„Katalytisch aktive Proteinschäume und Verfahren zu deren Herstellung"

Die vorliegende Erfindung betrifft katalytisch aktive Proteinschäume und Verfahren zu deren Herstellung.

Als Biokatalyse wird eine Umsetzung und Beschleunigung oder Steuerung chemischer Reaktionen bezeichnet, in der Enzyme als biologische Katalysatoren dienen. Enzyme bestehen vollständig oder überwiegend aus einem oder mehreren Proteinen und teilweise auch aus einem Co-Faktor.

Die Biokatalyse bietet gegenüber der klassischen chemischen Katalyse mehrere Vorteile: Erstens werden die Reaktionen typischerweise in einem milderen Temperaturbereich (4 - 60 °C) durchgeführt, was zu einem geringeren für die Reaktionen benötigten Energiebedarf führt. Enzymreaktionen können in einer wässrigen Umgebung durchgeführt werden; parallel dazu hat die Verwendung von Enzymen in Kombination mit organischen Lösungsmitteln in den letzten Jahrzehnten zugenommen. Biokatalytische Reaktionen in zweiphasigen Systemen und in reinen organischen Lösungsmitteln ermöglichen eine höhere Substratbeladung, verhindern die Hydrolyse von wasserempfindlichen Verbindungen und verschieben das thermodynamische Gleichgewicht vieler Reaktionen. Ein weiterer Vorteil biokatalytischer Reaktionen ist, dass sie nicht unter Schutzgas durchgeführt werden müssen, während viele homogene und heterogene Katalysatoren bereits bei Raumtemperatur durch Luft oxidiert und deaktiviert werden (E. M. M. Abdelraheem et al., React. Chem. Eng. 2019, 4, 1878-1894).

Aufgrund der komplexen, aber definierten 3-dimensionalen Struktur von Enzymen profitiert die Enzymkatalyse von einer hohen Chemo-, Regio- und Stereoselektivität, die die Herstellung von komplexen und chiralen Molekülen erlaubt. Heutzutage wird die Biokatalyse für eine Reihe von industriellen Prozessen genutzt, wie beispielsweise für die Herstellung von wertvollen Feinchemikalien, optisch aktiven Pharmazeutika, Pflanzenschutzmitteln und Duftstoffen oder für den Abbau von Kunststoffen. Da Enzyme weniger gesundheits- und umweitschädlich sind als chemische Katalysatoren, wird ihr Einsatz in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie favorisiert (E. M. M. Abdelraheem et al., React. Chem. Eng. 2019, 4, 1878- 1894).

Die Biokatalyse bietet die Möglichkeit, ganze Synthesewege für die Herstellung wichtiger Moleküle neu zu gestalten, sie in höheren Ausbeuten zu gewinnen und ihre nachgeschalteten Prozesse zu vereinfachen. Die Vorteile von Synthesestrategien, die auf organischen Ein-Topf-Transformationen basieren, ohne dass Zwischenverbindungen isoliert werden müssen, sind aus zahlreichen Studien bekannt. Derartige Prozesse werden auch als "Kaskaden"-Reaktionen bezeichnet (E. M. M. Abdelraheem et al., React. Chem. Eng. 2019, 4, 1878-1894).

Die Proteintechnologie erlaubt es, Enzyme über die Änderung ihrer Aminosäuresequenz hinsichtlich des Expressionsniveaus, der Stabilität, der katalytische Aktivität und der Selektivität zu optimieren und industriellen Anforderungen anzupassen. So wurden beispielsweise neue Varianten der P450- Enzyme mit gewünschter Aktivität generiert, die eine bemerkenswerte Vielfalt chemischer Reaktionen, wie die regiospezifische Oxyfunktionalisierung, C-C-Bindungsbildung, Zyklopropanierung usw., ermöglichen. Auch Lipasen wurden Protein-Engineering-Studien unterzogen, die zu neuen Katalysatoren für die kinetische Racematspaltung chiraler Alkohole geführt haben (E. M. M. Abdelraheem et al., React. Chem. Eng. 2019, 4, 1878-1894). Die Enzymimmobilisierung ist ein vergleichsweise alter Ansatz, Enzyme technisch nutzbar zu machen (N. Grubhofer et al., Naturwissenschaften 1953, 40, 508) . Heute werden immobilisierte Enzyme breitflächig u.a. in Produktions verfahren der Chemie und Lebensmittelindustrie, in der Diagnostik und Biosensorik oder in Waschmitteln, Agrarprodukten und Kosmetik genutzt.

Enzymimmobilisierung ist generell definiert als „physikalische Abgrenzung oder Lokalisierung von Enzymen in einem begrenzten Raum unter Erhalt der katalytischen Aktivität" (E. Katchalski- Katzir, Trends Biotechnol. 1993, 11, 471-478). So kann durch Immobilisierung eine Konzentrierung der Enzyme und damit verbunden eine höhere Produktivität (Raum-Zeit-Ausbeute) erreicht und die dabei eingesetzte Katalysatormenge reduziert werden. Je nach Wahl der Immobilisierungsstrategie kann die Stabilität gegenüber hohen Temperaturen, extremen pH-Werten, mechanischen Scherkräften und organischen Solventien verändert werden. Gleichzeitig wird die Abtrennung der Enzyme vom Reaktionsmedium erleichtert, wodurch die Verwendung der Enzyme in mehreren Reaktionszyklen ermöglicht wird. Zusätzlich kann mit der Immobilisierung eine intrinsische Stabilisierung der Enzyme einhergehen, sodass Lagerfähigkeit und Prozessstandzeit im Vergleich zum freien Enzym signifikant verbessert sind (R. A. Sheldon et al., Chem Rev. 2018, 118, 2, 801-838).

Grundlegend lassen sich als Immobilisierungsmethoden die kovalente und nicht kovalente Trägerbindung, das Einschlussverfahren in polymere Matrizes und in Membranen und die trägerfreie Immobilisierung unterscheiden. Herkömmliche Methoden zur Fixierung von Enzymen beruhen auf der Verankerung oder Vernetzung der Proteine durch polyfunktionale Kupplungsreagenzien („crosslinker"), entweder direkt in der Kanalstruktur oder auf porösen Trägermaterialien (Polymere, Partikel) . Die Verwendung von Trägermaterialien stellt hierbei einen Kompromiss dar, der zwar eine effektive Immobilisierung unter Erhalt der katalytischen Aktivität ermöglichen kann, jedoch auch zwangsläufig zur „Verdünnung" der katalytischen Spezies und damit zur Verringerung von Raum/Zeit-Ausbeuten führt. Trägerfreie unlösliche Agglomerate (Immobilisate) von Enzymen entstehen durch direkte oder über Spacer vermittelte kovalente Quervernetzung der einzelnen Proteinmoleküle (U. Rössl et al., Biotechnol. Lett. 2010, 32, 341-350). Dabei kommen bifunktionelle Reagenzien zum Einsatz, die mit den reaktiven Funktionen der Aminosäureseitenketten auf der Enzymoberfläche reagieren. Wie bei der kovalenten Trägerbindung dienen vorrangig die e-Aminofunktionen der Lysinreste als Reaktionspartner. Als Vernetzungsreagenzien sind Dialdehyde (z. B. Glutardialdehyd, Dextrandialdehyd), Diisocyanate (z.B. Hexamethyldiisocyanat) und Diisothiocyanate (z.B. p-Phenylendiisothiocyanat) geeignet. Die Quervernetzung ist sowohl auf Basis gelöster Enzyme als auch ausgehend von gefrier- bzw. sprühgetrockneten Präparaten, Enzymkristallen und voraggregierten Enzymen möglich. Anwendungstechnische Bedeutung haben vor allem vernetzte Enzymkristalle, sog. cross-linked enzyme crystals (CLEC), und vernetzte Enzymagglomerate, sog. cross-linked enzyme aggregates (CLEA), erlangt. CLECs weisen eine solide mikroporöse Struktur mit uniformen, den Kristall durchziehenden Kanälen auf. Der Partikeldurchmesser kann über das Verhältnis von Enzym und Vernetzungsreagenz bzw. über die Inkubationszeit zwischen 1 - 100 gm flexibel eingestellt werden.

Die Erzeugung von CLEAs macht sich die spontane Agglomeration und Präzipitation von Proteinen in Gegenwart verschiedener organischer Lösungsmittel, Elektrolyte, nicht ionischer Polymere und Säuren zunutze und erfolgt unter Erhalt der dreidimensionalen Struktur, d. h. ohne Denaturierung. Die resultierenden Aggregate werden zu Partikeln gelartiger Konsistenz mit einem Durchmesser von 5 - 50 gm vernetzt. (Einführung in die Enzymtechnologie, K.-E. Jaeger et al., 2018 Springer Spektrum, Springer-Verlag GmbH Deutschland, 187-206; R. A. Sheldon, Org. Process Res. Dev. 2011, 15, 1, 213-223).

