Substanzgemischen kultiviert wurden, wobei das Präpa- rat eine erhöhte CD44-Expression dieser Zellen auf- weist. An die so vorbehandelten Zellen wird dann Hya- luronsäure gebunden.

Diese Zellpräparate dienen der medizinischen Behand- lung und/oder kosmetischen Anwendung. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des Präparates.

Die Arthrose beginnt mit einer initialen Schädigung des Knorpelgewebes aufgrund verschiedener Ursachen.

Dabei tritt neben einer Reduktion der Anzahl intakter Chondrozyten auch eine reaktive Synovialitis auf, welche ihrerseits sowohl zu pathologischen Verände- rungen der Synovialflüssigkeit u. a. zur Abnahme der Konzentration und des Molekulargewichtes Hyaluronsäu- re führt, sowie die Freisetzung von Entzündungsmedia- toren bewirkt. Dies führt zu einer sekundären Knor- pelschädigung und damit letztendlich zur Arthrose, welche neben dem Knorpelgewebe auch alle anderen Ge- lenkstrukturen betrifft. Es ist bekannt, dass intra- artikulär applizierte Hyaluronsäure zur Verbesserung der Gelenkbeweglichkeit, zur Schmerzreduktion, zur Hemmung der Entzündungsprozesse und unter in vitro Bedingungen zur Steigerung der Chondrozyten-Proli- feration führt (K. Kawasaki et al. (1999) Hyaluronic acid enhances proliferation and chondroitin sulfate synthesis in cultured chondrocytes embedded in colla- gen gels. J Cell Physiol. 179 : 142-148 ; D. Wohlrab et al. (2000) Unterschiede in der Reaktion humaner Chondrozyten auf verschiedene Hyaluronsäurepräparate. hylan news. 2 : 2-5).

Die therapeutische Effektivität intraartikulär appli- zierter Hyaluronsäure ist von mehreren Faktoren ab- hängig. Bedingt durch die erhebliche Molekülgröße der Hyaluronsäure (1-6xlO6Da) muss diese mehrfach ge- spalten werden, bevor sie den intraartikulären Raum verlassen und ab-bzw. in Knorpelgewebe eingebaut werden kann. Diese Spaltungsprozesse nehmen in Abhän-

gigkeit der Molmasse der Hyaluronsäure Stunden bis mehrere Tage in Anspruch. Dieser Prozess wird auch wesentlich durch die Fähigkeit von Chondrozyten ge- steuert, über Rezeptoren Hyaluronsäure zu binden, wo- durch für Hyaluronsäure im Vergleich zu anderen, nie- dermolekularen Substanzen (wie z. B. Lokalanästheti- ka) eine verlängerte intraartikuläre Verweildauer nachzuweisen ist.

An der Oberfläche der Zellmembran von Chondrozyten werden die Matrixrezeptoren CD44 und/oder Integrine exprimiert. Beide Rezeptorfamilien spielen in der Ho- möostase des Gelenkknorpels eine zentrale Rolle. Ins- besondere CD44 Rezeptoren, ein sehr variables und multifunktionelles Glykoprotein, wurde als der we- sentlichste Zelloberflächenrezeptor für Hyaluronsäure erkannt (Proteins 39 (2000) 103-111). Der CD44-Rezep- tor ist an der Oberfläche der Zellmembran vieler vi- taler humaner Zellen lokalisiert. Er ist ein Hyalu- ronsäure-bindendes, membraninterkalierendes Glycopro- tein, welches mit Zytoskelettproteinen interaktiert.

Es ist sowohl an der intrazellulären Signalweiterlei- tung als auch an einer Zell-Zell bzw. Zell-Matrix- Interaktion beteiligt. Der genaue Mechanismus dieser Vorgänge ist bisher nicht vollständig bekannt. CD44 besitzt eine hohe Affinität zur Hyaluronsäure. Gerin- gere Affinitäten bestehen auch für Chondroitinsulfat und Heparansulfan.

Das CD44-Gen ist auf dem Chromosom 11 lokalisiert. Es besteht aus 20 Exons, davon werden immer 10 expri- miert (CD44H). Die anderen 10 kodieren extrazelluläre

Regionen (genannt vl-v10). Diese werden als unter- schiedliche Splicevarianten bezeichnet. CD44-Isofor- men sind in unterschiedlichen humanen Gewebearten (z. B. Tonsillen, Schilddrüse, Brust, Prostata, Cer- vix, Ösophagus, Epithel, Haut) nachgewiesen worden.

