Le présent document est relatif généralement aux dispositifs de diagnostic par amplification d’acide nucléique, notamment, à partir d'un échantillon biologique tel que des gouttes de sang, d'urine, de salive et de sueur. Plus spécifiquement, la présente invention concerne des plaquettes de test, utilisées dans un système de test biologique automatisé destiné à identifier la présence d’un microorganisme infectieux (bactérie, virus, etc.). Toutefois, le dispositif et la méthode proposés peuvent être appliqués à la détection d’autres marqueurs biologiques pouvant révéler d’autre types de pathologie quelconque, cancer y compris.

S’agissant des tests de diagnostic basés sur la détection par amplification de l’ADN/ARN d’un microorganisme infectieux, on connaît les tests PCR usuels (PCR pour Réaction de Polymérisation en Chaîne) nécessitant des cycles en température, qui sont longs et coûteux à mettre en oeuvre (nécessitent l’utilisation de thermocycleurs onéreux).

Dans les tests de diagnostic plus rapide, il a été utilisé récemment un type de test dit LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) ou RT-LAMP (Reverse transcriptase Loop-mediated isothermal amplification), pour lequel il n’est plus nécessaire d’effectuer plusieurs cycles en température. Un plateau de mise en température suffit d’où le qualificatif d’« isotherme ».

C’est dans ce contexte qu’est apparu un besoin de proposer un système de test biologique qui permet de traiter un grand nombre d’échantillons de façon fiable et rapide, qui convienne pour un test de type isotherme, sans exclure toutefois de l’appliquer à d’autres types de tests.

À cet effet, il est donc proposé une plaquette de test, pour usage unique, dans un système de test biologique destiné à détecter la présence d’une ou plusieurs espèces pathogènes (e.g. une séquence d’acide nucléique d’intérêt), la plaquette de test comprenant :

- un corps dans lequel sont formés des canaux et des logements, lesquels sont généralement isolés de l’environnement extérieur,

- une entrée pour recevoir un échantillon biologique à tester sous forme liquide, l’entrée étant de préférence scellable ou refermable,

- optionnellement au moins une entrée d’air,

- une membrane d’extraction, agencée dans un premier logement,

- une première zone de réaction contenant un media poreux agencé dans un deuxième logement et contenant un premier mélange réactionnel de test sous forme lyophilisée, le premier mélange réactionnel permettant l'amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt,

- de préférence, au moins une deuxième zone de réaction contenant un media poreux agencé dans un troisième logement et contenant un deuxième mélange réactionnel de contrôle (positif ou négatif) sous forme lyophilisée,

- optionnellement au moins une sortie d’air,

- optionnellement un réservoir de récupération, - une zone de lecture de résultat, comprenant au moins la première zone de réaction, et le cas échéant la deuxième zone de réaction, la plaquette de test étant configurée pour amener l'échantillon biologique à tester dans la membrane d’extraction, puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, amener l’éluat résultant dans les zones de réaction, pour, après réaction, en déduire un résultat au travers de la zone de lecture.

Grâce aux dispositions exposées ci-dessus, le processus du test peut être automatisé et sécurisé. La plaquette de test est insérée dans une station d’analyse qui déroule des actions correspondant au processus ci-dessus. Notamment le séchage de la membrane d’extraction est fait in situ par un flux d’air qui circule dans les canaux et le logement qui contient la membrane d’extraction, grâce aux entrées/sorties d’air. La membrane peut, complémentairement ou alternativement, être séchée par un dispositif de chauffage. On évite toute manipulation pendant le test, la plaquette reste placée dans la station d’analyse, tout se déroule sous le contrôle de la station, cette dernière ayant de préférence un capot fermé pendant le déroulement du test. La membrane étant rapidement et correctement séchée, cela augmente la fiabilité et la rapidité du test.

Le terme « membrane d’extraction » désigne ici un organe poreux permettant d’absorber momentanément les acides nucléiques contenus dans l’échantillon à tester, de retenir ces acides nucléiques pendant une ou plusieurs opérations de rinçage destinées à éliminer des espèces chimiques telles protéines ou débris, résidus de tampon de lyse y compris, suite à quoi un éluant à plus forte affinité ionique avec lesdits acides nucléiques permet de capter ces acides nucléiques et de les entraîner vers les zones de réaction/d’amplification.

Le terme « plaquette » doit être pris ici au sens très large, la plaquette est ici un support qui peut prendre toute forme géométrique.

On note que la deuxième zone de réaction dite zone de contrôle, permet de confirmer le bon déroulement de la réaction. Le deuxième mélange réactionnel de contrôle permet par exemple l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques non spécifique, se trouvant communément dans tous les échantillons (contrôle positif). Ceci permet de vérifier notamment que l’extraction s’est bien déroulée, et que l’éluat est bien parvenu aux zones de réaction et que la réaction d'amplification s’est bien déroulée. Alternativement, le deuxième mélange peut être un contrôle négatif qui ne s’active normalement pas, sauf si la cartouche a présenté un disfonctionnement (par exemple une contamination d’ARN dans ce disque de contrôle). Dans un mode de réalisation, la plaquette de test peut comporter un disque de contrôle positif et un disque de contrôle négatif.

La plaquette de test et le système de test biologique peuvent être utilisés notamment par une méthode isotherme d’amplification d’acide nucléique dite « LAMP » ou « RT-LAMP », mais d’autres méthodes sont possiblement utilisables.

Une espèce pathogène peut être un microorganisme tel qu’un virus ou une bactérie, la séquence d’acides nucléiques d’intérêt étant ainsi spécifique à l’espèce pathogène à détecter.

Pour le « corps » de la plaquette, on peut aussi utiliser le terme de « substrat », ou « corps-substrat ».

Avantageusement, le corps de la plaquette est de type monolithique.

S’agissant du réservoir de récupération, on note que ce dernier peut être prévu pour recueillir non seulement l’échantillon biologique, mais aussi le ou les liquide(s) de rinçage ayant rincé, la membrane d’extraction avant son élution, et les restes de l’échantillon biologique sous forme d’éluat après traitement. Typiquement, le réservoir de récupération reçoit d’abord l’échantillon, puis le liquide de rinçage et enfin l’éluat provenant des zones de réaction. Grâce au réservoir de récupération, aucun liquide ne ressort de la plaquette, seul de l’air peut ressortir de la plaquette. Ainsi on évite toute contamination de l’environnement et/ou du test suivant.

Dans divers modes de réalisation de l’invention, on peut éventuellement avoir recours en outre à l’une et/ou à l’autre des dispositions suivantes, prises isolément ou en combinaison.

Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre au moins un premier volume de premier liquide de rinçage, et un volume d’éluant, contenus directement dans des logements du corps ou contenus dans des sachets agencés dans des logements du corps.

Les volumes de liquide de rinçage et d’éluant sont embarqués à bord de la plaquette. La station d’analyse est ainsi relativement simple, et seule une connexion pneumatique est nécessaire entre la plaquette et la station d’analyse. Les liquides (rinçage et éluant) étant embarqués à bord de la plaquette, ils peuvent être différents en fonction de la nature du test biologique et des espèces d’acide nucléique d’intérêt que l’on cherche à révéler, la station d’analyse restant la même. Eventuellement, les paramètres et le logiciel faisant fonctionner la station peuvent être mis à jour par téléchargement mais le matériel de la station reste inchangé.

Selon un aspect, la plaquette est monolithique et contient dans un seul corps les éléments suivants : la membrane d’extraction, une ou deux zones de réaction (voire plus), les volumes de liquide de rinçage et d’éluant, le réservoir de récupération, et la zone de lecture de résultat.

Selon un aspect, l’éluant contenu dans le volume d’éluant est de l'eau distillée exempte d'RNase et le volume d’éluant présente un volume compris entre 30 microlitres et 50 microlitres. Cette eau, dite « DNase/RNase free water», vient éluer les espèces d’acide nucléique retenues dans la membrane d’extraction et les entraîner vers les zones de réaction.

Selon un aspect, on peut choisir comme éluant un composé connu sous le nom d’Ibuffer™ d’Optigene™ (10x Buffer (500mM Tris-HCI (pH 8.1 @ 25 °C), 300mM KCI, 300mM (NH4)2 S04 and 1% Triton X-100)).

Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un deuxième volume d’un deuxième liquide de rinçage, les premier et deuxième volumes de liquide de rinçage ayant un volume compris entre 100 microlitres et 300 microlitres. Ce volume d’un deuxième liquide de rinçage permet de compléter le premier rinçage avant le séchage. On a ainsi 3 volumes de liquide embarqués à bord de la plaquette. Avantageusement, aucun liquide n’est présent dans la station d’analyse. Les liquides (rinçage et éluant) étant embarqués à bord de la plaquette, ils peuvent être différents en fonction de la nature du test biologique et des espèces cibles.

Selon un aspect, il peut être prévu un réservoir de récupération unique à bord de plaquette, ce réservoir de récupération étant configuré pour recueillir tous les liquides. Ainsi non seulement les restes de l’échantillon biologique sous forme d’éluat après traitement, mais aussi le ou les liquides de rinçage qui ont été utilisés pour rincer la membrane d’extraction avant son élution sont piégés dans le réservoir de récupération unique et ne peuvent pas ressortir de la plaquette (seul de l’air peut ressortir de la plaquette), évitant ainsi toute contamination de l’environnement et/ou du test suivant.

Selon un aspect alternatif, il peut être prévu que les fluides de rinçage et d’élution ne soient pas embarqués sur la plaquette, mais soient reçus sur la plaquette en provenance de la station d’analyse. La plaquette est alors très simple, elle ne contient aucun liquide avant utilisation. Après utilisation, le réservoir contient et piège les liquides utilisés pendant le test, à savoir les liquides de rinçage et d’élution ainsi que restes de l’échantillon biologique initial.

Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre au moins deux valves, de préférence de type membrane, pour diriger un flux de fluide depuis la membrane d’extraction sélectivement vers le réservoir de récupération ou vers la ou les zones de réaction.

Ces valves permettent de diriger les flux de fluides à l’intérieur de la plaquette notamment lorsqu’on utilise un nombre réduit de connexions pneumatiques entre la station d’analyse et la plaquette. Les valves sont embarquées à bord de la plaquette mais leurs commandes sont faites depuis la station d’analyse.

Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un réservoir auxiliaire agencé de manière adjacente à la première, et le cas échéant à la deuxième, zone(s) de réaction de manière à pouvoir alimenter en éluat les première et deuxième zones de réaction par pompage capillaire.

