige Ahornarten - unter ihnen die rotblättrigen japanischen Ahornsorten - Fichten und Buchen.

Besonders bevorzugt ist ein Verfahren zur Bekämpfung von Haustorien-bildenden Pflanzenpathogenen wobei das Aufbringen der erfindungsgemäßen Peptide und/oder der Zusammensetzung durch Aufsprühen auf die Pflanze erfolgt.

Zuletzt betrifft ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines erfϊndungsgemäßen Peptids, einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder eines erfindungsgemäßen Antikörpers zur Bekämpfung von Haustorien-bildenden Pflanzenpathogenen wie oben ereits erläutert.

Durch die hier dargestellte Erfindung wird ein Weg aufgezeigt, der einen Parasitenbefall von Wirtspflanzen durch bevorzugt C. reflexa verhindert und bereits befallene Pflanzen vom Parasiten befreit. Durch die Anwendung eines ungefährlichen Peptids z.B. in einer wässrigen Lösung, das zudem biologisch abbaubar ist, wird ein Eindringen von Infektionsorganen des Parasiten, verhindert bzw. löst sich der Parasit von der behandelten Pflanze ab. Auf diese Weise wird eine Ausbreitung des Parasiten auf landwirtschaftlich genutzten Anbauflächen unterbunden.

Das Peptid ist ein natürliches Produkt, das vollständig abbaubar ist. Es lässt sich spezifisch nur gegen den Parasiten anwenden, eventuelle Nützlinge, sowie die zu schützende Nutzpflanze (=Wirtspflanze) nehmen aller Voraussicht nach keinen Schaden.

Die vorliegende Erfindung soll im folgenden anhand der beigefügten Beispiele weiter beschrieben werden, ohne jedoch auf diese beschränkt zu werden. In den Figuren und Sequenzen zeigt:

SEQ ID Nr. 1 : Die Aminosäure-Sequenz des erfindungsgemäßen Propeptids (Inhibitor-Sequenz) aus C. reflexa.

SEQ ID Nr. 2: Die Aminosäure-Sequenz der gesamten erfindungsgemäßen Cystein-Proteinase aus C. reflexa.

SEQ ID Nr. 3: Die erfindungsgemäße cDNA-Sequenz der gesamten Cystein-Proteinase aus C. reflexa.

SEQ ID Nr. 4: Die erfindungsgemäße cDNA-Sequenz des Propeptids (Inhibitor-Sequenz).

Figur 1 : die Wirkung des erfindungsgemäßen Inhibitor-Pro-Peptids. (A) normaler unbeein- flusster Befall, (B) Wirkung des erfindungsgemäßen Inhibitor-Pro-Peptids 7 Tage nach Applikation.

Figur 2: eine schematische Darstellung des verwendeten Gateway® Vektors, welche den Rekombinationsort zeigt (gestrichelt unterlegt). Am 5'-Ende befinden sich zwei 35S Promotoren. Die Bedeutung der Abkürzungen: attR: attachment site, Cm ^r : Chloramphenicolresistenz, ccdB: "Killergen" (Das Genprodukt inhibiert die Helikase der Zelle), nos T: Transkriptions- stop, Hyg ^r : Hygromycinresistenz. Der Vektor enthält ebenfalls eine Kanamycinresistenz (nicht gezeigt).

Beispiele

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine cDNA-Bibliothek im Umfang von ca. 7000 cDNA Klonen des Parasiten Cuscuta angelegt. Es wurde speziell Gewebe aus Prähau-

storien und Haustorien zur Herstellung der cDNA-Bibliothek verwendet. Die parasitären cDNA-Klone wurden in zweifacher Ausfuhrung auf „Microarray chips" aufgetragen. Zwei identische „Chips" wurden mit zwei unterschiedlichen cDNASonden hybridisiert, die einmal mit Gesamt-RNA aus prähaustorialem und haustorialem Gewebe als Matrize, und im andern Fall mit Gesamt-RNA aus Cuscuta-Spross als Matrize synthetisiert wurden. Auf diese Weise sind bis jetzt 2000 cDNA-Klone differentiell nach cDNAs durchmustert worden, deren Gene bei der Haustorienentwicklung, also während der Infektion im Parasiten Cuscuta reflexa induziert sind.

cDNA-Klone deren Gene während der Infektion in Cwscwta-Prähaustorien induziert sind, auf dem Chip also deutliche Signale gaben, wurden sequenziert. Deren cDNA, sowie Protein- Sequenzen wurden in Datenbanken (NCBI) mit bekannten Sequenzen verglichen.

Dabei wurde die Sequenz für die erfindungsgemäße Cystein Proteinase, sowie die darin enthaltene Teilsequenz des erfindungsgemäßen Inhibitor-Peptids identifiziert, die in der cDNA zu 86% und in der Aminosäuresequenz zu 90% zu einer Cystein-Protease aus der Süßkartoffel {Ipomoea batatas) identisch war.

