Campo de la invención La presente invención se refiere a dos nuevos genes de Blakeslea trispora denominados carRP y carB. El gen carRP codifica para la enzima bifuncional licopeno ciclasa/ fitoeno sintasa, mientras que carB codifica para la actividad enzimática fitoeno deshidrogenasa. Ambos genes están implicados en la ruta biosintética de R-caroteno de B. trispora (ver esquema).

Estado de la técnica Los carotenoides son pigmentos de naturaleza isoprenoide sintetizados por ciertas bacterias, hongos y organismos fotosintéticos. Debido a sus efectos beneficiosos para la salud y a sus atractivos colores, los carotenoides poseen una gran importancia comercial como colorantes y aditivos alimentarios. El a-caroteno es un carotenoide, cuya síntesis química se conoce desde el año 1956, que posee un peso molecular de 536,9 y una molécula (C4oH56) con once dobles enlaces conjugados. Posee color rojo-violeta en estado cristalino, amarillo-naranja en solución oleosa y naranja en dispersión acuosa. El ß- caroteno sintético posee la configuración isomérica todo- trans, mientras que el P-caroteno procedente de diversas fuentes naturales posee diferentes formas : mono-cis, di-cis y poli-cis.

La producción de carotenoides por biosíntesis microbiana es un ejemplo clásico de competencia entre los procesos químicos y los biológicos. Los procesos biotecnológicos muestran, entre otras, la ventaja de permitir obtener de forma simple los carotenoides de estructura más compleja, así como los isómeros conformacionales que sólo existen de forma natural. Los procesos biotecnológicos industriales para la producción de P-caroteno, competitivos con la síntesis química, están basados en la utilización del alga Dunaliella salina y del hongo B. trispora. E1 proceso de producción con B. trispora implica la realización de una fermentación mixta de las cepas (+) y (-) para conseguir una máxima producción de ß- caroteno. De esta forma se produce la biosíntesis de ácidos trispóricos, los cuales inducen la producción de P-' caroteno. El P-caroteno es producido tanto por la cepa (+) como por la (-), siendo metabolizado por ambas a retinal y posteriormente a 4-dihidrotrisporol. La cepa (+) utiliza 4- dihidrotrisporol como sustrato para formar ácido dihidrotrispórico y su éster metílico (metil-4- dihidrotrisporato). Por su parte, la cepa (-) metaboliza el 4-dihidrotrisporol a trisporol. Finalmente, el metil-4- dihidrotrisporato es convertido en ácido trispórico por la cepa (-) y el trisporol es convertido en ácido trispórico por la cepa (+). Esta descripción de la biosíntesis de los ácidos trispóricos es una simplificación, ya que durante el proceso se generan muchos co-metabolitos, algunos de los cuales son comunes a ambas cepas (+) y (-), pero otros son específicos de una de ellas. Las cantidades relativas de dichos co-metabolitos son variables en función de las cepas.

A pesar de la gran importancia biotecnológica del hongo B. trispora, el conocimiento científico de la biosíntesis de P-caroteno es escaso, ya que : (i) aún no han sido descritos procedimientos básicos para su manipulación genética, es decir, clonación de genes biosintéticos/ reguladores y transformación y (ii) se carece de información sobre la caracterización de actividades enzimáticas implicadas en la biosíntesis de-caroteno. No obstante, la ruta biosintética de a-caroteno (ver esquema) ha sido descrita en hongos filogenéticamente relacionados como Phycomyces blakesleeanus y Mucor circinelloides [Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 98 : 1687-1692; Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267 : 5509-5519]. Para dicha biosíntesis son necesarias al menos tres actividades enzimáticas : (i) fitoeno sintasa, la cual une dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato generando fitoeno, (ii) fitoeno deshidrogenasa, la cual introduce cuatro dobles enlaces en la molécula de fitoeno para sintetizar licopeno, y (iii) licopeno ciclasa, la cual, utilizando licopeno como sustrato, se encarga de formar los anillos situados en ambos extremos de la molécula de P-caroteno.

