La présente invention concerne de nouvelles substances bactéricides, possédant un spectre d\'activité étendu.

Parmi les substances bactéricides connues, on distingue notamment un certain nombre d\'antibiotiques, et les antiseptiques.

Les antiseptiques sont des agents chimiques qui s\'opposent à la prolifération des microorganismes et les détruisent. On peut citer par exemple la chlorhexidine, les halogènes, les sels de métaux lourds, les ammoniums quaternaires, l\'acide salicyiique et ses dérivés.

Les antibiotiques sont définis à l\'origine comme des substances chimiques produites par des microorganismes et ayant le pouvoir d\'inhiber ou de détruire les bactéries et d\'autres microorganisn.es, en solution diluée. Un grand nombre de ces molécules sont actuellement préparées par hémisynthèse ou synthèse chimique.

Ces molécules peuvent avoir une action bactéπostatique ou bactéricide.

On distingue plusieurs grandes familles d\'antibiotiques, en fonction de leur structure et de leur mode d\'action. Les principales sont les béta-lactamines (pénicillines et cephalosporines), les aminosides, les cyclines, les phénicolés, les macrohdes, les polymyxines et les quinolones.

Les sulfamides constituent un autre groupe de produits antibactériens.

Cependant, l\'émergence constante de souches présentant une résistance aux substances bactéricides connues et la propagation rapide de ce caractère, conduisent à rechercher en permanence de nouveaux produits actifs.

En outre, on recherche de plus en plus des antibiotiques présentant des spectres limités ou destinés à des applications spécifiques, de façon à ne pas bouleverser, notamment au niveau digestif, l\'équilibre microbiologique naturel.

L\'un des intérêts du produit selon la présente invention, est de présenter une activité intéressante sur des bactéries impliquées dans les désordres du système digestif, en particulier les Clostπdium.

3 1

En effet, on a découvert que des dérivés porphyriques possèdent une activité bactéricide.

La présente invention a pour objet un produit bactéricide, caractérisé en ce qu\'il comporte un noyau porphine.

Le noyau porphine est le noyau fondamental des porphyπnes, constitué par quatre noyaux pyrroliques reliés par quatre chaînons -CH= , et se trouve représenté ci-dessous :

avec R≈R^R^H

L\'invention se rapporte aux dérivés des porphyrines, pour leur application en tant que substances thérapeutiquement actives, en particulier en tant que produits bactéricides.

Parmi les produits bactéricides selon l\'invention, on peut notamment citer les produits comportant une molécule d\'hématoporphyrine, pour laquelle R=Œ- ₃ , R^CHOH-CH^ et R ² =CH ₂ CH ₂ COOH.

D\'autres produits bactéricides particulièrement adaptés selon l\'invention sont les produits comportant au moins une molécule choisie parmi i\'hémine et l\'hematine ; l\'invention concerne également un produit bactéricide qui comporte au moins une partie du groupement hème, ou au moins une molécule dérivée des chlorophyllines, qui sont des sels des différentes chlorophylles.

Par fixation complexante d\'un groupement métallique aux quatre atomes d\'azote du squelette de base, on obtient une série de groupements prosthetiques qui conviennent à la mise en oeuvre de l\'invention.

Cependant, la présence de ce groupement métallique n\'apparaît pas essentielle, et sa nature peut être variable, avec conser¬ vation de l\'activité bactéricide des dérivés. Ces paramètres seront adaptés par l\'homme du métier. Le produit bactéricide selon l\'invention peut être préparé par synthèse, tout au moins pour sa partie porphyπque ; ceci présente des avantages tant pour des raisons de sécurité que de spécificité d\'action. Selon un autre aspect de l\'invention, le produit bactéricide peut être préparé par incubation d\'un substrat contenant de l\'hémoglobine avec un mélange enzymatique contenant au moins une protéase (puis récupération de la solution du produit obtenue).