Die erfϊndungsgemäße cDNA-Sequenz der gesamten Cystein-Proteinase (SEQ ID Nr. 3) lautet:

ATGGCACTCCGTTTATCTCTCATGTTCTTACTATGCTCCTTCCTCCTAGTGACAACG TCTTTGGGGCTCGCCGAC

TTCACAGTTTTCAAGAAGCGGTTCGGAAAGGCGTACGCCTCGGAGGAGGAGCACGAT TACAGGTTCTCTGTGTTC

GATTTGACCCCATCCGAATTCAAACGCAACTTTCTCGGATTGAATCGCCGGCTTAGG TTTCCAGCCGATGCTCAA ACAGCTCCCACCCTTCCCACCGACGATCTCCCGTCAGATTTCGATTGGAGAGACCATGGT GCCGTTACGGCAGTA

ACTGGGAAGCTCGTGAGCCTTAGTGAGCAACAGCTTGTGGATTGTGATCACGAGTGT GACCCTGAAGAAGCTGGT TCTTGTGATTCTGGCTGCAATGGCGGGCTCATGACCAGCGCCTTTGAATACACATTGAAA GCTGGCGGGCTAATG AGGGAAGAAGACTACCCTTACACAGGCAACGATGCTCAAGTCTGCAACTTTGACAAAACC AAGATTGCAGCCAAG GTTGCCAACTTCAGCGTGGTATCCCTCGACGAAGACCAAATCGCTGCAAATCTGGTCAAG AACGGCCCTCTTGCA GTGGCAATCAACGCAGTGTTCATGCAGACATACGCAGGGGGAGTTTCATGCCCATACATT TGCTCCAAGCGGTTG GACCATGGCGTCCTGCTGGTGGGTTATGGTTCAGCAGGCTATGCCCCTGTTCGGGCGAAA GAGAAGCCTTATTGG GTCATCAAGAACTCTTGGGGAGAGCAATGGGGGGAGAAGGGGTACTACAAGATATGCAGG GGAAGCAATGTGTGT GGAGTGGACTCCATGGTTTCAACTGTTGCAGCTGTTAGCACCAACTCGGAGTAGCAGCAG CAAAGAAAGTAGCTT TTGTACATAAGTTTTTTTTTGCGTGTGATGTCCTGGGGAGCCATAACACAATACAGCATC ACATTATGCAAGTGT

GTGTATTCACTATTATTTcATTAATCTATTTCTCAATTTGGTCAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA

Die erfindungsgemäße cDNA-Sequenz des Propeptids (Inhibitor-Sequenz) (SEQ ID Nr. 4) ist:

ATTCTGATCCGTCAAGTTGTCGGAGACGACGGCGCACTGCTGAGCGACGACCACCAA TTCACAGTTTTCAAGAAG CGGTTCGGAAAGGCGTACGCCTCGGAGGAGGAGCACGATTACAGGTTCTCTGTGTTCAAG GCTAACATGCGCCTT GCAAAGCAACACCAACAGCTCGACCCCTCCGCCGTCCACGGTGTCACTCGCTTCTCCGAT TTGACCCCATCCGAA

TTCAAACGCAACTTTCTCGGATTGAATCGCCGGCTTAGGTTTCCAGCCGATGCTCAA ACAGCTCCCACCCTTCCC ACCGACGAT

Die Aminosäure-Sequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids (Protease-Sequenz) (SEQ ID Nr. 2) lautet (Start-Methionin unterstrichen):

_MALRL SLMFLLCSFLLVTTSLGLADGSSSDDILIRQVVGDDGALLSDDHQFTVFKKRFGKAYASE EEHDYRFSVF _KA N _MR LAKQHQQLDPSAVHGVTRFSDLTPSEFKRNFLGLNRRLRFPADAQTAPTLPTDDLPSDFD WRDHGAVTAV KNQGSCGSCWSFSTTGALEGANFLATGKLVSLSEQQLVDCDHECDPEEAGSCDSGCNGGL MTSAFEYTLKAGGLM _REE DYPYTGNDAQVCNFDKTKIAAKVANFSVVSLDEDQIAANLVKNGPLAVAINAVFMQTYAG GVSCPYICSKRL DHGVLLVGYGSAGYAPVRAKEKPYWVIKNSWGEQWGEKGYYKICRGSNVCGVDSMVSTVA AVSTNSE

DieAminosäure-Sequenzdes erfindungsgemäßen Propeptids(Inhibitor-Sequenz) (SEQ ID Nr.1) lautet:

ILIRQVVGDDGALLSDDHQFTVFKKRFGKAYASEEEHDYRFSVFKANMRLAKQHQQL DPSAVHGVTRFSDLTPSE FKRNFLGLNRRLRFPADAQTAPTLPTDD

Die oben beschriebene Wirkung des Pro-Peptid wurde in Gewächshausversuchen an Cuscuta reflexa mit den Wirtspflanzenspezies Tabak (Nicotiana tabacum vor. Samsuή). Tomate (Ly- copersicon esculentum var. Money Maker) und Buntnessel (Coleus blumeϊ) durchgeführt.