Eine Lösung für die Beladung mit relativ großen Mengen aktiver Biokatalysatoren bietet die in-situ-Generierung reiner Enzym- Hydrogele. Hydrogele sind poröse Polymere, die aus natürlichen oder synthetischen Strukturproteinen hergestellt sind und innerhalb der Biomedizin für die Verkapselung von Zellen und das Tissue Engineering erforscht werden (J. H. Lee, J. Tissue Eng. 2018, 9, 1-4).

Eine kürzlich eingeführte Strategie zur Protein-Gelbildung verwendet ein Paar von genetisch kodierten reaktiven Partnern, SpyTag und SpyCatcher, die unter physiologischen Bedingungen spontan eine kovalente Isopeptid-Bindung eingehen (S. C. Reddington et al., Current Opinion in Chemical Biology 2015, 29, 94-99; EP2534484B1). Peschke et al. beschreiben ein Verfahren zur Herstellung selbst-assemblierender Enzym- Hydrogele, in dem Enzyme genetisch mit einer SpyTag- bzw. SpyCatcher-Domäne fusioniert werden. Diese derart mit Konnektoren fusionierten Enzyme vernetzen sich in situ mit sich selbst und bilden monolithische (im Stück polymerisierte) „all-enzyme hydrogels". Die so hergestellten quervernetzten Polymere haben typischerweise Porengrößen von < 200 nm und zeigen eine höhere katalytische Aktivität als die zuvor erwähnten CLEAs.

Die Enzymimmobilisierung ist auch in Form von Schäumen beschrieben worden: Die W09820100A1 beschreibt unvernetzte Enzymformulierungen in Detergenzien, die anschließend aufgeschäumt werden. In diesen werden allerdings extrem niedrige Enzymkonzentrationen im Bereich von 0,0001 - 0,005 % eingesetzt. In der US4195127A werden die Herstellung von enzymhaltigen Polyurethan-basierten Biohybridschäumen und in Brun et al. die Herstellung von mesoporigen Silica-basierten Biohybridschäumen beschrieben, auf denen nachträglich Enzyme immobilisiert werden (N. Brun et al., Chem. Mater. 2010, 22, 16, 4555-4562).

Die Herstellung von Schäumen ist eine etablierte Technologie, die darauf basiert, Blasen in eine flüssige Phase einzubringen (W. Drenckhan et al., Advances in Colloid and Interface Science 2015, 222, 228-259; W. Drenckhan et al., Advances in Colloid and Interface Science 2015, 224, 1-16).

Schäume können zum Beispiel durch die Gasdurchführung durch eine Membran (J. Dittmann et al., Journal of Colloid and Interface Science 2016, 467, 148-157) oder durch Schütteln eines Behälters, der eine mit einem Tensid versetzte Flüssigkeit enthält, hergestellt werden (A. Maestro et al., Soft Matter 2014, 10, 36, 6975-6983).

Die mikrofluidische Erzeugung von Schäumen basiert auf der Generierung von Einzelkompartimenten in Zweiphasensystemen aufgrund von Abscherungen von einer Phase in die andere. Die beiden Phasen sind dabei nicht mischbar. Diese Technologie ist als Tropfenmikrofluidik bekannt (S. Mashagi et al., Trends in Analytical Chemistry 2016, 82, 118-125) . Die Literatur unterscheidet zwischen Tropfen (flüssig-flüssig-Systeme) und Blasen (flüssig-Luft-Systeme), wobei die Erzeugung von Blasen analog zu Generierung von Tropfen in verschiedenen Geometrien erfolgen kann (S. L. Anna, Annu. Rev. Fluid. Mech. 2016, 48, 285-309) . Die etabliertesten Verfahren sind die T-Kreuzung und die Fluss-fokussierende Kreuzung (T. Fu et al., Chemical Engineering Science 2015, 135, 343-372).

Die Blasensysteme werden weiterhin darin unterschieden, ob die Gasphase als kontinuierliche Phase (P. Tirandazi et al., Journal of Micromechanics and Microengineering 2017, 27, 075020) oder als disperse Phase verwendet wird (S. Andrieux et al., Langmuir 2018, 34, 1581-1590). Diese Blasensysteme unterscheiden sich hinsichtlich der Flussregime und der Systeme zur Blasenstabilisierung. Die so generierten Blasen weisen Blasengrößen im Bereich von 10 gm bis 1000 gm auf und fusionieren in einem Selbstassemblierungsprozess in höher geordnete Gitterstrukturen, die dann über die Flussparameter kontrolliert geändert werden können. In Abhängigkeit der äußeren Geometrieparameter der Struktur bilden sich diese Gitter zu dynamisch assemblierten Schäumen aus (P. Garstecki, Applied Physics Letters 2004, 85, 13, 2649-2651).

Proteinschäume sind ein wesentlicher Bestandteil der Lebensmittelindustrie und werden weitläufig für das gleichmäßige Inserieren feiner Luftzellen zur Texturierung von Lebensmitteln verwendet. Dabei werden katalytisch nicht aktive Mischungen aus Strukturproteinen wie beispielsweise Eiklar, Gelatine, Soja- oder Molkeproteinen zur Schaumerzeugung eingesetzt .

Bei der Bildung eines Proteinschaums wird zwischen drei Phasen unterschieden (J. R. Clarkson et al., Journal of Colloid and Interface Science 1999, 215, 2, 323-332):

Phase 1: Die Proteine diffundieren zur Luft/Wasser- Grenzfläche, werden dadurch lokal konzentriert und reduzieren so die Oberflächenspannung. Phase 2: Die an der Grenzfläche adsorbierten Proteine entfalten sich partiell mit Ausrichtung ihrer hydrophilen, polaren Anteile zur wässrigen Phase und ihrer hydrophoben Anteile zur nicht-wässrigen Phase.

Phase 3: Zusätzlich interagieren die Proteine an der Grenzfläche miteinander und bilden einen Film, der zu einer weiteren partiellen Entfaltung und Koagulation führen kann. Über die drei genannten Phasen adsorbieren Proteine schnell an der Grenzfläche und bilden einen stabilisierenden Film um einzelne Blasen. Dies fördert die Schaumbildung.

Bei der sog. Zerschäumung von Proteinen wird das Konzentrieren der oberflächenaktiven Proteine an der Grenzfläche zur fraktionierten Auftrennung genutzt. Dabei wird eine proteinhaltige Lösung mit einem inerten Gas durchströmt und der entstehende Schaum sukzessive abgetrennt. Dieses Verfahren ermöglicht eine kostengünstige und einfache Methode, um Proteine aus einer Lösung abzutrennen, und eignet sich zur industriellen Aufreinigung von Enzymen (F. Uraizee et al., Enzyme Microb. Technol. 1990, 12, 315-316).

Aufgrund der Denaturierung von Proteinen an den Grenzflächen wirken Schäume allerdings im Zusammenhang mit katalytisch aktiven Proteinen in der Regel destabilisierend und inaktivieren diese in erheblichen Maße (J. R. Clarkson et al., Journal of Colloid and Interface Science 1999, 215, 2, 333- 338; Z. Liu et al., Bioseparation 1998, 7, 3, 167-174).

Die kontinuierliche Durchfluss-Biokatalyse ist ein aufstrebender Bereich der industriellen Biotechnologie, der in Fließkanälen immobilisierte Enzyme für die Produktion von höherwertigen Chemikalien verwendet. Biokatalytische Fließprozesse sind schwierig zu realisieren, weil das heterogene Katalysesystem effektive Oberflächen immobilisierungstechniken erfordert, die für Enzyme anspruchsvoller sind als für konventionelle organo- (metallische) Katalysatoren.

Gängige Methoden zur Enzymimmobilisierung innerhalb mikrostrukturierter Strömungskanäle, wie z.B. Physisorption, chemische Quervernetzung oder genetisch kodierte Immobilisierungs-Tags haben ihre Anwendbarkeit bewiesen, aber es bleibt das Problem, dass die Menge des immobilisierten Biokatalysators durch die effektive Oberfläche begrenzt ist. Um diese Beschränkung zu überwinden, können Pseudo-3D- Grenzflächenschichten aus synthetischen Polymeren oder Mikro- /Nanopartikeln verwendet werden, um die Beladungskapazität für Enzyme zu erhöhen. Diese Ansätze verschwenden allerdings den begrenzten Reaktorraum und erfordern zudem oft zusätzliche Kopplungsschritte mit möglichen Nachteilen für die biokatalytische Aktivität. Eine Alternative stellen die zuvor erwähnten selbst-assemblierenden „all-enzyme hydrogels" dar, die in biokatalytischen Strömungsprozessen als immobilisierte Biokatalysatoren relativ hohe Raum-Zeit-Ausbeuten aufweisen (T. Peschke et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 17028- 17032).

