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La tecnología está orientada al área de la agricultura, más particularmente, corresponde a una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas.

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El daño por heladas tardías o primaverales en climas templados ocasiona grandes pérdidas económicas en la agricultura. Así, por ejemplo, en el Estado de Florida, EEUU, la industria de los cítricos ha sufrido pérdidas en cosecha y en plantaciones superiores en miles de millones de dólares (ODEPA, 2010). Este evento climatológico también afecta a países andinos, así en Chile se estima que las pérdidas por las heladas del mes de septiembre de 2013 estuvieron entre US$ 600 a US$ 900 millones y que el volumen de fruta exportada disminuyó entre 15 - 20%. Estas cifras estimativas sólo se refieren a la pérdida económica de esa temporada, ya que es difícil cuantificar las pérdidas por el daño fisiológico sufrido por las plantas debido a la helada.

La magnitud de este daño depende fundamentalmente de: (i) intensidad y duración de la helada; ( 7) concentración de bacterias activas nucleantes de hielo, conocidas como INA; (7/7) grado de endurecimiento, relacionado con la adaptabilidad de las plantas a las bajas temperaturas, que decrece rápidamente después de periodos cálidos; (iv) resistencia de la planta a la congelación; y (v) estadio fenológico de la planta. Así, en árboles frutales de hojas caducas, el daño se incrementa desde el desarrollo inicial de las yemas hasta el estadio de fruto pequeño, donde los cultivos son más sensibles a las heladas.

En los árboles frutales las pérdidas económicas por heladas tardías no sólo producen la merma o pérdida total de la cosecha por frutos deformes, con corteza parcial o total áspera o manchada, podridos, sino además al daño fisiológico sufrido por los árboles. Se debe considerar que las especies frutales de carozo tales como cerezo, ciruelo, duraznero, nectarino y almendro son más susceptibles a la pérdida total de la cosecha, ya que los frutos normalmente pierden su semilla y no son capaces de mantener su desarrollo partenocárpico.

El real daño que puede causar una helada primaveral se define principalmente por su magnitud (°C bajo cero) y por su duración. A medida que la temperatura desciende por debajo de 0°C, la formación de hielo se inicia típicamente en los espacios extracelulares de plantas debido a que el fluido extracelular i generalmente tiene un punto de congelación mayor que el fluido intracelular. Los cristales de hielo extracelulares dañan la membrana celular mediante el aumento de la concentración de solutos intracelulares (deshidratación), alteran la presión osmótica a través de la membrana celular y por el estrés mecánico con el aumento del tamaño de los cristales extracelulares (Saltveit y Morris, 1990). Se estima que temperaturas inferiores a 0 ^Q C durante 30 a 45 minutos en período de floración y cuaja de especies frutales, serían suficientes para producir algún tipo de daño en las estructuras reproductivas de la planta.

Las yemas de flor son las más afectadas por las heladas primaverales, las yemas vegetativas y los brotes jóvenes suelen aguantar más, salvo en las especies más sensibles en las que puede morir el brote, rebrotando unos días más tarde por las yemas laterales. Durante el desborre, la yema es más resistente que en el estado de botón verde (flor envuelta en los sépalos), y éste más resistente que el estado con la flor abierta (estado en el que se puede afectar más fácilmente el ginecéo, al estar menos protegido por las cubiertas florales). La sensibilidad máxima se da con el fruto recién consolidado. Una vez formado el fruto, la resistencia se incrementa al aumentar el tamaño del fruto (Sakai, 1987).

Los métodos existentes para disminuir el daño por heladas primaverales se clasifican en activos y en pasivos. Los métodos activos son aplicados al comienzo y durante la ocurrencia de la helada. Su principal objetivo es evitar la pérdida de calor del suelo y/o incidir activamente en la temperatura de la planta mediante aportes externos de energía. Ejemplo de métodos activos son: inversión de las capas de aire al mezclar, con ayuda de grandes hélices, el aire frío cercano al suelo con el aire cálido de las capas atmosféricas más altas; interrupción de la radiación que se pierde desde el suelo utilizando algún tipo de cubierta sobre la vegetación; aumento de los aportes energéticos al aire que rodea al vegetal u órgano con la ayuda de quemadores; y aspersión de agua sobre los cultivos, aprovechando la planta el calor liberado que produce el cambio de estado de líquido a sólido (80 cal/g).