Beispiele der Wirkung des Pro-Peptids verdeutlicht Figur 1. Links (A) ist der normale unbe- einflusste Befall zu sehen, in der rechten Abbildung (B) die Wirkung des Pro-Peptids 7 Tage nach Applikation. Diese Ergebnisse wurden in 100% der Fälle erhalten.

Konstitutive Expression des Propeptids in Nicotiana tabacum

Herstellung des Konstruktes

Die Konstrukte wurden mit Hilfe der Gateway® Technologie hergestellt (Invitrogen, U.S.A). Diese Methode basiert auf der Rekombination des Konstrukts in den Vektor und nutzt dabei die orts-spezifischen Rekombinationsstellen des Phagen Lambda, anstelle von "herkömmlicher" Ligation mittels Endonuklease und Ligase. Das Propeptid befindet sich nach erfolgter Rekombination am 3 '-Ende von zwei 35S-Promotoren (Figur 2), welche das Gen konstitutiv exprimieren. Das hergestellte Konstrukt wurde durch Hitzeschocktransformation in Agrobak- terien (GV3101) kloniert. Der Vektor wurde über ABRC-Stocks (http://www.arabidopsis.org/servlets/Order?state=catalog) bezogen. Der Vektor wurde dort von Mark D. Curtis und UeIi Grossnikiaus (2003) bereitgestellt.

Stabile Transformation von Nicotiana tabacum nach Horsch et al. (1985)

Die Agrobakterien (GV3101) wurden über Nacht bei 28 °C und 200 U/min in 3 ml 2YT-

Medium angezogen. 1 ml dieser Kultur wuH ^< 5 dazu benutzt um 50 ml 2YT zu inokulieren.

Das Medium enthielt jeweils 200 mg/L Kanamycin und 150 mg/1 Rifampicin. Die Kultur wurde bei 28 °C für weitere 24 Stunden inkubiert. Danach wurde die O.D. ₆₀₀ auf 1,0 mit 2YT eingestellt. Dies ergab eine Suspension mit einem Endvolumen von ca. 150 ml.

Es wurden 100 Blattscheiben aus ca. 6 Wochen alten Tabakblättern mit einem Korkbohrer (0 0,8 cm) ausgestanzt. Die Blattscheiben wurden in 2%iger Natriumhypochlorit-Lösung sterilisiert. Zur Transformation der Blattzellen mit dem Konstrukt wurden die Blattscheiben in die Bakterien-Suspension überführt und für 5 min inkubiert. Danach wurden die Blattscheiben auf ein saugfähiges Material gelegt, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Anschließend wurden die Blattscheiben auf Co-Kultivierungsmedium (Zusammensetzung s.u.) transferiert und in einem Klimaschrank für 2 Tage bei 25 °C und 16 h Licht (50-60 μmol/m ² s) inkubiert.

Es erfolgte ein Transfer der Scheiben auf Selektionsmedium (Zusammensetzung: s.u.). Nach einer Inkubation von 1 Woche bei obengenannten Verhältnissen wurden die Blattscheiben in vier Teile geteilt und weitere drei Wochen auf Selektionsmedium inkubiert. Nach ca. drei Wochen bildeten sich Sprosse, diese wurden an der Basis abgeschnitten, wenn sie ein Länge von 5 - 10 mm erreicht hatten und auf Wurzelmedium überführt (Zusammensetzung: s.u.). Nachdem die Sprosse Wurzeln gebildet hatten, wurden sie vom Agar befreit und in einer Mischung aus Erde, Perlit und Makrolit eingepflanzt und für 3-7 Tage mit einer transparenten Folie abgedeckt. Die Zeitspanne der Regeneration bis zur bewurzelten Pflanze, betrug zwei Monate. Sechs weitere Wochen vergingen bis zur Blütenbildung.

2YT-Medium: lό g Trypton

10 g Yeast Extrakt 5,0 g NaCl 200 mg/1 Kanamycin 150 mg/1 Rifampicin

Co-Kultivierungs-Medium: 1 x MS (Murashige & Skoge) Mikro- und

Makroelemente 3 % Sucrose (ICN) 1 mg/1 6-Benzylaminopurin (BAP) pH 5,8 mit KOH 0,8 % Pflanzen Agar MS-Vitamine

Selektions-Medium: wie Co-Kultivierungsmedium Antibiotika applizieren: 70 mg/L Hygromycin B 500 mg/L Carbenicillin

Wurzel-Medium: 1 x MS (Murashige & Skoge) Mikro- und Makroelemente

3 % Sucrose (ICN)

0,1 mg/1 Naphtylessigsäure (NAA)

MS -Vitamine

0,8 % Pflanzen Agar pH 5,8 mit KOH

Erdenzusammensetzung : 2 Teile Perlit

3 Teile Vermikulit (Hydroglimmer)

4 Teile Pflanzenerde