Katalytisch aktive Proteinschäume, die aus miteinander kuppelnden katalytisch aktiven Proteinen hergestellt werden, sind noch nicht beschrieben worden.

Auch die Verwendung von katalytisch aktiven Proteinschäumen als trägerfreies Material für die Strömungsbiokatalyse ist bisher nicht bekannt.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, katalytisch aktive Proteinschäume und ein Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen, wobei die Proteindenaturierung während der Schaumbildung möglichst gering sein soll, die volumenspezifische Enzymbeladung und die Stabilität der Proteinschäume hingegen möglichst hoch sein sollen.

Die vorstehende technische Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.

Die Erfindung zielt darauf ab, katalytisch aktive Proteinschäume herzustellen, die im Wesentlichen allein aus miteinander gekuppelten katalytisch aktiven Proteinen oder aus Verbundmaterialien einschließlich der miteinander gekuppelten katalytisch aktiven Proteine bestehen. Die Proteine sind wesentlicher Bestandteil des Materials selbst, sie sind also nicht nachträglich auf geschäumte Materialien, wie z.B. Polymere, aufgebracht. Im Folgenden werden die Begriffe „Proteinschaum" und „Proteinschäume" als Synonyme verwendet und sind definiert als gasförmige Blasen, die von flüssigen oder festen Proteindünnfilmen eingeschlossen sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

A) Herstellung katalytisch aktiver, mit einem Konnektor (7) fusionierter Proteine sowie katalytisch aktiver, mit einem zum Konnektor (7) komplementären Konnektor (8) fusionierter Proteine;

B) Herstellung von katalytisch aktive Proteine enthaltenden Blasen in einem Blasengenerator unter Einsatz einer Gasphase und einer Lösung der katalytisch aktiven, mit dem Konnektor (7) fusionierten Proteine und der katalytisch aktiven, mit dem Konnektor (8) fusionierten Proteine aus Schritt A);

C) Überführen der in Schritt B) hergestellten Blasen in eine Reaktionskammer (5);

D) Kupplung der in den Blasen enthaltenen katalytisch aktiven Proteine aus Schritt B) in der Reaktionskammer (5) unter Ausbildung eines katalytisch aktiven Proteinschaums (10).

Ein Merkmal des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) besteht darin, dass die individuellen Moleküle der katalytisch aktiven Proteine (6) über zueinander komplementäre Konnektoren (7) und (8) miteinander gekuppelt sind. „Miteinander gekuppelt" bedeutet für das erfindungsgemäße Verfahren, dass die Konnektoren (7) und (8) eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung eingehen. Nicht kovalente-Bindungen sind im erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise Wasserstoff brückenbindungen oder ionische Bindungen, aber auch hydrophobe Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Kräfte.

Zueinander komplementär bedeutet im erfindungsgemäßen Verfahren für die Konnektoren (7) und (8), dass sie spezifisch miteinander reagieren, sodass eine spezifische Bindung zwischen den katalytisch aktiven Proteinen ausgebildet wird. Die Bindung ist hierbei in einer Ausführungsform eine kovalente Bindung, in einer anderen Ausführungsform eine nicht-kovalente Bindung .

Für das SpyTag/SpyCatcher-System besteht die Kompelmentarität darin, dass das Ne eines Lysinrests der SpyCatcher-Domäne spezifisch mit dem C _a eines (komplementären)

Asparaginsäurerests der SpyTag-Domäne unter Ausbildung einer Isopeptidbindung und Abspaltung von H2O reagiert (S. C. Reddington et al., Current Opinion in Chemical Biology 2015, 29, 94-99).

In einer Ausführungsform werden die katalytisch aktiven, mit einem Konnektor (7) fusionierten Proteine sowie die katalytisch aktiven, mit dem zum Konnektor (7) komplementären Konnektor (8) fusionierten Proteine in Schritt A) heterolog exprimiert und die Konnektoren sind ein genetisch-fusionierter Teil der Proteine. Für die heterologe Expression der mit den Konnektoren (7) bzw. (8) fusionierten katalytisch aktiven Proteine werden Bakterienzellen mit dem entsprechenden Expressionsvektor transformiert.

In einer bestimmten Ausführungsform sind die Konnektoren genetisch-fusionierte Peptid-Tags, die kovalente

(Iso)peptidbindungen bilden können, wie beispielsweise Split- Inteine (N. H. Shah et al., Chem Sei 2013, 5, 446-461), Sortasen (H. Mao et al., JACS 2004, 126, 2670-2671),

Transglutaminasen (A. Fontana et al., Adv Drug Deliv Rev 2008, 60, 13-28), Peptiligasen (A. Toplak et al., Adv Synth Catal.

2016, 358(13), 2140-2147,) oder das SpyTag/SpyCatcher-System. Beispielsweise wird das katalytisch aktive Protein (6) genetisch mit einer SpyTag- bzw. SpyCatcher-Domäne fusioniert. Die Reaktion des SpyTags mit dem SpyCatcher führt zu einer definierten kovalenten Bindung zwischen den katalytisch aktiven Proteinen.

In einer weiteren Aus führungsform werden genetisch fusionierte, nicht-kovalente, Peptid- bzw. Protein-basierte Bindungssysteme zur Verknüpfung der katalytisch aktiven Proteine (6) verwendet, wie beispielsweise das RIDD/RIAD- System (W. Rang et al., Nat. Commun. 2019, 10, 4248), selbst- assemblierende amphipathische Peptide (self-assembling amphipathic peptides) (VS. Zhao et al., Microb Cell Fact. 2019, 18, 91), Leucin-Zipper-Systeme (J. R. Moll et al., Protein Sei. 2001, 10, 3, 649-655, ⁾ oder Elastin-ähnliche Peptide (elastln-llke peptides (ELPs)) und Kollagen-ähnliche Peptide (collagen-like peptides (CLPs)) (Ό. W. Urry et al., Biopolymers. 1985, 24, 12, 2345-2356; T. Luo et al., J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 49, 15362-15365j.

Eine bestimmte Ausführungsform stellen die Protein/Protein Interaktionsdomänen PDZ (PSD95-Discs large_Z01), GBD (GTPase- Bindedomäne), SH3 (Src-homology 3) und deren korrespondierende Liganden dar (J. Dueber et al., Nat. Biotechnol. 2009, 27, 753-759) . In einer weiteren bestimmten Ausführungsform werden sogenannte Einzeldomänenantikörper und deren korrespondierende Antigene verwendet (R. H. J. van der Linden et al., Biochimica et Biophysica Acta 1999, 1431, 37-46). In einer weiteren bestimmten Ausführungsform werden sogenannte makrozyklische Wirt-Gast-Wechselwirkungen zur Verknüpfung der katalytisch aktiven Proteine (6) verwendet. Ein Ausführungsbeispiel ist die Verwendung eines an die katalytisch aktiven Proteine fusionierten FGG (phenyalanine-glycine-glycine) Peptidmotivs und die Verwendung von Cucurbit[8]uril (D. H. Nguyen et al., Angew Chem Int Edit. 2010, 49, 5, 895-898).

In einer anderen Ausführungsform werden in Schritt A) katalytisch aktive Proteine (6) heterolog exprimiert, wobei für die heterologe Expression Bakterienzellen mit dem entsprechenden Expressionsvektor transformiert werden. Die Konnektoren (7) bzw. (8) werden hingegen nachträglich chemisch an die katalytisch aktiven Proteine (6) gebunden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Konnektoren hetero- oder homobifunktionelle Crosslinker zur kovalenten Verknüpfung der katalytisch aktiven Proteine (6), wie beispielsweise Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1- carboxylat, N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat, Dimethyladipimidat oder Dialdehyde, wie beispielsweise 1,5- Pentandial. Als homobifunktionelle Vernetzer werden Vernetzer mit zwei gleichen reaktiven Gruppen, als heterobifunktionelle Vernetzer solche mit zwei unterschiedlichen Gruppen bezeichnet .

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das katalytisch aktive Protein (6) ein Enzym, etwa ein stereoselektives Enzym, und/oder ein Enzym, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Oxidoreduktasen (EC 1.-.-.-), Transferasen (EC 2.-.-.-), Hydrolasen (EC 3.-.-.-), Lyasen (EC 4.-.-.-), Isomerasen (EC 5.-.-.-), Ligasen (EC 6.-.-.-) und Translokasen (EC 7.-.-.-). Die Nummer der Enzymkommission (EC-Nummer) ist ein numerisches Klassifikationsschema für Enzyme, das auf den von ihnen katalysierten chemischen Reaktionen basiert, (https://www.enzyme-database.org/).

Beispiele für im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Enzyme sind Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydro-genase (BsGDH), Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD), Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P), Streptomnyces sp. (S)-imine reductase (GF3546), Halomonas elongata amine transaminase (HEWT).