Auch an der Zellmembran humaner Chondrozyten wurde bereits der CD44-Rezeptor nachgewiesen. Die CD44- Expression der Chondrozyten im hyalinen Knorpelgewebe ist eine wesentliche Voraussetzung für die Bindung von Hyaluronsäure, wobei die Intensität der Hyaluron- säurebindung von der Anzahl, der Aktivierung und In- tensität der Expression entsprechender Rezeptoren ab- hängig ist Die im Knorpelgewebe gebundene Hyaluron- säure ist in der Lage, die entsprechenden Funktionen als Matrixbaustein zu erfüllen.

Die chemische Struktur der Hyaluronsäure (Hyaluronan) entspricht der Formel Ungeachtet der positiven klinischen Erfahrungen mit hochmolekularer Hyaluronsäure bzw. deren Salzen (Mol- masse > 1x106 Dalton), ist die Kenntnis über den Wirkmechanismus bei der Aufrechterhaltung der Homö- ostase des Gelenkknorpels unvollständig. Der bisheri-

ge Wissenstand weist intraartikulär applizierte Hya- luronsäure als ein Schmier-und Gleitmittel aus.

Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass Hyaluronsäure intraartikulär entzündungshemmende Eigenschaften be- sitzt. Die bisherigen Ergebnisse die mit hochmolkula- rer Hyaluronsäure bzw. deren Salze erzielt wurden, sind jedoch in Bezug auf Regeration der Gelenkstruk- turen nicht befriedigend.

Somit bestand die Aufgabe, intraartikulär, intradis- cal, subcutan oder intracutan anwendbare Zellpräpara- te zur Verfügung zu stellen, um eine verbesserte Re- generation von Gelenkstrukturen, insbesondere des Ge- lenkknorpels und/oder Gelenkfunktion und/oder Entzün- dungshemmung durch Hyaluronsäure und/oder deren Sal- ze, verglichen mit der alleinigen Substitution der Hyaluronsäure, zu ermöglichen. Eine weitere Aufgabe besteht darin, ein geeignetes Verfahren zur Herstel- lung eines derartiges Präparates anzugeben.

Die Aufgabe wird in Bezug auf das Zellpräparat durch die Merkmale des Patentanspruches 1 und in Bezug auf die Verwendung durch die Merkmale des Anspruches 15 gelöst. Das Verfahren zur Herstellung des Zellpräpa- rates ist durch die Merkmale der Ansprüche 19 bis 21 gekennzeichnet. Die Unteransprüche geben vorteilhafte Weiterbildungen an.

Erfindungsgemäß wird somit ein Zellpräparat zur the- rapeutischen und/oder kosmetischen Anwendung beim Menschen und/oder Tier vorgeschlagen, das humane oder

tierische Zellen enthält, die unter Zusatz einer die CD44 Expression dieser Zellen aktivierenden Substanz bzw. Substanzgemisch kultiviert wurden, wobei das Zellpräparat eine erhöhte CD44 Expression dieser Zel- len aufweist. Dieses Zellpräparat zeigt ausgezeichne- te Bindungseigenschaften für Hyaluronsäure, dessen Salze und/oder Fragment.

Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass ein derartiges Zellpräparat, das intraartikulär, intra- discal, subcutan oder intracutan angewendet werden kann, eine deutlich verbesserte Regeneration von Ge- lenkstrukturen verglichen mit der Hyaluronsäure und/oder dessen Salze zeigt.

Für das erfindungsgemäße Zellpräparat sind grundsätz- lich alle humanen oder tierischen Zellen geeignet.

Bevorzugt sind die Zellen autologen, allogenen oder xenogenen Ursprungs. Der Erfinder konnte zeigen, dass es dabei besonders bevorzugt ist, wenn die Zellen Chondrozyten, Keratinozyten, Fibroplasten und/oder Meniskuszellen sind. Die benutzten Zellen können aus Gewebe isoliert oder durch Differenzierungsvorgänge aus anderen Zellsystemen z. B. Stammzellen oder Fibroblasten erhalten werden.

Besonders bevorzugt ist es dabei, wenn im Falle von Chondrozyten diese aus dem Knorpelgewebe isoliert wurden. Im Falle von Keratinozyten ist es günstig, wenn diese aus der Epidermis isoliert werden. Wenn Meniskuszellen eingesetzt werden, können diese aus dem Meniskusgewebe isoliert werden. Selbstverständ-

lich können die vorstehend beschriebenen Zellen auch durch Differenzierungsvorgänge aus anderen Zellsyste- men z. B. aus Stammzellen oder Fibroblasten erhalten werden.