Le produit bactéricide peut être obtenu à partir de différents substrats contenant de l\'hémoglobine, notamment à partir de sang total, de globules rouges, du contenu érythrocytaire ou d\'hémoglobine purifiée. On fait agir sur ce substrat un mélange enzymatique contenant au moins une protéase, notamment de la trypsine ; toutefois, de meilleurs résultats sont obtenus en associant la trypsine à d\'autres enzymes, tels que celles trouvées dans le suc pancréatique ou dans les surnageants de fecès d\'animaux axéniques. Le produit bactéricide peut également être obtenu par incubation d\'un substrat contenant de l\'hémoglobine avec de la protéinase K. L\'hydrolyse est alors conduite de préférence à une température de l\'ordre de 50° C.

Les conditions de l\'incubation dépendront de l\'activité du mélange enzymatique et de l\'origine du substrat, mais la digestion est conduite de préférence à 37° C pendant environ 2 heures, mais il est possible d\'utiliser des températures inférieures jusqu\'à 20° C, et des durées de l\'ordre de 1 heure à 72 heures.

Après incubation, le produit est récupéré en solution après élimination des éléments solides résiduels.

Le produit selon la présente invention peut être préparé notamment par le procédé suivant : a) on centrifuge un échantillon de sang total de mammifère, et on recueille le culot contenant les érythrocytes,

b) après lavage (par exemple avec une solution tampon isotonique), on met le culot en présence d\'eau distillée pour provoquer l\'hémolyse des érythrocytes, c) on centrifuge, d) on fait incuber le surnageant obtenu à l\'issue de l\'étape c) avec du suc pancréatique, e) la solution de produit bactéricide obtenue est stérilisée par filtration (0,k5 μm).

Le sang peut provenir de différents mammifères. Il est recueilli sur un anticoagulant comme l\'héparine.

Les érythrocytes sont isolés, par exemple par centrifugation à 2000 rpm, 10 min à +k ^a C, puis lavés dans le même volume de tampon, de préférence du tampon PB5 ; ils sont ensuite hémolyses par addition du même volume d\'eau distillée, et les débris cellullaires sont séparés du contenu érythrocytaire par centrifugation, par exemple à 13000 rpm, 10 min à + ° C. L\'extrait obtenu peut être conservé à ---4° C ou congelé à -20° C, s\'il n\'est pas soumis immédiatement à l\'action des enzymes.

L\'incubation en présence du mélange enzymatique est plus particulièrement effectuée à 37° C pendant 2k heures, en aérobiose, après dilution du substrat dans la préparation enzymatique.

Selon un autre des aspects de l\'invention, le produit bactéricide peut être obtenu par incubation d\'hémoglobine purifiée humaine ou animale avec du suc pancréatique. Ce produit peut être stérilisé par filtration.

Dans le cas où l\'incubation* est réalisée avec du suc pancréatique, on utilisera de préférence du suc pancréatique de porc, dilué à 2 %.

L\'action d\'un mélange enzymatique tel qu\'il a été défini ci-dessus, sur le sérum issu de la coagulation, le plasma des sangs hépaπnés séparé par centrifugation, ou les parois érythrocytaires séparées après

hémolyse, conduit à un produit dépourvu d\'activité bactéricide. De même, l\'incubation du mélange enzymatique avec la globine seule conduit à un produit inactif, démontrant la nécessité de la présence de Thème lors de la réaction. L\'action du mélange enzymatique sur le sang total conduit à un produit bactéricide ayant une activité inférieure à celle du produit obtenu à partir du contenu érythrocytaire.

De manière générale, l\'activité bactéricide du produit est portée par la fraction porphyπque, qui est insoluble dans l\'eau.

Des produits solubies dans l\'eau, préférés selon l\'invention, comportent donc le noyau porphine éventuellement substitué et/ou complexé par un métal, et associé à un résidu de 3 à 10 acides aminés, plus particulièrement des acides aminés provenant des chaînes de globine.