On fournit ainsi une alimentation par capillarité des zones de réaction depuis le réservoir auxiliaire, sans que le flux d’éluat ne traverse les media poreux des zones de réaction et ne sorte les réactifs lyophilisés des zones de réaction. Cela permet aussi de contrôler plus finement le volume d'éluat qui imbibe les médias poreux et hydrate les mélanges réactionnels, ce qui augmente la répétabilité du test. On peut aussi faire en sorte que les médias poreux occupent sensiblement presque tout l'espace du logement pour éviter les volumes morts qui viendraient trop diluer les mélanges réactionnels. Il peut être prévu un petit passage d’évacuation d’air sur le pourtour du média poreux.

Selon un aspect, le media poreux de chacun des dits premier et deuxième mélanges réactionnels est formé d’un substrat papier sous forme générale de disque. On utilise ainsi un matériau et une forme disponibles à coût compétitif.

Selon un aspect, le media poreux de chacun desdits premier et deuxième mélanges réactionnels est formé comme un disque en papier avec une projection radiale pour le pompage capillaire, les deuxième et troisième logements qui les renferment ont un seul port d’entrée/sortie dans lequel passe la projection radiale, autrement dit les deuxième et troisième logements sont en configuration de cul-de-sac. Seule la projection radiale qui dépasse du disque est baignée par le flux d’éluat. Les disques ne sont baignés par le flux d’éluat, ils sont alimentés en éluat par le pompage capillaire. Cela permet de limiter la diffusion des réactifs lyophilisés hors des disques.

Selon un aspect, le corps de la plaquette est formé en matériau plastique translucide, tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polycarbonate (PC), le copolymère cyclo-oléfinique (COC) ou le Cyclo Oléfines Polymères (COP).

On a ainsi une lecture du résultat aisée par transparence, le corps de la plaquette ne faisant pas obstacle. On note que la lecture optique est réalisée sans déplacer la plaquette qui reste en place sur l’embase.

Selon un aspect, les canaux et les logements peuvent être formés par usinage dans le corps de la plaquette de test. Selon un autre aspect, les canaux et les logements peuvent être obtenus de moulage.

Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre une membrane ou un clapet de ventilation, agencé sur au moins une des sorties d’air, pour laisser passer de l’air vers l’atmosphère et ne pas laisser passer de liquide.

Une capsule de type Gore tex™ peut avantageusement empêcher tout déversement de liquide tout en laissant passer l’air.

Selon un aspect, il est prévu une sortie d’air intermédiaire agencée à proximité de l'entrée du réservoir de récupération, pour faciliter le séchage de la membrane après le passage des liquides de rinçage.

On évite que le flux de séchage ne traverse le réservoir sur sa longueur.

De plus cela facilite l'avancée de l'éluat après élution en chassant l'air par cet orifice, dans la configuration de réservoir de récupération unique.

Selon un aspect, il est prévu des nervures dans le réservoir de récupération. Ceci procure une maîtrise de l’avance du front de liquide dans le réservoir de récupération.

Selon un aspect, il est prévu dans le réservoir de récupération un tampon absorbant pour capturer les liquides arrivant dans le réservoir (typiquement par capillarité) et éviter une fuite de liquide par la sortie d’air (y compris lorsque de l’air est injecté dans la plaquette de test). En particulier, le tampon absorbant permet de capturer des amplicons qui atteindrait le réservoir de récupération et ainsi éviter que ces derniers ne puissent s’échapper du réservoir de récupération pour contaminer la plaquette ou la station. Il peut être prévu un passage d’air sur le pourtour du tampon absorbant pour permettre la libre circulation de l’air jusqu’à la sortie d’air. Le réservoir de récupération permet aussi de diminuer la force nécessaire pour déplacer les fluides dans la cartouche (par capillarité).

Selon un aspect, la plaquette de test peut présenter une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales et dans laquelle l’entrée d’air et l’entrée pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sont agencées sur une seule face principale.

Ceci procure une simplicité de réalisation et de la conception de la station d’analyse.

Selon un aspect optionnel, l’entrée d’air et l’entrée recevant l’échantillon biologique à tester sont confondues et forment ensemble une entrée unique de fluide.

Selon un aspect, toutes les interfaces fonctionnelles, à savoir les entrées et les éléments activés par les poussoirs, sont agencées sur une seule face principale. Ceci procure une simplicité de réalisation et de la conception de la station d’analyse. Selon un aspect, toutes les interfaces fonctionnelles, à savoir les entrées et les éléments activés par les poussoirs, sont regroupées d’un seul côté de la face principale (par exemple regroupés sur les trois quarts d’une longueur de la face ou la moitié). Cela permet d’avoir une partie de la plaquette qui reste à l’extérieure du capot de la station d’analyse, ce qui permet de toujours pouvoir identifier la plaquette en cours de traitement (le capot sera décrit par la suite).

Selon un aspect, il est prévu que toutes les interfaces de la plaquette avec la station d’analyse se trouvent d’un même côté, et l’autre côté de la plaquette est muni d’une membrane de scellement rectangle et d’épaisseur uniforme. Cette membrane de scellement peut être du type “film adhésif PCR” ou du type ‘PSA tape™’. On a ainsi une simplicité de réalisation et de la conception de la station d’analyse. Des adhésifs différents peuvent être utilisés : un pour les disques et un autre pour le reste de la plaquette de test.

Selon un aspect, il peut être prévu que les interfaces de la plaquette avec la station d’analyse se trouvent d’un premier côté, i.e. d’une première face principale et l’entrée pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) est agencée sur le deuxième côté, i.e. sur la deuxième face principale.

Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un élément d’identification de la plaquette.

Grâce à cela, l’élément d’identification permet d’identifier précisément la plaquette et le test pratiqué, données qui peuvent être associées de manière fiable à un patient duquel provient l’échantillon biologique à tester. L’identification de la plaquette par la station permet également d’adapter la séquence de test à la plaquette (temps de séchage, température de chauffe, temps de chauffe, etc...).

Selon un aspect, la plaquette peut être configurée pour recevoir, par enfichage, un récipient de collecte contenant un échantillon biologique à tester. On supprime ainsi un risque lié au déversement d’un échantillon biologique contenu dans un tube de collecte standard dans l’entrée de la plaquette pour recevoir un échantillon biologique.

Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un clapet anti-retour sur l’entrée d’air. On évite ainsi un risque de reflux de liquide par l’entrée d’air lors de l'introduction de l’échantillon biologique à tester.

Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un clapet anti-retour sur l’entrée de réception de l’échantillon biologique à tester. On évite ainsi un risque de reflux de liquide par cet orifice.

Ces deux clapets anti-retour (ou valve anti-retour ou encore ‘check valve’) autorisent une entrée de fluide (air ou liquide) vers l’intérieur de la plaquette et empêche le flux inverse c’est-à-dire une sortie de fluide (air ou liquide) vers l’extérieur de la plaquette. On remarque que, dans tout le processus proposé, rien ne peut sortir de la plaquette à part de l’air sur la sortie d’air en aval du réservoir.

Selon un aspect, le premier logement, le deuxième logement et le troisième logement sont agencés à proximité les uns des autres, de préférence dans une zone d’interaction thermique de surface au plus égale à 5 cm ² ou 4cm ² . On peut ainsi chauffer la membrane d’extraction et les disques réactionnels par un seul module d’activation thermique dans la station d’analyse.

Selon un aspect, la plaquette de test comprenant deux faces principales, opposées, et toutes les interfaces fonctionnelles pour le test (c’est-à-dire l’entrée pour échantillon, entrée d’air, les volumes de rinçage, les valves, les zones de réactions) sont situées sur une seule des deux faces principales.

Selon un aspect, il est proposé un ensemble comprenant une plaquette de test telle que décrite précédemment et un support rigide sur lequel la plaquette de test est montée, le support rigide recouvrant intégralement la face principale n’ayant pas les interfaces fonctionnelles. Lorsqu’installé dans la station, la plaque rigide est positionnée entre la plaquette de test et le capot. La plaque rigide a une épaisseur typiquement comprise entre 0,5 mm et 2mm.

Selon un aspect, il est proposé un équipement de test comprenant une plaquette de test telle que décrite précédemment, et un récipient de collecte comprenant une entrée operculée et une sortie operculée, toutes deux agencées en partie basse du récipient de collecte, et un couvercle à fermeture hermétique.

Selon un aspect, le récipient de collecte peut être enfiché sur la plaquette de test, et la plaquette de test peut comprendre deux aiguilles agencées respectivement en vis-à-vis de l’entrée operculée et de la sortie operculée, les aiguilles traversant les opercules durant l’opération d’enfichage.

Selon un aspect, il est proposé un système de test biologique, comprenant une station d’analyse, et une ou plusieurs plaquettes de test telles que décrites précédemment, la station d’analyse comprenant au moins un connecteur pneumatique configuré pour être accouplé à l’entrée d’air et/ou à la sortie d’air.

On a ainsi un raccordement simple lors du mouvement d’insertion de la plaquette dans la position de test. Un seul mouvement à savoir descendre la plaquette dans l’embase de test en translation, suffit pour réaliser l’accouplement entre station et plaquette.

Selon un aspect, la station d’analyse comprend au moins l’une des caractéristiques suivantes :

- une unité de commande,

- une pompe à air,

- un ou plusieurs actionneurs (pour pousser sur les volumes et/ou activer les valves commandées),

- un dispositif d’analyse optique (pour déterminer le résultat),

- un dispositif de chauffage,

- des moyens de communication sans fil,

- un lecteur d’identifiant,

- un système de verrouillage de capot.

Selon un aspect, il est proposé une station d’analyse pour plaquette de test telle que décrit précédemment ou selon un ensemble tel que décrit précédemment, la station d’analyse comprenant :

- une pompe à air,

- un ou plusieurs actionneurs, pour pousser sur des volumes et/ou activer des valves commandées,

- un dispositif d’analyse optique pour déterminer des résultats,

- un dispositif de chauffage,

- une embase configurée pour recevoir la plaquette de test.

L’embase peut comprendre une empreinte de forme complémentaire à une face principale de la plaquette de test, de sorte que la plaquette de test puisse être positionnée par simple emboîtement dans l’empreinte et retirée en exerçant une force de direction opposée à l’empreinte. L’empreinte peut comprend une zone d’interface pour la pompe à air, l’un ou plusieurs actionneurs, le dispositif d’analyse optique et le dispositif de chauffage, la zone d’interface étant configurée pour coopérer avec une interface fonctionnelle de la face principale de la cartouche.

