以下、細胞として微生物を例にとり、本� ��明の最良形態を詳述する。尚、本発明の技� ��的範囲は本最良形態には何ら限定されず、� ��えば微生物以外の他の細胞(例えば動物細胞 や植物細胞)に本発明に係る単離方法を適用� �た場合でも、本発明の技術的範囲に属する� �とはいうまでもない。

 本法は、多種の微生物を含有する可能性� ��ある試料に対して培地その他の培養条件を� ��択適用し、同適用と同時又はその前後に細� ��肥大剤を加え、培養して目的とする微生物� ��単離する方法である。即ち、本法は、取得� ��希望する目的微生物との関係で、細胞肥大� ��及び培養条件を決定することにより、確実� ��当該目的微生物を容易かつ効率的に取得す� ��ことができる点を本質とする。

 本法を詳述すると、まず目的とする性質� ��持つ微生物を育成(生育)しやすい培地を作� �。次に有用な微生物が生息している可能性� �ある試料(例えば土壌)を入手し、微生物の肥 大作用を示す細胞肥大剤(例えば、細胞分裂� �止める抗生物質等の細胞分裂阻害剤)と共に� ��の試料の少量を培地に入れて培養を開始す� ��。一週間程度の後、細胞分裂阻害剤のため� ��この培地で生息可能な微生物は肥大して大� ��くなる。一方、この培地で育成不能な微生� ��の細胞は小さいままである。顕微鏡下で、� ��きい細胞の微生物のみをマイクロ・マニピ� ��レーションにより可能な限り1個の細胞を1� �の試験管に入れて培養し、増殖させると、� �的とする性質を持つ微生物株を得ることが� �来る。

 ここで、細胞肥大剤は、取得を希望する� ��生物との関係で当該細胞を肥大させる作用� ��有する限り特に限定されず、例えば、細胞� ��裂を止める抗生物質等の細胞分裂阻害剤を� ��げることができる。また、細胞肥大剤は、� ��得を希望する微生物との関係では、濃度が� ��い場合には当該微生物の殺菌剤として機能� ��、濃度が低くなると当該微生物の分裂機能� ��損なわせる細胞肥大剤として機能する(後者 が本発明にいう「細胞肥大剤」)。尚、当該� �胞肥大剤を用いると、例えば、通常の大き� �の3~4倍程度の長さ又は大きさになる。そし� �、細胞肥大剤が存在しない別環境に配され� �と、細胞肥大剤の影響が無くなり、通常通� �の細胞機能を発揮する(可逆的)。具体的には 、既知化合物(抗生物質、農薬等)が使用可能� ��あり、ナリジクス酸、ピペミド酸、ピロミ� ��酸、Novobiocin、Moxifloxacin、シプロフロキサシ ン(ciprofloxacin)、ベノミル、チオファネートメ チル、チアベンダゾール、フベリダゾール、 カルベンダゾール、グリセオフルビン、ペン シクロンが例示される。例えば、ナリジクス 酸は、グラム陰性菌、ピペミド酸とピロミド 酸とNovobiocinはグラム陽性菌に有効である。� �た、Moxifloxacinは桿菌に有効である。また、� �数の菌種に関して共通の性質を有すること� �判明している場合には、複数の細胞肥大剤� �組み合わせて使用してもよい。例えば、実� �例においては脱窒能を持つ菌(グラム陽性・� ��性菌どちらにも存在)の取得を目的とし、こ れら両方をカバーするために3種の抗生物質� �組み合わせて使用している。

 次に、使用する培地は、取得を希望する� ��生物に適合した培地を選択することが重要� ��ある。例えば、光合成を行う菌と行わない� ��を取得する場合には、グルコース等のエネ� ��ギー源のない培地(即ち無機的な栄養素のみ の培地)では光合成を行う菌のみが生育し、� �ルコースのようなエネルギー源を含む培地� �は光合成を行わない菌が生育する。尚、当� �者であれば、どのような微生物の取得を希� �するときにどのような培地を選択すればよ� �かは容易に判断可能である。参考までに、� �得を希望する微生物と使用される培地との� �例を表1に示す。