L\'analyse par chromatographie d\'hydrolysats d\'hémoglobine brute par la protémase K permet de séparer et de purifier la plus petite molécule soluble en eau portant l\'activité bactéricide. Il s\'agit d\'un composé absorbant à l ± nm et 380 nm, qui possède un poids moléculaire apparent compris entre 600 et 1000 daltons.

Un tel composé présente une bonne activité bactéricide, favorisée par une solubilité permettant une bonne répartition dans les liquides biologiques.

L\'administration per os de ce produit à une souris axénique permet de constater que l\'activité du produit est maintenue dans le contenu intestinal. Il s\'agit donc d\'un produit qui n\'est pas absorbé et reste dans la lumière du tractus digestif ; en outre ce produit n\'est pas dégradé par les enzymes digestives.

Si on le souhaite, le produit bactéricide peut comporter un nombre plus grand d\'acides aminés, ce qui augmente sa solubilité et permet son passage éventuel à travers la barrière digestive pour avoir une activité systémique. Les molécules actives ont comme structure commune le groupement porphyrinique et différent par les résidus d\'acides am inés maintenus associés au noyau porphyre. Elles sont autoclavabies.

Le produit bactéricide selon l\'invention est un produit ayant une partie substantielle de nature peptidique pouvant provenir de la globine. Le produit obtenu est certainement constitué par un mélange de molécules qui diffèrent par leur nombre d\'acides aminés. II s\'agit d\'un produit résistant, dont l\'activité persiste après un traitement à 60° C, pendant 15 heures. Ce produit est iyophilisable.

Il résiste en outre à l\'action de la protéase K-, 2k heures à 50° C.

Ce produit est sans doute dérivé de l\'hémoglobine comportant tout ou partie de l\'hème. Le produit bactéricide selon l\'invention est actif sur des bactéries gram anaérobies strictes, en particulier sur des bactéries du genre Ciostridium, tel que Ciostridium perfringens, Ciostridium butyricum, et des sporulés isolés de la flore humaine. II n\'est pas actif sur plusieurs souches de Ciostridium difficile. Il est actif sur d\'autres souches de la flore dominante de l\'homme adulte, tel que bifides, les peptostrep- tocoques, et Eubacterium.

Son activité s\'exerce également sur les bactéries du genre Bâcillus.

Ce produit est donc particulièrement intéressant puisqu\'il s\'agit d\'un produit d\'origine naturelle, actif sur des germes responsables d\'infections particulièrement dangereuses ; par exemple Ciostridium butyricum est impliqué dans Tentérocoiite uicéronécrosante du nouveau-né. Ce produit donne donc naissance à une nouvelle génération de substances inhibitrices, lyophilisables, stérilisables par filtration. Ce produit purifié pourra être utilisé notamment comme additif alimentaire, par exemple pour éviter les troubles observés lors du sevrage du porcelet.

Les produits bactéricides selon l\'invention peuvent également être utilisés comme conservateurs.

La présente invention concerne donc des compositions médicamenteuses comportant à titre de principe actif un produit selon la présente invention avec un excipient compatible avec une application thérapeutique notamment par voie orale.

Il pourra s\'agir notamment de compositions telles que des tablettes, comprimés, poudre ou autre forme administrable per os.

La présente invention concerne également des comprimés destinés à l\'alimentation, notamment animale, contenant son des concentrés du produit selon l\'invention destinés à être ajoutés aux aliments proprement dits, soif à l\'eau de boisson ou bien des pré-méianges d\'aliments animaux contenant le produit selon l\'invention.

