La délivrance intracellulaire d'un principe actif spécifique trouve application dans de nombreux domaines allant de la biologie cellulaire à la médecine. En biologie cellulaire, l'introduction dans des cellules de gènes (transfection) d'ARNm ou d'ARNi, d'oligonucléotides antisens, de ribozymes, de peptides et de protéines peut être utilisée notamment pour l'étude de la régulation de l'expression de gènes. En médecine, ces techniques ont été développées pour la délivrance de protéines thérapeutiques, d'oligonucléotides antisens et ribozymes (thérapies antisens) et de gènes (thérapie génique) pour pallier une déficience métabolique ou à un désordre génétique. Ces techniques sont également utilisées en vaccination pour la délivrance d'antigènes peptidiques et protéiques et de vaccins à base d'ADN.

De nombreuses méthodes et composés ont déjà été proposés pour introduire des acides nucléiques dans des cellules. Il s'agit notamment de (i) la co-précipitation d'acide nucléique et de phosphate de calcium ou de dextran DEAE, (ii) l'utilisation de polymères cationiques substitués ou non par des ligands, ou encore (iii) l'utilisation de lipides cationiques qui forment des complexes avec des polynucléotides chargés négativement et facilitent leur passage au travers de la membrane cytoplasmique.

Parmi les lipides cationiques connus on peut notamment citer (i) les lipospermines telles que le 5-carboxyspermylglycine-dioctadécylamide (DOGS) et le trifluoroacétate de 2,3 diolyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-propanammonium fournie sous les dénominations commerciales respectives de Transfectam et LipofectamineTM ; (ii) le chlorure de N- [1- (2, 3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium (DOTMA) commercialisé en association avec un lipide neutre, la dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) sous la dénomination Lipofectin ; (iii) des lipopolylysines (Zhou et al., Biochem.

Biophys. Acta, (1991) 1065 : 8) ; (iv) des détergents à ammonium quaternaire, tels que le cétyltriméthylammonium ou le bromure de diméthyldioctadécyl-ammonium (DDAB),

commercialisé en association avec un lipide neutre sous la dénomination TransfectaceTM ; (v) des dérivés cationiques du cholestérol tel que le 3ß [N-(N', N'-diméthylaminométhane) - carbamoyl] cholestérol (DC-Chol) (Gao &. Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun.

(1979) : 280) ; (vi) des analogues métabolisables du DOTMA tels que le (1,2-dioleoyloxy- 3-triméthylammonio) propane (DOTAP) fourni par la société Avanti Polar Lipids ; (vit) des lipides cationiques triacylés tels que le O, O', O"-tridodécanoyl-N- (co- triméthylammoniododécanoyl)-tris- (hydroxyméthyl) aminométhane et ses analogues décrits dans W096/32102.

Ces réactifs sont notamment capables de former un complexe de charge avec un polynucléotide dans la mesure où ils sont porteurs d'une ou plusieurs charges positives, constituées par un ou plusieurs groupements amines protonés ou ammoniums localisés à l'extrémité hydrophile de leur tête polaire. Ils permettent de délivrer les polynucléotides au niveau des tissus de manière non spécifique.

Des méthodes de transfert ciblé ont aussi été proposées. Le principe de ces méthodes consiste soit dans l'incorporation d'un composé permettant le ciblage, tel qu'un glycolipide spécifique d'une lectine cellulaire particulière, dans les couches lipidiques de liposomes contenant un lipide cationique comme le DOGS (Remy et al., PNAS (1995) 92 : 1744) ; soit dans le couplage d'un composé permettant le ciblage avec un polymère cationique comme la polylysine (Wu & Wu, J. Biol. Chem. (1988) 263 : 14621 ; Wagner et al. PNAS (1990) 87 : 3410 ; Huckett et al. Biochem. Pharmacol. (1990) 40 : 253 ; Midoux et al.

Nucleic Acids Res. (1993) 21 : 871) ou la polyethylèneimine PEI (Diebold et al. J. Biol.

Chem. (1999) 274 : 19087).

Jusqu'à présent aucune des méthodes déjà connues ne permet une livraison cellulaire ciblée, basée sur une interaction directe et sélective entre le lipide cationique et un récepteur présent en grande quantité ou de manière spécifique à la surface des cellules-cible.