Entre los métodos pasivos se encuentra la selección del emplazamiento del cultivo y de las especies o variedades de plantas resistentes al frío, y manejo de la nutrición vegetal, donde se controlan los fertilizantes que se agregan a las plantas para prepararlas antes de una helada, favoreciendo el endurecimiento y la recuperación de los tejidos.

Los agroquímicos crioprotectores se consideran métodos pasivos y se emplean generalmente por aspersión antes y durante la temporada de heladas. En particular, estos productos han demostrado baja efectividad, menor al 50%, aunque favorecen directamente la adaptabilidad natural de las plantas al congelamiento (endurecimiento), la cual decrece bruscamente a comienzos de la primavera. Se debe considerar que la resistencia de la planta a la helada radica en mantener la fluidez de la membrana celular durante el congelamiento y en tolerar la deshidratación inducida por la formación de cristales de hielo extracelulares, que conllevan a la ruptura de la membrana celular. Para ello, la planta sintetiza dehídrinas y proteínas anticongelantes, y reduce la cantidad de receptores y portadores localizados en la membrana durante el estadio de pre endurecimiento a finales del otoño.

Las proteínas anticongelantes o glicoproteínas anticongelantes inhiben la formación de cristales de hielo reduciendo el punto de congelación del agua y además controlan el tamaño, la forma y la agregación de los cristales de hielo (Hass- Roudsari et al., 2012). Las proteínas anticongelantes producen tres efectos: i) histéresis térmica, que corresponde a la diferencia entre el punto de congelación y la temperatura de fusión en estado de no equilibrio; ii) modificación de la forma de los cristales de hielo, lo que resulta en morfologías de cristales de hielo hexagonales; e

MI) inhibición de la recristalización del hielo durante el descongelamiento, en la recristalización cuando no están presentes agentes crioprotectores se forman cristales voluminosos a expensa de los cristales pequeños, que provocan daños físicos a la pared celular y facilitan el proceso de deshidratación por diferencia osmótica.

El empleo de proteínas anticongelantes como crioprotectores es técnicamente insostenible desde el punto de vista industrial, debido a que la extracción desde fuentes naturales como la sangre de insectos y peces genera un alto impacto medioambiental. Estas proteínas se encuentran naturalmente en muy bajas concentraciones y ejercen su actividad de forma no coligativa, haciendo muy difícil obtener la masa crítica necesaria de proteínas para replicarla. Ante este desafío se han sintetizado proteínas anticongelantes sintéticas o análogos con actividad crioprotectora (Peltier et al., 2010; Congdon et al., 2013).

Existen macromoléculas como polivinilpirrolidona y el polivinil alcohol (PVA) que de por sí son conocidos por sus propiedades crioprotectoras, específicamente actividad inhibitoria de la recristalización del hielo, a pesar de ser estructuralmente distintos a las proteínas. Los mecanismos de acción de las macromoléculas poliméricas no están completamente dilucidados. No obstante, la mayoría de los estudios concuerdan en que la adhesión de las macromoléculas a la superficie del hielo juega un papel preponderante en su efecto crioprotector.

Se han estudiado varias estrategias para modular o mejorar las propiedades crioprotectoras del PVA. Los PVA comerciales, atácticos y completamente hidrolizados (98 - 99% de grado) presentan actividad de inhibición de la recristalización de hielo (IRI), similar a las glicoproteínas anticongelantes (Biggs et al., 2017). La arquitectura y composición molecular (peso molecular y distribución de los grupos OH y acetato) se han modificado para mejorar las propiedades crioprotectoras del PVA. En general, un aumento en el peso molecular de PVA conduce a un aumento en la actividad IRI. Sin embargo, el PVA lineal, el ramificado y el que presenta conformación de estrella tienen actividades IRI comparables. Curiosamente, la estructura supramolecular del homopolímero de PVA modificado con grupos finales de catecol y coordinado a Fe ³⁺ (relación PVA: Fe ³⁺ de 1 : 0,33) aumenta la efectividad en la actividad IRI de PVA (Phillips et al., 2016), lo que sugiere que el volumen hidrodinámico de la estructura de PVA, por ejemplo, en forma de micro/nanopartículas de este polímero biomimético, juega un rol importante en IRI.