D\'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Figure 1 : Mise en évidence de l\'effet bactéricide des substances înhibiτπces produites par l\'hydrolysat ES

EXEMPLE 1 : PREPARATION DE SUBSTANCE BACTERICIDE A PARTIR

DE SANG TOTAL

Du sang total ou ses fractions (globules rouges lavés, contenu érythrocytaire) sont traités par des enzymes digestives.

a) Préparation des substrats sanguins

On utilise le sang de n\'importe quel mammifère, homme ou animai, soit ses différentes fractions obtenues par les techniques classiques de fractionnement du sang : le sérum issu de la coagulation, . le plasma : surnageant de sang héparine centrifugé 2000 tours, 10 min,

+k° C, les globules rouges ; culot de centrifugation des sangs hépaπnés lavés 3 fois en PBS 0,01 M, les parois des globules rouges obtenues après hémolyse dans l\'eau distillée des globules rouges lavés centrifugés ( 13000 tours, 10 min,

+ °C), le contenu érythrocytaire (E) surnageant de centrifugation de Thémo- lysat des globules rouges.

b) Préparations enzymatiques

On utilise :

le surnageant des- fèces fraîchement collectées sur rat ou souris axéniques (sans germe) diluées au I/10è, le suc pancréatique lyophilisé de porc (S) à raison de 2 g/100 ml de PBS 0,01 M, - la trypsine purifiée de bovin (Sigma T86 2) à 5 mg/ml de PBS.

Suc pancréatique et trypsine sont préparés extemporanément.

c) Incubation des substrats dans les préparations enzymatiques

Les substrats sanguins fraîchement préparés ou stockés, aliquotés à la température ambiante ou au froid, sont dilués au l/10è et au l/20è dans les préparations enzymatiques, ils sont incubés pendant 2 h à 37° C.

EXEMPLE 2 : ACTIVITE BACTERICIDE DE PRODUITS OBTENUS A l\'EXEMPLE I

Les résultats sont présentés dans le tableau 1.

EFFET BACTERICIDE SUR BACILLUS SUBTILIS BFR DES SUBSTRATS SANGUINS DE CINQ DONNEURS HUMAINS INCUBES AVEC DES ENZYMES DIGESTIVES

Les nombres représentent le rayon moyen, en millimètres, de la zone d\'inhibition de croissance de Bacillus BFR. Les traits l\'absence de zone, entre parenthèses le nombre de réponses positives dans le cas de réponses différentes dans le groupe de cinq donneurs.

L\'incubation de sang humain total, d\'un culot de globules rouges lavés ou de la fraction soluble de globules rouges hémolyses avec les enzymes pancréatiques génère in vitro une activité bactéricide. La production des substances inhibitrices est le résultat d\'un processus enzymatique : les témoins substrats sanguins et enzymes seuls sont sans effet.

Les substrats ne sont pas les constituants du sérum et du plasma. L\'activité enzymatique s\'exerce sur les globules rouges, non pas sur la paroi, mais sur le contenu érythrocy taire.

L\'effet bactéricide est moins fort avec le sang total ; ceci est sans doute lié à la présence d\'inhibiteurs trypsiques. L\'activité bactéricide est plus forte après l\'action de mélanges enzymatiques comme ceux présents dans les fèces des animaux axeniques ou dans le suc pancréatique qu\'avec la trypsine seule.

EXEMPLE 3 : PREPARATION DE SUBSTANCE BACTERICIDE A PARTIR D\'HEMOGLOBINE

Des hémoglobines brutes, de préférence purifiées (H) d\'origine humaine (Hl) ou animale (H2) sont traitées par n\'importe quel type de protéase, pas nécessairement digestive. On utilisera de préférence la protéinase K- purifiée qui hydrolyse les protéines, glycoprotéines, peptides et esters d\'acides aminés.

a) Préparation des solutions d\'hémoglobine

Hl : hémoglobine humaine purifiée (Sigma H7379). Hl est diluée et utilisée à même concentration que celle du sang d\'un homme adulte. On dilue 12,5 à 15 g d\'hémoglobine dans 100 ml de PBS 0,01 M. H2 : hémoglobine bovine brute ou purifiée (Sigma H2625-

H2500). H2 est préparée comme Hl mais diluée 10 fois soit 1,2 à 1,5 g/lOOmi de PBS.

b) Préparation enzymatique

Une solution mère de protéinase à 10 mg/ml est préparée en tampon Tris 0,01 M-pH=7,9. Cette solution est stabilisée avec 2 m de Ca sous forme de CaC12.

c) Conditions d\'hydrolyse

La protéinase K est utilisée à plusieurs concentrations, de préférence à la concentration finale de 0,1 mg/ml d\'hémoglobine à hydrolyser. L\'hydrolyse est conduite de préférence à 50° C sous agitation lente. La durée d\'hydrolyse est variable de 1 heure à 2k heures. Les hydrolysats obtenus après 2 heures d\'incubation génèrent une bonne activité antibiotique.