Erfindungsgemäß umfasst die Erfindung bei der Hyalu- ronsäure auch dessen physiologisch verträgliche Salze sowie Spaltprodukte dieser Verbindungen. Die Erfin- dung schließt selbstverständlich auch Ausführungsfor- men ein, bei denen die Hyaluronsäure und die Spalt- produkte gemeinsam eingesetzt werden.

Es hat sich weiter gezeigt, dass es vorteilhaft ist, wenn der Anteil an der oder an den Verbindungen aus- gewählt aus Hyaluronsäure, den physiologisch verträg- lichen Salzen der Hyaluronsäure sowie den Spaltpro- dukten dieser Verbindungen von 0, 001 bis 5,0 Gew. -% bezogen auf die gesamte galenische Formulierung be- trägt.

Beim erfindungsgemäßen Zellpräparat ist es bevorzugt, wenn die Zellen Chondroitin sind. Selbstverständlich kann das Zellpräparat zusätzlich noch Chondroitinsul- fat sowie Spaltprodukte dieser Verbindungen enthal- ten. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sieht vor, dass beim Zellpräparat eine oder mehrere Be- standteile des physiologischen Knorpels (beispiels- weise Glukosaminglykane oder Proteoglykane) enthalten sind. Auch ist es bevorzugt, wenn eine oder mehrere Substanzen mit Radikalfängereigenschaften enthalten sind. Beispiele hierfür sind Tocopherol oder Flavo- noide. Weitere Substanzen die das Zellpräparat ent-

halten kann, sind eine oder mehrere Substanzen mit steroidale oder corticosteroidale Wirkung, eine oder mehrere nicht steroidale Antiphlogistika (auch nicht steroidale Antirheumatika), eine oder mehrere Analge- tika, eine oder mehrere Substanzen mit hemmender Wir- kung auf die Prostaglandinsynthese, insbesondere Li- poxygenasehemmer, Cyclooxygenasehemmer, Cyclooxygena- sehemmer und Phospholipase A2-Hemmer, eine oder meh- rere wachstumsstimulierende oder wachsstumsregulie- rende Substanzen sogenannte Wachstumsfaktoren, eine oder mehrere Vitamine, eine oder mehrere Antioxidan- tien und/oder eine oder mehrere Substanzen mit was- serbindenden Eigenschaften.

Als die CD44-Expression von Zellen, insbesondere Chondrozyten aktivierende Substanz wird bevorzugt mindestens ein Lokalanästhetikum oder Derivate dieser Verbindung eingesetzt.

Das erfindungsgemäße Zellpräparat kann an und für sich in allen bekannten gängigen Formulierungen be- reitgestellt werden. So ist es bevorzugt, das Zell- präparat in Form einer Matrix, einer Lösung, einer Suspension, einer Emulsion, einer Paste, einer Salbe, eines Gels, eine Creme oder einer Lotion oder eines Sprays anzuwenden.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des vorstehend beschriebenen Zellpräparats zur therapeu- tischen und/oder kosmetischen Anwendung beim Menschen und/oder Tier.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des vor- stehend beschriebenen Zellpräparats zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zur Herstellung ei- nes Arzneimittels zur intraartikulären, intradisca- len, subcutanen, intracutanen oder epicutanen (to- pisch) Anwendung.

Bevorzugt ist es dabei, wenn das Zellpräparat zur Be- handlung von degenerativen Erkrankungen menschlicher oder tierischer Gelenke angewendet wird.

Nachfolgend sind einige spezifische Verwendungen von ausgewählten Zellpräparaten angegeben. die Verwendung von einer oder mehrere Verbindun- gen ausgewählt aus humanen Chondrozyten oder an- deren humanen oder tierischen Zellen, Hyaluron- säure, den physiologisch verträglichen Salzen der Hyaluronsäure sowie den Spaltprodukten die- ser Verbindungen und eine die CD44 Expression von Chondrozyten aktivierende Substanz oder Sub- stanzgemischen, bevorzugt ein Lokalanästhetikum oder mehreren Lokalanästhetika oder den Deriva- ten dieser Verbindungen zur Herstellung eines intraartikulär, intradiscal, subcutan oder intracutan anwendbaren Zellpräparates, die Verwendung von einer oder mehrere Verbindun- gen ausgewählt aus humanen Chondrozyten oder an- deren humanen oder tierischen Zellen, Hyaluron- säure, den physiologisch verträglichen Salzen der Hyaluronsäure sowie Spaltprodukten dieser