El análisis de mutantes de B. trispora ha permitido concluir que la ruta biosintética de-caroteno en este hongo es similar a la descrita para P. blakesleeanus [Metha B. J. y Cerdá-Olmedo E. (1995) Applied Microbiology and Biotechnology 42 : 836-838]. En el caso de P. blakesleeanus, el color amarillo de su micelio puede ser modificado mediante mutación dando lugar a cepas con micelio de color rojo, blanco o varias gradaciones de amarillo. Los mutantes rojos acumulan licopeno, mientras que los blancos carecen de producción de carotenoides o acumulan fitoeno. Mediante

análisis de complementación se han identificado dos genes denominados carB y carRA, cuyos productos probablemente estén organizados en un complejo enzimático en el que las cuatro deshidrogenaciones están catalizadas por cuatro unidades idénticas de fitoeno deshidrogenasa y las dos ciclaciones están catalizadas por dos unidades idénticas de licopeno ciclasa [Candau R. et al. (1991) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 88 : 4936-4940]. Tanto el gen carB [Ruiz-Hidalgo M. J. et al. (1997) Molecular and General Genetics 253 : 734-744] como el gen carRA [Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 98 : 1687-1692] han sido clonados y caracterizados. El gen carRA posee dos dominios diferentes : (i) el dominio R, el cual se encuentra más cercano al extremo 5'y codifica para la actividad licopeno ciclasa y (ii) el dominio A, el cual es responsable de la actividad fitoeno sintasa. Asimismo, el gen carB de P. blakesleeanus ha sido expresado en M. circinelloides [Ruiz-Hidalgo M. J. et al. (1999) Current Microbiology 39 : 259-264].

Los genes carB [Velayos A. et al. (2000) Planta 210 : 938-946] y carRP [Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267 : 5509-5519] de M. circinelloides también han sido clonados y caracterizados. El gen carRP codifica para una enzima bifuncional licopeno ciclasa/fitoeno sintasa con dos dominios : (i) el dominio R, el cual se encuentra más cercano al extremo 5'y codifica para la actividad licopeno ciclasa y (ii) el dominio P, localizado en el extremo 3'y responsable de la actividad fitoeno sintasa. El dominio R es funcional incluso en ausencia del dominio P, mientras que el dominio P necesita de la presencia del dominio R para su correcto funcionamiento.

Descripción detallada de la invención La presente invención describe por primera vez los genes carB y carRP de B. trispora. Tal y como ha sido descrito previamente para P. blakesleeanus y M. circinelloídes, el gen carB codifica para fitoeno deshidrogenasa y el gen carRP codifica para una enzima bifuncional licopeno ciclasa /fitoeno sintasa con un dominio R (más cercano al extremo 5'y que codifica para la actividad licopeno ciclasa) y un dominio P (localizado en el extremo 3'y responsable de la actividad fitoeno sintasa). Concretamente, el producto codificado por carB realiza la conversión de fitoeno en licopeno y la enzima bifuncional codificada por carRP cataliza tanto la biosíntesis de fitoeno a partir de geranilgeranil-PP como la conversión de licopeno en caroteno. Ambos genes : (i) están implicados en la ruta de biosíntesis de a-caroteno, (ii) se encuentran contiguos en el genoma y (iii) se expresan bajo el control de un promotor bidireccional situado entre ambos. Dicho promotor bidireccional permite la expresión génica en un sentido o en el opuesto. Los mutantes que carecen de alguno de estos dos genes no son capaces de producir P-caroteno, acumulando los intermediarios biosintéticos correspondientes (ver esquema).

B. trispora es un hongo que posee una gran importancia industrial para la producción biotecnológica de P-caroteno.

De hecho, dicho proceso resulta competitivo con el procedimiento sintético utilizado industrialmente en la actualidad. Los genes carRP y carB anteriormente mencionados pueden ser utilizados, a modo de ejemplo, para (i) la mejora de la producción de (3-caroteno mediante el incremento de su expresión y (ii) la modificación de la ruta biosintética de P-caroteno generando cepas capaces de

biosintetizar otros carotenoides. El incremento de la expresión génica de carRP y carB puede conseguirse introduciendo en B. trispora copias adicionales de dichos genes, bien en su estado natural o expresados bajo el control de promotores fuertes. La modificación de la ruta biosintética de a-caroteno puede conseguirse, por ejemplo, inactivando la actividad licopeno ciclasa mediante la manipulación del gen carRP. De esta forma se generarían cepas capaces de producir licopeno, un carotenoide de gran interés industrial y comercial.