EXEMPLE k : EFFICACITE INHIBITRICE DE DIFFERENTS TYPES D\'HYDROLYSATS

Les résultats d\'hydrolysats obtenus montrent que le contenu érythrocytaire ou l\'hémoglobine purifiée traités par la protéinase K à 0, 1 mg/ml génère une substance inhibitrice sur BFR efficace jusqu\'au 1 / 128. La quantité de substance bactéricide produite dépend de la concentration d\'hémoglobine à hydrolyser. L\'hydrolysat du contenu érythrocytaire par le suc pancréatique produit une substance plus diffusible donc plus solubie.

Les résultats sont présentés dans le tableau 2.

Tableau 2

E : contenu erythrocytaire, H : hémoglobine purifiée, K : protéinase K, S : suc pancréatique de porc, sont sans activité sur BFR a toutes les concentrations utilisées.

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice.

EXEMPLE 5 : PREPARATION DE SUBSTANCE BACTERICIDE A PARTIR DES FRACTIONS DE L\'HEMOGLOBINE

a) Extraction chimique de Thème de l\'hémoglobine Hl

On utilise la méthode de F. Ascoli et col. (Methods in enzymology vol 76.5.1981 ) qui consiste à extraire la globine des hémoprotéines en enlevant Thème. Le principe consiste, dans les conditions décrites, à mélanger 2,5 mi d\'hémoglobine à 100 ml d\'une solution d\'acide chlorhydπque et d\'acétone. Le précipité ou culot de centrifugation contient la globine que Ton peut solubiliser en PBS. Le surnageant contient Thème. Pour tester l\'activité de ce surnageant et parce que le mélange alcool acétone est inhibiteur de la croissance des cellules cibles BFR, il est évaporé par Speed Vac. Le concentrât est insoluble en PBS mais peut être partiellement solubilisé en acétonitπle, 60 % dans kO % d\'acide tπfluoro- acétique à 0, 1 % inactif sur les cellules BFR.

b) Effet bactéricide des fractions de l\'hémoglobine humaine purifiée, traitée par un mélange HC1

Les résultats, présentés dans le tableau 3, montrent que le principe actif de l\'inhibition est loca lisé dans la fraction du sang fortement colorée : la fraction héminique. La fractiorî globinique est inactive alors que la fraction héminique conduit à un produit bactéricide insoluble en PBS donc différent dans sa structure chimique des hydrolysats actifs déjà utilisés.

Tableau 3

EXEMPLE 6 : EFFET BACTERICIDE DE DIFFERENTS TYPES DE PORPHYRINES DU COMMERCE EXTRAITES DE L\'HEMOGLOBINE OU DE CHLOROPLASTES

Tableau k

L\'effet inhibiteur obtenu soit avec une porphine (Thémato- porphyrine) soit avec des dérivés de substitution combinés au fer (hémine, hématine) ou bien au magnésium (chlorophylline) confirme que les noyaux porphyres sont impliqués dans l\'activité bactéricide. Dans cet essai, la nature du complexe métallique seul (Fe ou Mg) ou chimiquement combiné (FeCl, FeOH) n\'est pas. déterminante. Les noyaux sont insolubles en eau mais ils peuvent être chimiquement solubilisés (cas de la chlorophylline) ou obtenus plus ou moins solubies (cas des hydrolysats) suivant le degré de dénaturation de la globine associée, en fonction de l\'efficacité de la

10 protéase utilisée (suc pancréatique et protéinase K par exemple).