Le dispositif d’analyse optique et le dispositif de chauffage sont par exemple agencés au niveau de l’empreinte à proximité les uns des autres, de préférence dans une zone de d’interaction thermique de surface au plus égale à 4 cm ² . La station d’analyse peut comprendre un capot, monté à rotation par rapport à l’embase, par exemple à l’aide d’une charnière, qui configuré pour, en position ouverte, permettre à un opérateur d’emboîter et déboîter la plaquette de test dans l’empreinte et, en position fermée, plaquer la plaquette dans l’empreinte. Le capot peut être verrouillé par un système de verrouillage de capot. Un capteur à effet Hall peut être utilisé pour détecter la position fermée du capot et autoriser le déclenchement du verrouillage.

La station d’analyse peut comprendre en outre : une unité de commande pour piloter les différents composants de la station et des moyens de communication sans fil pour communiquer les résultats de test à un dispositif externe (téléphone portable, tablette, ordinateur).

Selon un aspect, il est proposé un procédé de test biologique mis en oeuvre dans une plaquette de test telle que décrite précédemment, le procédé comprenant :

51- faire passer échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide dans la membrane d’extraction, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération,

52- faire passer un premier liquide de rinçage dans la membrane d’extraction, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération,

53- faire passer de l’air dans la membrane d’extraction, pour la sécher,

54- faire passer un volume d’éluant dans la membrane d’extraction, et diriger l’éluat qui en sort en aval vers la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction.

De manière avantageuse, le séchage de la membrane d’extraction est fait in situ par un flux d’air qui circule dans les canaux et le logement qui contient la membrane d’extraction. On s’assure ainsi qu’il n’y a plus de liquide, i.e. que la membrane a été bien asséchée, pour que seulement de l’éluant prévu à cet effet ne soit ainsi après entraîné vers les zones de réaction, ce qui contribue à la fiabilisation du processus de test.

Selon un aspect, il peut être prévu avant l’étape de séchage S3:

S25- faire passer un deuxième liquide de rinçage dans la membrane d’extraction, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération.

Selon un aspect, il peut être prévu en outre :

55- chauffer au moins la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction à une température prédéfinie,

56- attendre au moins un temps prédéterminé en maintenant la température prédéfinie,

S65- attendre que cela refroidisse ou procéder à un refroidissement actif par l’activation par exemple d’une cellule Peltier ou au moyen d’un moyen convecteur,

57- éclairer la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31 ,32), et recevoir en retour un niveau de fluorescence,

58- déterminer un résultat. Selon un aspect particulier, on prévoit une étape de refroidissement des zones de réaction à température ambiante avant la lecture optique.

Avantageusement, les étapes S1 à S8 ci-dessus sont réalisées lorsque la plaquette est en position dans l’embase prévue à cet effet, sans déplacement ni manipulation de la plaquette.

Selon un aspect particulier, on prévoit une première lecture optique de référence avant chauffage, qui peut être réalisée afin de faire le « zéro » du système optique.

Selon un aspect, il peut être prévu en outre :

S9- affecter le résultat à un dossier patient.

L’identification de la plaquette étant liée de manière bi-univoque à l’échantillon biologique et à son donneur, le résultat est affecté à un dossier patient de manière bi-univoque à la plaquette, donc à l’échantillon biologique et donc à son donneur, i.e. le patient. On peut ainsi traiter de très nombreux échantillons sans risquer de se tromper dans l’affectation des résultats.

Selon un autre aspect, il est donc proposé une plaquette de test, pour usage unique, dans un système de test biologique destiné à détecter la présence d’une une ou plusieurs espèces pathogènes (e.g. une séquence d’acide nucléique d’intérêt), la plaquette de test comprenant :

- un corps dans lequel sont formés des canaux et des logements, lesquels sont généralement isolés de l’environnement extérieur,

- une entrée pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide, l’entrée étant de préférence scellable ou refermable,

- au moins une entrée d’air, et au moins une sortie d’air,

- une membrane d’extraction, agencée dans un premier logement,

- une zone de réaction contenant un media poreux agencé dans un deuxième logement et contenant un premier mélange réactionnel de test sous forme lyophilisée, ledit mélange réactionnel permettant l'amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt,

- un réservoir de récupération,

- une zone de lecture de résultat, comprenant au moins la zone de réaction, la plaquette de test étant configurée pour amener l’échantillon biologique à tester dans la membrane d’extraction, puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, amener l’éluat résultant dans la zone de réaction, pour, après réaction, en déduire un résultat au travers de la zone de lecture.

Pour réaliser des tests en très grand nombre, lorsque le test est déjà bien connu, on peut simplifier la plaquette de test et se passer de la zone de contrôle. On peut utiliser un autre moyen plus simple pour vérifier que l’éluat est arrivé dans la zone de réaction. Par exemple, une caméra de la station peut surveiller par transparence les opérations qui se déroulent dans la plaquette.

Par exemple, un capteur de pression de la station peut être placé en parallèle de l’entrée d’air ou de la sortie d’air. Par exemple, un capteur capacitif de la station peut détecter des déplacements de fluides. Par exemple, un capteur de fin de course ou un encodeur optique peut détecter la position des actionneurs. Par exemple, un capteur de force peut détecter un effort appliqué par les actionneurs (via le courant du moteur, par exemple). On a ainsi une solution particulièrement économique concernant la plaquette avec un seul disque de réaction, la plaquette étant un consommable du point de vue du système de test. L’ensemble des caractéristiques optionnelles décrites ci-dessus peuvent être appliquées à cette configuration mono zone de réaction.

D’autres aspects, buts et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description suivante de plusieurs modes de réalisation de l’invention, donnés à titre d’exemple non limitatif. L’invention sera également mieux comprise en regard des dessins joints sur lesquels :

- la figure 1 est une vue générale synoptique d’un système de test biologique selon la présente invention,

- la figure 2 est une vue schématique d’un premier exemple de réalisation d’une plaquette de test selon la présente invention,

- la figure 3 est une vue en perspective du premier exemple de réalisation d’une plaquette de test selon la présente invention,

- la figure 4 est une vue en perspective depuis le côté opposé de la plaquette de la figure 2, avec la membrane de fermeture séparée,

- la figure 5 est une vue en perspective et en transparence d’une station d’analyse compatible avec le premier exemple de réalisation,

- la figure 6 est une vue partielle en perspective vu de dessous de la station de la figure 5,

- la figure 7 est une vue schématique d’un deuxième exemple de réalisation d’une plaquette de test,

- les figures 8A et 8B sont des vues schématiques respectivement de face et de côté d’un troisième exemple de réalisation d’une plaquette de test,

- les figures 9A et 9B illustrent un récipient de collecte selon deux modes de réalisation particulier,

- la figure 10 illustre une vue schématique en élévation d’une plaquette de test selon l’un des exemples possibles, dans une variante adaptée à recevoir le récipient de collecte de la figure 9,

- la figure 11 est une vue schématique d’un quatrième exemple de réalisation d’une plaquette de test,

- la figure 12 illustre le procédé mis en oeuvre dans divers exemples de réalisation de la plaquette et/ou de la station d’analyse,

- les figures 13A et 13B sont des vues de détail illustrant une valve de type membrane,

- la figure 14 est une vue de détail illustrant un sachet de liquide embarqué sur la plaquette et poussé par un piston de la station d’analyse,

- la figure 15 est une vue système centrée sur une illustration schématique fonctionnelle de la station d’analyse, - la figure 16 est une vue de détail partielle illustrant le dispositif de lecture optique des zones de réaction.

- Les figures 17 à 21 illustrent un cinquième exemple de réalisation d’une plaquette de test, avec notamment :

- la figure 17 est une vue en plan depuis la face dorsale de la plaquette, du côté supérieur en position de test dans la station,

- la figure 18 est une vue en plan depuis la face opposée de la plaquette, avec les éléments d’interface et d’activation,

- la figure 19 est une vue en coupe avec la plaquette et le dispositif de chauffage/refroidissement et de lecture optique,

- la figure 20 est une vue en perspective du dispositif de chauffage/refroidissement et de lecture optique,

- la figure 21 est une vue de dessus du dispositif de chauffage/refroidissement et de lecture optique,

- la figure 22 est une vue de dessus de la station d’analyse, capot ouvert,

- les figures 23a, 23b et 23c illustrent deux vues de la plaquette de test associée à une plaque rigide et une vue de la plaquette de test avec sa plaque en rigide en position dans la station de test (capot ouvert).

Sur les différentes figures, les mêmes références désignent des éléments identiques ou similaires. Pour des raisons de clarté de l’exposé, certaines dimensions peuvent ne pas être représentées à l’échelle.

Système - généralités

Selon la vue synoptique présentés à la figure 1 , il est proposé un système de test biologique ST qui comprend une station d’analyse 8, une plaquette de test 1 et un récipient de collecte 40.

La plaquette de test 1 est prévue pour usage unique ; il y a donc autant de plaquettes de test que de tests unitaires à réaliser. Dans l’exemple représenté ici, le récipient de collecte 40 est de type standard, toutefois, nous verrons plus loin qu’un autre type de récipient de collecte, plus spécifique, peut être utilisé.

Le récipient de collecte 40 est utilisé pour recueillir un échantillon biologique, par exemple de la salive, un prélèvement naso-pharyngé, ou de l’urine, voire de la sueur. Bien que le système proposé s’adresse en particulier au traitement d’échantillons humains, il n’est pas exclu d’utiliser le système proposé pour traiter des échantillons prélevés sur des animaux. Optionnellement, pour certains types de tests, on peut être amené à recueillir du sang ou de la lymphe comme un échantillon biologique à tester.

Le recueil de l’échantillon biologique dans le récipient de collecte 40 consiste à déposer un prélèvement de fluide corporel brut provenant de l’être humain ou animal dans un tampon de lyse (pour rompre les membranes des cellules biologiques), puis d’agiter le récipient de collecte pendant un temps suffisant de une à plusieurs minutes, suite à quoi on verse une quantité prédéfinie d’éthanol dans le récipient pour figer l’échantillon dans un état d’échantillon préparé. On note qu’il suffit de prélever une quantité faible de fluide corporel brut, typiquement un volume entre 0,1 millilitre et 1 millilitre suffit pour de multiples types de tests.

L’échantillon biologique dans récipient de collecte 40 ainsi préparé (noté ET) est ensuite versé dans un orifice d’entrée de la plaquette repéré 12. Suite à quoi on rebouche cet orifice d’entrée, i.e. on rend hermétique cette entrée par un bouchon voire un scellement de membrane de fermeture étanche.

Selon une autre configuration optionnelle et avantageuse, l’orifice d’entrée 12 de la plaquette est muni d’un clapet anti-retour. Ce clapet autorise une entrée dans la plaquette mais interdit le mouvement inverse. Le clapet peut être monté sur l’orifice d’entrée par une bague de retenue, par exemple. Le clapet peut être une valve en silicone, comme une « duckbill valve », « dôme valve », « umbrella valve », etc.