En el siguiente esquema se muestran los genes y enzimas implicados en la ruta biosintética de P-caroteno de B. trispora. La actividad fitoeno sintasa une dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato generando fitoeno. La actividad fitoeno deshidrogenasa introduce cuatro dobles enlaces en la molécula de fitoeno para sintetizar licopeno.

La actividad licopeno ciclasa, utilizando licopeno como sustrato, forma los anillos situados en ambos extremos de la molécula de P-caroteno. Mevalonato 4 Isopentenil-PP, Opp PP w w w PP Geranilgeranil-PP GeranHgeranH-PP Fitoeno sintasa (carRP) Fitoeno Fitoeno deshidrogenasa (carB) Fitoflueno w w. w Fitoeno deshidrogenasa (carB) i -caroteno n Fitoeno deshidrogenasa (carB) Neurosporeno Fitoeno deshidrogenasa (carB) Licopeno Licopeno ciclasa (carRP) y-Caroteno < Licopeno ciclasa (carRP) I i-Caroteno ', Y ESQUEMA

E1 ADN genómico del hongo B. trispora se utilizó para la construcción de una genoteca en el vector fágico GEM12. Para ello, se realizó una digestión parcial con la endonucleasa de restricción Sau3AI y los fragmentos resultantes se ligaron a A-GEM12 tal y como se describe en Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA. Los genes carRP (licopeno ciclasa/fitoeno sintasa) y carB (fitoeno deshidrogenasa) se clonaron mediante el rastreo de dicha genoteca de B. trispora utilizando una sonda correspondiente al gen carRP de Mucor circinelloides. La sonda se obtuvo mediante la técnica de PCR (reacción en cadena de la ADN polimerasa) utilizando cebadores diseñados a partir de la secuencia del gen carRP de Mucor circinelloides [Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267 : 5509-5519]. De esta forma se amplificó un fragmento de ADN de 560 pb con el que se rastreó la genoteca y se aislaron 4 fagos recombinantes denominados fALBT1, fALBT4, fALBT12 y fALBT15 (Figura 1).

Dichos clones se analizaron con una serie de endonucleasas de restricción y seguidamente se procedió a la subclonación de un fragmento HindIII de 2,4 kb en vectores plasmídicos de E. coli. El mapa de restricción del citado fragmento aparece en el Esquema. Posteriormente se determinó la secuencia de las 2.430 pb incluidas en el fragmento HindIII anteriormente citado, encontrando dos marcos de lectura abiertos (ORF) incompletos que se transcribían en sentidos opuestos. En base a su similitud con secuencias presentes en bases de datos se denominaron carRP (SEQ ID NO : 1) y carB (SEQ ID NO : 2). La posterior subclonación y secuenciación de las regiones de ADN adyacentes a los extremos del citado fragmento de 2,4 Kb HindIII permitió completar la secuencia nucleotídica de ambos ORFs.

El ORF correspondiente al gen carRP posee una longitud de 1.894 pb y se encuentra interrumpido por un intrón de 70 pb localizado entre las posiciones 406 y 475. Dicho ORF codifica para una proteína de 608 aminoácidos, 69.581 Da y un punto isoeléctrico de 7, 78. La comparación de su secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO : 3) con la base de datos SwissProt, muestra elevada similitud con genes que codifican para las actividades enzimáticas licopeno ciclasa /fitoeno sintasa de M. circinelloides (67%), P. blakesleeanus (55%) y Neurospora crassa (29%) [Velayos A. et al. (2000). European Journal of Biochemistry 267 : 5509- 5519; Arrach N. et al. (2000). Proceedings of the National Academic of Sciences USA 98 : 1687-1692; Schmidhauser T. J. et al. (1994). The Journal of Biological Chemistry 269 : 12060-12066].