Algunos documentos vinculados con la presente tecnología se detallan a continuación:

1.- “Effect of Polyvinyl Alcohol on Ice Formation in the Presence of a Liquid/Solid Interface” (Zhu et al.); Langmuir 33(1): 191-196, 2016. Se señala que la formación de hielo es de gran importancia en los sistemas biológicos y en algunas aplicaciones tecnológicas, y que se ha demostrado que muchos polímeros sintéticos afectan la formación de hielo, en particular el PVA. Este estudio tiene por objeto comprender este proceso ya descrito. Se introdujo la sílice coloidal (CS) como modelo de interfaz líquido-sólido y se estudió el efecto del PVA en la formación de hielo en detalle. Los resultados mostraron que tanto el PVA como el CS promovían la formación de hielo, mientras que la mezcla de ellos (CS-PVA) prevenía su formación (anticongelante). La principal contribución proviene del factor cinético en lugar del factor de barrera energética. La combinación del comportamiento de adsorción de PVA en partículas de CS, sugiere que la adsorción de PVA en la interfase reduce la nucleación del hielo, lo que puede proporcionar nuevas ideas para el desarrollo de agentes crioprotectores.

2.- “The Synthesis of High Molecular Weight Partially Hydrolyzed Poly(vinyl alcohol) Grades Suitable for Nanoparticle Fabrication” (Chana, Jasminder et al.), Journal of Nanoscience and Nanotechnology,8(11 ): 5739-5747, 2008. Se divulga que el PVA es un polímero sintético muy versátil que se forma por hidrólisis total o parcial de poli(acetato de vinilo) (PVAc). Este estudio se centra en los PVA parcialmente hidrolizados en un rango de 30 - 60%. Se sintetizaron los grados anfifílicos de PVA a escala de laboratorio, analizaron sus propiedades químicas y determinaron si estos grados podían ser utilizados para formar nanopartículas. PVA 30%, PVA 40%, PVA 50% y PVA 60% por saponificación directa de PVAc. Todos los grados de PVA formaron nanopartículas utilizando una técnica de precipitación, con una tendencia hacia un tamaño de partícula más pequeño con un grado creciente de hidrólisis de PVA; el PVA 30% resultó en nanopartículas significativamente mayores (225 nm) en comparación con el PVA 40 - 60% (137-174 nm). 3.- “Preparation of monodisperse poly(vinyl alcohol) (PVA) nanoparticles by dispersión polymerization and heterogeneous surface saponification” (Lee, Y. et al.), Fibers and Polymers 17(4): 502-511, 2016. Se describe una preparación con una distribución uniforme de tamaño de nanopartículas monodispersas de PVA/poli (acetato de vinilo) (PVAc) mediante saponificación de PVAc. El acetato de vinilo (VAc) se polimerizó en dispersión en una mezcla de disolvente de etanol y agua. Al aumentar la cantidad de etanol en el medio, el tamaño de nanopartícula de PVAc resultante aumentó. Para determinar la concentración de solución alcalina para la saponificación heterogénea, se saponificaron nanopartículas monodispersas de PVAc con diferentes concentraciones a 25°C durante 0,5 - 3,0 h. Las nanopartículas de PVA/PVAc, obtenidas por la saponificación heterogénea con una solución alcalina del 4%, fueron uniformes y con una distribución estrella de tamaño, con diámetros que oscilaron entre 428 - 615 nm. La microscopía electrónica de transmisión confirmó la naturaleza esférica y la estructura regular del núcleo/coraza de las nanopartículas de PVA/PVAc.

4.- Patente US 6,391 ,224 (Wowk): “ Polyvinyl alcohol compounds for inhibition of ice growth". Se divulga el PVA y compuestos similares para inhibir la congelación de agua y de soluciones acuosas. Se prefieren concentraciones que oscilan entre 0,01% y 10% p/p con hidrólisis de 80 a 97% y peso molecular inferior a 30kDa; u oligómeros de PVA tales como: 1 ,3, 5, 7 heptanetetrol y homólogos, son activos como compuestos inhibidores del hielo, y donde el PVA está compuesto entre 1 y 25% de acetato de vinilo.

5.- Patente US 3,399,991 (Clarence): “Freeze resistant pesticida! composition”. Se refiere al uso de sustratos de pesticidas resistentes a la congelación. Su composición es de 20 a 50% de pesticida pulverulento, 0,15 a 1 ,5% de metilcelulosa de baja viscosidad, 0,1 a 2,5% de alcohol polivinílico, sulfato de lignina parcialmente desulfurada o alquilaril sulfonato polimerizado, y 46 a 79,8% en solución acuosade etilenglicol o propilenglicol en la que la relación glicoLagua es de 2:1 a 1 :23.