La plaquette 1 contenant désormais l’échantillon biologique à traiter (on dit aussi ‘à tester’, d’où le nom de ‘plaquette de test’), est placé sur un poste de test dans la station d’analyse 8 qui a alors son capot 80 ouvert. Ensuite la porte (le capot) est refermée et un utilisateur déclenche un cycle de traitement, i.e. un cycle de test. A la fin dudit cycle, un résultat de test est donné par la station d’analyse, sous une forme qui sera décrite plus loin. La plaquette de test et la station d’analyse peuvent présenter diverses fonctions et caractéristiques ; plusieurs exemples de réalisation sont présentés ci-après.

Le résultat est obtenu dans un temps de quelques dizaines de minutes. Le plus souvent le résultat est obtenu dans un temps inférieur à 1 heure. Pour de nombreux types de test, le résultat est obtenu en moins de 50 minutes tout compris.

Un tel système peut être utilisé dans le contexte d’un laboratoire d’analyse, mais, au vu de sa simplicité et la rapidité de sa mise en oeuvre, ce système de test biologique peut être utilisé au-delà, dans un contexte très large, à savoir dans une pharmacie, dans un cabinet médical, dans un établissement de soins généraux, dans un système de mise en quarantaine et libération de quarantaine. Ce système de test biologique peut aussi être utilisé dans un véhicule de vétérinaire pour tester des animaux.

Plaquette - premier exemple

Les figures 2 à 6 illustrent un premier exemple de réalisation de plaquette de test 1 et de station d’analyse 8 compatible à son traitement.

La plaquette de test présente comprend un corps 10, qu’on peut aussi appeler substrat. Des canaux et des logements vus plus loin sont formés dans le corps de plaquette.

D’une façon générale, le terme ‘plaquette’ doit être pris ici au sens très large, la plaquette est ici un support qui peut prendre toute forme géométrique. Par abus de langage on peut aussi l’appeler ‘chip’ ou ‘puce’ terme qui vient de la logique ‘Lab-on-a-chip’. En lieu et place de plaquette de test, on pourrait aussi utiliser « cartouche » ou « cassette ». L’ensemble des opérations de traitement pratiqué sur l’échantillon biologique à tester sont réalisés dans cette plaquette, notamment l’extraction des molécules ADN/ARN rinçage élution, la plaquette comprenant également au moins une zone de lecture du résultat.

Dans l’exemple illustré, la plaquette de test présente une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales, à savoir une première face principale 10A dite face d’interaction et une deuxième principale 10B dite face arrière. De plus, une tranche périphérique 10C formant les quatre autres faces s’étend entre les deux faces principales. Dans l’exemple illustré, l’épaisseur de la plaquette notée H1 est comprise entre 3 mm et 20 mm. La longueur L1 est comprise entre 20 mm et 80 mm et la largeur W1 est comprise entre 10 mm et 60 mm. La configuration géométrique peut s’apparenter à un format carte de crédit avec toutefois une épaisseur un peu plus importante.

La plaquette est identifiée par un élément d’identification 27 de la plaquette, qui peut être agencé sur la plaquette (i.e. QR Code) ou dans la plaquette comme dans le cas d’une puce RFID, NFC ou équivalents. L’élément d’identification peut être même plus simple, comme un codage couleur ou un codage mécanique. L’élément d’identification 27, lorsqu’il est numérique, permet d’identifier unitairement sans ambiguïté la plaquette de test, et accessoirement de stocker le résultat dans l’élément d’identification 27 à la fin du test avant l’ouverture de la porte/capot 80.

Par ailleurs, l’échantillon biologique étant associé à un individu duquel provient cet échantillon biologique, ce qui permet d’associer de façon bi- univoque l’échantillon biologique, la plaquette et le donner.

La puce RFID ou NFC permet aussi d’identifier qu’une plaquette est bien montée dans la station. Cela peut conditionner l’activation du verrouillage de la station.

Dans l’exemple illustré, la plaquette est obtenue par enlèvement de manière à partir d’un bloc de matière homogène parallélépipédique. On pratique depuis la face arrière 10B des fraisages et des perçages pour obtenir les canaux et logements susmentionnés.

Le corps de la plaquette est formé en matériau plastique translucide, tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polycarbonate (PC), le copolymère cyclo-oléfinique (COC) ou le Cyclo Oléfines Polymères (COP).

Au lieu de partir d’un bloc homogène parallélépipédique, on peut partir d’une forme moulée où les principaux logements sont déjà formés de moulage et seuls des perçages de petit diamètre restent à faire.

On peut aussi obtenir directement de moulage la plaquette avec tous ses canaux et logements, sans reprise d’usinage.

En outre, au lieu d’une méthode par enlèvement de matière, on peut utiliser un procédé de fabrication additive de type impression 3D.

On note que le substrat choisi forme une barrière efficace pour contenir les fluides considérés, il ne laisse pas passer ni n’absorbe l’air et les liquides de rinçage dont il va être question plus loin.

Canaux, réservoirs et logements

Sur face arrière 10B, pour fermer les canaux et les logements, on vient coller une membrane de fermeture 59, par exemple un film plastique adhésif bio-compatible. Alternativement, on peut prévoir de souder un capot arrière, par exemple par soudure ultrasons. Une plaque rigide, décrite plus loin, peut faire office de capot arrière. Ladite plaque rigide peut avoir des dimensions supérieures à la plaquette proprement dit.

Ainsi les canaux et les logements sont généralement isolés de l’environnement extérieur. Les canaux sont repérés de manière générale par la référence 13. Dans ces canaux circule du fluide qui peut être du liquide ou de l’air. Les canaux ont une section transversale petite au regard des dimensions des logements. Parmi les logements, on trouve un réservoir dit amont et noté 11 qui forme un réservoir pour le stockage temporaire de l’échantillon biologique à tester ET ; cet espace est un serpentin dans l’exemple illustré.

Mais il pourrait avoir une autre forme. On trouve aussi un réservoir aval aussi appelé réservoir de récupération repéré 18. Ce réservoir de récupération 18 est en aval des canaux transportant des fluides liquides et ce réservoir de récupération est dimensionné pour contenir : le volume de l’échantillon biologique à tester entrée + les volumes de liquide de rinçage + le volume d’éluat. Le volume de ce réservoir de récupération 18 est compris entre 0,1 millilitre et 2 millilitres. Le réservoir de récupération 18 s’étend d’une extrémité d’entrée 18a à un fond 18b.

Selon une configuration optionnelle, le réservoir de récupération 18 contient un tampon absorbant 180. Ce tampon absorbant présente un effet buvard et capture les liquides. Il est prévu que le tampon absorbant 180 n’occupe pas tout le volume disponible dans le réservoir de récupération 18, et de laisser au moins un passage d’air 181 entre le tampon 180 et les parois du réservoir afin que de l’air puisse s’échapper par l’orifice de sortie 16. Un canal de sortie 160 peut relier le passage d’air 181 à la sortie d’air 16.

Pour en revenir aux canaux et en référence notamment à la figure 4, un canal 13h relie l’entrée d’air 14 à l’espace formant réservoir amont 11.

Un autre canal 13a relie l’espace formant réservoir amont 11 à un premier logement 24 contenant un élément appelé membrane d’extraction qui sera vu plus loin.

Un autre canal 13b relie le logement 24 à une valve de dérivation 52. A partir de là, un autre canal 13f relie la sortie de valve à la zone contenant les réactants, notamment à un réservoir auxiliaire 38.

Un autre canal 13c prolongeant le canal 13b relie l’entrée de valve de dérivation à une autre valve 51 qui autorise ou stoppe le passage de fluide vers l’aval en direction du réservoir de récupération 18, en se terminant à une sortie d’air 17. Un autre canal 13e prolonge le canal 13d et débouche dans le réservoir de récupération 18. Des canaux 13s,13u,13k relient respectivement les logements repérés 74,75,76 au canal 13a en amont du logement 24 de la membrane d’extraction.

Un canal 13f relie la sortie de la valve de dérivation 52 à un réservoir auxiliaire 38 interposé entre les logements 72,73.

De plus un canal 13g relie le réservoir auxiliaire 38 et débouche au voisinage de l’extrémité d’entrée 18a du réservoir de récupération 18.

Enfin un canal 13j met en communication la portion de fond 18b du réservoir de récupération 18 avec l’atmosphère via une sortie d’air 16.

Concernant les canaux 13, de petites flèches en traits pointillés illustrent à la figure 4 le sens de circulation du fluide (liquide et/ou air) dans ces canaux. Les termes ‘amont’ et ‘aval’ font référence aux sens de circulation indiqués. Généralement il n’y a pas de circulation à double sens dans les canaux 13.

Comme déjà évoqué, il est prévu une entrée 12 pour recevoir l’échantillon biologique à tester ET sous forme liquide. Cette entrée est scellable ou refermable par bouchon. En variante cette entrée est équipée d’un clapet anti retour. Ainsi après déversement de l’échantillon biologique et fermeture, la plaquette peut être retournée sans aucun risque de répandre une partie de l’échantillon biologique.

Une fois versé dans la plaquette, le liquide de l’échantillon biologique est contenu dans un réservoir d’entrée 11 , qui se présente dans l’exemple illustré comme un logement en forme d’un serpentin.

De plus, la plaquette comprend une entrée d’air repérée 14. De l’air peut être ainsi envoyé dans la plaquette, notamment par la station d’analyse.

Dans un exemple de réalisation non représenté aux figures, l’entrée d’air 14 et l’entrée 12 recevant l’échantillon biologique à tester ET sont confondues et forment ensemble une entrée unique de fluide.

Membrane d’extraction, liquides de traitement et valves

De plus, la plaquette comprend une membrane d’extraction repérée 2. La membrane d’extraction peut être une membrane de silice ou membrane de cellulose. La membrane d’extraction présente une structure poreuse, c’est-à- dire une structure alvéolaire. La fonction de la membrane d’extraction est l’isolation des molécules ADN/ARN et l’élimination des protéines et autres déchets à molécules courtes comme il va être décrit ci-après.

Dans un exemple, la matrice en silice de la membrane d’extraction est capable de fixer sélectivement les ADN/ARN en condition de force ionique élevée et en pH < 7. Les impuretés sont éliminées par des rinçages et après séchage, les molécules d’ADN et séquences ARN sont élués dans une solution en force ionique faible et à pH > 7. La matrice en silice peut être sous un format de poudre de verre, de particules de verre/silice ou de fibres en verre. En particulier, le rinçage permet également d’élimer les résidus de tampon de lyse et le séchage permet d’éliminer les résidus d’éthanol. L’éluant ne doit pas être contaminé par le tampon de lyse ou le liquide de rinçage, qui peuvent autrement inhiber la réaction d’amplification. Pour plus de détails sur les membranes d’extraction utilisées ici, on pourra se référer au document EP1463744.