Im erfindungsgemäßen Verfahren umfassen die katalytisch aktiven Proteinschäume (10) ein katalytisch aktives Protein (6) oder mehrere katalytisch aktive Proteine (6) mit unterschiedlichen Reaktionsspezifitäten.

In einer Ausführungsform zur Herstellung eines Mono- Enzymschaums ist das katalytisch aktive Protein (6), das mit dem Konnektor (7) fusioniert ist, identisch mit dem katalytisch aktiven Protein (6), das mit dem Konnektor (8) fusioniert ist. Mono-Enzymschaum bedeutet im erfindungsgemäßen Verfahren, das der katalytisch aktive Proteinschaum (10) nur ein katalytisch aktives Protein (6) enthält.

In einer Ausführungsform zur Herstellung eines Bi-Enzymschaums werden in Schritt D) unterschiedliche katalytisch aktive Proteine (6) über die Konnektoren (7) und (8) miteinander verknüpft, indem in Schritt A) ein katalytisch aktives Protein (6) mit dem Konnektor (7) fusioniert wird und ein davon verschiedenes katalytisch aktives Protein (6) mit dem zum Konnektor (7) komplementären Konnektor (8) fusioniert wird (Methode a). Bi-Enzymschaum bedeutet im erfindungsgemäßen Verfahren, das der katalytisch aktive Proteinschaum (10) zwei verschiedene katalytisch aktive Proteine (6) enthält.

In einer weiteren Ausführungsform zur Herstellung eines Bi- Enzymschaums oder eines Multi-Enzymschaums werden mehrere zueinander orthogonale Konnektor-Paare verwendet (Methode b). Multi-Enzymschaum bedeutet im erfindungsgemäßen Verfahren, das der katalytisch aktive Proteinschaum (10) mindestens drei verschiedene katalytisch aktive Proteine (6) enthält.

Orthogonale Konnektor-Paare bedeutet im erfindungsgemäßen Verfahren, dass ein erstes Konnektor-Paar, umfassend die zugehörigen Konnektoren (7) und (8), spezifisch miteinander kuppelt und dass mindestens ein zweites Konnektor-Paar, umfassend die jeweils zugehörigen Konnektoren (7) und (8), ebenfalls spezifisch miteinander kuppelt, ohne dass eine Kreuzkupplung des ersten und des mindestens zweiten Konnektor- Paars stattfindet. Brune et al. beschreiben beispielsweise zwei orthogonale Konnektorenpaare SpyTag/SpyCatcher und SnoopTag/SnoopCatcher , die zur Herstellung synthetischer Nanopartikel mit verschiedenen Antigenen eingesetzt werden. Hierbei bildet die SpyCatcher-Domäne eine Isopeptid-Bindung mit der SpyTag-Domäne durch spontane Amidierung, die SnoopCatcher-Domäne bildet hingegen eine Isopeptid-Bindung mit der SnoopTag-Domäne durch eine Transamidierung (K. D. Brune et al., Bioconjugate Chem. 2017, 28, 1544-1551; D. Hatlem et al., Int. J. Mol. Sei. 2019, 20, 2129).

Zur Herstellung eines Bi-Enzymschaums unter Einsatz zweier orthogonaler Konnektor-Paare wird ein katalytisch aktives Protein (6) über ein erstes Konnektor-Paar, umfassend die zugehörigen Konnektoren (7) und (8), miteinander gekuppelt und ein zweites katalytisch aktives Protein (6) über ein zweites zum ersten Konnektor-Paar orthogonales Konnektor-Paar, umfassend die jeweils zugehörigen Konnektoren (7) und (8), miteinander gekuppelt (Methode b).

Zur Herstellung eines Multi-Enzymschaums unter Einsatz mindestens dreier orthogonaler Konnektor-Paare werden mindestens drei verschiedene katalytisch aktive Proteine (6) mit dem jeweiligen Konnektor (7) bzw. (8) fusioniert, wobei die jeweiligen Konnektoren (7) und (8) jeweils ein Konnektor- Paar bilden. Beispielsweise wird zur Herstellung eines drei verschiedene katalytisch aktive Proteine (6) enthaltenden Multi-Enzymschaums ein erstes katalytisch aktives Protein (6) über ein erstes Konnektor-Paar, umfassend die zugehörigen Konnektoren (7) und (8), miteinander gekuppelt, ein zweites katalytisch aktives Protein (6) über ein zweites zum ersten Konnektor-Paar orthogonales Konnektor-Paar, umfassend die jeweils zugehörigen Konnektoren (7) und (8), miteinander gekuppelt und ein drittes katalytisch aktives Protein (6) über ein drittes zum ersten und zweiten Konnektor-Paar orthogonales Konnektor-Paar, umfassend die jeweils zugehörigen Konnektoren (7) und (8), miteinander gekuppelt. Für die Herstellung eines Multi-Enzymschaums, der mindestens 4 verschiedene katalytisch aktive Proteine (6) enthält, werden entsprechend weitere orthogonale Konnektor-Paare gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt.

Denkbar ist auch die Herstellung eines Multi-Enzymschaums durch die Kombination der Methoden a) und b), das heißt, es wird über ein erstes Konnektorpaar ein Heterodimer von katalytisch aktiven Proteinen (6) gebildet und über ein dazu orthogonales mindestens zweites Konnektorpaar wird ein mindestens zweites Heterodimer von katalytisch aktiven Proteinen (6) gebildet.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst in einem weiteren Schritt B) die Herstellung von katalytisch aktive Proteine enthaltenden Blasen. Diese Blasen werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einer strömungstechnischen Vorrichtung hergestellt .

In einer Ausführungsform umfasst die strömungstechnische Vorrichtung einen Blasengenerator. Für die Herstellung des Blasengenerators werden im erfindungsgemäßen Verfahren verschiedene Materialien, wie z.B. Metalle, Glas oder Polymere verwendet. Bevorzugt werden für die Herstellung des Blasengenerators Polydimethylsiloxan und Polymethyl- methacrylat eingesetzt. Um die Strukturen als fluidische Einheiten zu verwenden, müssen die Strukturen verschlossen werden. Die Struktur wird dabei entweder durch thermische Plasmaoxidation auf einen Glasobjektträger oder auf Polydimethylsiloxan gebondet. Alternativ wird eine Klebefolie zum Abdichten (z.B. aus Polyolefin) verwendet. Das erste Element des Blasengenerators (Figur 1) ist ein Einlass (1) für eine kontinuierliche Phase, die sich in zwei spiegelsymmetrische Pfade aufteilt. Diese treffen von beiden Seiten in einem 45° Winkel auf einen Einlasskanal für eine disperse Phase (2). Letztere entspricht dem Gas, aus dem die Blasen bestehen. Der Kanalquerschnitt kann dabei ein beliebiges Profil aufweisen. Der Kanal der dispersen Phase schneidet den Kanalquerschnitt der kontinuierlichen Phase in dessen Spiegelachse und generiert damit das funktionelle Element der flussfokussierenden Kreuzung (3). Beide Phasen treffen an der Kreuzung (3) aufeinander, an der die Gasphase durch die kontinuierliche Phase in einzelne Blasen abgetrennt wird. Die an der Kreuzung generierten Blasen fließen über den Auslasskanal (4) aus der Struktur in eine Reaktionskammer (5) (Figur 2). Die Reaktionskammer besteht aus einem gestreckten rechteckigen Kanal, der sich zu den Enden hin verjüngt, um eine Kontaktierung zur Flussaktuierung zu gewährleisten.

Um Blasen in der zuvor beschriebenen Struktur zu generieren, werden zwei nicht ineinander mischbare Phasen verwendet. Die Phase, die die Blase umhüllt, ist die kontinuierliche Phase, die Phase, aus der die Blase besteht, ist die disperse Phase. Als Phasen für die Blasengeneration können alle nur schwer miteinander mischbaren Kombinationen aus Gas - Flüssigkeit verwendet werden.

Als Gasphase wird im erfindungsgemäßen Verfahren ein beliebiges Gas, bevorzugt ein inertes Gas verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird als Gasphase Stickstoff verwendet.

Als kontinuierliche Phase wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine verwendet.

Die Lösung der katalytisch aktiven, mit Konnektoren fusionierten Proteine ist in einer Ausführungsform eine wässrige Lösung der katalytisch aktiven, mit Konnektoren fusionierten Proteine. Die wässrige Lösung umfasst gegebenenfalls Puffersysteme, wie zum Beispiel Citrat-, Acetat- oder Phosphat-Puffersysteme. Im erfindungsgemäßen Verfahren ist eine wässrige Lösung eine Lösung, in der H2O als Lösungsmittel zu > 99,9 Volumenprozent des Lösungsmittel anteils eingesetzt wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Lösung der katalytisch aktiven, mit Konnektoren fusionierten Proteine auch Lösungsmittelgemische aus H2O und organischen Lösungsmitteln, wie zum Beispiel Acetonitril, Ethanol, Methanol, Dimethylsulfoxid, Isopropanol. Der Volumenanteil des organischen Lösungsmittels im Lösungsmittelgemisch kann hierbei 0,1 - 99,9 Volumenprozent betragen. Die Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine, die solche Lösungsmittelgemische aus H2O und organischen Lösungsmitteln enthält, umfasst gegebenenfalls Puffersysteme wie zum Beispiel Citrat-, Acetat oder Phosphat-Puffersysteme.