En base a estos antecedentes, aún persiste la necesidad de encontrar alternativas que permitan modular la formación y el crecimiento de hielo, y con ello, inhibir la recristalización del hielo extracelular, mitigando así el daño que provocan las heladas primaverales en las plantas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 : corresponde a las imágenes de microscopía electrónica de barrido (a, d y g), a los histogramas a partir de la microscopía de barrido (b, e y h) y a las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de las micro/nanopartículas de PVA obtenidas a partir de PVA de diferente peso molecular promedio en peso (c, f e i); donde: (a), (b) y (c) corresponde a micro/nanopartículas de L-PVA; (d), (e) y (f) a micro/nanopartículas de m-PVA; y (g), (h) e (i) a micro/nanopartículas de ñ-PVA. Figura 2: corresponde a los espectros FTIR de las macromoléculas de PVA de diferente peso molecular promedio en peso (a, c y e) y de las micro/nanopartículas de PVA (b, d y f), donde: (a) y (b) corresponde a L-PVA; (c) y (d) a m- PVA; y (e) y (f) a h- PVA.

Figura 3: corresponde a imágenes de microscopía óptica de una gota congelada de agua que contiene: solución de PVA de diferentes peso molecular promedio en peso al 1 ,0 % p/v (A, B, E, F, I y J); dispersión de micro/nanopartículas de PVA 1 ,0 %p/v (C, D, G, H, K y L) y solución de NaCI al 0,137 mol/L (O y P), y al 0,7 mol/L (Q y R) a tiempo cero (A, E, I, O, C, G, K y Q) y a los 60 min (B, F, J, P, D, H, L y R) de mantener las muestras a -6°C; donde: (A), (B), (C) y (D) corresponde a L-PVA; E, F, G y H a m-PVA; e (I), (J), (K) y (L) a h- PVA.

Figura 4: corresponde a imágenes de microscopía óptica de una gota congelada de agua que contiene: solución de PVA de diferentes peso molecular promedio en peso al 0,01 % p/v (A, B, E, F, I y J) y dispersión de micro/nanopartículas de PVA 0,01 %p/v (C, D, G, H, K y L) y solución de NaCI al 0,07 mol/L (O y P), a tiempo cero (A, E, I, O, C, G y K) y a los 60 min (B, F, J, P, D, H y L) de mantener las muestras a -6°C; donde: (A), (B), (C) y (D) corresponde a L-PVA; (E), (F), (G) y (H) a m-PVA;e (I), (J), (K) y (L) a h- PVA.

Figura 5: corresponde a los ensayos de microcámara sobre el efecto de la aplicación de los diferentes productos (agua, solución de PVA, dispersión de micro/nanopartículas y crioprotector comercial) en la incidencia del daño por heladas en primordios florales en condiciones simuladas de heladas (-5°C por 4h); los valores representan el promedio de distintos estados fenológicos.

Figura 6: corresponde a los resultados del ensayo de campo expresados en daño de primordios florales en los estados fenológicos de: yema en receso, yema hinchada, botón verde y floración al aplicar los diferentes productos (agua, solución de PVA, dispersión de micro/nanopartículas y crioprotector comercial); donde (a) corresponde a solución de PVA a 0,1 %p/v; (b) a dispersión de micro/nanopartículas de PVA (0,01 %p/v), (c) a agente crioprotector comercial y (d) a agua.

Divulgación de la Invención

La presente tecnología corresponde a una formulación acuosa cuyo principio activo es un soluto biomimético que reduce los daños en plantas producidos por heladas primaverales. Esta formulación contiene micro/nanopartículas de PVA, un polímero biomimético con actividad inhibidora de la recristalización del hielo, que logra una protección a las plantas, independientemente del estado fenológico, en condiciones de hasta -5°C y durante 4 horas.