On note que la membrane d’extraction 2 occupe tout le logement 24 dans lequel elle est disposée dans la direction transversale à l’écoulement des fluides que l’on fait passer dans la membrane d’extraction 2. Autrement dit, le flux d’écoulement des fluides (rinçage, séchage, élution) ne peut pas contourner la membrane d’extraction 2.

On peut choisir pour la membrane d’extraction la membrane GF/F Whatman de source Sigma-Aldrich™. Selon un autre exemple, on peut choisir pour la membrane d’extraction la membrane GF/D Whatman de source Sigma- Aldrich™, qui a des pores plus gros que la membrane GF/F Whatman et permet un écoulement accéléré.

Par exemple, la longueur de la membrane peut être de l’ordre de 10 mm, sa largeur peut être comprise entre 3 mm et 5 mm et son épaisseur peut être comprise entre 0,3 mm et 0,6 mm.

De plus, la plaquette comprend des liquides de traitement qui sont prédisposés sur la plaquette, c’est-à-dire présents sur la plaquette elle-même. On peut dire qu’ils sont embarqués ou à bord de la plaquette.

Dans l’exemple illustré, il est prévu un premier volume 61 de liquide de rinçage R1 agencé dans le logement 74, un deuxième volume 62 d’un deuxième liquide de rinçage R2 agencé dans le logement 75, et un volume 63 d’éluant 23 agencé dans le logement 76. Ces volumes/produits sont contenus directement dans des logements du corps 10 ou contenus dans des sachets 37 lesquels sont agencés dans des logements du corps. Dans la configuration sachet/blister, ces sachets sont préparés en avance et ont une contenance bien précise. Le liquide d’intérêt est contenu dans ce sachet, par exemple en film d’aluminium, et il n’y a pas de contact direct entre le corps de la plaquette et le liquide d’intérêt avant utilisation effective par percement/déchirement du sachet.

Le contenu de ces volumes de liquide peut être déversé et dirigé vers la membrane d’extraction 2 au travers des canaux susmentionnés 13s,13u,13k comme il sera vu plus tard, en réponse à une activation.

On remarque que la présence du deuxième liquide de rinçage R2 est optionnelle. En effet, en fonction du type de test, le logement 75 peut rester inutilisé ou être absent, un seul liquide de rinçage est utilisé.

Dans l’exemple illustré, les premier et deuxième volumes de liquide de rinçage R1, R2 ont un volume compris entre 100 microlitres et 300 microlitres. Bien entendu, l’invention fonctionne aussi pour des volumes de rinçage plus petits et aussi pour des volumes plus grands.

Concernant le volume d’éluant, il peut être compris entre 30 microlitres et 50 microlitres. Là aussi, l’invention fonctionne aussi pour des volumes d’éluant plus petits et aussi pour des volumes d’éluant plus grands.

Concernant l’éluant, on choisira de préférence une eau particulière, à savoir une eau distillée exempte de RNase et de DNase, i.e. dépourvue de RNase et DNase, dite « DNase/RNase free water». Dans un autre exemple on utilise un tampon Tris/EDTA. Pour l’éluant, on peut aussi choisir comme éluant un composé connu sous le nom d’Ibuffer™ d’Optigene™. De plus, l’éluant peut aussi contenir des sels utiles pour la réaction.

L’éluant présente une force ionique faible et présente un pH > 7.

Pour plus de détails sur le type d’éluant utilisé ici, on pourra se référer au document EP1463744.

En outre, dans l’exemple illustré, la plaquette comprend deux valves de routage qui servent à diriger ou stopper un flux de fluide circulant dans les canaux 13.

Plus précisément, les deux valves permettent de diriger un flux de fluide depuis la membrane d’extraction 2 sélectivement vers le réservoir de récupération 18 ou vers les zones de réaction.

Une première valve 51 peut sélectivement fermer l’accès au réservoir de récupération 18. En amont de la première valve 51 se trouve le canal 13c et en aval se trouve le canal 13d (Fig 4).

Une deuxième valve 52 peut sélectivement ouvrir l’accès vers les zones de réaction. En amont de la deuxième valve 52 se trouve le canal 13b et en aval se trouve le canal 13f (Fig 4).

Les valves 51 , 52 sont dans l’exemple illustré des valves de type membrane. En effet une membrane déformable vient sélectivement ouvrir ou fermer un passage entre deux orifices voisins, la membrane étant placée dans un logement fermé, les deux orifices étant les seules voies de passages disponibles pour le fluide.

Les figures 13A et 13B illustrent une membrane déformable 51 , qui ouvre ou ferme sélectivement un passage entre deux canaux 131, 132.

La membrane déformable délimite par le bas une chambre 151. Le corps de la plaquette délimite sur les côtés et sur le haut la chambre 151 , sauf aux endroits où débouchent les canaux, avec un premier port 131a (première embouchure) et un deuxième port 132a (deuxième embouchure). En figure 13A la membrane déformable 51 est au repos (forme plate au repos) et le passage entre les deux embouchures 131a, 132a est ouvert (circulation en flèche pointillée). En figure 13B sous l’effet d’une action mécanique de poussée par l’élément noté 94, la membrane déformable 51 est fléchie et vient porter sur les ports (deux embouchures) 131a, 132a ; le passage est entre les deux embouchures 131a, 132a est alors fermé.

La valve membrane a été illustrée dans une configuration normalement ouverte, mais il est aussi possible d’utiliser une membrane de configuration normalement fermée.

La sortie d’air 16 est agencée au fond ou en communication avec le fond du réservoir de récupération, tandis que la sortie d’air intermédiaire 17 est agencée à proximité de l'entrée du réservoir de récupération. L’une et l’autre peuvent être équipées d’une capsule Goretex™ ou équivalente qui empêche tout déversement de liquide tout en laissant passer l’air.

Pour la sortie d’air 16 du fond de réservoir, en fonction de la configuration du réservoir et notamment s’il a un volume excédentaire par rapport au besoin de stockage, la capsule Goretex™ est optionnelle.

On note qu’il pourrait y avoir seulement la sortie d’air 16 du fond de réservoir mais pour faciliter le séchage de la membrane après le passage des liquides de rinçage, et l’avancement de l’éluat par le canal 13g on dispose la sortie d’air intermédiaire 17 qui elle doit être équipée d’une capsule Goretex™ ou équivalente.

Zones de réaction et zone de lecture

De plus, la plaquette comprend une première zone de réaction 31 contenant un media poreux 35 contenant un premier mélange réactionnel de test 33, et une deuxième zone de réaction 32 contenant un media poreux 35 contenant un deuxième mélange réactionnel de contrôle 34.

Les première et deuxième zones de réaction sont agencées respectivement dans le deuxième logement 72 dans le troisième logement 73.

Dans l’exemple illustré, il est prévu un réservoir auxiliaire 38 agencé de manière adjacente aux premier et deuxième logements 72,73 pour alimenter indirectement les media poreux. Ainsi les médias poreux des zones de réaction 31,32, i.e. les disques des premier et deuxième mélanges réactionnels 33,34 sont alimentés en éluat par l’arrivée de cet éluat dans le réservoir auxiliaire 38, sans que cet éluat ne traverse les disques.

Selon une disposition optionnelle avantageuse, dans chaque disque de mélange réactionnel 33,34, il est prévu une projection radiale 33a, 33b pour la fonction de pompage capillaire. Seule la projection radiale 33a, 33b est baignée directement par le flux d’éluat. Les disques ne sont baignés par le flux d’éluat, ils sont alimentés en éluat par le pompage capillaire. On note que les deuxième et troisième logements 72,73 qui renferment les disques ont un seul port d’entrée/sortie dans lequel passe la projection radiale, autrement dit lesdits logements sont en configuration de cul-de-sac. On note que les interfaces de contact entre les disques et le réservoir sont minimisées, tout comme les volumes morts autour des disques de manière à limiter la diffusion des réactifs contenus sur les disques.

On peut choisir pour les deux disques de test et de contrôle les références GF/DVA Whatman de source Cytiva™ (précédemment GE HEalthcare™ Life Sciences™). Par exemple, les disques ont un diamètre compris entre 5 mm et 6 mm et une épaisseur comprise entre 0.7 mm et 1 mm.

Selon un exemple, chaque disque occupe tout le logement dans lequel il est placé ; il n’y a pas de jeu ou de d’espace disponible où de l’éluant pourrait se loger. Selon une variante, on prévoit que l’air contenu initialement dans le disque puisse s’échapper lors de la réhydratation du disque. Par exemple une gorge est ménagée sous les disques et un passage de fuite pour faciliter cet échappement d’air.

Les réactifs intégrés sont dans un exemple : H20, dNTPs, 10x tampon isotherme, MgS04, bétaine, agent intercalant, mélange d’amorces, enzyme Bst 2.0 W S, et enzyme AMV-RT (enzymes polymérase et reverse transcriptase). Dans un exemple, il peut s’agir du WarmStart LAMP Kit de New England Biolabs™.

Le mélange réactionnel de test contenu dans le media poreux comprend ainsi, dans un exemple, la transcriptase inverse qui permet de transcrire l’ARN en ADN, le jeu d’amorces spécifiques à l’ADN du pathogène, l’ADN polymérase, un tampon isotherme contenant des désoxynucléotides triphosphates (dNTP), nécessaires à l’amplification ADN, du MgS04 agissant comme un cofacteur et catalyseur de la réaction, ainsi que de la bétaine, additif souvent utilisé pour améliorer l’amplification des séquences ADN. Enfin, un fluorophore ou une sonde colorimétrique est incluse afin de révéler la réaction d’amplification quand celle-ci a lieu.

Les premier et deuxième mélanges réactionnels 33,34 se présentent sous forme lyophilisée. Cette forme est stable et autorise un stockage long des plaquettes neuves avant leur utilisation.

Les premier et deuxième mélanges réactionnels 33,34 se présentent sous une forme générale de disque.

Selon une disposition optionnelle avantageuse, le media poreux 35 est formé en papier. Sa capacité d’absorption d’eau exempte d’ARNase et/ou d’ADNase (éluant) est connue, maîtrisée et répétable, ce qui contribue à la fiabilité du test.