El ORF correspondiente al gen carB, posee una longitud de 1.955 pb y se encuentra interrumpido por dos intrones de 141 pb y 68 pb, localizados entre las posiciones 594-734 y 1584-1651 respectivamente. Dicho ORF codifica para una proteína de 582 aminoácidos, 66.426 Da y un punto isoeléctrico de 6, 9. La comparación de su secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO : 4) con la base de datos SwissProt, muestra elevada similitud con genes que codifican para la actividad enzimática fitoeno deshidrogenasa en M. circinelloides (80%), P. blakesleeanus (72%) y Neurospora crassa (48%) [Velayos A. et al. (2000).

Planta. 210 : 938-946 Ruiz-Hidalgo et al. (1997). Molecular and General Genetics 253 : 734-744; Ruiz-Hidalgo et al.

(1999). Current Microbiology 39 : 259-264; Schmidhauser et al. (1990). Molecular and Cellular Biology 10 : 5064-5070].

Un fragmento de ADN de 6,9 kb que incluye ambos genes (carRP y carB) fue subclonado, utilizando dianas de

restricción adecuadas, en vectores plasmídicos capaces de integrarse en una o más copias en el genoma de B. trispora, los cuales permiten la expresión de estos genes en el hongo hospedador. Asimismo, los promotores de los genes carRP y carB pueden ser obtenidos (utilizando dianas de restricción adecuadas o mediante PCR) y utilizados para la expresión de genes homólogos o heterólogos en B. trispora. En los ejemplos siguientes se describe la expresión del gen de resistencia a fleomicina (bleR) de Streptoalloteichus hindustanus [Drocourt D. et al. (1990). Nucleic Acids Research 18 : 4009] bajo el control de los promotores de los genes carRP y carB. Como se describe anteriormente, los promotores de los genes carRP y carB pueden ser utilizados para la correcta expresión de genes heterólogos en B. trispora o para la superexpresión de genes homólogos que se transcriben débilmente.

La expresión en B. trispora de genes biosintéticos de xantofilas puede dar lugar a transformantes capaces de biosintetizar carotenoides como zeaxantina, cantaxantina, astaxantina o nuevos carotenoides. Asimismo, mediante interrupción génica, podría bloquearse la ruta biosintética de P-caroteno obteniéndose transformantes capaces de producir, por ejemplo, licopeno como producto final.

Depósito de microorganismos de acuerdo con el Tratado de Budapest.

Dos cepas de Escherichia colí portadoras de los plásmidos pALBT9 (el cual contiene el gen carRP) y pALBT52 (el cual contiene el gen carB) han sido depositadas, según lo previsto en el Tratado de Budapest, en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Dpto. de Microbiología de la Facultad de Biología de la Universidad de Valencia, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot, Valencia, (España), con

los números CECT 5982 y CECT 5981 respectivamente el día 17.09. 01.

Los siguientes ejemplos describen en detalle y sin limitación la presente invención.

EJEMPLO 1 Construcción de genotecas de las cepas (+) y (-) de B. trispora.

Las genotecas de las cepas (+) y (-) de B. trispora se construyeron de la siguiente forma : Un total de 300 ug de ADN total se digirieron parcialmente con 20 unidades de Sau3AI en un volumen de reacción de 600 ul a 37°C y se recogieron 3 alícuotas de 200 ul a los 45 segundos, 1 minuto y 2 minutos respectivamente, deteniéndose la digestión con EDTA 20 mM frío. Tras comprobar las digestiones en un gel del 0,7% de agarosa, se mezclaron, se calentaron a 68°C durante 10 minutos, se dejaron enfriar lentamente hasta temperatura ambiente y se colocaron sobre un gradiente de sacarosa (10-40%) de 38 ml. Dicho gradiente se centrifugó a 26.000 r. p. m. durante 24 horas a 25°C, tras lo cual se recogieron alícuotas de 0,5 ml y se analizaron 10 ul de cada una de ellas en un gel del 0, 4% de agarosa.

