[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material, ein Verfahren zur Kultivierung von Aggregaten aus biologischem Material, und die Verwendung von biokompatiblen Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material.

[0002] Traditionell werden biologische Zellen in vitro, also in der Kulturschale, im Wesentlichen auf drei verschiedenen Arten und Weisen kultiviert: 1. Auf beschichteten oder unbeschichteten Plastik- oder Glasoberflächen; die Beschichtung erfolgt meist durch Gele oder Proteine sowie Peptide der extrazellulären Matrix; bei einer Kultivierung auf unbeschichteten Plastikoberflächen spricht man von einer adhärenten Zellkultur; 2. auf semipermeablen Membranen ("Transwell"); und 3. als dreidimensionale Kulturen, wie Suspensionskulturen. [0003] Mit den ersten beiden Verfahren lassen sich die Zellen oder Zellmixturen aus (Primär-) Geweben oder aus Stammzellen abgeleitet kultivieren, welche eine gewisse Zellreife und Funktionalität erreichen können. Trotzdem sind diese Zellen wenig physiologisch und können selten komplexe Zell- und Gewebeinteraktionen reproduzieren.

[0004] Suspensionskulturen von Zellaggregaten, sog. Sphäroide oder Organoide, bieten dagegen den Vorteil, dass die Zellen, meist selbstorganisierend, komplexe Strukturen und Interaktionen bilden können. Sphäroide können bspw. über Selbstaggregation hergestellt werden. Hierbei werden adhärente Einzel- oder Mixkulturen in einem Gefäß zusammengebracht und formen dann eigenständig Sphären oder differenzieren sich zu organähnlichen, komplexen Organoiden. Beispiele sind hier Retina-Organoide. Sie bilden eine lichtsensitive, strukturierte Netzhaut. Darmorganoide können Darmtransportfunktionen darstellen und in vivo zu Darmzotten beitragen. Weitere Beispiele sind Hirnorganoide, Nierenorganoide usw.

[0005] Zumeist bleiben diese Organoide oder Sphäroide aber einzelne Organ-/Gewebesysteme und bilden miteinander keine komplexen Organsysteme. Sie bilden meistens auch keine Gefäß- und Leitungsbahnen bzw. keine Strukturen, die in der normalen Entwicklung aus anderen Körperbereichen in das Organ einwachsen oder einwandern.

[0006] Eine Möglichkeit, dies bis zu einem gewissen Grad zu erreichen, bieten die sogenannten Assembloide (engl. Assembloids). Diese stellen die Fusionierung mehrere Organoide zu einer morphologischen und funktionellen Einheit dar. Ein Beispiel dafür sind Cortico-Spi- nale-Muskel Assembloide, welche aus Hirnbereichen (Cortex), Rückenmarksphäroiden (Spinal) und Muskelzellen bestehen; vgl. Anderson et al., Generation of Functional Human 3D Cortico-Motor-Assembloids. Cell, Band 183, 2020, Seiten 1913-1929, e1-10.

[0007] Die Assembloide, ebenso wie die Organoide, lassen sich jedoch nur schlecht zueinander orientieren und fusionieren weitgehend zufällig miteinander. Die Organoide und Assembloide sind oft unterschiedlich groß, was es erschwert, sie räumlich richtig ausgerichtet zusammenzubringen. Häufig "absorbiert" und überwuchert ein Organoid bzw. As- sembloid einen anderen. Ferner sind die Möglichkeiten, Organoiden und Assembloiden eine Struktur zu geben, sehr begrenzt. Organoide und Assembloide können nur "in Reihe" miteinander verbunden werden, nicht aber in anderer Orientierung. Es gibt schließlich keine einfache Möglichkeit, zusätzlich noch fehlende Einzelzellen oder Substanzen oder funktionelle Strukturen, wie z.B. Immunzellen, zu den fusionierten Organoiden oder As- sembloiden hinzugeben.

[0008] Vor diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Kultivierungsverfahren vermieden oder zumindest reduziert werden.

[0009] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material ("Linkerspheres") gelöst, das folgende Schritte aufweist:

1) Bereitstellen einer unpolaren, mit Wasser nicht mischbaren biokompatibe- len Flüssigkeit, vorzugsweise von Mineralöl;

2) Einbringen einer Lösung eines biokompatiblen Matrixmaterials in Flüssigkeit zum Erhalt einer Emulsion;

3) Inkubation der Emulsion;

4) Ausbildung einer dreidimensionalen Struktur aus dem Matrixmaterial in der Emulsion durch die Inkubation zum Erhalt der Linkerspheres.

[0010] Erfindungsgemäß steht "biokompatibel" für die Eigenschaft, nicht-toxisch gegenüber biologischem Material zu sein. In Bezug auf die erfindungsgemäßen Linkerspheres und das Matrixmaterial bedeutet dies insbesondere, dass letztere als Substrat für die Kultivierung und das Wachstum von biologischem Material geeignet sind.

[0011] Erfindungsgemäß umfasst "biologisches Material" biologische Zellen, Aggregate von biologischen Zellen, Organe und Teile hiervon. [0012] Erfindungsgemäß ist die in Schritt (1) bereitgestellte unpolare, mit Wasser nicht mischbaren biokompatible Flüssigkeit eine solche, die sich wie Mineralöl verhält, zu 100% nicht mit Wasser mischbar ist, um eine erfindungsgemäße Emulsion bilden zu können, und keine für biologisches Material toxische Eigenschaften aufweist.