La lecture du résultat est faite par une mesure optique, notamment un premier dispositif optique 98 agencé dans la station d’analyse 8 en vis-à-vis de la première zone de réaction 31 et un deuxième dispositif optique 99 agencé dans la station d’analyse 8 en vis-à-vis de la deuxième zone de réaction 32. Il est prévu dans la station d’analyse 8 un élément d’illumination 98a, commun ou non et un appareil d’imagerie, un capteur optique ou des photodiodes pour recevoir des rayonnements réfléchis (ou transmis) par les media poreux des premier et deuxième mélanges réactionnels 33, 34.

Dans l’exemple illustré, on utilise les propriétés de fluorescence des media poreux où les acides nucléiques se sont multipliés.

Lesdits premier et deuxième mélanges réactionnels permettant l'amplification et la détection d’une ou plusieurs séquences d'acide nucléique.

On note qu’il est prévu une zone de lecture de résultat, comprenant au moins les première et deuxième zones de réaction 31,32. Dans le cas où le corps est formé en matière translucide, on peut considérer que la zone de lecture est aussi large que la plaquette elle-même. Si le substrat utilisé pour le corps n’est pas transparent ou pas suffisamment translucide, on peut prévoir une fenêtre spécifique transparente pour la lecture du résultat.

On détermine la réponse en fluorescence des première et deuxième zones de réaction pour en déduire un résultat de test.

Plus précisément, on compare la réponse en fluorescence de chaque disque avant et après chauffage. Si la réponse en fluorescence du disque de contrôle est faible alors le test est déclaré nul.

Si la réponse en fluorescence du disque de contrôle est élevée et que la réponse en fluorescence du disque de test est faible, alors le test est déclaré négatif.

Si la réponse en fluorescence du disque de contrôle est élevée et que la réponse en fluorescence du disque de test est élevée aussi, alors le test est déclaré positif.

En effet, la première zone de test amplifie l’ADN spécifique au pathogène recherché. La deuxième zone (disque de contrôle) consiste à amplifier l’ARN non spécifique provenant de l’échantillon. En effet, les deux mélanges réactionnels sont identiques mis à part le jeu d’amorces mis en place. Dans le cas du contrôle, il s’agit d’amorces non spécifiques au virus recherché (agent pathogène recherché) mais coopérant à une séquence ARN toujours présente dans l’échantillon/l’éluat incident. Le but du contrôle étant de confirmer qu’à la fois l’étape d’extraction ainsi que l’étape d’amplification se sont bien déroulées, permettant ainsi d’éliminer l’option d’un faux négatif.

Il n’est pas exclu de délivrer un résultat plus riche qu’un résultat binaire. A condition que la réponse en fluorescence du disque de contrôle soit élevée, l’intensité de réponse en fluorescence du disque de test peut être traduite en un index allant de 0 à 1.

Il faut noter qu’en lieu et place d’une mesure de réponse en fluorescence, on pourrait aussi utiliser d’autres méthodes optiques, comme une méthode de colorimétrie, une méthode de photométrie, une méthode de coefficient de transparence.

Il faut aussi noter qu’on peut analyser optiquement les mélanges réactionnels après réactions, soit par mesure de réflectivité, soit par mesure de transmissivité (émetteur et récepteur de part et d’autre de la plaquette).

Il faut aussi noter qu’on réalise une lecture optique de référence avant chauffage, pour permettre de faire le « zéro » du système optique, aux conditions de rayonnements ambiantes et avec la plaquette telle qu’elle est en transparence. Après chauffage réaction et refroidissement, les nouvelles mesures optiques sont prises avec comme référence la mesure de référence avant chauffage (méthode différentielle).

Station d’analyse

La station d’analyse 8 comprend un châssis 89 comprenant des colonnes de structure 88. La station d’analyse 8 se présente comme une boite parallélépipédique. Dans un exemple, cette boite est proche d’une forme cubique. Dans un exemple, le côté de cette forme cubique présente une longueur comprise entre 25 cm et 40 cm. La station d’analyse pourrait toutefois présenter une forme quelconque. La largeur, longueur ou profondeur maximale de la station d’analyse 8 est inférieure à 40 cm, ou inférieure à 20cm, voire inférieure à 12cm (comprise entre 11cm et 12cm).

Dans l’exemple illustré, la station d’analyse 8 comprend une platine de fond 81 , une platine intermédiaire 82 et une platine supérieure 83.

La station d’analyse 8 comprend une embase 86 configurée pour recevoir une plaquette de test 1 et la soumettre à une série d’opérations. L’embase 86 est agencée dans la platine supérieure 83 et comprend des guides pour positionner la plaquette précisément à l’endroit souhaité pour qu’une interface mécanique, pneumatique, thermique et optique entre la plaquette et la station se produise.

Par exemple, l’embase 86 comprend une empreinte 87 de forme complémentaire à la face principale de la cartouche qui comprend les interfaces fonctionnelles. La cartouche peut donc s’emboîter aisément dans l’empreinte 87, assurant ainsi un positionnement facile et correct de la cartouche dans la station.

La station d’analyse 8 comprend un capot 80 monté sur le châssis grâce à une articulation, par exemple grâce à un mouvement pivotant d’axe Y8 (type charnière).

Il est prévu un système de verrouillage de capot 112. En effet, lorsque les opérations de test sont en cours sur une plaquette de test, le capot est fermé et verrouillé. Lorsque le test est fini et que le résultat est obtenu, le système de verrouillage déverrouille le capot. Un opérateur peut alors ouvrir le capot, enlever la plaquette de test et placer sur l’embase une nouvelle plaquette de test à traiter.

Le capot 80 ne comprend typiquement pas d’interface fonctionnelle concernant le circuit fluidique ou pneumatique. En d’autres termes, le capot ne loge pas de composant configuré pour interagir avec la plaquette de test 1 pendant un test. Cela permet de simplifier la conception de la station d’analyse 8.

Un capteur à effet Hall est utilisé pour détecter l’état de fermeture du capot. La donnée du capteur conditionne l’activation du verrouillage. Ainsi, il faut un signal NFC/RFID indiquant que la plaquette de test est en place et un signal du capteur à effet Hall indiquant que le capot est fermé pour déclencher le verrouillage du capot.

La station d’analyse 8 comprend une pompe à air 85. Ce peut être une pompe génératrice de surpression ou génératrice de dépression, suivant les configurations plaquette/station.

La station d’analyse 8 comprend un dispositif de chauffage 96. Le dispositif de chauffage peut être complémentée par un dispositif de refroidissement, tel qu’un ventilateur, un dissipateur (échangeur à ailettes par exemple, le dissipateur étant par exemple positionné au-dessus du ventilateur) et/ou une cellule Peltier (la même que pour chauffer par exemple), pour forcer le refroidissement. La station d’analyse 8 comprend un capteur de température 97 pour réguler la commande du dispositif de chauffage. Le dispositif de chauffage peut être une résistance chauffante, une cellule à effet Peltier, ou encore comprendre un ou plusieurs corps, typiquement des corps noir(s), disposé(s) à proximité des zones de réaction et un éclairage infrarouge pour chauffer le(s)dit(s) corps noir(s). La station commande le dispositif de chauffage pour avoir un palier à une certaine température et sur une certaine durée. Par exemple, la température de palier est comprise entre 50 °C et 70 °C. Dans un exemple, la température de palier est de 65 °C. La durée du palier est comprise entre 20 minutes et 40 minutes. La station d’analyse peut fonctionner avec une durée de palier prédéterminée (paramètre). Dans un mode alternatif, la fin de palier peut dépendre de l’analyse optique des zones de réaction, par exemple le résultat peut être lu avant la durée prédéfinie, ou dans le cas opposé, l’analyse optique des zones de réaction peut permettre d’identifier une erreur.

La station d’analyse 8 comprend une unité de commande 100, dont le synoptique est présenté à la figure 15.

La station d’analyse 8 comprend un dispositif d’analyse optique 98,99 pour déterminer le résultat, comme déjà évoqué plus haut.

La station d’analyse 8 comprend des moyens de communication sans fil 116. Ces moyens permettent de transmettre le résultat à une entité distante.

La station d’analyse 8 peut comprendre, sur la platine intermédiaire 82, un ou plusieurs actionneurs 91-95 pour pousser sur les volumes et/ou activer les valves commandées, suivant les différents exemples de réalisation. Plus précisément, un premier actionneur 91 permet d’exercer une action mécanique sur le volume du premier volume de rinçage 61. Un deuxième actionneur 92 permet d’exercer une action mécanique sur le volume du deuxième volume de rinçage 62. Un troisième actionneur 93 permet d’exercer une action mécanique sur le volume d’éluant 63. Un quatrième actionneur 94 permet d’exercer une action mécanique sur la première valve 51. Un cinquième actionneur 95 permet d’exercer une action mécanique sur la deuxième valve 52. Les actionneurs peuvent être appelés ‘poussoirs’.

La station d’analyse 8 comprend au moins un connecteur pneumatique 66 configuré pour être accouplé à l’entrée d’air 14 de la plaquette. Il est prévu une tuyauterie pneumatique 67 pour relier la pompe à air 85 au connecteur pneumatique 66.

Dans d’autres configurations, le ou les connecteur(s) pneumatique(s) peuvent être raccordés à différentes entrées ou sorties d’air.

La station d’analyse 8 comprend une interface utilisateur sous forme de bouton de commande 108, 109 et/ou d’écran tactile.

La station d’analyse 8 peut comprendre un dispositif de lecture 105 de l’élément d’identification 27 de la plaquette / des plaquettes.

La station d’analyse 8 peut comprendre une caméra 102. Cette caméra peut être utilisée pour vérifier le déplacement des liquides dans la plaquette.

En référence à la figure 14, on a illustré le déversement d’un liquide de rinçage contenu dans un sachet 37. L’extrémité supérieure de l’actionneur 94 vient pousser sur la poche/le sachet. Il est prévu des picots 36 dans le fond du logement 74. Lorsqu’on presse le sachet 37, lesdits picots 36 s’y enfoncent et viennent déchirer le sachet libérant ainsi le liquide y contenu qui s’écoule dans le canal 131.

En référence à la figure 16, on a illustré plus en détails le dispositif d’analyse optique et sa disposition vis-à-vis des disques 35.

Une Led 98a illumine un disque 35 et le rayonnement reçu en retour est capté par une ou plusieurs photodiodes 98. Sur l’autre disque, le même processus se déroule avec une ou plusieurs photodiodes 99.