Las alícuotas cuyo ADN poseía un tamaño entre 18 y 22 kb se mezclaron y se diluyeron con agua destilada hasta aproximadamente el 10% de sacarosa. Seguidamente se precipitó el ADN con etanol, se resuspendió en 50 pl de un tampón TE y 3 ul de esta última solución se analizaron en un gel del 0, 4% de agarosa. En dicho gel se comprobó que el tamaño de los fragmentos de ADN era correcto y que su concentración era de aproximadamente 50 ng/ul.

Paralelamente se preparó el ADN del bacteriófago - GEM12 (Promega) por procedimientos previamente descritos [Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA]. 50 ug de ADN del bacteriófago se digirieron con las endonucleasas BamHI y EcoRI a 37°C durante 2 horas.

La doble digestión se extrajo con fenol-CIA y CIA, se precipitó con etanol y se resuspendió en 50 pl de tampón TE. Tras recoger una alícuota de 2 ul, al resto se le añadió MgCl2 hasta 10 mM y se incubó a 42°C durante 1 hora para favorecer el reanillamiento de los brazos del vector por sus extremos cohesivos. Nuevamente se recogió una fracción de 2 pl que se analizó junto con la anterior en un gel del 0. 5% de agarosa para confirmar el correcto reanillamiento por los extremos cohesivos y estimar su concentración aproximada (alrededor de 100 ng/pl).

Seguidamente se realizaron una serie de ligaciones utilizando 0,25 ug de inserto y cantidades de vector comprendidas entre 0,25 y 0,75 ug, variando la relación inserto/vector. Las reacciones se incubaron a 12-14°C durante 16 horas. La encapsidación del ADN fágico recombinante originado tras la ligación se realizó con los extractos de empaquetamiento in vitro"Packagene" (Promega). Con el resultado de la reacción de encapsidación resuspendido en 500 ul de SM se realizaron infecciones de E. coli NM538 (Promega) para titular el número de fagos presentes y de E. coli NM539 (Promega) con la finalidad de determinar el porcentaje de fagos recombinantes. E. coli NM539 es una cepa lisógena del fago P2 y sólo origina placas de lisis cuando el fago que la infecta carece de la región central dispensable.

El título de las genotecas construidas resultó ser el siguiente : 125.000 ufps para B. trispora (+) y 50.000 ufps

para B. trispora (-). En ambos casos alrededor del 80% de los fagos eran portadores de un fragmento de ADN exógeno.

Ejemplo 2 Clonación y caracterización de los genes carB y carRP de B. trispora.

Ambas genotecas se transfirieron a filtros de nitrocelulosa y se rastrearon con una sonda de 560 pb correspondiente al gen carRP de M. circinelloides. Dicha sonda fue obtenida por amplificación mediante la técnica de PCR utilizando los cebadores #61 (SEQ ID NO : 5) y #62 (SEQ ID NO : 6), los cuales se diseñaron en función de la secuencia de ADN del gen carRP de M. circinelloides [Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267 : 5509-5519]. El proceso de selección de fagos positivos se llevó a cabo de acuerdo con procedimientos de hibridación previamente descritos [Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA]. Una vez completado el proceso de prehibridación, hibridación, lavados y autorradiografía se seleccionaron 4 clones denominados fALBTl, fALBT4, fALBT12 y fALBT15 que originaban señales positivas con el DNA sonda. El ADN que incluye los genes carRP y carB reivindicados en esta invención puede ser obtenido digiriendo los fagos fALBT4 ó fALBT15 (Figura 1) con enzimas de restricción adecuadas utilizando técnicas estándar [Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA]. Fragmentos de ADN que contengan las secuencias SEQ ID NO : 1 y SEQ ID NO : 2 pueden ser obtenidos con una o más enzimas de

restricción (Figura 1) y subclonados en un vector adecuado (por ejemplo pBluescript).