On a maintenant trouvé que le bromure de 2-propanaminium, N- [2- (acetyloxy) ethyl]-1, 3- bis (hexadecyloxy)-N, N-dimethyl-1, 3-dioxo- (aussi appelé 2Ci60Ac) permettait de transférer de manière préférentielle un composé porteur de charge négative tel qu'un polynucléotide ou un polypeptide dans des tissus riches en récepteurs acétylcholine telles que les tissus musculaires et certaines tumeurs.

La formule développée (0) de ce composé est la suivante :

Ainsi que l'on peut aisément s'en rendre compte, la charge positive de ce composé est un ammonium quaternaire situé à la jonction entre sa partie lipophile et sa tête polaire. De manière surprenante, cette charge positive reste néanmoins accessible pour la complexation de molécules polymériques porteuses de charges négatives, malgré l'encombrement stérique.

C'est pourquoi l'invention a pour objet une composition qui comprend un polynucléotide ou un polypeptide chargé négativement et un composé répondant à la formule (I) : dans laquelle : Ri et R2, identiques ou différents, sont des chaînes aliphatiques saturées ou insaturées contenant de 3 à 24 atomes de carbone ; et soit R3 répond à la formule (I') dans laquelle : X est un anion acceptable d'un point de vue pharmaceutique ; et (i) R4 et R5 représentent chacun un atome d'hydrogène ; et

R6 est de telle sorte que R3 constitue un radical peptidique comportant une séquence d'acides aminés qui est un ligand de ciblage ou un élément de marquage ; ou (ii) R4, R5 et R6 sont de telle sorte que R3 constitue un radical qui est un ligand de ciblage ou un élément de marquage ; soit R3 répond à la formule (I")-R7-R8 dans laquelle : R7 est un agent de liaison répondant à la formule (I"') dans laquelle : X est un anion acceptable d'un point de vue pharmaceutique ; et Rg et Rlo, identiques ou différents, représentent chacun (i) un atome d'hydrogène ou (ii) un radical méthyl, éthyl, propyl ou alkyl supérieur comportant de 1 à 22 atomes de carbone, substitué ou non, interrompu ou non par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, S et N ou par un ou plusieurs radicaux carbocycliques ou hétérocycliques, saturés, insaturés ou aromatiques ; et Ru représente (i) une liaison simple ou (ii) une chaîne aliphatique comportant de 1 à 22 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée, substituée ou non, saturée ou insaturée, interrompue ou non par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, S et N ou par un ou plusieurs radicaux carbocycliques ou hétérocycliques, saturés, insaturés ou aromatiques ; et est un ligand de ciblage ou un élément de marquage.

Aux fins de la présente invention, un composé répond avantageusement à la formule (I) dans laquelle Rl et R2 sont des chaînes aliphatiques de 8 à 18, de préférence de 12 à 16 atomes de carbone.

L'anion X présent dans les formules (I') et (I"') est avantageusement choisi parmi Br-, Cl-, I-et F- Par « ligand de ciblage » on entend un composé capable d'interagir de manière spécifique ou non spécifique (e. g. interaction hydrophobe ou électrostatique) avec un récepteur présent

dans un tissu, incorporé ou non dans une membrane cellulaire. Par « élément de marquage » on entend un composé facilement détectable dans un tissu, un organe ou une cellule par des techniques physico-chimiques préférentiellement basées sur des mesures de fluorescence ou de radioactivité.

Lorsque R3 répond à la formule (I') en constituant un radical peptidique, ce radical comprend une séquence reconnue par un récepteur de membrane, avantageusement de 3 à 15, de préférence de 3 à 10, de manière tout à fait préférée de 3 à 5 acides aminés. Les séquences d'acides aminés reconnues par des récepteurs (usuellement appelées « motifs ») sont généralement très courtes, e. g. de 3 à 5 acides aminés. Mais il est tout à fait possible que la séquence constituant le radical R3 contienne des acides aminés additionnels. A titre d'exemple de séquence reconnue par un récepteur membranaire, on cite (i) la séquence RGD, YIGSR ou leurs homologues capables de reconnaître des intégrines cellulaires comme la fibronectine ou la laminine (S. Zalipsky et al., Bioconjug. Chem. (1995) 6 : 705 et T. Nishiya & S. Sloan, Biochem. Biophys. Res. Commun., (1996) 224 : 242) ou (ii) HAV (His-Ala-Val), ligand des N-et E-cadherines des cellules neuronales, musculaires et épithéliales (J. Willems et al. FEBS Lett., (1995) 363 : 289).