[0013] Vorzugsweise handelt es sich bei der in Schritt (1) bereitgestellten Flüssigkeit um "Mineralöl" (CAS-Nummer: 8042-47-5; EC-Nummer: 232-455-8), d.h. ein hochviskoses Bioreagenz, das eine Qualität und ein Reinheitsgrad aufweist, die eine Verwendung in der Molekularbiologie erlauben, bspw. zur Überschichtung von wässrigen Lösungen und Zentrifugationsgradienten (Qualitätsniveau 200). Erfindungsgemäß geeignet ist bspw. das Mineralöl von Sigma-Aldrich (M5904), Carl Roth GmbH & Co. KG (#8904), Merck (#107160; #113898). Synonyme für das erfindungsgemäße Mineralöl sind "Paraffinöl" und "Vaselinöl". Die Bereitstellung des Mineralöls erfolgt vorzugsweise vorgelegt in einem Behältnis, weiter vorzugsweise in einem Mikroreaktionsgefäß mit geeigneter Größe, wie bspw. mit einem Volumen von 2 ml, 1 ,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml etc. (z.B. "Eppendorf'-Gefäß).

[0014] Erfindungsgemäß wird unter einem "Matrixmaterial" ein Gemisch von Molekülen verstanden, das in Schritt 2 in liquider Form vorliegt und durch Einwirkung von physikalischen oder chemischen Phänomenen in eine feste, gewebeähnliche Form überführt werden kann. Dabei wird durch das Matrixmaterial in der festen Form eine biokompatible, vorzugsweise netzwerkartige Struktur bereitgestellt, die die Kultivierung von biologischem Material erlaubt. Beispiele für erfindungsgemäß geeignetes Matrixmaterial umfassen Hydrogele, basalmembranartige Matrices (z.B. Matrigel; enthält einen hohen, günstigen Anteil an Laminin), und andere biokompatible, gelartige Substanzen.

[0015] Das Einbringen der Lösung des biokompatiblen Matrixmaterials in das Mineralöl in Schritt (2), erfolgt durch eine geeignete Dosiervorrichtung, wie eine Pipette. Durch die Fluidität des wässrigen Matrixmaterials wird diese vorzugsweise in Form eines Flüssigkeitstropfens in das Mineralöl eingebracht, um eine Emulsion zu bilden. [0016] Die Größe der erfindungsgemäßen Linkerspheres lässt sich einfach über das Volumen des Matrixmaterials steuern. Ein größeres Volumen resultiert in größeren Linkerspheres, ein kleineres Volumen in kleineren Linkerspheres.

[0017] Erfindungsgemäß erfolgt in Schritt (3) eine Inkubation für eine Zeitspanne, die die Ausbildung der Linkersphäres erlaubt, vorzugsweise von zumindest 10 Sekunden bis zu 60 Minuten.

[0018] Die genaue Zeitspanne wird durch den Fachmann ermittelt und richtet isch nach der Art des Geliervorganges. Matrigele bspw. gelieren bei höheren Temperaturen. Andere Hydrogele benötigen "Crosslinker" oder ähnliche Bindungschemikalien. Somit kann die Inkubation wenige Sekunden bis Minuten (bis zu 1 Stunde) dauern.

[0019] In Schritt (4) des erfindungsgemäßen Verfahrens nimmt, aufgrund der Grenzflächeneffekte zwischen dem wässrigen biokompatiblen Matrixmaterial und dem umgebenden Mineralöl, das wässrige biokompatible Matrixmaterial in der Emulsion eine kugelförmige Gestalt an, die den Linkerspheres ihren Namen gibt.

[0020] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird damit vollkommen gelöst.

[0021] Die Erfinder haben erkannt, dass mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens biokompatible Strukturen in Form der Linkerspheres geschaffen werden können, die ein wertvolles Werkzeug für die Gewebekonstruktion (engl. "Tissue Engineering") darstellen, mit denen die Nachteile aus dem Stand der Technik zumindest teilweise oder gar vollständig behoben werden können.

[0022] Gemäß der Erfindung sind die nach dem Verfahren erhaltenen Linkerspheres geeignet und ausgebildet, um in ihnen und/oder darauf biologisches Material zu kultivieren. Sie sind ferner geeignet und ausgebildet, um biologisches Material miteinander zu verbinden, also als eine Brücke oder Bindeglied zwischen verschiedenen biologischen Materialien oder Aggregaten hiervon zu fungieren (engl.: "linker" = Verbindung, "spheres" = Kugeln). Da die Linkerspheres biologisches Material kultivieren können, wird es ermöglicht, dass das biologische Material oder Teile hiervon durch die Linkerspheres hindurch oder auf diesen wachsen können. Somit lässt sich über die Linkerspheres eine Verbindung zwischen einem ersten biologischen Material oder Aggregat hiervon und einem zweiten biologischen Material oder Aggregat hiervon oder weiteren biologischen Materialien oder Aggregaten hiervon schaffen.

[0023] Die Linkerspheres stellen eine physiologische Umgebung für biologisches Material bereit, das auch die Ausbildung von Gefäß- und Leitungsbahnen erlaubt, welche bei der Entwicklung eines Organismus aus verschiedenen Körperbereichen kommend in ein Organ einwachsen oder einwandern. Die erfindungsgemäß erhaltenen Linkerspheres ermöglichen die Reproduktion von komplexen Zell-, Gewebe- und Organinteraktionen. Sie eignen sich somit insbesondere zur Untersuchung von komplexen biologischen Strukturen, wie Organen, Organsystemen etc.

[0024] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Matrixmaterial eine basalmembranartige Matrix (engl.: "basement membrane-like matrix").