Support rigide de la plaquette

En référence aux Figures 23a-c, la plaquette de test 1 peut être montée sur un support rigide 39 qui peut dépasser de la station lorsque la plaquette de test y est installée. Dans un mode de réalisation, le support rigide est une plaque (par exemple parallélépipédique) dont les dimensions en largeur et en longueur sont supérieures à celle de la plaquette de test mais dont la dimension en épaisseur est inférieure à celle de la plaquette de test. Cela signifie que l’une 10B des faces principales 10A, 10B de la plaquette de test (à savoir la face principale ne comportant pas d’interface fonctionnelle) peut être entièrement comprise sur le support rigide. Un tel support rigide 39 permet de manipuler aisément la plaquette 1 sans toucher la face principale 10 avec l’interface fonctionnelle, permet de retirer aisément la plaquette de test 1 de la station 8 (il suffit de saisir la partie rigide et de tirer en direction opposée à l’empreinte 87) et offre, du côté du support rigide opposé à plaquette de test 1 , une surface libre sur laquelle peuvent figurer des informations, comme l’élément d’identification 27 de la plaquette de test 1.

En particulier, il n’est pas nécessaire de prévoir de système d’éjection et d’insertion automatisé de la plaquette, ce qui permet de s’affranchir de moteur et autres composants mécaniques/électriques. La compacité de la station 8 s’en trouve améliorée.

La plaquette de test 1 peut être collée ou soudée sur le support rigide 39.

Lorsque la plaquette de test 1 est mise en place dans la station 8 et que le capot 80 est fermé, une extrémité 39’ du support rigide peut rester accessible (« portion visible ») pour un utilisateur. Sur l’extrémité visible peut être déporté l’élément d’identification 27 (ou une partie de celui-ci) de la plaquette de test (en particulier lorsqu’il s’agit d’une référence alphanumérique, d’un code-barre, d’un QR code ou autres éléments nécessitant d’être visible pour un opérateur), qui est donc visible par l’opérateur même quand la cartouche est installée dans la station. Cela permet une vérification de l’identification de la cartouche qui est simple, rapide et non-sujette à des pannes de matériel.

L’épaisseur du support rigide est par exemple comprise entre 0,5mm et 3 3mm, ou 1 mm et 2mm.

Le capot 80, lors de sa fermeture autour de l’axe Y8 vient au contact du support rigide 39 pour plaquer la plaquette de test 1 dans l’empreinte 87 et assurer ainsi la fonctionnalité de l’interface entre la plaquette de test et la zone d’interface 90 de la station 8.

Par rigide, il est signifié suffisamment rigide pour pouvoir manipuler la plaquette ; mais le support rigide peut se courber légèrement (type carte de crédit).

Procédé

Sur la figure 12, on a illustré les étapes du procédé. Dans le premier exemple où on utilise un récipient de collecte 40 standard, on a recueilli un par exemple de la salive, puis on l’a lysé puis on l’a inhibé avec de l’éthanol. On a ainsi obtenu un échantillon biologique prêt à tester, que l’on a versé dans l’entrée 12 et qui se trouve dans le réservoir amont 11.

La première étape d’intérêt consiste à :

51- faire passer échantillon biologique à tester ET sous forme liquide dans la membrane d’extraction 2. En pratique on pousse, grâce à une surpression d’air, l’échantillon biologique ET, depuis le réservoir amont 11 vers le réservoir de récupération 18, au travers de la membrane d’extraction 2. La première valve 51 est ouverte alors que la deuxième valve 52 est fermée.

Les acides nucléiques et d’autres espèces moléculaires sont retenus par la membrane d’extraction 2.

On note que la sortie d’air 16 permet à l’air présent dans le réservoir de récupération de s’échapper au fur et à mesure que le réservoir de récupération se remplit de liquide.

Ensuite on va procéder au rinçage, dans une étape notée S2.

52- faire passer un premier liquide de rinçage R1 dans la membrane d’extraction 2, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération 18. Optionnellement, on peut utiliser une deuxième passe de rinçage, au moyen de l’étape :

S25- faire passer un deuxième liquide de rinçage R2 dans la membrane d’extraction 2, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération.

Ensuite on va procéder au séchage, dans une étape notée S3.

53- faire passer de l’air dans la membrane d’extraction 2, pour la sécher. La station envoie de l’air sous pression dans l’entrée d’air 14 qui parcours les canaux 13h, 11 , 13a, 13b, 13c, 13e, 13j. L’air peut sortir au fond du réservoir par la sortie 16 mais aussi l’air peut sortir par la sortie d’air intermédiaire 17. L’étape S3 peut aussi inclure : faire chauffer la membrane, pour accélérer le séchage. Cette étape de chauffage peut être alternative ou complémentaire à l’étape de passage d’air dans la membrane d’extraction pour la sécher. On procède ensuite à l’élution de la membrane d’extraction, dans une étape notée S4.

54- faire passer un volume d’éluant dans la membrane d’extraction 2, et diriger l’éluat qui en sort en aval vers les première et deuxième zones de réaction 31 ,32. La première valve 51 est fermée alors que la deuxième valve 52 est ouverte.

D’autres étapes interviennent ensuite :

S45- optionnellement on fait une lecture optique de référence avant chauffage, pour permettre de faire le « zéro » du système optique, aux conditions de rayonnements ambiantes et avec la plaquette telle qu’elle est en transparence,

55- chauffer au moins les première et deuxième zones de réaction 31 ,32 à une température prédéfinie,

56- attendre au moins un temps prédéterminé en maintenant la température prédéfinie,

S65- laisser refroidir ou ventiler pour refroidir afin de revenir à la température ambiante,

57- éclairer les première et deuxième zones de réaction 31,32, et recevoir en retour un niveau de fluorescence,

58- déterminer un résultat.

Pour finir, le procédé prévoit d’affecter le résultat (étape S9) à un dossier patient PF.

Deuxième exemple de réalisation

La figure 7 illustre un deuxième exemple de réalisation. Pour les éléments non commentés dans les paragraphes suivants, il faut considérer que ces éléments sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation.

Dans le deuxième exemple de réalisation, les volumes ne sont pas embarqués, i.e. les fluides de rinçage R1,R2 et d’élution 23 ne sont pas embarqués sur la plaquette, mais sont reçus sur la plaquette en provenance de la station d’analyse 8. La plaquette est alors très simple, elle ne contient aucun liquide avant utilisation. Après utilisation, le réservoir de récupération 18 contient et piège les liquides utilisés pendant le test, à savoir les liquides de rinçage et d’élution ainsi que restes de l’échantillon biologique initial.

La station d’analyse 8 comprend alors des micro-doseurs, respectivement 56, 57, 58 pour les trois fluides R1, R2, éluant 23, le résultat des 3 microdosages se retrouve alors dans trois buffers intermédiaires 50. La station d’analyse 8 comprend alors des valves de sélection, respectivement 53, 54, 55 pour alimenter en air en surpression les canaux des trois fluides. Les trois canaux se rejoignent en aval dans un canal de sortie unique. Il y a une seule interface pneumatique 66 avec la plaquette, au niveau de l’entrée d’air 14.

Troisième exemple de réalisation

Les figures 8A et 8B illustrent un troisième exemple de réalisation. Pour les éléments non commentés dans les paragraphes suivants, il faut considérer que ces éléments sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation. Les canaux internes à la plaquette ont été simplifiés. Un tronc commun de canal 13z est relié successivement de l’amont vers l’aval aux éléments suivants de l’amont vers l’aval :

- l’entrée d’air 14,

- le volume d’éluant 23,

- le volume du deuxième liquide de rinçage R2,

- le volume du premier liquide de rinçage R1,

- l’entrée 12 de l’échantillon biologique,

- la membrane d’extraction 2 dans son logement 24.

En aval, on retrouve, deux branches qui divergent, chacune étant ouverte ou fermée par respectivement les première et deuxième valves 51,52.

Pour les rinçages et le séchage on ouvre la première valve 51 et on ferme la deuxième valve 52.

Pour l’amenée de l’éluat vers les première et deuxième zones de réaction, on ouvre la deuxième valve 52 et on ferme la première valve 51.

Dans cet exemple, le flux d’éluant traverse les media des mélanges réactionnels 33,34. Mais on pourrait aussi avoir un réservoir auxiliaire comme précédemment décrit.

Quatrième exemple de réalisation

Les figures 9 à 11 illustrent un quatrième exemple de réalisation. Pour les éléments non commentés dans les paragraphes suivants, il faut considérer que ces éléments sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation.

Selon la présente invention, dans son quatrième exemple de réalisation illustré, le récipient de collecte n’est pas standard. Le récipient de collecte 4 comprenant une entrée 41 et une sortie 42, toutes deux agencées en partie basse du récipient de collecte, et un couvercle 43 à fermeture hermétique.

Chacune de ces entrée et sortie 41 ,42 est operculée à l’état neuf, i.e. un opercule 64 scelle hermétiquement chacune de ces entrée et sortie.

Il est prévu une cheminée 44 formant un canal interne au récipient et amenant de l’air qui va arriver par l’entrée 41 en partie supérieure du récipient.

Le récipient 4 est prévu pour coopérer avec la plaquette de test 1 par enfichage.

Sur la plaquette de test 1, il est prévu une première aiguille 45 agencée respectivement en vis-à-vis de l’entrée operculée 41, et une deuxième aiguille 46 agencée respectivement en vis-à-vis de la sortie operculée 42.

Lorsque l’on vient enficher le récipient 4 sur la plaquette, les aiguilles 45,46 percent les opercules 64 et mettent en communication d’un part :

- l’entrée d’air 14 avec l’entrée 41 et la cheminée 44, et d’autre part :

- la sortie 42 avec l’entrée 12 d’échantillon biologique.

Pour vider le contenu du récipient de collecte 4, la station souffle de l’air dans l’entrée d’air 14, l’air remonte dans la cheminée et pousse l’échantillon biologique vers la sortie 42 du récipient, le liquide d’échantillon biologique s’écoule alors depuis l’intérieur du récipient 4 dans l’entrée 12 de la plaquette. Grâce à ce procédé, il n’y a aucun risque de déverser à l’extérieur du liquide d’échantillon biologique. Au lieu d’utiliser une pression relative positive en amont, on obtient le même résultat en créant une dépression en aval.

Selon le présent exemple, on utilise une pluralité de récipients de collecte à usage unique, chaque récipient de collecte est configuré pour être enfiché sur une plaquette de test, formant ainsi un couple [plaquette de test + récipient de collecte] à usage unique, donc destiné à être jeté après usage.