Un fragmento de ADN de 2,4 kb HindIII procedente del fago fALBT1 (Figura 1) fue subclonado en el sitio de restricción HíndIII del plásmido pBluescript I KS (+) en las dos posibles orientaciones. Los plásmidos resultantes se denominaron pALBT3 y pALBT11. Dichos plásmidos se sometieron a deleciones secuenciales con el kit"Erase-a- base" (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de secuencia de los clones delecionados se realizaron con el"Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactions Kit"y los fragmentos de ADN se separaron en un secuenciador automático ABI PRISM (Perkin Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante. De esa forma se obtuvo la secuencia de nucleótidos, por ambas, cadenas, de un total de 2.430 pb. Utilizando el programa Geneplot (DNASTAR) se identificaron dos ORFs incompletos que se correspondían con los genes carRP y carB. Con la finalidad de completar la secuencia nucleotídica de ambos genes, se llevó a cabo la subclonación y posterior secuenciación de las regiones de ADN adyacentes al citado fragmento HindIII. A partir del fago fALBT1 se subclonó en pBluescript I KS (+) un fragmento XhoI de 1.0 Kb (Fig. 1), el cual incluye el extremo 3'del gen carRP, originando el plásmido pALBT12. La secuenciación por ambas cadenas del fragmento incluido en dicho plásmido permitió completar la secuencia nucleotídica del gen carRP.

Asimismo, con la finalidad de determinar la secuencia de la región 3'del gen carB, se abordó la subclonación en pBluescript I KS (+) de un fragmento ClaI-NotI de 5,1 kb procedente de fALBT15. Los plásmidos obtenidos (ambas orientaciones), denominados pALBT59 y pALBT82, se

sometieron a deleciones secuenciales con el kit"Erase-a- base" (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de secuencia de los clones delecionados se realizaron con el"Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactions Kit"y los fragmentos de ADN se separaron en un secuenciador automático ABI PRISM (Perkin Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante.

La secuencia nucleotídica completa del gen carRP mostró un ORF de 1.894 pb, interrumpido por un intrón de 70 pb, localizado entre las posiciones 406-475 y flanqueado por las siguientes secuencias de unión intrón/exón : 5' (g/GTATGCA) y 3' (TTAG/c). Se trata de secuencias conservadas cuando se comparan con las secuencias consenso descritas para hongos : 5' (g/GTAHGTYW) y 3' (MYAG/g). Dicho gen codifica para un polipéptido de 608 aminoácidos con un peso molecular deducido de 69.581 Da y un punto isoeléctrico de 7,78. La proteína deducida de la secuencia (SEQ ID NO : 3) muestra elevada similitud con las enzimas con actividad licopeno ciclasa/fitoeno sintasa de M. circinelloides (67%), P. blakesleeanus (55%) y N. crassa (29g) descritas en las bases de datos [Velayos A. et al.

(2000). European Journal of Biochemistry 267 : 5509-5519; Arrach N. et al. (2000). Proceedings of the National Academic of Sciences USA 98 : 1687-1692; Schmidhauser T. J. et al. (1994). The Journal of Biological Chemistry 269 : 12060-12066].

El gen carB, de 1.955 pb de longitud, se encuentra interrumpido por dos intrones de 141 y 68 pb, localizados entre las posiciones 594-734 y 1584-1651, respectivamente y flanqueados por secuencias de unión intrón/exón fúngicas conservadas [5'(g/GTAAGTA) y 3' (ATAG/t) para el intrón de 141 pb y 5' (g/GTAATAC) y 3' (GTAG/t) para el intrón de 68 pb] similares a las descritas para el gen carRP. El gen carB

codifica para un polipéptido de 582 aminoácidos con un peso molecular deducido de 66.426 Da y un punto isoeléctrico de 6,9. La proteína deducida de la secuencia (SEQ ID NO : 4) muestra similitud elevada con las enzimas con actividad fitoeno deshidrogenasa de M. circínelloides (80%), P. blakesleeanus (72%) y N. crassa (48%) descritas en las bases de datos [Velayos A. et al. (2000). Planta. 210 : 938- 946 ; Ruiz-Hidalgo et al. (1997). Molecular and General Genetics 253 : 734-744 ; Ruiz-Hidalgo et al. (1999). Current Microbiology 39 : 259-264; Schmidhauser et al. (1990).