[0025] Erfindungsgemäß wird unter einer "basalmembranartigen Matrix" eine komplexe Mischung von Biomolekülen verstanden, die in der 3D-Zellkultur und bei der Gewebekonstruktion als Wachstumsgrundlage, also als Matrix oder Zellsubstrat, verwendet wird. Eine basalmembranartige Matrix ist das gereinigte Sekret der murinen Sarkom-Zelllinie Engel- breth-Holm-Swarm (EHS-Zellen) und ähnelt in seiner Zusammensetzung der extrazellulären Matrix der Basalmembranen von tierischen Zellen. Sie enthält unter anderem Laminin, Entactin, Kollagen und Heparansulfat-Proteoglykane. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein erfindungsgemäß besonders geeignetes biokompatibles Matrixmaterial zum Einsatz kommt. Die basalmembranartige Matrix bildet bei ca. 37°C durch Polymerisierung der enthaltenen Proteine eine vernetzte, gelartige Struktur bzw. ein Hydrogel aus, während sie bei niedrigeren Temperaturen, bspw. bei 4°C, flüssig ist. Basalmembranartige Matrices führen im Vergleich zu polylysinbeschichteten Zellkulturmatrices zum Erhalt einer komplexen, physiologischen, dreidimensionalen Zellverbandstruktur. Eine Übersicht über basalmembranartige Matrices findet sich bspw. in Hughes et al: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. In: Proteomics. Band 10, Nummer 9, 2010, ISSN 1615-9861 , S. 1886-1890. [0026] Handelsnamen für erfindungsgemäß geeignete basalmembranartige Matrices sind z. B. Matrigel (Corning Life Sciences), BME, EHS matrix etc.

[0027] In einer Ausführungsform der Erfindung wird in Schritt (2) des Verfahrens eine Lösung einer wachstumsfaktorreduzierten (growth factor reduced GFR) basalmembranartigen Matrix eingebracht.

[0028] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine solche Matrix zum Einsatz kommt, in der Wachstumsfaktoren vermindert vorliegen, die eine Wirkung auf die Zellen im Aggregat haben können (z.B. EGF). Neuronen bspw. werden vorzugsweise auf einer solchen Matrix kultiviert, um diesen Einfluss zu verringern. Eine erfindungsgemäß geeignete GFR basalmembranartige Matrix wird unter dem Handelsnamen Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, Produktnummer 354230, Corning Life Sciences, vertrieben.

[0029] In einer Ausführungsform der Erfindung wird in Schritt (3) des Verfahrens eine Behandlung der Emulsion zur Verfestigung des Matrixmaterials durchgeführt, vorzugsweise durch Wärmebeaufschlagung der Emulsion, vorzugsweise bei ca. 37°C, weiter vorzugsweise für ca. 15 bis 30 Minuten.

[0030] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Linkerspheres durch die Quervernetzung des Matrixmaterials bzw. der enthaltenen Proteine in eine handhabbare und für Kultivierungszwecke geeignete, feste Form gebracht werden. Durch die Verfestigung bzw. Quervernetzung bildet sich ein(e) feste(s) Hydrogel bzw. gelartige Struktur aus, die eine Kultivierung von und ein Durchwachsen mit biologischem Material ermöglicht. Die Wärmebehandlung kann zweckmäßigerweise durch Einbringung des die Emulsion enthaltenen Reaktionsgefäßes in ein Wasserbad erfolgen.

[0031] In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die Lösung des biokompatiblen Matrixmaterials Zellkulturmedium auf. [0032] Durch diese Maßnahme werden die physiologischen Voraussetzungen dafür geschaffen, dass die Linkerspheres unmittelbar nach ihrer Herstellung zur Kultivierung von biologischem Material einsetzbar sind. Erfindungsgemäß geeignet ist jede Art von Kultivierungsmedium, wobei sich die konkrete Wahl durch den Fachmann danach richtet, welches biologisches Material mit den Linkerspheres kultiviert bzw. verbunden werden soll. Ein zur Kultivierung von Astrozyten geeignetes Zellkulturmedium ist bspw. N2-Medium und "B27- based retinal differentiation medium" (BRDM-Medium).

[0033] Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist die Lösung des Matrixmaterials biologisches Material, vorzugsweise biologische Zellen auf.

[0034] Durch diese Maßnahme werden bereits bei der Herstellung biologisches Material bzw. Zellen von Interesse in die Linkerspheres integriert. Derartige, biologisches Material enthaltende Linkerspheres können als eigene Kultivierungseinheit zum Einsatz kommen oder aber zur Verbindung von Einheiten bzw. Aggregaten von biologischem Material verwendet werden.

[0035] In einer Ausführungsform der Erfindung weist die Lösung des biokompatiblen Matrixmaterials einen Farbstoff auf.

[0036] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Sichtbarkeit der Linkerspheres verbessert wird und deren Handhabung und Einsatz in den späteren Anwendungen erleichtert. Geeignet sind biokompatible Farbstoffe, bspw. gelöst in Puffer.

[0037] In einer Ausführungsform der Erfindung wird in Schritt (2) des Verfahrens die Lösung des Matrixmaterials als Fluidtropfen in das Mineralöl eingebracht, vorzugsweise über eine Pipettenspitze.

[0038] Diese Maßnahme erlaubt eine besonders gute Herstellung der erfindungsgemäßen Linkerspheres. Dabei wird die Pipette mit ihrer Spitze, die die Lösung des biokompatiblen Matrixmaterials enthält, direkt über die Oberfläche der Ölflüssigkeit gehalten. Bei Verwendung einer Mikropipette wird anschließend vorzugsweise bis zum ersten Druckpunkt gedrückt. Auf diese Weise bildet sich ein Tropfen an der Vorderseite der Pipette. Durch Eintauchen der Pipettenspitze in die Ölflüssigkeit löst sich der Tropfen von der Spitze und sinkt in die Ölflüssigkeit bis zum Boden des Gefäßes.

[0039] In einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach Schritt (4) folgender Schritt durchgeführt:

5) Isolieren der Linkerspheres aus der Emulsion.

[0040] Mit dieser Maßnahme werden die Linkerspheres auf vorteilhafte Art und Weise aus der Emulsion herausgelöst und zur weiteren Verwendung bereitgestellt.