In einer anderen Ausführungsform werden für die Lösung der katalytisch aktiven, mit Konnektoren fusionierten Proteine organische Lösungsmittel, zum Beispiel Acetonitril, Ethanol, Methanol, Dimethylsulfoxid, Isopropanol, verwendet, die einen Wasseranteil von weniger als 0,1 Volumenprozent haben.

In einer weiteren Ausführungsform können für die Lösung der katalytisch aktiven, mit Konnektoren fusionierten Proteine nicht-klassische Lösungsmittel eingesetzt werden, wie zum Beispiel ionische Flüssigkeiten, niedrig schmelzende eutektische Lösungsmittel oder super-kritisches CO2.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt die Konzentration der Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine je nach gewünschter Polymerisierungszeit zwischen 1 mM und 100 mM. Bevorzugt ist eine Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine mit einer Konzentration von 1 mM.

In einer bestimmten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Proteinlösungen der komplementären Bindungspartner in einem stöchiometrischen Verhältnis miteinander gemischt, inkubiert und an den Blasengenerator angeschlossen. Der Blasengenerator wird in dieser bestimmten Ausführungsform zuerst mit N2 Gas geflutet und konstant mit N2 Gas durchströmt. Im Anschluss wird die Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine mit einer konstanten Flussgeschwindigkeit in die mikrofluidische Einheit eingelassen und an der Kreuzungsdüse mithilfe des N2 Gases aufgeschäumt . Das aufgeschäumte Material wird am Auslass aufgefangen und direkt in eine Reaktionskammer (5) (Figur 2) überführt .

Die Blasen werden durch die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Proteine stabilisiert, was die kurzfristige Koaleszenz der Blasen verhindert.

In einer Aus führungsform werden der Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine Additive in geringen Mengen von 10 - 100 pmol/l zugesetzt. Additive sind im erfindungsgemäßen Verfahren Zusatzstoffe, die einen positiven Effekt auf die Herstellung der Blasen in Schritt B) und die Bildung des katalytisch aktiven Schaums (10) in Schritt D) haben. So werden die Blasen in Schritt B) beispielsweise durch die Zugabe von Additiven längerfristig stabilisiert. Beispiele für Additive sind im erfindungsgemäßen Verfahren Tenside, bevorzugt biokompatiblen Tenside, wie zum Beispiel Saponine, Lauryl Sulfobetaine, Rhamnolipide, Tween 20 und Triton X100. Die Geschwindigkeiten der kontinuierlichen und dispersen Phase werden über einen Druckgradienten Dr geregelt. Der Druckgradient Dr liegt im erfindungsgemäßen Verfahren für die kontinuierliche Phase zwischen hp_kontinuierlich = 10 mbar und hp_kontinuierlich = 1000 mbar, bevorzugt zwischen 300 und 360 mbar. Der Druckgradient für die disperse Phase liegt im erfindungsgemäßen Verfahren zwischen hp_dispers = 10 mbar und hp_dispers = 1000 mbar, bevorzugt zwischen 110 und 200 mbar. Wichtig ist, dass hp_kontinuierlich größer als hp_dispers ist.

Der Durchmesser, die Porengrößen und die Generierungsfrequenz der Blasen lassen sich präzise über die Geometrie der Kanäle, den verwendeten Druckgradienten und die Art der kontinuier lichen Phase einstellen.

Die Blasen werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einem Durchmesser von 5 - 1500 gm und einer Porengröße von 10 - 2000 gm hergestellt. In einer bestimmten Ausführungsform werden Blasen mit einem Durchmesser von 200 - 300 pm erzeugt. Die Porengrößen der so generierten Blasen liegen bei 50 - 1200 pm, bevorzugt bei 250 - 310 pm.

In einer anderen bestimmten Ausführungsform werden Blasen mit einem Durchmesser von 15 - 200 pm, bevorzugt von 30 - 80 pm erzeugt. Die Porengröße der Blasen liegt dann bei 15 bis 250 pm, bevorzugt 30 bis 100 pm.

Die so hergestellten, katalytisch aktive Proteine enthaltenden Blasen werden in eine Reaktionskammer (5) überführt. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Reaktionskammer (5) aus Polydimethylsiloxan oder Polymethylmethacrylat.

In der Reaktionskammer (5) findet eine Kupplung der katalytisch aktiven Proteine über die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten komplementären Konnektoren (7) und (8) zu einem katalytisch aktiven Proteinschaum (10) statt. Der so vernetzte Proteindünnfilm auf den Blasen des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) hat im erfindungsgemäßen Verfahren eine Schichtdicke von 0,1 - 200 gm. In einer bestimmten Ausführungsform beträgt die Schichtdicke der vernetzten Proteindünnfilme auf den Blasen 1 - 60 gm.

Der Proteinschaum wird in einer Ausführungsform nach der abgeschlossenen Vernetzungsreaktion in der Reaktionskammer (5) in Schritt D) in einem weiteren Schritt E) getrocknet.

Durch den Trocknungsprozess kann die Schichtdicke der vernetzten Proteindünnfilme auf den Blasen auf 1- 50 gm genau eingestellt werden. Weitere Vorteile der Trocknung des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) sind eine erhöhte mechanische Stabilität, eine bessere Lagerfähigkeit, eine höhere Langzeitstabilität gegen Degenerationsprozesse der im Proteinschaum enthaltenen katalytisch aktiven Proteine sowie eine monodisperse Verteilung der Poren und damit ein reproduzierbareres Endprodukt.

Dieser Trocknungsschritt E) erfolgt in einer Ausführungsform bei offener Reaktionskammer (5) bei Raumtemperatur. In einer besonderen Ausführungsform erfolgt die Trocknung bei offener Reaktionskammer (5) bei Raumtemperatur bei kontinuierlicher Luftkonvektion, um den Trocknungsprozess zu unterstützen.

Die Trocknungszeit bei offener Reaktionskammer (5) beträgt im erfindungsgemäßen Verfahren 30 min - 28 Tage. Bevorzugt ist eine Trocknungszeit von mindestens 2 h. Besonders bevorzugt ist eine Trocknungszeit von 2 - 28 Tagen, um die Stabilität und Aktivität des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) zu erhöhen (Figur 12).

Eine andere Ausführungsform der Trocknung ist, den Proteinschaum bei 30 °C in einem Inkubator bei kontinuierlicher Luftkonvektion zu trocknen. Die Trocknungszeit beträgt hierbei 30 min - 28 Tage. In einer bestimmten Ausführungsform beträgt die Trocknungszeit im Inkubator 30 min - 60 min.

In einer bestimmten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dient die Reaktionskammer (5) als Durchflussbioreaktor, indem mit dem in Schritt E) getrockneten, katalytisch aktiven Proteinschaum (10) mindestens ein Substrat (11) zu mindestens einem Produkt (12) umgesetzt wird (Figur 3). Hierbei wird das mindestens eine Substrat (11) als Flüssigkeitsstrom mit einer bestimmten Flussrate durch die Reaktionskammer (5) geleitet. Das in der Reaktionskammer (5) entstehende mindestens eine Produkt (12) befindet sich nach der Umsetzung im Austrittsstrom der Reaktionskammer (5) und wird am Auslass der Reaktionskammer (5) gesammelt.

In einer anderen Aus führungsform werden die katalytisch aktiven Proteinschäume (10) aus katalytisch aktiven Proteinen und Verbundmaterialien hergestellt, wobei die Proteine mehr als 5 % (w/w) des Trockenmaterials ausmachen. Verbund materialien sind im erfindungsgemäßen Verfahren Materialien, die aus zwei oder mehr Bestandteilen mit deutlich unterschiedlichen physikalischen oder chemischen Eigenschaften bestehen. In Kombination ergeben diese Bestandteile ein Material mit Eigenschaften, die sich von den einzelnen Komponenten unterscheiden, wobei die einzelnen Komponenten innerhalb der fertigen Struktur getrennt und unterscheidbar bleiben (https://www.twi-global.com/technical-knowledge/faqs /what-is-a-composite-material ). Beispiele für solche Verbundmaterialien sind DNA-Silica-Nanokompositmaterialien (Y. Hu et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 17269-17272), welche aus einem DNA Polymer bestehen und durch Silica- Nanopartikel (SiNP) mit Größen von typischerweise < 200 nm Durchmesser durch eine in homogener Lösung ablaufende biochemische Reaktion hergestellt werden. In einem weiteren Ausführungsbeispiel werden als Verbundmaterialien DNA-SiNP- Kompositmaterialien eingesetzt, die durch Einbau von Kohlenstoffnanoröhren (CNT) in ihren mechanischen Eigenschaften einstellbar sind und somit aus unterschiedlichen Anteilen von DNA, SiNP und CNT bestehen (Y. Hu et al., Nat. Commun. 2019, 10, 5522).