Específicamente, la formulación acuosa comprende al menos los siguientes componentes: a. 0,001 - 2% peso de micro/nanopartículas de PVA, cuyo peso molecular fluctúa entre 10.000 - 100.000 g/mol y el porcentaje de grupos acetatos entre 1 y 20%; b. 0,0001 - 0,4% peso de agentes estabilizantes tales como polivinilpirrolidona y/o del tipo surfactantes no iónicos como tween c. 0,0005 - 0,05% peso de coadyuvantes comerciales categoría IV tales como Induce pH® que actúa como buffer o tapón al diluir el concentrado de la formulación; d. 0,00025 - 4% peso de emulsificante tal como la lecitina de soya para potenciar la adherencia de la formulación; e. 0,003 - 6% peso de hidróxido de sodio agente formador de las micro/nanopartículas de PVA; f. 0,0065 - 13 % peso de ácido clorhídrico (37% p/p y densidad 1 ,18 g/mL) como agente neutralizante.

La formulación en base a las nanopartículas de PVA se obtiene a través de un proceso de precipitación o tratamiento alcalino, el cual comprende al menos las siguientes etapas: a. disolución de PVA: el PVA se debe disolver en agua en al menos una relación 1/50 en baño mineral y con temperaturas que fluctúan entre 40 - 100 °C, dependiendo del peso molecular y el grado de hidrólisis del PVA y durante al menos 2 hora, empleando agitación con velocidades entre 500 - 900 rpm. b. disolución: el hidróxido de sodio se debe disolver en agua a temperatura ambiente (20 °C), empleando agitación con velocidades entre 500 - 900 rpm y concentraciones que fluctúan entre 2 - 8 % peso/volumen; c. mezclado: la solución obtenida en la etapa (a) se mezcla en un reactor que contiene una solución de la etapa (b) en la menos una relación de 1 /1 , mediante goteo usando una bomba peristáltica con velocidades que fluctúan entre 10 - 50 mL/h. Durante el mezclado se emplea agitación con velocidades entre 700 - 8000 rpm. En esta etapa se obtienen micro/nanopartículas de PVA cuyo tamaño fluctúa entre 300 - 3000 nm; d. neutralización: la dispersión obtenida en la etapa (c) se neutraliza con ácido clorhídrico (37% p/p y densidad 1 ,18 g/mL) hasta pH = 7, empleando agitación con velocidades entre 100 - 300 rpm; y e. mezcla de estabilizantes, emulsificantes y/o coadyuvantes: la dispersión obtenida en la etapa (d) se mezcla en un reactor con los diferentes estabilizantes, emulsificantes y/o coadyuvantes en al menos una relación 1/10 a temperatura ambiente, empleando agitación con velocidades entre 4000 - 8000 rpm.

Ventajosamente esta formulación permite: - inhibir la recristalización del hielo a concentraciones mayores e iguales que 0,01% p/v de micro/nanopartículas de PVA;

- reducir en heladas el daño en primordios florales de frutales de carozo en 20% con respecto al agua; y

- no ocasionar daños en la fruta cosechada, ni en la fruta durante la post- cosecha.

Ejemplos de aplicación

Ejemplo 1 . Elaboración de una formulación acuosa de micro/nanopartíclas de PVA y evaluación de sus propiedades.

PVA completamente hidrolizados y de tres masas moleculares promedios en peso (M _w ) distintos (M _w = 13000-23000 g/mol, M _w = 31000-50000 g/mol y M _w = 89000- 98000 g/mol) se disolvieron en agua nanopura usando un baño de aceite natural y bajo un mezclador magnético a 100°C por alrededor de 2h. Una solución al 2% p/v se adicionó gota por gota a una solución de 6% p/v de hidróxido de sodio a velocidad de 30 mL/h usando una bomba a jeringa (TE 331 , Terumo, Japón) y bajo agitación constante a 700 rpm. La razón de la solución PVA:NaOH fue 1 :1. Luego, la dispersión se neutralizó con ácido clorhídrico (37% en p/p y densidad de 1 ,18 g/mL). Las muestras se etiquetaron de acuerdo a la masa molecular del PVA. Así, la etiqueta L-PVA correspondió a la dispersión de micro/nanopartículas de PVA de bajo Mw (13000-23000 g/mol), la etiqueta m-PVA a la dispersión de micro/nanopartículas de PVA de medio M _w (31000-50000 g/mol) y la etiqueta h-PVA a la dispersión de micro/nanopartículas de PVA de alto M _w . (89000-98000 g/mol).