[0041] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach Schritt (5) folgender Schritt durchgeführt:

6) Waschen der isolierten Linkerspheres, vorzugsweise mit einer wässrigen Lösung, weiter vorzugsweise mit Zellkulturmedium.

[0042] Mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise das restliche Mineralöl von den Linkerspheres entfernt. Dieser Waschschritt kann wiederholt werden, um sämtliches überschüssige Öl von den Linkerspheres zu entfernen. Dadurch wird verhindert, dass sich etwaiges überschüssiges Öl in den späteren Kultivierungsanwendungen schädigend auswirken kann.

[0043] In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird nach Schritt (4) und vor Schritt (5) folgender weiterer Schritt durchgeführt:

4') Einbringen einer wässrigen Lösung, vorzugsweise einer wässrigen Pufferlösung, in die Emulsion zur Ausbildung einer wässrigen Phase und Überführung der Linkerspheres in die wässrige Phase. [0044] Durch diese Maßnahme wird ein Zwei-Phasen-System geschaffen, mit einer öligen und wässrigen Phase. Die gebildeten wässrigen Linkerspheres gehen von der Öl- in die wässrige Phase über, aus der sie sich leicht isolieren und aufreinigen lassen. Jeder handelsübliche biokompatible Puffer ist grundsätzlich geeignet, wie bspw. ein PBS-Puffer. Die konkrete Wahl des Puffers durch den Fachmann richtet sich danach, welches spezifische biologische Material kultiviert bzw. verbunden werden soll.

[0045] In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die isolierten und ggf. gewaschenen Linkerspheres in ein Kulturgefäß, vorzugsweise eine Kulturschale überführt.

[0046] Mit dieser Maßnahme werden die Linkerspheres in eine Umgebung gebracht, die ihre direkte Verwendung zur Kultivierung und Verbindung von biologischem Material erlaubt. Handelsübliche Kulturschalen, bspw. Petrischalen, sind geeignet und deren Auswahl richtet sich nach der konkreten Verwendung der Linkerspheres.

[0047] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die isolierten und ggf. gewaschenen und ggf. überführten Linkerspheres kultiviert, vorzugsweise bei ca. 37 °C, weiter vorzugsweise bei ca. 20 Vol.-% O2, weiter vorzugsweise bei ca. 5 Vol.-% CO2, weiter vorzugsweise für zumindest ca. 12 Stunden.

[0048] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass besonders geeignete Parameter zur Kultivierung der Linkerspheres zum Einsatz kommen.

[0049] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung und/oder Verbindung von Aggregaten aus biologischem Material, das folgende Schritte aufweist:

1) ln-kontakt-bringen der Aggregate mit biokompatiblen Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material ("Linkerspheres") in einem geeigneten Medium zum Erhalt eines Komplexes aus den Aggregaten und den Linkerspheres, 2) Kultivierung der Komplexe aus den Aggregaten und den Linkerspheres, wobei die Linkerspheres gemäß dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhalten wurden.

[0050] Die Merkmale, Eigenschaften, Weiterbildungen und Vorteile des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens gelten für das erfindungsgemäße Kultivierungsverfahren gleichermaßen.

[0051] Erfindungsgemäß erfolgt die "Kultivierung" der Komplexe aus den Aggregaten und den Linkerspheres unter üblichen Zellkulturbedingungen, bspw. in einem Inkubator in einem Nährmedium bei ca. 37 °C und ggf. 5 Vol.-% CO2.

[0052] Mittels der erfindungsgemäßen Linkerspheres können die Aggregate aus biologischem Material in definiertem Abstand, der durch die Linkerspheres bestimmt wird, miteinander verbunden bzw. fusioniert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung können auch mehr als eine Linkersphere bzw. eine beliebige Vielzahl davon dazwischen geschaltet werden. Durch den durch die Linkerspheres geschaffenen Abstand besteht eine räumliche Trennung der zu fusionierenden Aggregate; somit können diese nicht ohne weiteres ineinander wachsen und es wird verhindert, dass ein Aggregat ein anderes überwuchert. Die Linkerspheres erlauben auch die Verknüpfung einer Vielzahl von Aggregaten an demselben Aggregat, um eine z.B. kleeblattartige Struktur zu erhalten.

[0053] Durch die Verbindung bzw. Fusionierung der Aggregaten über eine Vielzahl von Linkerspheres lassen sich theoretisch unendlich große und komplexe Anordnungen herstellen, i.S.e. Bausteinsystems ("Lego-System").

[0054] Über die Linkerspheres lassen sich Bahnsysteme erstellen, die die Aggregate aus biologischem Material miteinander verknüpfen, bspw. leitende Blutbahnen, Nervenbahnen, oder Strukturen der extrazellulären Matrix (EZM). Diese können auch miteinander kombiniert werden. Die Bahnsysteme können entweder als weitere Sphäroid-Strukturen (mittels bspw. vaskulärer Organoide) bereitgestellt oder bei der Herstellung der Linkerspheren in letztere eingebettet werden. Auch die Fusionierung mehrerer Linkerspheren mit verschiedenen Zelltypen ist problemlos möglich.

[0055] Die Linkerspheres können beliebigen EZM-Strukturen enthalten und so die Körper-/Bahn- strukturen nachstellen.

[0056] Mit den erfindungsgemäßen Linkerspheres ist die Fusionierung unterschiedlich großer Aggregate unproblematisch möglich, da diese nur an die Linkerspheres gekoppelt werden müssen und dann Bahnsysteme dazwischen geschaltet werden können.

[0057] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens werden die Aggregate aus biologischem Material vor dem ln-kontakt-bringen mit den Linkerspheres geschnitten, vorzugsweise mit einer Mikroschere, wobei, weiter vorzugsweise, die Aggregate aus biologischem Material mit der Schnittfläche mit Linkerspheres in Kontakt gebracht werden.