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Hybridmaterialien aus den katalytisch aktiven Proteinen und DNA-SiNP- Kompositmaterialien oder DNA-SiNP-CNT-Kompositmaterialien mit variierenden Anteilen von Silica-Nanopartikeln von 0 - 100 % und Kohlenstoffnanoröhren von 0 - 100 % hergestellt. Zur Verknüpfung der Materialien werden beispielsweise chlorohexyl- modifizierte Nukleinsäuren durch eine Polymerasereaktion in das DNA Polymer eingebaut und über ein selbstligierendes Protein, z.B. das sogenannte HOB Protein (Halo-based oligonucleotide binder protein) (K. J. Koßmann et al., Chembiochem. 2016, 17, 12, 1102-1106) mit dem Proteinmaterial verbunden .

Zum Aufbau katalytisch-aktiver DNA-Protein-Hybridmaterialien werden im erfindungsgemäßen Verfahren in Schritt A) die katalytisch aktiven Proteine (6) sowohl mit den Konnektoren (7) bzw. (8) als auch mit dem HOB Protein genetisch fusioniert. Somit können die katalytisch aktiven Proteine (6) sowohl über die komplementären Konnektoren (7) und (8) miteinander gekuppelt werden als auch gleichzeitig über das HOB-Protein beispielsweise an ein DNA-SiNP-Kompositmaterial gekuppelt werden.

Die Aufschäumung der katalytisch aktiven Proteine hat im erfindungsgemäßen Verfahren den überraschenden Effekt, dass die miteinander kuppelnden katalytisch aktiven Proteine bei der Aufschäumung nicht denaturieren, wie dies in der Regel für Enzyme bei mechanischen Belastungen durch Scherkräfte beobachtet wird.

Die eingesetzten Konnektoren (7) und (8) führen darüber hinaus zu einer stabilen Verbindung der Proteine in Form eines Schaums, in dem die Blasen nicht mehr koaleszieren. So können in den erfindungsgemäßen Proteinschaum (10) überraschend auch empfindliche Proteine, wie beispielsweise das Enzym Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P) verwendet werden, obwohl sich dieses Enzym bereits in homogener Lösung bei starkem Rühren rasch entfaltet und seine Aktivität verliert. Auch für weitere kata lytisch aktive Proteine (6), wie Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD), Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydro- genase (BsGDH), Streptomnyces sp. (S)-imine reductase (GF3546) und Halomonas elongata amine transaminase (HEWT) konnte gezeigt werden, dass die katalytische Aktivität in Form der entsprechenden katalytisch aktiven Proteinschäume (10) erhalten bleibt und die katalytische Produktivität gegenüber den entsprechenden monolithischen Enzymmaterialien (14) („all- enzyme hydrogels", siehe T. Peschke et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 17028-17032) erhöht ist (Figur 8).

Darüber hinaus zeigen die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen katalytisch aktiven Proteinschäume (10) einen unerwarteten Alterungseffekt, der die katalytische Aktivität dieser Schäume erhöht. Während sich im Schaumbildungsprozess die Blasen anfänglich zunächst nebeneinander anordnen und mehrere Blasenschichten (9) ausbilden, ist im weiteren zeitlichen Verlauf ein „Aushärten" der Proteinschäume zu beobachten, in dem sich die Proteine über Konnektoren auf molekularer Ebene miteinander definiert vernetzen. Während dieser Reifung der katalytisch aktiven Proteinschäume wird auch deren mechanische Festigkeit erhöht. Gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten „all-enzyme hydrogels" (T. Peschke et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 17028-17032) haben die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Proteinschäume (10) eine wesentlich größere Oberfläche, was beispielsweise vorteilhaft für den Einsatz als immobilisierte Katalysatoren ist.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren, Ausführungsbeispiele und Beschreibungen näher erläutert.

Alle dargestellten Merkmale und deren Kombinationen sind nicht nur auf diese Figuren und Ausführungsbeispiele und deren Ausgestaltungen begrenzt. Vielmehr sollen diese stellvertretend für weitere mögliche, aber nicht explizit als Ausführungsbeispiele dargestellte weitere Ausgestaltungen kombinierbar angesehen werden.

Figur 1 zeigt die schematische Darstellung eines Blasengenerators zur Herstellung von katalytisch aktive Proteine (6) enthaltenden Blasen. Über den Einlass (1) wird die Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren fusionierter Proteine (kontinuierliche Phase) in das System eingeführt, über den Einlass (2) ein Gas als disperse Phase. Beide Phasen treffen an der Kreuzung (3) aufeinander, an der die Gasphase durch die kontinuierliche Phase in einzelne Blasen abgetrennt wird. Diese fließen über den Auslass (4) aus der Struktur in eine Reaktionskammer (5) (Figur 2).

Figur 2 zeigt die schematische Darstellung der Reaktionskammer (5) zur flusskatalytischen Prozessierung des Proteinschaums. Figur 2a) zeigt eine isometrische Ansicht der Reaktionskammer. Figur 2b) zeigt die Seitenansicht und Figur 2c) die Aufsicht auf die Struktur. Um die Struktur fluidisch zu kontaktieren, verjüngt sich diese über eine Länge von 4 mm von der Kanalbreite von 3 mm auf 1 mm zu den Enden. Der Proteinschaum befindet sich in der 1 mm hohen, 3 mm breiten und 54 mm langen Reaktionskammer im getrockneten Zustand in einer dicht gepackten Kugelpackung.

Figur 3 zeigt schematisch den gesamten Prozess der Herstellung eines katalytisch aktiven Proteinschaums (10): Zunächst werden mit einem Konnektor (7) bzw. einem Konnektor (8) verbundene katalytisch aktive Proteine (6) als Lösung in den Blasengenerator (Figur 1) eingelassen. Die im Blasengenerator generierten Blasen werden über den Auslasskanal (4) in die Reaktionskammer (5) überführt. In der Reaktionskammer (5) sind schematisch die einzelnen Blasen dargestellt, die durch eine flüssige Phase getrennt sind, welche die katalytisch aktiven, mit den Konnektoren (7) bzw. (8) fusionierten Proteine enthält. Einzelne Moleküle der katalytisch aktiven Proteine werden über die zueinander komplementären Konnektoren (7) und (8) miteinander gekuppelt. Die Blasen ordnen sich zunächst nebeneinander an und bilden mehrere Blasenschichten (9). Im dann entstehenden Proteinschaum (10) verbinden sich Proteine durch die Konnektoren (7) und (8) in einer "Reifung", das heißt Eigenschaften, wie beispielsweise die mechanische Festigkeit, verändern sich mit der Zeit. Mit dem resultierenden Material kann beispielsweise ein Substrat (11) zu einem Produkt (12) umgesetzt werden.

Figur 4 zeigt Hochgeschwindigkeitsaufnahmen der reproduzier baren Generation von monodispersen Blasen, die mittels des Blasengenerators aus Figur 1 hergestellt wurden, und deren räumlichen Anordnung im Auslasskanal (4) in Abhängigkeit der angelegten Drücke. Der Druck der kontinuierlichen Phase wurde dabei konstant auf p = 330 mbar gehalten. Der Druck der dispersen Phase entspricht a) 80 mbar, b) 90 mbar, c) 100 mbar, d) 110 mbar, e) 130 mbar, f) 140 mbar, g) 150 mbar.

Ab einem Druck von ca. 110 mbar beginnen sich die Blasen nebeneinander anzuordnen. Durch die Druckerhöhung der dispersen Phase ist gleichzeitig eine Zunahme des Blasendurchmessers zu erkennen.

In Figur 5 ist die zeitabhängige Vernetzung des Proteinschaums mithilfe von Durchlichtmikroskopie dokumentiert. Zu Beginn sind monodisperse Schaumzellen zu erkennen, die über einen Zeitraum von 2 Stunden unter Raumtemperatur bei konstanter Evaporation des wässrigen Anteils teilweise koaleszieren und eine stabile Matrix ausbilden. Figur 5a) zeigt den Proteinschaum in der Reaktorkammer nach 12 Minuten. Die Blasen ordnen sich als hexagonal dicht gepackte Kepler-FCC (face centered cubic)-Kugelpackungen an. Figur 5b) zeigt einen Zwischentrocknungsschritt nach 60 Minuten. Nach Trocknung und damit Reduktion der Flüssigfraktion geht die Kugelpackung nach ca. 2 Stunden in eine Anordnung über, die einer Kelvin- BCC (body-centered cubic) Packung ähnelt (Figur 5c)).