 ここで、細胞肥大剤の存在下での培養後� ��一個の肥大した微生物を分離取得する前に� ��当該培養後の微生物を予備分別処理に付し� ��もよい。当該操作により、一個の肥大微生� ��を分離取得する効率を大きく向上させるこ� ��が可能となる。また、当該予備分別処理の� ��で、一個の微生物を分離取得することがで� ��る場合もある。ここで、予備分別処理は、� ��に限定されず、例えば、濾過処理等のサイ� ��に基づく分別処理、遠心分離等の重さに基� ��く分別処理の他、フローサイトメトリー処� ��を挙げることができる。

 そして、当該培養の結果、肥大した一個� ��微生物を分離取得するに際しては、把持や� ��引といった物理力で一個の微生物を保持可� ��な保持器を使用することが好適である。当� ��保持器の好適例としては、キャピラリーで� ��個の微生物を吸引可能なマイクロ・マニピ� ��レーターを挙げることができる。ここで、� ��該キャピラリーは、ガラス製、鋼鉄製等で� ��ることが好適であり、かつ、内径が10~100μm� ��あり、30~80μmであることが好適である。こ� �で、「内径」とは、先端内径を意味し、顕� �鏡で確認可能である。ここで、図1は、マイ� ��ロ・マニピュレーター1を使用して肥大した 一個の微生物を保持する様子を示した図であ る。図に示すように、マイクロ・マニピュレ ーター1のキャピラリーホルダー1aは、本体部 に固定されており(図示せず)、油圧でXYZ方向� ��ミクロン単位で移動可能に構成されている� ��また、当該キャピラリーホルダー1aは、注� �筒1bと連結している。そして、当該注射筒1b� ��操作により、キャピラリーホルダー1a内は� �圧・加圧状態となり、これにより当該ホル� �ー内部に微生物が吸引・放出される。具体� �な微生物取得法を説明すると、図に示すよ� �に、培養後の試料をスライドグラス2上に載� ��た後、顕微鏡3で覗きながら試料中の肥大し た微生物を探す。この際、これまでの生きた 微生物のみを染色しての微生物一個取得法と 比較すると、微生物自体が巨大であるので発 見することが容易である。そして、このよう な肥大した微生物を発見した後は、顕微鏡を 覗きながらキャピラリーホルダー1aをXYZ方向� ��適宜操作し、キャピラリーホルダー1aの先� �部分にあるキャピラリー1cを当該肥大した微 生物に接触させ、注射筒1bを図中の矢印方向� ��操作すると、当該微生物がキャピラリー1c� �に吸引される。

 尚、前述のように、微生物自体が肥大して� ��るので発見は容易ではあるが、生きている� ��生物のみが染まる染色剤を組み合わせて使� ��すると、更に発見することが容易となる。� ��該染色剤は、生きている微生物のみが染ま� ��染色剤である限り特に限定されず、通常の� ��色剤や蛍光染色剤が使用可能である。ここ� ��、土壌のような固体中の微生物を得るため� ��は、蛍光染色剤を用いることが特に好適で� ��る。ここで、染色剤の好適例としては、エ� ��テラーゼ基質蛍光染色剤{CFDA-AM(5-carboxyfluores cein diacetate, acetoxymethyl ester)}を挙げること� �できる。その他、使用可能な蛍光染色剤の� �を表2に挙げる(Microbes and Environments vol.12, N o.2 41-56, 1997より抜粋)。
 