[0058] Durch diese Maßnahme werden die Aggregate in eine Form und Größe gebracht, die sich an der Größe der Linkersphere und/oder der gewünschten Verbindung orientiert. Die Schnittfläche schafft dabei eine besonders gut Kontaktfläche und sichert eine gute Verbindung mit den Aggregaten aus biologischem Material.

[0059] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens erfolgt die Kultivierung bei ca. 37 °C, vorzugsweise bei ca. 20 Vol.-% O2, weiter vorzugsweise bei ca. 5 Vol.-% CO ₂ .

[0060] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass dem Fachmann Kultivierungsbedingungen an die Hand gegeben werden, die sich nach Erkenntnissen des Fachmanns besonders bewährt haben.

[0061] In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens sind die Aggregate aus biologischem Material Organoide oder/und Sphäroide und/oder As- sembloide. [0062] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die im Stand der Technik für Organoide und As- sembloide beschriebenen Nachteile vermindert oder sogar vermieden werden. So erfolgt durch die Zwischenschaltung von Linkerspheren keine direkte Fusionierung von ggf. verschiedenen Gewebearten, was auch im Organismus i.d.R. nicht der Fall ist. Die Zwischenschaltung der Linkerspheres erlaubt außerdem die korrekte und beliebige räumliche Orientierung der Aggregate, was bei direkter Fusionierung, insbesondere bei unterschiedlich großen Aggregaten, meist zufällig und ungerichtet erfolgt. Auch erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren erstmals eine Orientierung der Aggregate "in Reihe".

[0063] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens sind die Aggregate aus biologischem Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: retinalem Organoid, vaskulärem Organoid, Hirnorganoid, Neurosphäroid.

[0064] Mit dieser Maßnahme kommt das erfindungsgemäße Kultivierungsverfahren bei solchen biologischen Aggregaten zum Einsatz, deren natürliche Pendants eine komplexe Umgebung aufweisen, die nun erstmals durch die Erfindung nachgebildet werden kann. Ein "retinales Organoid" ist eine dreidimensionale Struktur aus Zellen der Retina, differenziert aus pluripotenten Stammzellen, die eine Schichtung, Zell-Zell-Interaktion und zelltypenspezifische Diversität enthält, welche die humanen embryonalen Retina nachbildet. Ferner können sich in den retinalen Organoiden Fotorezeptoren bilden, welche lichtsensitiv sind und über den besonderen Aufbau (Innen und Außensegment) dieser Zellart verfügen. Unter einem "vaskulären Organoid" versteht man eine dreidimensionale Struktur, welche aus pluripotenten Stammzellen gebildet werden kann und Zellen des vaskulären Systems enthält. Dies sind unter anderem Endothelzellen und Perizyten. Vaskuläre Organoide organisieren sich selbständig zu einem 3D Kapillarnetzwerk, das von einer Basalmembran umgeben ist. Ein "Hirnoganoid ist ein aus pluripotenten Stammzellen gebildeter Organoid, welcher die Organisation und die Zelldiversität von bestimmten Hirnbereichen wiederspiegeln kann. So beinhaltet beispielweise ein thalamischer Organoid Neurone, welche im Thalamus vorkommen. Erfindungsgemäß wird unter einem "Neurosphäroid" eine sphäroidale Anordnung von neuralen Zellen (Neuronen, Gliazellen und deren Vorläufer) verstanden, die aus pluripotenten Stammzellen generiert werden können. Diese kann organisierte (e.g. Neurorosetten oder rindenartige Areale) und unorganisierte Bereiche beinhalten. [0065] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens weisen die Aggregate aus biologischem Material Astrozyten auf, vorzugsweise solche, die sich von induzierten, oder embryonalen, pluripotenten Stammzellen (iPSC) ableiten.

[0066] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass für die Gewebekonstruktion besonders wichtige Zellen zum Einsatz kommen, die insbesondere für neurowissenschaftliche Untersuchungen und die Testung von Wirkstoffen von besonderem Interesse sind. Die Stammzellen sind vorzugsweise menschlichen oder tierischen Ursprungs.

[0067] In einer Ausführungsform der Erfindung wird in dem Kultivierungsverfahren nach Schritt (2) folgender Schritt durchgeführt:

(3) Wiederholen der Schritte (1) und (2).

[0068] Durch diese Maßnahme lassen sich Gewebekonstruktionen von unbegrenzter Länge und Verbindungen zwischen Linkerspheres und Aggregaten von biologischem Material in beliebiger Anzahl herstellen. Erfindungsgemäß können deshalb die Schritte (2) und (3) zumindest einmal, zweimal, dreimal, viermal, ... zehnmal, zwanzigmal, hundertmal usw. wiederholt werden.

[0069] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Linkerspheres, die gemäß dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhalten wurden, zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material.

[0070] Die Merkmale, Eigenschaften, Weiterbildungen und Vorteile des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens und des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens gelten für die erfindungsgemäße Verwendung gleichermaßen.

[0071] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. [0072] Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen näher erläutert. Die dort erwähnten Merkmale gelten nicht nur in Bezug auf das konkrete Beispiel, sondern auch in isolierter Form als zur Erfindung gehörend.