Figur 6 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der Grenzflächen der getrockneten Proteinschaumatrix. Die Proteine wurden vor der Vernetzung mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Fluorescein-5-Isothiocyanat) gemischt, um die aus vernetzten katalytisch aktiven Proteinen bestehenden Grenzflächen sichtbar zu machen.

Figur 7 zeigt eine Aufnahme des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) mit einem konfokalen Laserscan-Mikroskop. An der obersten Schicht der Proteinschäume haben sich u.a. intakte Dünnfilme gebildet. Dunkle Bereiche zeigen die Lamellen zwischen den Blasen, helle Bereiche die Außenseite der Blasen, die mit einem vernetzten Protein-Dünnfilm bedeckt sind (Figur 7a)). Figur 7b) zeigt ein Detail einer Blase, bei der dieser dünne Film aufgrund äußerer Kräfte perforiert ist. Figur 7c) zeigt einen geschlossenen, intakten Dünnfilm.

Figur 8 veranschaulicht die Reaktorleistung verschiedener, katalytisch aktiver Proteinschaumsysteme. Dazu wurde die katalytische Produktivität der katalytisch aktiven Proteinschäume (10) am Beispiel von Enzymschäumen (13) unter Durchflussbedingungen in einem Mikroreaktor getestet und mit bereits publizierten monolithischen Enzymmaterialien (14) („all-enzyme hydrogels", siehe T. Peschke et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 17028-17032) verglichen (Beispiel 6). Zur Berechnung der spezifischen Raum-Zeit-Ausbeuten (engl. sSTY) wurde die jeweilige Substratumwandlung nach einer Stunde unter kontinuierlichem Betrieb des Reaktors ausgewertet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die spezifischen Raum-Zeit- Ausbeuten der Schaummaterialien (Enzymschäume (13)) die der dicht gepackten monolithischen Enzymmaterialien (14) bis zu 4- fach übertreffen. Die getesteten katalytisch aktiven Proteine sind ausgewählt aus Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD), Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydro- genase (BsGDH), Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P), Streptomnyces sp . (S)-imine reductase (GF3546), Halomonas elongata amine transaminase (HEWT).

Figur 9 zeigt die Stabilität des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) anhand der relativen Schaumhöhe in einer Küvette mit und ohne Zusatz von Additiven über einen Zeitraum von > 84 h. Als Additiv wurde 35,4 mM Saponin verwendet.

Figur 10 zeigt den katalytischen Umsatz des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) nach 48 h. Dabei weisen die mittels Tensid stabilisierten Proteinschäume (10) einen 20 % höheren katalytischen Umsatz auf als die nicht stabilisierten Proteinschäume (10).

Figur 11 zeigt Beispiele zur Herstellung der katalytisch aktiven Proteinschäume (10), die aus den Enzymen LbADH/BsGDH bestehen, welche mit den nicht kovalenten Protein/Protein Interaktionsdomänen SH3, PDZ und GBD und deren korrespondierenden Liganden genetisch fusioniert sind. Dabei wird die zeitabhängige Vernetzung des Proteinschaums mithilfe von Durchlichtmikroskopie dokumentiert. Zu Beginn sind monodisperse nasse, das heißt nicht getrocknete, Schaumzellen zu erkennen (obere Bilderreihe), die über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 30 °C in einem Inkubator unter konstanter Luftkonvektion getrocknet werden und eine stabile gleichmäßig vernetzte Matrix ausbilden (untere Bilderreihe).

Figur 12 zeigt den katalytischen Umsatz zum Zeitpunkt t = 30 h von Durchflussbioreaktoren in Abhängigkeit der Trocknungsdauer unter Verwendung des Enzymsystems LbADH/BsGDH, das entweder mithilfe des kovalenten Konnektorpaars SC/ST oder mithilfe des nicht-kovalenten Konnektorpaars der Protein/Protein Interaktionsdomäne SH3 und dem korrespondierenden Liganden verknüpft ist. Während bei einer Trocknungsdauer von zwei Tagen sowohl die kovalente als auch die nicht-kovalente Verknüpfung der Enzyme keine optimalen Umsätze generieren, bewirkt eine verlängerte Trocknung für 28 Tage eine signifikante, ca. 4-fache Verbesserung des katalytischen Umsatzes.

Die katalytisch aktiven Proteinschäume des erfindungsgemäßen Verfahrens können im Bereich der Biotechnologie, Biokatalyse und Mikrofluidik eingesetzt werden. Die Proteinschäume eignen sich insbesondere als trägerfreies, immobilisiertes Material für die Strömungsbiokatalyse, beispielsweise in Durchfluss- Bioreaktoren für kontinuierliche Produktionsprozesse.

Beispiele Beispiel 1:

Struktur und Funktion des Blasengenerators:

Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Blasengene rator (Figur 1) hat als erstes Element einen Einlass für die kontinuierliche Phase (1), die sich in zwei spiegelsymmetrische Pfade aufteilt. Diese treffen von beiden Seiten in einem 45° Winkel auf den Einlasskanal der dispersen Phase (2). Der Kanalquerschnitt ist im hier dargestellten Beispiel über eine Länge von 31,77 mm 400 gm x 100 pm und verjüngt sich kurz vor dem Zusammenführen der beiden Kanäle auf einer Länge 3,59 mm zu einem Querschnitt von 100 pm x 100 pm. Der Kanal der dispersen Phase schneidet den Kanalquerschnitt der kontinuierlichen Phase in dessen Spiegelachse und generiert damit das funktionelle Element der flussfokussierenden Kreuzung (3). Im hier dargestellten Beispiel hat die Kreuzung einen Querschnitt von 100 pm x 100 pm und eine Länge von 31,828 mm. Der vierte Kanal stellt den Auslasskanal (4) für die an der Kreuzung generierten Blasen dar. In dem hier gezeigten Beispiel hat er die Abmessungen 350 pm x 200 pm x 20,23 mm (BxHxL). Die senkrechten Ein- und Auslasskanäle haben einen Durchmesser von 800 pm. Die Ein- und Auslässe des Blasengenerators sind über spezielle pCTW (pchip- to-world)-Konnektoren verbunden. Die Abdichtungen zwischen Chip und Interface werden durch O-Ringe aus NBR 70 sichergestellt. Der pCTW-Konnektor besitzt auf der gegenüberliegenden Seite Anschlüsse für standardisierte Fittings und Schläuche, die wiederum mit den Präzision- Druckreglern verbunden sind.

Als Phasen für die Blasengeneration wurde Stickstoff als Gasphase und als kontinuierliche Phase eine wässrige Lösung katalytisch aktiver, mit den Konnektoren (7) bzw. (8) fusionierter Proteine verwendet. Die Konzentration der Proteinlösung lag in Abhängigkeit von der gewünschten Polymerisierungszeit zwischen 1 pM und 100 mM. Eine Konzentration der Proteinlösung von 1 mM erwies sich als gut geeignet. Die Geschwindigkeiten der kontinuierlichen und dispersen Phase wurden über einen Druckgradienten Dr geregelt. In diesem Beispiel wurde ein Druckgradient von Dr = 330 mbar experimentell für die hier gezeigte Blasengröße bestimmt. Für die Blasengenerierung lag der optimale Druckgradient für die disperse Phase bei Dr = 150 mbar.

Beispiel 2:

Erzeugung eines mikrofluidischen katalytisch aktiven Proteinschaums :

Der katalytisch aktive Proteinschaum wurde mithilfe des in Beispiel 1 und Figur 1 beschriebenen Blasengenerators hergestellt. Dazu wurde eine wässrige Lösung katalytisch aktiver, mit Konnektoren (7) fusionierter Proteine und eine wässrige Lösung katalytisch aktiver, mit komplementären Konnektoren (8) fusionierter Proteine in einem stöchiometrischen Verhältnis miteinander gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Lösung an den Blasengenerator angeschlossen. Der Blasengenerator wurde zuerst mit N2 Gas geflutet und konstant durchströmt. Im Anschluss wurde die Proteinlösung mit einer konstanten Flussgeschwindigkeit in die mikrofluidische Einheit eingelassen und an der Kreuzungsdüse (Kreuzung (3)) mithilfe des N2 Gases aufgeschäumt. Das aufgeschäumte Material wurde am Auslass aufgefangen und 100 pL direkt in eine angefertigte Polydimethylsiloxan-Reaktionskammer (5) überführt.