Molecular and Cellular Biology 10 : 5064-5070].

Ejemplo 3 Construcción de plásmidos para la expresión heteróloga en B. trispora.

El plásmido pALFleo7 [Díez B. et al. (1999) Applied Microbiology and Biotechnology 52 : 196-207] se utilizó como punto de partida para la construcción de plásmidos de expresión heteróloga en B. trispora. Dicho plásmido contiene el gen de resistencia a fleomicina (bleR) de S. hindustanus [Drocourt D. et al. (1990). Nucleic Acids Research 18 : 4009] con un sitio de restricción para NcoI localizado en el codón ATG de inicio de la traducción y un sitio de restricción para BamHI precediendo al NcoI. pALFleo7 posee asimismo el terminador del gen trpC de Aspergillus nidulans (TtrpC). El conjunto formado por el gen bleR y TtrpC se purificó por digestión doble de pALfleo7 con BamHI más BglII y se subclonó en el sitio BamHI de pBluescript I KS (+). El plásmido resultante se denominó pALfleo8. Seguidamente, se insertaron dos sitios NcoI en los codones ATG de inicio de la traducción de los genes carB y carRP, mediante mutagénesis dirigida utilizando el

"QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene).

Para la introducción del sitio de corte NcoI en el gen carb se diseñaron los siguientes oligonucleótidos representados por SEQ ID NO : 7 y SEQ ID NO : 8. Para la introducción del sitio de corte NcoI en el gen carRP se diseñaron los oligonucleótidos representados por SEQ ID NO : 9 y SEQ ID NO : 10. En ambos casos se utilizó pALBT3 como molde para la amplificación por PCR. Una vez introducidas las mutaciones correspondientes se obtuvo el plásmido pALBT56.

A partir del plásmido pALBT56 se purificó un fragmento NcoI de 0,6 kb, con el kit"Quiaex II" (Quiagen), correspondiente al promotor bidireccional de los genes carb y carRP (PcarB-PcarRP). Este fragmento se ligó con el plásmido pALfleo8, previamente digerido con la endonucleasa NcoI, obteniéndose dos plásmidos diferentes : pALBT57 (el cual expresa el gen blé bajo el promotor PcarRP) y pALBT58 (el cual expresa el gen bleR bajo el promotor PcarB). Los plásmidos pALBT57 y pALBT58 (Figura 2) permiten la expresión heteróloga del gen bleu de S. hindustanus en B. trispora.

Ejemplo 4 Construcción de plásmidos para la introducción de copias adicionales de los genes carRP y carB en B. trispora.

Con la finalidad de introducir en B. trispora copias adicionales de los genes carRP y carB, se construyeron los plásmidos pALBT83, pALBT84 y pALBT85 (Figura 2). En los tres casos se utilizó como punto de partida el plásmido pALBT57 anteriormente descrito. La construcción de pALBT83 se realizó de la siguiente forma : se digirió fALBT4 con la endonucleasa SphI, posteriormente se convirtieron sus extremos en romos con el fragmento Klenow de la ADN

polimerasa I de E. coli (sin adición de dNTPs para favorecer la acción de su actividad exonucleasa) y por último se digirió con la endonucleasa NotI. Seguidamente se purificó un fragmento de 6,9 kb, con el kit"Quiaex II" (Quiagen), el cual contiene los genes carB y carRP. Por otra parte, el plásmido pALBT57 se digirió con la endonucleasa SacI, posteriormente se incubó con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I para obtener extremos romos (sin adición de dNTPs para favorecer la acción de su actividad exonucleasa) y por último se digirió con NotI. Los extremos compatibles del plásmido y del inserto se ligaron y el resultado de la ligación se transformó por electroporación en E. coli DH5a. Los transformantes se seleccionaron en medio LB [Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA] por resistencia a ampicilina (presente en el vector pALBT57). La construcción deseada se seleccionó mediante análisis de restricción, obteniéndose el plásmido pALBT83 (Figura 2).