[0073] Dabei wird Bezug genommen auf die beiliegenden Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:

Fig. 1 : Schematische Darstellung der Herstellung der erfindungsgemäßen Linkerspheres;

Fig. 2: Astrolinker in schematischer (a) und mikroskopischer Darstellung (b) -

(e);

Fig. 3: Schematische Darstellung des Verbindungsvorgangs von ganzen und halben, geschnitten Organoiden mit den Linkerspheres (oben), und mikroskopische Darstellung des Verlinkungsproduktes (unten);

Fig. 4: Mikroskopische Darstellung des Vorgang der Verbindungs von retinalem

Organoid und Linkersphere (a), einer Suspensionskultur des Verbindungsproduktes (b), des Auswachsens von Axonen aus dem retinalen Organoid in eine Linkersphere (c), des Verbindungsproduktes bei einfacher Verbindung (d) und bei Doppel-Verbindung (e);

Fig. 5/6: Mikroskopische Darstellung einer Doppel-Verbindung einer Linkersphere mit einer Neuosphere und einem retinalen Organoid;

Fig. 7: Mikroskopische Darstellung einer Doppel-Verbindung eines Astrolinkers mit einer Neuosphere und einem retinalen Organoid;

Fig. 8: Schematische Darstellung eines komplexen Sehnervenmodells unter

Verwendung von erfindungsgemäßen Linkerspheres; Fig. 9: Schematische Darstellung der Unterstützung der Gefäßvaskularisierung durch erfindungsgemäße Linkerspheres;

Fig. 10: Schematische Darstellung von Multi-Verlinkungskonzepten.

Beispiele

1. Herstellung der Linkerspheres

Überblick

[0074] In der Fig. 1 ist die Herstellung der Linkerspheres in einer Übersicht schematisch dargestellt. In einem ersten, ganz links dargestellten Schritt wird in einem Reagenzgefäß Mineralöl bereitgestellt. In einer Pipette aufgezogen befindet sich das flüssige, biokompatible Matrixmaterial, ggf. mit biologischem Material, wie z.B. biologischen Zellen, und/oder Kulturmedium versetzt.

[0075] Im nächsten Schritt wird ein Tropfen der Lösung des biokompatiblen Matrixmaterials in das Mineralöl eingebracht. Dazu wird das sich an der Unterseite der Pipette befindliche biokompatible Matrixmaterial mit der Oberfläche des Mineralöls in Kontakt gebracht. Anschließend wird das Tropfenvolumen aus der Pipette ausgestoßen und der Tropfen kann auf den Boden des mit Mineralöl gefüllten Reagenzgefäßes sinken.

[0076] Im folgenden Schritt wird das Reagenzgefäß mit der darin gebildeten Emulsion einer Wärmebehandlung unterzogen, zum Beispiel durch Einsetzen in ein Wasserbad und Inkubation für 30 Minuten bei 37°C. Die Proteine des biokompatiblen Matrixmaterials werden quervernetzt und das Matrixmaterial wird verfestigt, so dass sich eine gelartige Struktur bzw. ein Hydrogel ausbildet, die "Linkersphere".

[0077] In der in Fig. 1 als letzten Schritt dargestellten Operation wird das Linkersphere gewaschen und in Kulturmedium überführt. Details

Linkerspheres mit Zellen

[0078] Nachfolgend werden die technischen Details für die Herstellung von Linkerspheres mit Zellen beschrieben. Dies erfolgt am Beispiel von Linkerspheres, die Astrozyten enthalten, sog. "Astrolinkers".

[0079] Folgende Materialien werden benötigt:

- Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel (Corning Life Sciences)

- Mineralöl (Sigma Aldrich)

- N2 Medium (DMEM/F12 mit Glutamax, 2% Hormonmix, 1% nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 1% Antibiotics-Antimycotics (Anti-Anti), alle Thermo Fisher Scientific)

- BRDM-Medium (DMEM/F12 (3:1) mit Glutamax, 2% B27 ohne Vitamin A, 1 % AA, 1% NEAA, alle Thermo Fischer Scientific)

- ASC ⁺⁺ Medium (N2 Medium + 10 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) + 10 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2))

- BRDM FBST (DMEM/F12 (3:1) mit Glutamax, 10%FBS, 2%B27, 1% AA, 1 % NEAA, alle Thermo Fisher Scientific, 100 pM Taurin)

- PBS ohne Magnesium/Calcium (PBS“, Thermo Fisher Scientific)

- TrypLE (Thermo Fisher Scientific)

- 1 ,5 ml Reaktionsgefäße - 15 ml konisches Röhrchen

- Heizblock für Röhrchen

- Nicht-adhärente 24- oder 48-Well-Platten

- 1000 pl Pipettenspitzen mit abgeschnittenen Spitzen (mit einer Schere)

- Wasserbad bei 37°C

- Eimer mit Eis

- Mikroschere (FST)

- Nicht-gewebebehandelte v-förmige 96-Well-Platte (Sarstedt)

[0080] Die Herstellung der astrozytenenthaltenden Linkerspheres ist wie folgt:

[0081] Humane iPSC-abgeleitete Astrozyten (AC) wurden gemäß Krencik et al. 2011 (Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells, Nat. Protoc. 6(11): 1710-7, doi:10.1038/nprot.2011.405) differenziert. Für jedes Experiment werden die Astrozyten aufgetaut und auf 24- oder 48-Well-Platten in ASC ⁺⁺ Medium kultiviert. 6-7 Tage vor Beginn des Experiments werden die AC mit 1 ng/ml CNTF in ASC ⁺⁺ Medium behandelt, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wird. Mindestens eine volle Vertiefung wird sehr sorgfältig mit PBS" gewaschen und 2 Minuten lang in TrypLE bei 37°C inkubiert, um die AC abzulösen. Nachdem sichergestellt wurde, dass die Zellen vereinzelt sind, wird N2-Medium in der doppelten Menge des TrypLE-haltigen Mediums zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Zellen werden in ein konisches 15- ml-Röhrchen überführt und 2 Minuten lang bei 1500 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in einem angemessenen Volumen von N2-Medium re- suspendiert, um die Zellen (etwa 500pl-1 OOOpI) in einer Neubauer-Zählkammer zu zählen, das 1 :1 mit Trypanblau verdünnt ist, um tote Zellen sichtbar zu machen. Die erforderliche Anzahl von Zellen wird in einen 1 ,5 ml Eppendorf-Behälter überführt. Zur Herstellung von 1 Astrolinker mit einer Größe von 2,5 pl pro Linker werden 10 000 Zellen benötigt.