A titre d'exemple de radical R3 répondant à la formule (I') sans être un radical peptidique, on cite des aminoglycosides tels que la galactosamine ou la glucosamine ; et le N, N- diméthylaminoethylacétate pour le ciblage de l'acétylcholine estérase et autres récepteurs à l'acétylcholine (F. Menger et D. Johnston Jr, J. Am. Chem. Soc. (1991) 113 : 5467). Ces ligands possèdent un groupement amine primaire, secondaire ou tertiaire leur permettant de réagir avec le dihexadecyl bromomalonate et ses analogues.

Lorsque le ligand d'un récepteur membranaire ne comporte pas de groupement amine (R8), il convient alors de le coupler au préalable à un agent de liaison porteur d'un groupement amine (R7) afin d'obtenir un dérivé R3 de formule (I"'). C'est en particulier le cas pour le NAD ou ses analogues, ligands du CD38 (NAD+ glycohydrolase) pour lequel la fonctionalisation a été décrite dans J. Salord et F. Schuber, Biochem. Biophys. Acta, (1988) 971 : 197. C'est aussi le cas pour le galactose et ses analogues, ligands du récepteur Gal/GaINAc présent à la surface des hépatocytes (i. e., le récepteur des asialoglycoprotéines) pour lesquels la fonctionalisation a été décrite dans A. Kichler et F.

Schuber, Glycoconj. J., (1995) 12 : 275.

Ainsi en pratique, il est possible d'utiliser tout type de ligand pour former un composé de formule (I). C'est pourquoi on incorpore par référence E. Forssen et M. Willis, Adv. Drug.

Del. Rev., (1998) 29 : 249, qui offre une liste plus exhaustive de ligands utiles aux fins de la présente invention.

L'élément de marquage peut être un composé qui permet de suivre le devenir de la composition dans un organisme ou une cellule. Il peut s'agir d'un composé porteur d'un radioélément tel que la tyramine qui se prête au radiomarquage par iodination à l'iode radioactif. La tyramine comporte un groupement amine et rentre ainsi dans la catégorie des radicaux R3 de formule (I'). Il peut s'agir aussi d'un chromophore tel qu'un fluorophore. A titre d'illustration, on cite la 5- (aminoacétamido) fluorescéine vendue par la société Molecular Probes, qui rentre aussi dans la catégorie des radicaux R3 de formule (I').

Sous un aspect particulier, une composition selon l'invention peut contenir deux composés de formule (I) l'un étant destiné au ciblage et à la délivrance, l'autre permettant de tracer le devenir de la composition dans l'organisme-hôte. Ainsi, une composition selon l'invention peut comprendre (a) un composé répondant à la formule (I) dans laquelle : Ri et R2 sont tels que précédemment définis ; et soit R3 répond à la formule (I') dans laquelle : X est un anion acceptable d'un point de vue pharmaceutique ; et (i) R4 et Rs représentent chacun un atome d'hydrogène ; et R6 est de telle sorte que R3 constitue un radical peptidique comportant une séquence d'acides aminés qui est un ligand de ciblage ; ou (ii) R4, Rs et R6 sont de telle sorte que R3 constitue un radical qui est un ligand de ciblage ; soit R3 répond à la formule (I") R7 R8 dans laquelle : R7 est tel que défini précédemment ; et Rg est un ligand de ciblage ; et (b) un composé répondant à la formule (I) dans laquelle : RI et R2 sont tels que définis précédemment ; et soit R3 répond à la formule (I')

dans laquelle : X est un anion acceptable d'un point de vue pharmaceutique ; et (i) R4 et Rs représentent chacun un atome d'hydrogène ; et R6 est de telle sorte que R3 constitue un radical peptidique comportant une séquence d'acides aminés qui est un élément de marquage ; ou (ii) R4, R5 et R6 sont de telle sorte que R3 constitue un radical qui est un élément de marquage ; soit R3 répond à la formule (I") R7 R8 dans laquelle : R7 est tel que défini précédemment ; et est un élément de marquage.