Toutes les chromoprotéides porphyriques peuvent générer une substance inhibitrice à partir de leur groupement prosthétique. Dans le cas de l\'hémoglobine, mieux que l\'extraction chimique, l\'hydrolyse enzymatique moins coûteuse et plus spécifique conduit suivant le type de protéase, à la - ^• * production de molécules héminiques actives qui diffèrent entre elles par leur niveau d\'efficacité et leur solubilité en eau (exemple hydrolysat ES et H ).

EXEMPLE 7 : MISE EN EVIDENCE DE L\'ACTIVITE ANTIBIOTIQUE SUR ²⁰ DES CELLULES CIBLES BACTERIENNES

1. Principe et réalisation du test d\'antibiose

8

10 cellules végétatives et viables d\'une souche bactérienne

^~ - ^J utilisée comme cible sont ensemencées en masse ou a la surface de 15 ml du milieu de culture suivant :

milieu coeur-cervelle (Difco 0037) 37 g/1 extrait de levure (Difco 0127) 5 g/1 ⁰ - gélose Bitec agar (Difco 0138) ik g/1

5

Des puits, ouverts dans l\'épaisseur de la gélose coulée en boîte de Pétri, sont remplis avec 30 μl de l\'antibiotique à tester. Après incubation, l\'activité antibiotique est mesurée par le rayon en mm de la plage de lyse totale développée autour des puits.

2. Souche \' cible de référence

On utilise une souche de Bacillus subtilis, la souche BFR isolée d\'une conserve alimentaire qui a la particularité d\'être facile à manipuler : souche mésophile, aérobie stricte, capable d\'initier une population abondante en 6 heures de culture à température du Laboratoire. Cette souche ne sporule pas dans le milieu de culture précité. Cette souche est très sensible aux différents types d\'antibiotiques et sera utilisée pour tester les divers hydrolysats, les témoins d\'une part, et, d\'autre part rechercher et contrôler le devenir des fractions actives dans les traitements de purification.

3. Effet de divers traitements physiques et chimiques sur Tactivité de l\'hydrolysat ES

Tableau 5

Traitements Rayon de la zone d\'inhibition de croissance de la souche BFR (mn)

Congélation -20°C, - 80°C 5,5

2 h à 20°C 5,5

8 jours à +k°C *,5

Ebullition 10-30 minutes 5,5

Pasteurisation 15h 2,5

Filtration stérilisante 5,5 Evaporation et concentration 10 fois 7,0 Lyophilisation et concentration 10 fois 8,0 -s- protéase K (1 mg/ml) I heure 50°C 5,5 + protéase K (10 mg/ml) 2k heures 50°C ,5

4. Mise en évidence de l\'effet bactéricide des substances inhibitrices produites par l\'hydrolysat ES

Des tubes de 9 ml de milieu de culture sans gélose contenant des dilutions croissantes de l\'hydrolysat brut ES sont ensemencées avec 1 ml d\'une population de 3.10 cellules végétatives de BFR. Après 8 heures de contact à 37° C, on mesure dans chaque tube le nombre de cellules vivantes et le rayon de la zone d\'antibiose.

19

Les résultats sont présentés à la figure 1.

L\'hydrolysat ES utilisé pur et dilué jusqu\'au 1/32, empêche la multiplication bactérienne et tue les bactéries de Tinoculum. La dilution au 1/32 représente la concentration minimale inhibitrice à partir de laquelle apparaît l\'effet bactéricide.

EXEMPLE 8 : SPECTRE D\'ACTIVITE DE L\'HYDROLYSAT ES SUR

DIFFERENTES SOUCHES BACTERIENNES

Origine des souches

A l\'exception des souches de collection ou en provenance de Belgique, toutes les souches ont été isolées au Laboratoire de la microflore dominante de l\'intestin d\'enfants et d\'adultes. Les prélèvements d\'enfants viennent du service de neonatologie d l\'hôpital A. Béclère : les enfants prématurés étaient âgés de 1 à 2 mois et n\'avaient pas de trouble pathologique intestinal. Les prélèvements d\'adultes concernent des individus sains non hospitalisés ou malades (pouchite ou colite).