Verbindungen und von einer die CD44 Expression von Chondrozyten aktivierende Substanz oder Sub- stanzgemisch zur Steigerung der humanen und/oder tierischen Chondrozytenproliferation, die Verwendung von einer oder mehrere Verbindun- gen ausgewählt aus humanen Chondrozyten oder an- deren humanen oder tierischen Zellen, Hyaluron- säure, den physiologisch verträglichen Salzen der Hyaluronsäure sowie Spaltprodukten dieser Verbindungen und von einem Lokalanästhetikum oder mehreren Lokalanästhetika oder den Deriva- ten dieser Verbindungen zur Veränderung der CD44-Rezeptorexpression die Verwendung von einer oder mehrere Verbindun- gen ausgewählt aus humanen Chondrozyten oder an- deren humanen oder tierischen Zellen, Hyaluron- säure, den physiologisch verträglichen Salzen der Hyaluronsäure sowie Spaltprodukten dieser Verbindungen und von einem Lokalanästhetikum oder mehreren Lokalanästhetika oder den Deriva- ten dieser Verbindungen zur Stabilisierung und/oder Regeneration von einzelnen oder mehre- ren Gelenkstrukturen, insbesondere des Gelenk- knorpels und der Menisken, die Verwendung von einer oder mehrere Verbindun- gen ausgewählt aus humanen Chondrozyten oder an- deren humanen oder tierischen Zellen, Hyaluron- säure, den physiologisch verträglichen Salzen der Hyaluronsäure sowie Spaltprodukten dieser

Verbindungen und von einem Lokalanästhetikum oder mehreren Lokalanästhetika oder den Deriva- ten dieser Verbindungen zur Verbesserung der Ge- lenkbeweglichkeit, die Verwendung von einer oder mehrere Verbindun- gen ausgewählt aus humanen Chondrozyten oder an- deren humanen oder tierischen Zellen, Hyaluron- säure, den physiologisch verträglichen Salzen der Hyaluronsäure sowie Spaltprodukten dieser Verbindungen und von einem Lokalanästhetikum oder mehreren Lokalanästhetika oder den Deriva- ten dieser Verbindungen zur Hemmung von Entzün- dungsprozessen, die Verwendung von einer oder mehrere Verbindun- gen ausgewählt aus humanen Chondrozyten oder an- deren humanen oder tierischen Zellen, Hyaluron- säure, den physiologisch verträglichen Salzen der Hyaluronsäure sowie Spaltprodukten dieser Verbindungen und von einem Lokalanästhetikum oder mehreren Lokalanästhetika oder den Deriva- ten dieser Verbindungen zur Verbesserung der Schmerzreduktion.

Die Anwendung des erfindungsgemäßen Zellpräparates kann sowohl am Menschen als auch an Tieren erfolgen.

Die erfindungsgemäßen Zellpräparate können sowohl in der Human-und in der Veterinärmedizin angewendet werden. Die Anwendungsgebiete der erfindungsgemäßen Zellpräparate betreffen die Therapie, Prophylaxe und/oder Metaphylaxe von Gelenkknorpel-, Knochen-und

Knorpelknochendefekten, Meniskus-und Bandscheibenlä- sionen sowie andere Knorpeldefekte (z. B. Nasen-und Ohrknorpel) auch unter kosmetischen Gesichtspunkten.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend beschriebenen Zellpräpa- rats. Erfindungsgemäß werden danach humane oder tie- rische Zellen unter Zusatz einer die CD44 Expression dieser Zellen aktivierenden Substanz bzw. Substanzge- misch hiervon kultiviert. Wesentlich ist nun, dass die CD44-Rezeptorexpression nur für eine bestimmte Zeit überproportional gesteigert wird. Es hat sich gezeigt, dass bei einer Zeitspanne für die Kultivie- rung der Zellen von 6 bis 15 Tage, bevorzugt 9 bis 11 Tage, ganz besonders bevorzugt nach 10 Tagen die CD44-Rezeptorexpression innerhalb von 12 bis 72 Stun- den am besten ist. Innerhalb dieser Zeitspanne sind 24 bis 48 Stunden besonders günstig. Die Zellen be- sitzen während dieser Zeitspanne offensichtlich be- sonders viele freie Rezeptoren für CD44, so dass sie sich gut an die Hyaluronsäure binden.

Gegebenenfalls können weitere Wirk-Hilfe-und/oder Trägerstoffe zugesetzt werden um eine geeignete For- mulierung zu erhalten. Nachfolgend sind geeignete Verfahren angegeben.

Herstellung eines intraartikulär, intradiscal, subcutan oder intracutan anwendbaren Zellpräpa- rates, wobei man humane Chondrozyten oder andere humane oder tierische Zellen, eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus Hyaluronsäure, den

physiologisch verträglichen Salzen der Hyaluron- säure sowie den Spaltprodukten dieser Verbindun- gen und eine die CD44 Expression von Chondrozy- ten aktivierende Substanz oder Substanzgemischen gegebenenfalls mit weiteren Wirkstoffen, Hilfs- und/oder Trägerstoffen in ein geeignetes Zell- präparat bringt.