 また、液体中の微生物を得るに際しては� ��蛍光染色剤で無く通常の染色剤でも可能で� ��る。染色に用いられる色素(染色剤、染色薬 )としては、特に限定されず、よく知られて� �るものとしては、例えば、ビスマルクブラ� �ン、カーミン、クマシーブルー、クリスタ� �バイオレット、エオシン、フクシン、ヘマ� �キシリン、ヨウ素、マラカイトグリーン、� �チルグリーン、メチレンブルー、ニュート� �ルレッド、ナイルブルー、ナイルレッド、� �ーダミン、サフラニン、アリザリンレッドS� ��アルシアンブルー等を挙げることができる� ��これらは、それぞれ細胞や組織の異なった� ��分に反応・集中し、それらの性質の違いは� ��定の部位を明らかにする事に役立つ。

 加えて、採取した試料にもよるが、その� ��まの状態では微生物同士が相互に連結して� ��たり凝集している場合がある(土壌試料では 経験上90%程度はこの状態)。この場合、これ� �微生物叢から一個の微生物を切り離したり� �る必要がある。当該切り離しに際しては、� �イフ及び/又は針を用いると効率が良いこと� ��見出した。

 そして、マイクロ・マニピュレーターで� ��個の微生物を取得した後は、所定の培地に� ��種し、所定期間(例えば1~5週間)培養して増� �させる。このように、完全に一種類である� �故に、細胞(例えば微生物)の種間の競争が無 く、競争に弱い種類の細胞(例えば微生物)を� ��殖させることが可能になる。

 次に、図2を参照しながら、本法における 目的微生物の取得プロセスパターン例を挙げ ることとする。尚、ここでは、理解の容易上 、試料中に存在する微生物が「菌A」~「菌D」 の4種類であり、使用される培地が「培地イ� �及び「培地ロ」の2種類であり、使用される� ��胞肥大剤が「細胞肥大剤α」及び「細胞肥� �剤β」の2種類である、簡単なモデルを例に� �り説明する。また、図中、培地に関する「� �」は、対象となる菌の生育に適した培地で� �ることを意味し、培地に関する「×」は、対 象となる菌の生育に不適な培地であることを 意味し、細胞肥大剤に関する「○」は、使用 濃度においては対象となる菌に対して細胞肥 大作用を示す薬剤であることを意味し、細胞 肥大剤に関する「×」は、使用濃度において� ��対象となる菌に対して毒(殺菌剤)となる薬� �である(この場合は死滅又は弱体化)か、或い は対象となる菌に対して作用しない薬剤であ る(この場合は通常通り細胞分裂)ことを意味� ��る。

 まず、図2中の例1は、使用する細胞肥大� �の種類を固定した状況で、複数種類の培地� �連続的に適用することにより、最終的に菌C� ��単離する例である。ここで、まず第一回培� ��においては、菌A~菌Cに対して細胞肥大作用� ��示す細胞肥大剤αの存在下、菌A~菌Cの選択� �地イが使用されている。この場合、菌A~菌C� �、当該培地の栄養で増殖・肥大する。他方� �菌Dは、培地が不適合で栄養不足のため、増� ��することなく死滅又は弱体化する。特に、� ��胞肥大剤αが毒として作用する場合には、� �Dは死滅する。このように、第一回培養にお� ��ては、菌A~菌Cが選択される。次に、第二回� ��養においては、菌A~菌Cに対して細胞肥大作� ��を示す細胞肥大剤αの存在下、菌C~菌Dの選� �培地ロが使用されている。この場合、菌C~菌 Dは、当該培地の栄養で増殖し得るが、これ� �の内、菌Cは細胞肥大剤αに適合しているの� �肥大する一方、菌Dは細胞肥大剤αに適合し� �いないので増殖するものの細胞は相対的に� �さいままである(加えて、菌Dは、第一回培養 において不適応培地に適用されていたので、 休眠等して生存している菌が仮に存在してい たとしても、当該菌数は減少しているか弱体 化している)。このように、第二回培養にお� �ては、菌Cが選択される結果、菌Cのみを単離 することが可能となる。