Caractérisation des souches isolées au Laboratoire

Elles sont classées par leur morphotype. Un certain nombre ont été caractérisées sur 20 réactions biochimiques différentes (API 20A) et sur les produits finaux de leur métabolisme fermentaire (acides fixes et acides gras volatils).

Techniques du test de bactéπcidie sur les souches bactériennes

Les souches anaérobies facultatives sont testées comme la souche témoin Bacilius FR.

Pour les souches anaérobies strictes, deux techniques ont été utilisées :

les souches très sensibles à Toxygène (EOS) sont cultivées dans une chambre anaerobie (Fréter). Elles sont ensemencées à la surface de la gélose et incubées 8 heures à 37° C dans la chambre anaerobie. les souches anaérobies moins sensibles à Toxygène sont ensemencées à l\'extérieur dans la masse de la gélose. Elles sont incubées k2> heures à 37° C en j ^\' arre anaerobie (Gaspack system).

TEST DE SENSffiUHΕ DE DIFFERENTES SOUCHES BACTERIENNES A L\'HYDROLYSAT E S BRUT OU CONCENTRE 3 FOIS

EXEMPLE 9 DEVENIR DE L\'ANTIBIOTIQUE H2K DANS LE TUBE DIGESTIF DE LA SOURIS AXENIQUE (SANS GERME)

0,5 ml de l\'hydrolysat brut H2 lyophilisé et concentré 10 fois, stérilisé à 100° C pendant 30 minutes est administré par sonαe gastrique à des souris axeniques selon le protocole suivant :

Tableau 6

Les contenus intestinaux, dilués au 1 / 1 Oè en PBS sont contrôlés sur cellule cible BFR ; les résultats sont présentés au taϋleau 7.

L\'antibiotique contenu dans l\'hydrolysat brut n\'est pas absorbé. Il transite dans le tube digestif de la souris axenique et est retrouvé actif sur BFR dans tous les contenus et les fèces 3h 30 après la première ingestion.

Dans la souris témoin, l\'apparition d\'une petite zone d\'antibiose dans l\'IG3 pourrait correspondre à l\'effet inhibiteur de substances digestives sécrétées dans l\'intestin grêle et réabsorσées au niveau du ca€cum.

Tableau 7

EXEMPLE 10 PURIFICATION ET DEBUT DE CARACTERISATION DE

LA SUBSTANCE BACTERICIDE SOLUBLE PRODUITE DANS L\'HYDROLYSAT H1K

a) Purification par fractionnement de la partie soluble en eau

L\'hydrolysat brut est élue dans une colonne Fractogel Butyl TS 650. S. On recherche les fractions actives par test d\'antibiose sur BFR. Les résultats du chromatogramme montrent qu\'après la fraction non retenue (fraction I), la première fraction retenue, éluée en eau (fraction II) contient

10 l\'effet antibiotique. La fraction active, éluée en méthanoi 20% correspond probablement à la partie insoluble de l\'antibiotique H1 K.

b) Purification de la fraction active soluble en eau

Les chromatogrammes comparés en HPLC.C 18 de l\'hydrolysat

- ~* brut, des fractions I et II du système Fractogel Butyl montrent que seule la fraction éluée à 100% de tampon B, absorbant à la fois à 2 \ k et 3S0 nm est active.

Cette fraction active est obtenue purifiée à partir de l\'éluat II

Fractogel Butyl. 0 c) Détermination du poids moléculaire

La fraction purifiée HPLC.C 18 étudiée en gel filtration Sephadex LH20 est éluée en une seule fraction active absorbant à 21 ^ et 380 nm à un poids moléculaire correspondant situé entre 600 et 1000 5 daitons.

* •* * * *

LEGENDE DE LA FIGURE 1 0

Conditions du test :

- 9 ml LBHI [ES]

- 1 ml 3.10 ⁷ BFR

- aucune spore ⁵ - 8H de contact