[0082] Die gesammelten Zellen werden dann erneut 2 Minuten lang bei 800 g pelletiert. Der Überstand wird sorgfältig und so vollständig wie möglich verworfen. Das Zellpellet wird dann in kaltem BRDM-Medium resuspendiert, um 1 ,25 pl pro Astrolinker zu erreichen (z.B. für 10 Linker/100.000 Zellen werden 10 pl Medium verwendet). Anschließend wird auf Eis gelagert. Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel (das über Nacht im Kühlschrank aufgetaut wurde), wird im Verhältnis 1:1 zur gekühlten Zellsuspension gegeben und die Lösung vorsichtig und gründlich gemischt, wobei Blasenbildung vermieden wird. Um die Linker später besser sichtbar zu machen, kann das Matrigel mit Tinte oder anderen Farbstoffen versetzt werden. Hier wurden 5 % einer 1 :1000-Verdünnung von Tinte in PBS" verwendet.

[0083] Vor Beginn des Verfahrens werden 1,5-ml-Reaktionsröhrchen (1 Röhrchen pro Astrolinker) mit ~50 pl Mineralöl gefüllt und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur aufbewahrt.

[0084] 2,5 pl der Astrozyten-Matrigel-Mischung werden dann mit einer dünnen 10 pl Pipettenspitze (möglichst vorgekühlt) in das mit Mineralöl gefüllte Reaktionsgefäß überführt. Zur Herstellung der Linker wird die Pipette mit ihrer Spitze, die 2,5 pl Astrozyten-Matrigel-Mix enthält, direkt über die Oberfläche der Ölflüssigkeit gehalten und dann bis zum ersten Druckpunkt gedrückt. Auf diese Weise bildet sich ein Tropfen an der Vorderseite der Pipette. Durch Eintauchen der Pipettenspitze und des Tropfens in die Ölflüssigkeit löst sich der Tropfen von der Spitze und sinkt in die Flüssigkeit. Die restliche Flüssigkeit in der Pipette wird verworfen. Das Röhrchen, das den Linker enthält, wird so schnell wie möglich in einen Heizblock (37 °C) gebracht, um eine schnelle Verfestigung zu ermöglichen. Dies ist notwendig, um zu vermeiden, dass die Zellen ungleichmäßig im Tropfen verteilt werden. Die Röhrchen werden dann für 15-30 Minuten bei 37 °C inkubiert.

[0085] Nach der Inkubation werden ca. 200 pl vorgewärmtes PBS" (37 °C) zugegeben. Dies wird so durchgeführt, dass die gebildete Linkersphere von der Öl- in die wässrige Phase übergeht. Die Linkersphere plus das PBS" (und so wenig Öl wie möglich) werden in eine Petrischale (z.B. 6 cm) mit auf 37 °C vorgewärmtem PBS" überführt. Hierfür wird eine abgeschnittene 1000 pl Spitze verwendet, um die Beschädigung der Linkerspheres zu vermeiden. Auf diese Weise werden die Linkerspheres gewaschen, und das Öl wird entfernt. Die Waschschritte können wiederholt werden, um die Ölreste zu entfernen. Die gewaschenen Astrolinker werden in eine nicht-gewebebehandelte 48-Well-Platte transferiert, die 250 pl auf 37 °C vorgewärmtes ASC ⁺⁺ enthält. Auch hier werden abgeschnittene Spitzen verwendet. Die Astrolinker werden bei 37 °C, 20 % O2 und 5 % CO2 mindestens über Nacht kultiviert und das Medium wird bis zur weiteren Verwendung oder Fixierung alle 2-3 Tage gewechselt (halber Mediumwechsel).

[0086] In der Fig. 2a ist der Astrolinker schematisch dargestellt. Fig. 2b zeigt einen Astrolinker (Linkersphere mit Astrozyten beladen) nach einem Tag in Kultur. Fig. 2c zeigt einen Astrolinker mit Astrozyten, die zuvor mit einem lentiviralen Konstrukt (Lenti-GFAP-GFP) trans- fiziert wurden, die ein grünfluoreszierendes Protein (GFP) unter einem 'glial fibrillary acidic protein (GFAP) Promotor exprimiert. Die Fig. 2d und Fig. 2e zeigen einer dreidimensionale Rekonstruktion des Teils eines Astrolinkers, in welchem die Astrozyten, wie in 2c, GFP unter einem GFAP-Promoter exprimieren. Die Fig. 2d) zeigt ein in Magenta eingefärbtes Bild der Fluoreszenz, Fig. 2e ein höhenkodiertes Falschfarbenbild.

Linkerspheres ohne Zellen

[0087] Für die Herstellung von zellfreien Linkerspheres wird das gleiche Protokoll wie oben verwendet.

[0088] Anstelle von Astrozyten wird dem GFR-Matrigel nur Medium (z. B. BRDM) zugesetzt. Alle nachfolgenden Schritte bleiben gleich. Zellfreie Linkerspheres können in jedem 37 °C vorgewärmten Medium oder Puffer kultiviert werden. 2. Herstellung von Doppel-Verbindungen

[0089] Humane iPSZ-abgeleitete Retinoid-Organoide (RO), die gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll (Zhong et al. 2014, Achberger et al. 2019) differenziert wurden, werden nach 40-80 Tagen der Differenzierung ausgewählt.