Les composés de formule (I) peuvent être obtenus selon la méthode de Menger & Johnston (supra) par réaction entre l'acide malonique et un excès d'alcool gras comprenant de 3 à 24, de préférence de 8 à 18, de manière tout à fait préférée de 12 à 16 atomes de carbone, pour former un diester malonique qui est, par exemple, bromylé ou fluoré en un diester bromomalonique ou fluoromalonique. Le diester bromo ou fluoromalonique est ensuite mis en contact avec ligand de ciblage ou un élément de marquage cellulaire comportant un groupement amine primaire, secondaire ou tertiaire capable de substituer l'atome de brome ou de fluor pour lier l'élément de ciblage (ou de marquage) sur le diester malonique via une amine secondaire ou tertiaire protonable ou via un ammonium quaternaire.

Aux fins de la présente invention, les composés de formule (I) peuvent être incorporés dans des liposomes, des micelles mixtes de lipides et de détergents, des microsphères ou microparticules lipidiques ou dans des émulsions huileuses. Cette incorporation s'effectue avantageusement avant mélange avec le polynucléotide ou le polypeptide. Selon des modes de réalisation particuliers, un composé de formule (I) peut être associé (i) à un lipide neutre tel que le cholestérol, une lécithine ou une phosphatidyléthanolamine pour former des

liposomes ; (ii) à un détergent tel que le Tween 80 pour former des micelles mixtes ; (iii) à une huile végétale ou animale métabolisable, comme par exemple le squalène ou l'huile de soja, au sein de microsphères lipidiques ou d'une émulsion huileuse. Les méthodes pour la préparation de ces formulations lipidiques sont connues par l'homme de métier et publiées dans la littérature ; par exemple dans Colloidale Drug Delivery Systems, 1994, Edited by Jörg Kreuter dans Drugs and the Pharmaceutical Sciences, vol. 66, James Swarbrick Eds, Applied Analytical Industries, Inc., Wilmington, North Carolina.

Selon un aspect particulier, l'invention a aussi pour objet une méthode de transfection ex vivo ou in vitro selon laquelle on met en contact des cellules eucaryotes en culture avec une composition selon l'invention.

Sous un autre aspect, l'invention a aussi pour objet l'usage d'un composé répondant à la formule (I) telle que définie précédemment, dans la fabrication d'un médicament contenant un polynucléotide ou un polypeptide à titre de principe actif ; le composé de formule (I) étant destiné à faciliter la pénétration du polynucléotide ou du polypeptide dans les cellules de l'individu ayant besoin d'un tel médicament. Ce médicament est avantageusement destiné à être administré par voie intramusculaire.

Aux fins de la présente invention, le polynucléotide peut être un polydeoxyribonucléotide (ADN) ou un polyribonucléotide (ARN). Son origine n'importe pas : naturelle or artificielle. Il peut être d'origine animale, humaine, végétale, bactérienne ou virale.

Sa fonction à titre d'agent thérapeutique peut être une fonction antisens venant contrôler l'expression d'un gène, sa transcription en ARN ou sa traduction en protéine dans une cellule-hôte. Il peut aussi agir en tant que ribozyme ou coder pour un polypeptide d'intérêt.

Sous un aspect particulier, le polynucléotide code de manière opérante pour un polypeptide d'intérêt pharmaceutique qui, lors de son expression dans la cellule-hôte, permet de pallier un disfonctionnement de l'organisme récepteur. Une composition selon l'invention est par conséquent utile en thérapie génique in vivo ou ex vivo.

Le polynucléotide peut aussi coder de manière opérante pour un polypeptide capable de générer une réponse immune à son encontre chez les humains ou les animaux. Un tel

polypeptide peut être spécifique d'un organisme pathogène (agent infectieux) ou d'un état tumoral (antigène-associé à une tumeur). Par conséquent, une composition selon l'invention trouve une application particulière dans le domaine des vaccins et de l'immunothérapie, notamment pour traiter ou prévenir des cancers ou des infections bactériennes ou virales.