Selon une variante du récipient de collecte illustré à la figure 9B, le récipient de collecte 4ST comprend deux espaces pré-emplis respectivement de lyse et d’éthanol et pouvant être mis sélectivement en communication. Plus précisément, le récipient est livré avec un volume de lyse dans un compartiment principal et un volume d’éthanol dans un compartiment annexe 47. On vient ensuite déposer grâce à un écouvillon scellable 49 le prélèvement de fluide corporel brut dans le compartiment principal. Ensuite on referme le couvercle 43 hermétiquement et on secoue le récipient de collecte 4ST. Le tampon de lyse rompt les membranes des cellules biologiques. Puis on vient percer le compartiment annexe 47 pour faire s’écouler l’éthanol afin qu’il se mélange avec le liquide lysé. A cet effet il est prévu un élément pointu ou tranchant 48 déplaçable par une action manuelle sur un bouton protégé dans un orifice.

On forme ainsi un kit de collecte très pratique.

Dans ce quatrième exemple, comme visible sur la figure 10, les interfaces de la plaquette avec la station d’analyse se trouvent d’un premier côté, i.e. d’une première face principale 10A et l’entrée 12 pour recevoir un échantillon biologique à tester ET est agencée sur le deuxième côté, i.e. sur la deuxième face principale 10B.

A l’inverse, on remarque que pour les trois premiers exemples, toutes les interfaces de la plaquette avec la station d’analyse se trouvent d’un même côté

10A.

Comme illustré dans la figure 11 , d’autres caractéristiques sont visibles, qui peuvent être indépendantes de la configuration du récipient de collecte. Ici, la plaquette n’a pas de valve embarquée. Les valves de sélection ou routage sont localisées dans la station d’analyse 8. De plus la pompe à air travaille en dépression au lieu de en surpression. On ‘tire’ au lieu de ‘pousser’.

Plus précisément, la plaquette dispose de quatre entrées d’air, l’entrée 14 déjà commentée pour faire avancer l’échantillon biologique dans la plaquette. Une autre entrée 142 est reliée au canal sur lequel arrive le premier volume de rinçage 61, R1. Une autre entrée 143 est reliée au canal sur lequel arrive le deuxième volume de rinçage 62, R2. Une autre entrée 144 est reliée au canal sur lequel arrive le premier volume d’élution 63,23. Il peut être prévu un canal spécial pour le séchage auquel cas on a une cinquième entrée d’air 145. Une seule des électrovannes 146 amont est ouverte à la fois, les autres restent fermées.

En aval, nous avons deux sorties d’air, une première sortie d’air 16 au fond du réservoir de récupération 18 et une deuxième sortie d’air 16b reliée fluidiquement au réservoir auxiliaire 38. Il peut y avoir une sortie d’air pour le séchage, notée 16c, en communication fluide avec l’aval du logement 24 de la membrane d’extraction 2. Une seule des électrovannes 147 amont est ouverte à la fois, pour générer une dépression dans un des circuits de canaux.

Pour rincer la membrane avec le premier liquide de rinçage, on ouvre la deuxième vanne amont et en aval la vanne 1472 reliée à la sortie 16. Pour rincer la membrane avec le deuxième liquide de rinçage, on ouvre à la place la troisième vanne amont. Pour sécher la membrane, on ouvre la première vanne aval 1471 et la cinquième vanne amont.

Pour l’élution, on ouvre la quatrième vanne amont et la troisième en aval 1473 reliée à la sortie.

Cinquième exemple de réalisation

Les figures 17 à 22 illustrent un cinquième exemple de réalisation

Il faut apprécier le cinquième exemple comme une variation du premier exemple. Pour les éléments non commentés dans les paragraphes suivants, il faut considérer que ces éléments sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation.

D’une manière générale, certains éléments ont des positions différentes dans ce cinquième exemple, mais le schéma de principe des canaux et des logements reste similaire.

Comme pour le premier exemple, la plaquette de test présente une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales, à savoir une première face principale 10A dite face d’interaction, contenant toutes les interfaces et une deuxième principale 10B dite face arrière, ne contenant aucune interface fonctionnelle. L’épaisseur de la plaquette est comprise entre 2 mm et 8 mm. La longueur est comprise entre 30 mm et 80 mm (par exemple entre 70 mm et 80 mm) et la largeur est comprise entre 10 mm et 60 mm (par exemple entre 40 mm et 60 mm).

L’échantillon à tester ET est introduit par l’orifice d’entrée 12. A cet endroit, il est prévu un clapet anti-retour (‘check valve’).

Le réservoir de récupération 18 contient un tampon absorbant 180. Ce tampon absorbant présente un effet buvard et capture les liquides. Le tampon absorbant n’occupe pas tout le volume disponible dans le réservoir de récupération, un passage d’air entre le tampon et les parois du réservoir permet à de l’air de s’échapper par l’orifice de sortie 16.

Un dispositif de chauffage et de lecture repéré généralement 120 est disposé en vis-à-vis de de la première face principale 10A de la plaquette. Plus précisément, comme illustré à la figure 19, en position d’analyse, le dispositif de lecture optique fait face aux zones de lecture 31 32.

Pour le chauffage, il est prévu une première portion de chauffage 96a en face du logement 24 de la membrane d’extraction 2 et une deuxième portion de chauffage 96 en faces des zones de réaction, notamment en dessous des logements 72,73.

La première portion de chauffage 96a est prévue pour chauffer la membrane d’extraction (2) à une température comprise entre 50 °C et 60 °C. Cette étape est notée S30 à la figure 12.

Dit autrement, le premier logement 24, le deuxième logement 72 et le troisième logement 73 sont agencés à proximité les uns des autres. La zone de d’interaction thermique notée 126 recouvre les trois logements suscités 24,73,73.

La zone d’interaction thermique 126 présente une surface au plus égale à 4 cm ² (voire 5 cm ² ). Par exemple la zone d’interaction thermique 126 peut faire 3 cm ² .

Le dispositif de chauffage et de lecture peut être équipé d’un ou plusieurs éléments de chauffage et de refroidissement.

Dans ce cinquième exemple, il est prévu un seul réservoir de liquide de rinçage 61.

On remarque que dans ce cinquième exemple, les interfaces fonctionnelles, à savoir les entrées et les éléments activés par les poussoirs, sont agencées sur une seule face principale (10A). De plus, toutes les interfaces fonctionnelles, à savoir les entrées et les éléments activés par les poussoirs, sont regroupées dans une zone d’interface repérée 190 à la figure 22, d’un seul côté de la face principale, la zone d’interface 190 étant localisée. La zone d’interface 190 est située dans l’empreinte 87, et plus précisément au fond de l’empreinte 87. On note que le complément de la zone d’interface 190 sur la face principale pourrait se retrouver au moins en partie à l’extérieur de la station d’analyse. Dans un exemple décrit précédemment, ce complément est une partie du support rigide 39. On peut ainsi concevoir une station d’analyse très compacte.

En miroir de la zone d’interaction thermique de la plaquette, la station d’analyse 8 peut comprendre elle aussi une zone d’interaction thermique. Cela signifie que, dans l’empreinte 87, le dispositif de chauffage 96 (en particulier les corps intermédiaires), le dispositif d’analyse optique sont eux-aussi compris dans une zone qui fait moins de 4 cm2.

Les cellules optiques 98, 99 d’émission et réception sont agencées sur le dispositif de chauffage et de lecture 120. Les composants et le procédé de lecture optique sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation.

Par ailleurs on remarque que le réservoir auxiliaire 38 interposé entre les logements 72,73 présente ici une forme losange et non pas circulaire. Ceci permet d’inonder de façon optimales les disques réactionnels.

Divers autres aspects

Dans le premier exemple de réalisation, ainsi que le 3ème, ainsi que le 4ème ainsi que le 5ème, la plaquette de test est monolithique et contient dans un seul corps les éléments suivants : la membrane d’extraction, une ou deux zones de réaction, les volumes de liquide de rinçage et d’éluant, le réservoir de récupération, et la zone de lecture de résultat.

On note qu’il est possible d’utiliser les récipients de collecte particuliers 4, 4ST décrits au quatrième exemple dans le contexte et l’implémentation des autres exemples.

On note qu’il n’y a pas de source électrique à bord de la plaquette, seulement des composés et réactifs chimiques pré-stockés sous forme lyophilisée et les cas échéant des liquides. La surpression ou la dépression créée par la pompe à air 85, relativement à la pression atmosphérique peut être comprise entre 100 mbar et 500 mbars. Cette surpression ou dépression peut être adaptée en fonction de la portion de cycle (rinçage, élution, séchage).

On note qu’il peut être prévu des nervures 19 dans le réservoir de récupération, ce qui permet de maîtriser l’avance du front de liquide dans le réservoir de récupération. Les nervures 19 se trouvent en partie basse du réservoir de récupération lorsque la plaquette est en position de test sur la station 8, les rainures 19 forment des mini barrages qui opposent une résistance hydrodynamique à la progression des liquides dans réservoir de récupération 18.

On note qu’il peut être prévu que le réservoir de récupération 18 est un réservoir de récupération unique à bord de plaquette, ce réservoir de récupération 18 étant configuré pour recueillir tous les liquides et les piéger à l’intérieur de la plaquette. Rien ne ressort de la plaquette. Seul de l’air peut ressortir de la plaquette. Ainsi on évite toute contamination de l’environnement et/ou du test suivant.

Grâce à une liaison sans fil 196, la station d’analyse s’interface avec un Smartphone ou une tablette 28.

De plus, la station d’analyse peut s’interfacer avec un serveur 29. Avantageusement, la station d’analyse est mise à jour par téléchargement.

En particulier, les paramétrages et certaines parties du logiciel peuvent ainsi être mis à jour par téléchargement depuis un serveur.

Concernant les actionneurs 91-95 agencés dans la station, on utilise des actionneurs linéaires. On peut par exemple choisir parmi : - un vérin système pneumatique qui vient directement actionner un piston destiné à pousser sur la membrane ou le volume de liquide à solliciter mécaniquement,

- un vérin électrique ou un moteur pas-à-pas avec un pignon crémaillère ou un mécanisme vis-écrou

- un solénoïde ou électro-aimant

- un empilage d’étage piezo-électrique, notamment pour les valves membranes.

Bien que la description ait cite principalement la méthode LAMP (Loop- mediated isothermal amplification) ou RT-LAMP (Reverse transcriptase Loop- mediated isothermal amplification), le présent système de test biologique et ses plaquettes peuvent tout-à-fait être utilisés pour les méthodes suivantes :

RPA : Recombinase polymerase amplification, ou RT-RPA,

HDA : Helicase dépendant amplification, ou RT-HDA, RCA : Rolling circle amplification, ou RT-RCA,

SDA : Strand displacement amplification, ou RT-SDA,

NASBA : Nucleic acid sequence-based amplification, ou RT-NASBA,

TMA : Transcription mediated amplification, ou RT-TMA.