Las micro/nanopartículas de PVA obtenidas se evaluaron mediante los siguientes ensayos: a.- Microscopía electrónica de barrido (SEM):

La morfología y tamaño de las micro/nanopartículas de PVA antes y después de la neutralización se analizaron usando un microscopio electrónico de barrido JEOL- JSM 6380LV (Tokyo, Japan) operado a 20 kV. Una gota de dispersión de micro/nanopartículas de PVA se secó a temperatura ambiente y se recubrió con una película de oro (50 nm). Los aumentos fueron 2000x, 5000x y 10000X. En la Figura 1 se pueden apreciar las imágenes de microscopía, donde (A), (D) y (G) corresponden micro/nanopartículas de L- PVA; (B), (E) y (H) corresponden amicro/nanopartículas de m-PVA; y (C), (F) e (I) corresponden a micro/nanopartículas de fr-PVA.

El tratamiento alcalino a la solución acuosa de PVA produce partículas de forma esférica como se puede observar en la Fig. 1 A, B y C. El tamaño de estas micro/nanopartículas de PVA se midió directamente de las micrografías SEM, utilizando el software ImageJ, y los gráficos de distribución de tamaño se construyeron a partir de al menos 190 partículas (ver Fig. 1 B, E y H). El tamaño promedio de las micro/nanopartículas de PVA fue de 900 ± 300, 1300 ± 400, 1500 ± 700 nm para muestras de L-PVA, m-PVA y ñ-PVA, respectivamente. El tamaño medio de partícula aumentó significativamente (prueba de Tukey, a = 0,05) al aumentar el peso molecular del PVA. Las distribuciones de tamaño de las micro/nanopartículas de m-PVA y ñ-PVA fueron más amplias que las correspondiente a las nanopartículas de L-PVA. En general, las muestras de partículas de ñ-PVA mostraron mayor cantidad de agregados en forma de cadena de las micro/nanopartículas esféricas (ver Fig. 1 C, F e I).

El efecto del peso molecular de PVA sobre el tamaño promedio de las micro/nanopartículas puede explicarse teniendo en cuenta que: a la concentración de 1% p/v, el ovillo estaba formado por una sola cadena (Budhlall et al., 2003), y que la distancia entre las cadenas de PVA completamente hidrolizado era relativamente corta, debido a la competencia entre las interacciones polímero- solvente y polímero-polímero (Mansur et al, 2008). La adición de la solución acuosa de PVA a la solución de NaOH disminuyó la solubilidad del PVA, ya que la hidratación de los iones Na ⁺ y OH reduce el número de moléculas de agua libres disponibles para interactuar con el PVA. Como resultado, la interacción polímero- polímero fue dominante y las cadenas de ovillos simples de PVA tendieron a unirse, formando una estructura micelar con forma esférica. Por lo tanto, el tamaño de esta estructura micelar depende del grado de polimerización de las cadenas de PVA que las componen. Se propone que las micro/nanopartículas se estabilizaron mediante repulsión electrostática de sus cargas negativas, probablemente debido a la absorción de grupos OH libres sobre las partículas de PVA por interacciones de puente hidrógeno, como se puede deducir de los resultados de espectroscopia infrarroja FTIR. El cambio en el entorno dieléctrico de las micro/nanopartículas de PVA mediante la adición de HCI condujo a una disposición pseudo-lineal de micro/nanopartículas, como se puede observar en las imágenes de SEM. b.- Microscopía de transmisión electrónica (TEM):

Este ensayo se realizó en un microscopio de transmisión JEOL/JEM 1200 EX II (EEUU) operado hasta 120 kV. Una gota de una dispersión diluida de micronanopartículas de PVA antes y después de la neutralización se colocó en una rejilla de Cu recubierta de carbono (G200 Hex) y luego se secó al aire.

En la Figura 1 (C, F y H) se muestra las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de las micro/nanopartículas obtenidas a partir de PVA de diferentes pesos moleculares promedios en peso, donde se observa que las partículas neutralizadas estaban recubiertas por cristales de cloruro de sodio, sugiriendo la interacción del hidróxido de sodio con las cadenas de PVA. c.- Espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR):

Los espectros FTIR de las micro/nanopartículas de PVA y de las macrocloléculas de PVA se registraron por triplicado en un espectrofotómetro Perkin Elmer Spectrum Two FTIR (EEUU), en el rango de 600 - 4000 cnr ¹ a 4 cnr ¹ de resolución. El espectro FTIR se tomó con reflectancia interna total atenuada (ATR). El espectro se muestra en modo de transmitancia. La corrección basal del espectro se realizó usando un software Spectral Manager, versión 2. Los datos fueron procesados de acuerdo a Pozo et al. (2018), usando el software Origin, versión 8.6.