Par « polypeptide » on entend tout enchaînement d'acides aminés quelle que soit sa taille.

Ainsi ce terme recouvre notamment les notions de peptide et de protéine.

Pour usage dans les domaines de la thérapie génique, des vaccins et de l'immunothérapie, le polynucléotide est avantageusement de l'ADN et de préférence, se présente sous forme de vecteur e. g., de vecteur plasmidique. Pour des raisons de sécurité, un tel vecteur doit être non-infectieux et ne pas se répliquer dans l'organisme-hôte. De plus, il ne doit pas être capable de s'intégrer de manière substantielle dans le génome de l'organisme-hôte. Dans un tel vecteur, la séquence d'ADN codant pour le polypeptide antigénique ou thérapeutique est placée sous le contrôle d'éléments assurant son expression dans l'organisme-hôte. A cet effet, le promoteur de la région précoce du génome du cytomégalovirus est d'un usage courant.

Tel que mentionné ci-dessus, une composition pharmaceutique selon l'invention peut être utilisée en thérapie génique in vivo ou ex vivo. C'est pourquoi, sous un autre aspect, l'invention a également pour objet une méthode pour traiter une maladie induite par l'absence ou la déficience d'un gène, méthode selon laquelle : (i) on administre une composition selon l'invention qui comprend un polynucléotide comportant un gène capable de corriger la maladie et un composé répondant à la formule (I) à un patient ayant besoin d'un tel traitement ; ou (ii) on collecte des cellules appropriées à partir d'un patient ayant besoin d'un tel traitement, on met ces cellules en contact avec une composition selon l'invention qui comprend un polynucléotide comportant un gène capable de corriger la maladie et un composé répondant à la formule (I), de manière à ce que les cellules soient transfectées et on réimplante les cellules transfectées chez le patient.

Une composition utile en thérapie génique met en jeu un polynucléotide comportant un gène thérapeutique i. e., un gène codant pour un polypeptide ayant un effet thérapeutique.

Ce polypeptide peut être homologue vis-à-vis de la cellule-cible (i. e. un polypeptide qui est normalement exprimé en l'absence de condition pathogène). Dans ce cas, l'expression du polypeptide suite à l'administration d'une composition selon l'invention, permet de surmonter une expression insuffisante ou l'expression d'un polypeptide inactif ou faiblement actif. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour une forme variante du polypeptide cellulaire qui possède une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le polypeptide peut être aussi hétérogène vis-à-vis de la cellule-cible et, par exemple, peut supplémenter ou modifier une activité aberrante ou déficiente.

En d'autres termes, l'invention a aussi pour objet l'usage combiné tel que décrit ci-dessus d'un polynucléotide codant pour un polypeptide capable de corriger une déficience génétique et d'un composé répondant à la formule (I), dans la fabrication d'un médicament destiné au traitement de cette déficience génétique.

Une composition selon l'invention peut aussi être utile dans le domaine de l'immunisation (e. g. de la vaccination) et de l'immunothérapie. Dans ce cas, la composition met en jeu un polynucléotide comportant une séquence codant pour un polypeptide antigénique qui peut être soit un polypeptide exprimé dans des conditions naturelles par un organisme pathogène (agent infectieux, tel qu'un virus ou une bactérie) ou un polypeptide de mammifère dont l'expression aberrante est caractéristique d'un état cancéreux. On parle respectivement d'antigène spécifique d'un agent infectieux et d'antigène associé à une tumeur.

En d'autres termes, l'invention a aussi pour objet l'usage combiné tel que décrit ci-dessus d'un polynucléotide codant pour un polypeptide spécifique d'un agent infectieux ou d'un cancer et d'un composé répondant à la formule (I), dans la fabrication d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie infectieuse ou d'un cancer.

Dans les traitements thérapeutiques in vivo, une composition selon l'invention peut être administrée par la voie la plus favorable au traitement, sans exclusion particulière. Une composition selon l'invention utile dans le domaine de l'immunisation ou de l'immunothérapie peut être administrée par n'importe quelle voie communément en usage dans ces domaines. Néanmoins, on indique que les voies qui permettent l'accès à des

cellules riches en récepteurs membranaires de l'acétylcholine sont tout particulièrement appropriées ; par exemple, la voie intramusculaire.