La construcción de pALBT84 se realizó de la siguiente forma : se digirió pALBT9 con la endonucleasa NdeI y posteriormente se convirtieron sus extremos en romos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli.

Seguidamente se purificó, con el kit"Quiaex II" (Quiagen), un fragmento de 3,5 kb que contiene el gen carRP. Por otra parte, el plásmido pALBT57 se digirió con la endonucleasa SacI y posteriormente se incubó con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I para obtener extremos romos (sin adición de dNTPs para favorecer la acción de su actividad exonucleasa). Los extremos romos del plásmido y del inserto se ligaron y el resultado de la ligación se transformó por electroporación en E. coli DH5a. Los transformantes se

seleccionaron en medio LB [Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA] por resistencia a ampicilina (presente en el vector pALBT57).

La construcción deseada se seleccionó mediante análisis de restricción, obteniéndose el plásmido pALBT84 (Figura 2).

La construcción de pALBT85 se realizó de la siguiente forma : se digirió pALBT52 con las endonucleasas XhoI-XbaI y posteriormente se convirtieron sus extremos en romos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli.

Seguidamente se purificó, con el kit"Quiaex II" (Quiagen), un fragmento de 2,6 kb que contiene el gen carB. Por otra parte, el plásmido pALBT57 se digirió con la endonucleasa SacI y posteriormente se incubó con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I para obtener extremos romos (sin adición de dNTPs para favorecer la acción de su actividad exonucleasa). Los extremos romos del plásmido y del inserto se ligaron y el resultado de la ligación se transformó por electroporación en E. coli DH5a. Los transformantes se seleccionaron en medio LB [Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA] por resistencia a ampicilina (presente en el vector pALBT57).

La construcción deseada se seleccionó mediante análisis de restricción, obteniéndose el plásmido pALBT85 (Figura 2).

Con la finalidad de definir claramente la invención se presentan un total de dos figuras. Las abreviaturas BamHI, HindIII, etc. son abreviaturas convencionales de endonucleasas de restricción. La longitud aproximada de los fragmentos de ADN se indica en kilobases (kb) de acuerdo con los tamaños determinados mediante electroforesis en gel de agarosa. En las figuras no se muestran todos los sitios

de restricción presentes. El ADN presente en la invención puede ser introducido en cualquier vector adecuado por diferentes métodos : combinación directa de extremos cohesivos, utilización de colas homopoliméricas, mediante moléculas adaptadoras o ligadoras, etc.

Descripción detallada de las figuras Figura 1. Mapa de restricción de la región del genoma de B. trispora que contiene los genes carB y carRP. La flecha indica el sentido de la transcripción de cada uno de ellos y los rectángulos la presencia de intrones. Las líneas situadas en la parte inferior de la figura representan los fragmentos de ADN de B. trispora clonados en el vector fágico A-GEM12 (fALBT) o en plásmidos (pALBT). La secuencia de nucleótidos de este fragmento de ADN está descrita en SEQ ID NO : 1 y SEQ ID NO : 2.

Figura 2. Mapa físico de los plásmidos pALBT57, pALBT58, pALBT83, pALBT84 y pALBT85. pALBT57 consiste en pBluescript I KS (+) con un inserto HindIII-BamHI de 1,7 kb que incluye la construcción de resistencia a fleomicina PcarRP-bleR- TtrpC. pALBT58 consiste en pBluescript I KS (+) con un inserto HindIII-BamHI de 1,7 kb que incluye la construcción de resistencia a fleomicina PcarB-bleR-TtrpC. pALBT83 está formado por pALBT57 con un inserto SphI-NotI de 6,9 kb que incluye los genes carB y carRP. pALBT84 consiste en pALBT57 con un inserto NdeI de 3,5 kb que incluye el gen carRP. pALBT85 es pALBT57 con un inserto XhoI-XbaI de 2,6 kb que incluye el gen carB.