Los espectros FTIR de mico/nanopartículas de PVA y precursores de PVA se muestran en la Figura 2. Los espectros muestran picos propios de PVA (Awada y Daneault, 2015). La banda ancha entre 3400 - 3100 cnr ¹ se asigna a las vibraciones de estiramiento de los grupos OH. La vibración simétrica y asimétrica de los grupos CH2 se observa en 2910 y 2942 cnr ¹ , respectivamente. Los picos alrededor de 1420 y 840 cnr ¹ están asociados a las vibraciones de flexión y estiramiento en el plano, respectivamente, del grupo CH2. El pico más intenso a 1080 crrn ¹ corresponde al estiramiento de C-OH en alcoholes alifáticos. Como era de esperar, las vibraciones asociadas al estiramiento C=0 del grupo acetato alrededor de 1715 cnr ¹ se observa a menor intensidad para los precursores de PVA con alto grado hidrolizado (98- 99%). La banda a 1142 cnr ¹ es atribuida a la vibración de estiramiento C-O-C y está relacionada con la cristalinidad del PVA. Esta banda fue similar tanto para la macromolécula de PVA como para las micro/nanopartículas de PVA, lo que sugiere que no se producen incrementos en la cristalinidad al formarse las micro/nanopartículas de PVA.

Las principales diferencias entre los espectros de las micro/nanopartículas de PVA y los PVA precursores son la ausencia de bandas entre 1750 - 1735 cnr ¹ y la presencia de una nueva banda a 1647 cnr ¹ en los espectros de las micro/nanopartículas de PVA. La ausencia de bandas en la región entre 1750 - 1735 cnr ¹ da cuenta de que PVA fue completamente hidrolizado durante el tratamiento alcalino. La banda a 1647 cnr ¹ se atribuyó a que la vibración de doblaje fuera del plano o el resultado de d(HOH), la cual es influenciada por enlaces de hidrógeno tipo puente. La banda de d(OH) a número de onda mayores a 1645 cm-1 indica una alta proporción de enlaces de hidrógeno tipo puente en las micropartículas de PVA. d.- Ensayo de enfriamiento por salpicadura:

La actividad IRI se evaluó utilizando un método adaptado desde Knight et al. (1988). Una gota de 10 pL se dejó caer desde una altura de 1 ,85 m sobre un portaobjeto del microscopio, previamente enfriado durante 1 h con hielo seco. Luego, el portaobjeto se transfirió rápidamente al sistema Peltier LTS120 (Linkam, Reino Unido) acoplado al microscopio Olympus BX43 (Japón) y se mantuvo a -6 °C durante 1 h. El proceso de recristalización se siguió durante el descongelamiento a -6 °C utilizando un polarizador para la luz transmitida (U-POT). Las imágenes se recolectaron utilizando una cámara de video Olympus SC50 con un aumento de 10x. Como control negativo se utilizó una solución de NaCI a diferentes concentraciones y a la solución del PVA precursor también se le adicionó NaCI para distinguir mejor el contorno del cristal de hielo. La concentración de NaCI seleccionada fue igual a la presente en las micro/nanopartículas de PVA, excepto para las macromoléculas de PVA al 1% p/v, donde se utilizó una menor concentración de NaCI 0,137 mol/L (Biggs et al. 2019), debido a la insolubilidad de la macromolécula en una solución de NaCI al 0,7 mol/L. El tamaño del cristal de hielo antes (tiempo cero) y después (1 hora) de mantener a las muestras de PVA a -6°C se comparó para determinar la actividad de la inhibición de la recristalización del hielo de las micro/nanopartículas de PVA con respecto a los PVA precursores.