Beispiel 3:

Herstellung von katalytisch aktiven Proteinen mit genetisch fusionierter SpyCatcher bzw. SpyTag-Domäne (Tabelle 1) für die Polymerisation :

Für die heterologe Expression von 6 katalytisch aktiven, mit SpyCatcher bzw. SpyTag fusionierten Proteinen, ausgewählt aus Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD), Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydro-genase (BsGDH), Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P), Streptomnyces sp. (S)-imine reductase (GF3546) und Halomonas elongata amine transaminase (HEWT), wurde E. coli BL21 (DE3) mit dem entsprechenden Expressionsvektor mittels Hitzeschocktransformation transformiert. Die frisch transformierten E. coli-Zellen, die die proteincodierenden Plasmide tragen, wurden über Nacht auf LB-Agar-Platten mit 100 pg/ml Ampicillin bei 37 °C selektiert. Flüssigkulturen von 160 ml mit Ampicillin versetztem LB-Medium wurden aus Klonen der LB-Agar-Platten hergestellt und über Nacht für 14-18 Stunden bei 37 °C und 180 U/min in einem 500 ml Schüttelkolben kultiviert. 2 1 ampicillinhaltiges LB-Medium wurde 1:20 mit einer Übernachtkultur beimpft. Die Kulturen wurden bei 37 °C, 180 U/min bis zu einer OD600 von 0,6 kultiviert. Die Temperatur wurde anschließend auf 25 °C gesenkt, IPTG wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zugegeben und die Kulturen wurden weitere 16 Stunden inkubiert. Die Kulturen wurden gepoolt und die Zellen durch Zentrifugation (10000xg, 10 min) geerntet und in 60 ml Puffer A (50 mM NaH ₂ P0 ₄ , 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0) resuspendiert. Nach dem Aufschluss durch Ultraschall wurde das Zelllysat nach Zentrifugation (45000xg, 1 h) gewonnen, durch eine 0,45 pm Durapore PVDF-Membran (Steriflip, Millipore) filtriert und auf zwei in Reihe geschaltete HisTrap FF (5 ml) Ni-NTA-Säulen (GE Healthcare, Deutschland) geladen, die auf einem Äkta Pure Flüssigchromatographie-System (GE Healthcare, Deutschland) montiert waren. Die Säule wurde mit 100 ml Puffer A gewaschen und die 6xHis-getaggten Proteine wurden mit einem Gradienten von 100% Puffer A zu 100% Puffer B (50 mM NaH2PC>4, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazol, pH 8,0) über ein Volumen von 200 ml eluiert. Anschließend wurde der Puffer mit Vivaspin 10000 MWCO (GE Healthcare) gegen einen geeigneten Lagerpuffer ausgetauscht. Die genetischen Konstruktionen wurden mit der isothermen Rekombination (D. G. Gibson et al., Nat Methods. 2009, 6, 5, 343-345) unter Verwendung von Oligonucleotidprimern mit 30 bp (Basenpaaren) homologen Überlappungen durchgeführt. Nach dem Zusammenbau wurden die Reaktionsgemische mit dem Restriktionsenzym Dpnl behandelt, um alle verbliebenen Vektoren aus früheren PCR-Reaktionen zu entfernen, und dann in E. coli DH5 Zellen transformiert. Alle Plasmide wurden mit ZR Plasmid Miniprep-Classic (Zymo Research, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt und die Sequenz durch kommerzielle Sequenzierung (LGC genomics, Deutschland) verifiziert. Tabelle 1: DNA-Sequenzen für die heterologe Expression katalytisch aktiver, mit SpyCatcher bzw. SpyTag oder mit den nichtkovalenten Protein/Protein Interaktionsdomänen SH3, PDZ und GBD und deren korrespondierenden Liganden fusionierter Proteine (SC = SpyCatcher-Domäne; ST bzw. ST2 = SpyTag-Domänen; SH3-, PDZ- bzw. GBD-BD = SH3-, PDZ- bzw. GBD-Bindedomäne; SH3-, PDZ- bzw. GBD-L = SH3-, PDZ- bzw. GBD-Ligand. WO 2022/022850 PCT/EP2021/025233

GATGTTCGTGTGAATACCGTTCATCCGGGTTATATCAAAACACCGCTG

GTTGATGATCTGCCTGGTGCCGAAGAAGCAATGAGCCAGCGTACCAAA

ACCCCGATGGGTCATATTGGTGAACCGAATGATATTGCCTATATCTGT

GTTTATCTGGCCAGCAACGAAAGTAAATTTGCAACCGGTAGCGAATTT

GTTGTGGATGGTGGTTATACCGCACAGTAA

Beispiel 4:

In Beispiel 4 wurden monodisperse Blasen mittels des Blasengenerators aus Figur 1 unter Variation des Druckes der dispersen Phase hergestellt ((Figur 4). Der Druck der kontinuierlichen Phase wurde dabei konstant auf p = 330 mbar gehalten. Der Druck der dispersen Phase entsprach a) 80 mbar, b) 90 mbar, c) 100 mbar, d) 110 mbar, e) 130 mbar, f) 140 mbar, g) 150 mbar. Ab einem Druck von ca. 110 mbar begannen die

Blasen sich nebeneinander anzuordnen. Durch die Druckerhöhung der dispersen Phase war gleichzeitig eine Zunahme des Blasendurchmessers zu erkennen. Beispiel 5:

In Beispiel 5 wurde die zeitabhängige Vernetzung des Proteinschaums mithilfe von Durchlichtmikroskopie demonstriert. Zu Beginn der Vernetzungsreaktion waren in der Reaktionskammer (5) monodisperse Schaumzellen zu erkennen, die über einen Zeitraum von 2 Stunden unter Raumtemperatur bei konstanter Evaporation des wässrigen Anteils teilweise koaleszierten und eine stabile Matrix ausbildeten. Nach 12 Minuten Vernetzungszeit in der Reaktorkammer ordneten sich die Blasen als hexagonal dicht gepackte Kepler-FCC (face centered cubic)-Kugelpackungen an (Figur 5a). Nach einem Zwischentrocknungsschritt nach 60 Minuten (Figur 5b) ging die Kugelpackung nach 120 min in eine Anordnung über, die einer Kelvin-BCC (body-centered cubic) Packung ähnelte (Figur 5c).

Beispiel 6:

In Beispiel 6 wurde die katalytische Produktivität des katalytisch aktiven Proteinschaums (10) am Beispiel von Enzymschäumen (13) unter Durchflussbedingungen in einem Mikroreaktor getestet (Figur 8). Die Reaktorleistung wurde mit der Reaktorleistung bereits publizierter monolithischer Enzymmaterialien (14), den „all-enzyme hydrogels" (T. Peschke et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 17028-17032) verglichen (Figur 8). Zur Berechnung der spezifischen Raum-Zeit-Ausbeuten (sSTY) wurde die jeweilige Substratumwandlung nach einer Stunde unter kontinuierlichem Betrieb des Reaktors ausgewertet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die spezifischen Raum-Zeit-Ausbeuten (engl. sSTY) der Schaummaterialien (Enzymschäume (13)) die der dicht gepackten monolithischen Enzymmaterialien (14) bis zu 4-fach übertreffen (Figur 8). Die getesteten Proteine sind ausgewählt aus Enterobacter sp. phenacrylate decarboxylase (EsPAD), Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH), Bacillus subtilis glucose 1-dehydro-genase (BsGDH), Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (Gre2P), Streptomnyces sp . (S)-imine reductase (GF3546), Halomonas elongata amine transaminase (HEWT).

Unter Verwendung des Enzyms EsPAD wurde das Substrat p- Cumarsäure mit einer Substratkonzentration von 5 mM zu 4- Vinylphenol umgesetzt (E. Mittmann et al., Micromachines 2019, 10, 795). Unter Verwendung des Enzymsystems LbADH/BsGDH wurde unter Regenerierung des Kofaktors NADPH 5-Nitrononan-2,8-dion mit einer Konzentration von 5 mM zu den entsprechenden (R)- Hydroxyketonen und (R,R)-Diol umgesetzt (T. Peschke et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2018, 57, 52, 17028-17032). Unter Verwendung des Enzymsystems Gre2p/BsGDH wurde unter Regenerierung des Kofaktors NADPH 5-Nitrononan-2,8-dion mit einer Konzentration von 5 mM zu den entsprechenden (S)- Hydroxyketonen und (S,S)-Diol umgesetzt (P. Bitterwolf P. et al., Chemical Science 2019, 10, 9752). Unter Verwendung des

Enzymsystems GF3546/BsGDH wurde unter Regenerierung des Kofaktors NADPH 3,4-Dihydroisoquinolin mit einer Konzentration von 5 mM zu 1,2,3,4-Tetrahydroisoquinolin umgesetzt (P. Bitterwolf P. et al., Micromachines 2019, 10, 11, 783). Unter Verwendung des Enzyms HEWT wurde 4-Nitrobenzaldehyd mit einer Konzentration von 1 mM zu 4-Nitrobenzylamin umgesetzt.