[0090] Am Tag 1 (Tag nach der Linker-Produktion), vor der Verbindung, werden die RO mit einer Mikroschere in zwei Teile geschnitten und in eine nicht-gewebebehandelte 96-Well-V- Form-Platte übertragen. In jede Vertiefung wird ein halbes Organoid gegeben. Dann wird eine Astrolinker- oder zellfreie Linkersphere mit einer 10OQ- l-Spitze in die Vertiefungen mit den RO gegeben. Mit einer kleinen Nadel oder Pipettenspitze werden die RO und der Linker unter einem Mikroskop positioniert. Das RO wird so positioniert, dass die aufgeschnittene Seite die Astrolinker/Linkersphere direkt berührt. Die Platte wird dann äußerst vorsichtig (ohne die Positionierung zu stören) in einen Inkubator (37 °C, 20% O2, 5% CO2) platziert.

[0091] Die Herstellung von Triple-Verbindungen, erfolgt optional am darauffolgenden Tag oder zu einem beliebigen späteren Zeitpunkt.

3. Herstellung von Triple-Verbindungen

[0092] Einen Tag später werden Thalamus-Organoide (TO), die nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll (Xiang 2019) differenziert wurden, nach 40-80 Tagen der Differenzierung ausgewählt. Die einzelnen TO werden in die 96-Well-V-Form-Platte gegeben, die die Doppel-Verbindung (Astrolinker/Linkersphere + RO) enthält. Die Triple-Verbindung erfolgt wiederum mit einer kleinen Nadel oder Spitze, wobei das Thalamus-Organoid direkt auf der gegenüberliegenden Seite des am Astrolinker/Linkersphere befestigten Retina-Organoids platziert wird. Dies ist von entscheidender Bedeutung, damit sich die Zellverbindung durch den Astrolinker und nicht direkt bilden muss. Ohne sich zu bewegen, wird die Platte über Nacht im Inkubator bei 37 °C, 20% O2 und 5% CO2 gelagert.

[0093] Die Kultivierung der Triple-Verbindung erfolgt optional am darauffolgenden Tag. [0094] Der Verbindungsvorgang ist schematisch in der Fig. 3 dargestellt. Der Maßstabsbalken in den beiden in der Figur unten dargestellten mikroskopischen Aufnahmen entspricht einer Strecke 1000 pm.

4. Kultivierung der Triple-Verbindungen

[0095] Am nächsten Tag wird eine nicht-gewebebehandelte 48- Well-Platte mit 250 pl auf 37 °C vorgewärmtem BRDM-Medium vorbereitet. Die Triple-Verbindungen werden in diese 48- Well-Platte übertragen (mit abgeschnittenen 1000-pl-Spitzen) und erneut bei 37 °C, 20% O2, 5% CO2 inkubiert. Um die Projektionen zwischen RO und TO zu sehen, werden die Linker unter dem Mikroskop überprüft. Dazu kann die RO z.B. stabil mit GFP transduziert werden (z.B. mit lentiviralen Vektoren). Der Mediumwechsel bei Doppel- oder Triple-Verbindungen erfolgt jeden zweiten bis dritten Tag mit warmem BRDM-Medium (250 pl pro Well, halber Mediumwechsel).

[0096] In der Fig. 4b ist in einer mikroskopischen Aufnahme das Ergebnis des Verbindungsvorgangs zwischen einer Linkersphere und einem retinalen Organoid dargestellt. In der Fig. 4b ist der Komplex in einer Suspensionskultur gezeigt. In der Fig. 4c ist das Auswachsen von Neuriten aus dem Organoid in die Linkersphere erkennbar. Fig. 4d zeigt das Ergebnis einer einfachen Verlinkung von retinalem Organoid und Linkersphere, die Fig. 4e zeigt das Ergebnis einer Doppel-Verbindung. Die Astrozyten sind mit GFP markiert und dementsprechend eingefärbt.

[0097] In der Fig. 5 ist eine Doppel-Verlinkung einer Linkersphere mit einer Neuosphere auf der einen Seite und einem retinalen Organoid auf der anderen Seite dargestellt. Die Neuosphere ist mit dem retinalen Organoid über Nervenbahnen verbunden, die sich durch die Linkersphere ziehen. In der Fig. 6 ist gezeigt, dass GFP-markierte Zellen des retinalen Organoids im Inneren der Neurosphere projizieren und positiv für den Ganglienzell-Marker NEFM sind.

[0098] In der Fig. 7 ist eine Doppel-Verlinkung eines Astrolinkers mit einer Neuosphere auf der einen Seite und einem retinalen Organoid auf der anderen Seite dargestellt. Die Neuosphere ist mit dem retinalen Organoid über Nervenbahnen verbunden, die sich durch die Linkersphere ziehen.

[0099] In der Fig. 8 ist ein komplexes Sehnervenmodell schematisch dargestellt. Das komplexe Sehnervenmodell, z. B. zur Modellierung eines Glaukoms, besteht aus einem retinalem Organoid, das retinale Ganglienzellen enthält, zwei Linkern, gefüllt mit Oligodendrozyten (myelinisierter Teil des Sehnervs) + Astrozyten (intra-retinalen Teil des Sehnervs)) + Hirnorganoide (gemustert z. B. für Diencephalon oder Metathalamus).

[00100] In der Fig. 9 ist schematisch gezeigt, wie mittels der Linkershperes die Gefäßvaskularisie- rung unterstützt werden kann, z.B. durch Verbindung von Gewebeorganoiden mit Blutgefäßorganoiden.

[00101] In den Fig. 10a und 10b sind Multi-Verlinkungskonzepte gezeigt. Linkerspheres erlauben es, mehrere Organoide und verschiedene konnektive Konzepte (z.B. neuronale Verbindungen, Vaskularisierung) zu kombinieren. Linkerspheres könnten möglicherweise das Wachstum/den Zusammenbau von komplexen multiorganoiden und multizellularen Geweben einschließlich Nervenwachstum und Vaskularisierung erleichtern.