Herstellung eines intraartikulär, intradiscal, subcutan oder intracutan anwendbaren Zellpräpa- rates, wobei man humane Chondrozyten oder andere humane oder tierische Zellen, eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus Hyaluronsäure, den physiologisch verträglichen Salzen der Hyaluron- säure sowie den Spaltprodukten dieser Verbindun- gen und eine die CD44 Expression aktivierende Substanz bzw. Substanzgemischen und über den pH- Wert der Formulierung eine optimale Bindung der Zellen an Hyaluronsäure bzw. der Hyaluronsäure an die Zellen und/oder den physiologisch ver- täglichen Salzen der Hyaluronsäure und/oder den Spaltprodukten dieser Verbindungen erreicht.

Die Erfindung soll an einem konkreten Beispiel erläu- tert werden, ohne sie darauf zu beschränken :

Beispiel 1 : Beeinflussung der CD44-Rezeptorexpression humaner Chondrozyten durch Lidocain Herstellung Lidocainhydrochlorid (Universitätsapotheke der Mar- tin-Luther-Universität Halle-Wittenberg) lag primär in Pulverform vor. Dieses wurde in entsprechender Menge in RPMI-Medium (Seromed, Berlin) gelöst, sodass eine Endkonzentration von 0,1 mmol/1 Lidocain vorlag.

Anschließend erfolgte die Sterilfiltration. Die Sub- stanzzugabe zur Zellkultur erfolgte beim letzten Me- diumwechsel am 10. Kulturtag.

Präparation des biologischen Materials Die Untersuchungen erfolgten an humanen Chondrozyten, welche aus arthrotisch verändertem Kniegelenksknorpel isoliert wurden. Das Knorpelgewebe entstammte den bei der Implantation von Knietotalendoprothesen resizier- ten femoralen Gelenkflächen. Es wurde ausschließlich arthrotisch verändertes Knorpelgewebe von drei ver- schiedenen Patienten ohne bekannte relevante Nebener- krankungen, insbesondere ohne rheumatoide Arthritis, verwandt.

Die intraoperativ gewonnenen Knochen-Knorpelfragmente wurden zunächst in steriles L15 Medium (Seromed, Ber- lin) als Transportmedium überführt. Anschließend er- folgte unter sterilen Bedingungen die Ablösung des Knorpelgewebes vom subchondralen Knochen mittels

Skalpell sowie eine scharfe Durchtrennung des Gewebes in ca. lmm3 große Stücke. Die enzymatische Isolierung der Chondrozyten aus den Knorpelstücken erfolgte mit- tels Pronase und Kollagenase A (Boehringer Mannheim) über eine Zeitspanne von 16 Stunden.

Versuchsbedingungen Die isolierten Chondrozyten wurden in Zellkulturfla- schen in RPMI-Medium (Seromed, Berlin) unter Zusatz verschiedener Antibiotika bei 37°C und 5% Kohlendi- oxid im Brutschrank als Monolayerkultur kultiviert.

Der Mediumwechsel erfolgte alle 2 Tage. Am 10. Kul- turtag erfolgte letzmalig ein Mediumwechsel. Hier er- folgte die Zugabe von Lidocain im Zellkulturmedium in einer Konzentration O/1 mmol/l. Zusätzlich wurde De- weils eine unbehandelte Chondrozytenpopulation als Kontrolle mitgeführt. Die Kulturdauer betrug 11,12 bzw. 13 Tage.

Versuchsdurchführung Der Nachweis des CD44-Membranproteins bei humanen Chondrozyten erfolgte 24,48 bzw. 72 Stunden nach Zu- gabe des Lidocains flowzytometrisch durch Vergleich mit der Isotypkontrolle (ms-IgG1-FITC, Mouse IgG1, DAKO Diagnostika GmbH, Mannheim). Dabei wurde die An- zahl der merkmalstragenden Zellen gegen die Fluores- zenzintensität des FITC-konjugierten CD44-Antikörpers (anti-CD44H-FITC, DAKO) aufgetragen.

Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Fig. 1 dar- gestellt.

Fig. 1 : Flowzytometrische Bestimmung der CD44- Rezeptorexpression humaner in vitro kultivierter Chondrozyten unter dem Einfluss von 0,1 mmol/1 Lidocain in Abhängigkeit von der Kulturdauer.

Zugabe von Lidocain am 10. Kulturtag.

(N=5) (# signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe (CD44), p<0,05)