En las Figura 3 y 4 se muestra la evolución de los cristales de hielo para muestras con micro/nanopartículas de PVA y para las macromoléculas de PVA precursor a dos concentraciones: 1 % p/v (Figura 3) y 0,01 % p/v (Figura 4). Los tamaños de los cristales de hielo aumentaron en el tiempo en la solución de NaCI de diferentes concentraciones. Las soluciones de PVA precursor de distintos pesos moleculares y las dispersiones de micro/nanopartículas de PVA mostraron tamaños de cristales más pequeños a los 60 min y a - 6°C en comparación a la solución de NaCI, a pesar de que la solución de PVA al 1 %p/v tenía la misma concentración de NaCI que el control negativo. Las dispersiones de micro/nanopartículas de PVA presentaron mayor actividad de IRI que las soluciones de los PVA precursores. Esto se explica por el volumen hidrodinámico que presentan las partículas de PVA al ser adsorbidas en la superficie del hielo, lo que impide que los cristales de hielo adyacentes se unan para formar uno más grande (Knight et al., 1995). Además, se observa que a medida que aumenta el peso molecular del PVA, el grado de inhibición de recristalización del hielo fue mayor, lo que sustenta nuestra teoría. e.- Evaluación de las crioprotectoras de las micro/nanopartículas de PVA en árboles frutales.

Las propiedades crioprotectoras de las micro/nanopartículas de PVA en árboles frutales se evaluaron mediante ensayo de microcámara y ensayo de campo: e.1 Ensayo de microcámara:

El ensayo en la microcámara consistió en colocar dardos de cerezo desnudos de distintos estados fenológicos en cámara de frío y aplicarle los diferentes productos para inhibir el daño en heladas. Los dardos de 4 - 5 yemas de cereza de la variedad ^' Sweetheart ^' se depositaron en una bandeja plástica con algodón hidratado. Seguidamente, las brácteas de cada yema se desnudaron para dejar el tejido interno expuesto a bajas temperaturas. Los dardos se asperjaron con diferentes productos: agua, solución de PVA al 0,1 % p/v, dispersión de micro/nanopartículas ft-PVA al 0,01% p/v o agroquímico crioprotector comercial, e inmediatamente se colocaron en una micro-cámara a temperatura de - 5°C y humedad relativa de 70% por un periodo de 4 horas. Los estados fenológicos testeados fueron: yema en receso, yema hinchada y de inicio de brotación. En la Figura 5 se muestra el efecto de la aplicación de los diferentes productos en la incidencia del daño por heladas en primordios florales en el ensayo de la microcámara, donde el producto más efectivo fue la dispersión de micro/nanopartículas de PVA al 0,01 %p/v. Esta formulación redujo aproximadamente en 10% la incidencia de daño por heladas en primordios florales con respecto al control (agua). e.2.- Ensayo de campo:

Los ensayos de campo se realizaron durante la temporada 2018-2019 en un huerto comercial de cereza del cultivar Sweetheart. El huerto del cultivar Sweetheart, estaba formado por árboles de nueve años de plantados, injertados sobre el porta- injerto Colt y plantado a una distancia de 4,5 x 3 m. Como unidad experimental se seleccionaron cuatro ramas por árbol a las que se le aplicó en el periodo de receso de la yema (julio 2018), cianamida hidrogenada (Dormex ®, T rostberg, Alemania) en una dosis del 2% v/v junto a un coadyuvante concentrado soluble (Break®, Hopewell, EEUU) en dosis del 0,01 % v/v. El experimento se planificó en un diseño de bloques completamente al azar con cuatro réplicas (árboles).

Los productos aplicados fueron: agua, solución de PVA al 0,1 % p/v, dispersión de micro/nanopartículas ñ-PVA al 0,01% p/v y agroquímico crioprotector comercial. Las aplicaciones se realizaron en los estados fenológicos de: yema en receso, yema hinchada, botón verde y floración; y antes de un evento de helada. Las aplicaciones de cianamida hidrogenada y de los productos se realizaron a través de una moto- pulverizadora manual (SWISSMEX®, Jalisco, México) con capacidad de 15 L.

En la temporada de 2018-2019 la cantidad de horas acumuladas con temperaturas bajo 0 ^o C superó las 200 horas en la localidad donde se emplaza el huerto comercial en estudio. En este caso, la formulación micro/nanopartículas de PVA al 0,01% p/v redujo en un 85% la cantidad de primordios florales dañados en las yemas (Figura 6). Para este producto la cantidad de primordios florales por dardo dañados fue menor en todos los estados fenológicos, excepto en 54 y 41 días antes de la floración (estado de yema en receso), en donde no se apreció un efecto significativo mayor de primordios dañados por la aplicación del producto. La formulación con micro/nanopartículas de PVA dispersas fue 45% más efectiva en reducir la incidencia de daño, en comparación al anticongelante comercial.

Finalmente, estos ensayos permitieron demostrar que la formulación en base a nanopartículas de PVA permite reducir el daño producido por heladas en las plantas.