 ここで、例1においては、菌Cを確実に取� �するため、各培養工程において細胞肥大剤� �使用している。しかしながら、最終工程(例1 では第二回培養)で細胞肥大剤を使用する限� �は、理論上、その途中の培養工程の一部又� �すべてにおいて細胞肥大剤を使用しなくと� �よい。例えば、例1の変更例として、例1の第 一培養工程において、細胞肥大剤αを使用し� ��い例を示す。このように、理論的には、第� ��培養工程で培地イにより菌A~菌Cが選択され� ��が、菌Dは休眠又は死滅する。またこれらの 菌には肥大剤を適用しない。第二培養工程で は、培地ロにより菌Cと菌Dが生育できるが、� ��Dは既に死滅しているので菌Cのみが選択さ� �、最終的に肥大剤αにより菌Cのみが肥大す� �。

 次に、例2は、使用する培地を固定した状 況で、複数種類の細胞肥大剤を連続的に適用 することにより、最終的に菌Cを単離する例� �ある。ここで、まず第一回培養においては� �菌A~菌Cに適合した培地イの存在下、菌A~菌C� �対して肥大作用を示す細胞肥大剤αが使用さ れている。この場合、菌A~菌Cは、当該培地の 栄養で肥大する。他方、菌Dは、培地が不適� �で栄養不足のため、肥大することなく死滅� �は弱体化する。特に、細胞肥大剤αが毒とし て作用する場合には、菌Dは死滅する。次に� �第二回培養においては、菌A~菌Cに適合した� �地イの存在下、菌C~菌Dに対して肥大作用を� �す細胞肥大剤βが使用されている。この場合 、菌A~菌Cは、当該培地の栄養で増殖し得るが 、これらの内、菌Aと菌Bは、(1)当該細胞肥大� ��βが毒として作用する菌については、死滅� �は弱体化し、(2)当該細胞肥大剤βが毒として 作用しない菌については、肥大することなく 細胞分裂を行う(即ち、相対的に小さいまま)� ��そのため、残る菌Cのみが、当該培地で更に 肥大する結果、菌Cのみを単離することが可� �となる。

 次に、例3は、使用する培地と細胞肥大剤 とを絞込み、より少ない回数(本例では一回)� ��菌Cを単離する例である。ここで、培地とし ては、菌A~菌Cの選択培地イを採用する。他方 、細胞肥大剤としては、菌C~菌Dに対して肥大 作用を示す細胞肥大剤βを採用する。このよ� ��に、まず、選択培地イを採用した場合、菌A ~菌Cは、当該培地の栄養で増殖し得る。他方� ��菌Dは、培地が不適合で栄養不足のため、増 殖することなく死滅又は弱体化する。更に、 細胞肥大剤βを採用した場合、菌C~菌Dは肥大� ��能であるが、前述のように、菌Dは、培地が 不適合で栄養不足のために増殖することなく 死滅又は弱体化しているので、菌Cのみが、� �該培地で肥大する。その結果、菌Cのみを単� ��することが可能となる。

 次に、本法を用いての応用例を説明する� ��まず、本法は、バイオレメディエーション� ��有用である。バイオレメディエーションと� ��、微生物等の働きを利用して汚染物質を分� ��・無害化することによって、土壌・地下水� ��の環境汚染の浄化・修復を図る技術である� ��この汚染物質の分解・無害化に係る微生物� ��発見を効率的に行うことができる。更に、� ��れら方法は、新薬を生み出す素となる微生� ��の発見にも有用である。特に、放線菌は医� ��品の素として重要な多くの有用物質を作る� ��とが知られている。したがって、新種の放� ��菌を探すことは重要である。そこで、放線� ��のみを生育させる培地に放線菌が含まれて� ��る土壌等を入れて、分裂阻害剤を入れて微� ��物を生育させると放線菌のみが肥大する。� ��こから一個の放線菌の細胞を本法で得て培� ��すると、未知のものも含めて高い効率で多� ��の放線菌を入手することができる。