En général, la quantité de polynucléotide devant être administré dépend d'un grand nombre de facteurs, tels que la maladie elle-même, la nature du polynucléotide, e. g. ADN/ARN antisens ou ADN plasmidique, la force du promoteur du plasmide, l'activité biologique du polypeptide exprimé par le gène, la condition physique de l'individu ou de l'animal, i. a. du mammifère auquel la composition est destinée, la méthode d'administration et le type de formulation. En général, une dose efficace en prophylaxie ou en thérapie chez un adulte humain est comprise entre 10 ug et 5 mg, avantageusement entre 100 llg et 5 mg, de préférence entre 250 u. g et 3 mg. L'administration peut être réalisée en dose unique ou répétée par intervalles.

De manière alternative, un polynucléotide codant pour un polypeptide chargé négativement peut être remplacé par le polypeptide lui-même dans les compositions selon l'invention, à toutes fins prophylactiques ou thérapeutiques. Par « polypeptide chargé négativement » on entend un polypeptide caractérisé par un rapport global charges négatives/charges positives supérieur à zéro, à pH neutre. Un tel polypeptide doit être majoritairement constitué par des acides aminés acides.

Dans les compositions selon l'invention, le rapport des charges négatives apportées par le polynucléotide ou le polypeptide/charges positives apportées par le composé de formule (I) est avantageusement compris entre 0.1 et 100, de préférence entre 0.5 et 20.

Une composition selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle selon les directives en usage dans les domaines de la thérapie génique, des vaccins ou de l'immunothérapie et notamment par simple mélange des constituants en milieu aqueux.

Une composition contient un véhicule support ou diluant acceptable d'un point de vue pharmaceutique et peut être sous forme liquide ou solide e. g. lyophilisée. Si nécessaire, la forme solide peut être reconstituée en milieu liquide avant usage.

Les exemples suivants illustrent, de façon non limitative, quelques modes de mise en oeuvre de l'invention.

Exemple 1 On synthétise du bromure de 2-propanaminium, N- [2- (acetyloxy) ethyl]-1, 3- bis (hexadecyloxy)-N, N-dimethyl-1, 3-dioxo- selon la méthode de Menger & Johnston, Am.

Chem. Soc. (1991) 113 : 5467. Ce composé est appelé de manière courante le 2Cl60Ac.

On dissout 11.43 mg (15 moles) de 2Cl60Ac dans 500 gel de chloroforme dans un pilulier en verre et on évapore la solution sous un flux d'azote pour former un film lipidique sur les parois et le fond du pilulier. Le film lipidique formé est encore séché pendant 4 heures sous vide poussé puis réhydraté avec 2 ml d'eau désionisée. Après une nuit à 4°C, la suspension obtenue est soumise à sonication dans un bain à ultrasons à 55°C pendant 2-10 minutes pour former une suspension homogène de liposomes. Cette suspension de liposomes à 7.5 mM de 2Cl60Ac en eau est conservée à 4°C.

Exemple 2 On répète les étapes de l'exemple 1 en mélangeant au départ 11.43 mg de 2Cl60Ac et 22.3 mg de dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE ; 30 moles) dans 500 ni de chloroforme. On obtient une suspension de liposomes à 7.5 mM de 2Cl60Ac et 15 mM de DOPE en eau qui est conservée à 4°C.

Exemple 3 : Transfection du plasmide pCMV-pGal dans des cellules CHO à l'aide des liposomes préparés dans l'exemple 1 ou 2, comportant le 2Cl60Ac.

Les suspensions de liposomes obtenues dans les exemples 1 et 2 sont chacune diluées dans de l'eau désionisée pour atteindre une concentration de 0.747 mM de charges positives en vue de leur utilisation pour transfecter le plasmide pCMV-pGal dans des cellules CHO en culture selon la méthode décrite par Felgner et al., J. Tiss. Cult. Meth. (1993) 15 : 63.

Les cellules CHO sont mises en culture dans une plaque à 96 puits (10 000-30 000 cellules par puits) un jour avant l'essai de transfection.

On prépare des complexes pCMV-pGal-liposomes à différentes teneurs en ADN et en liposomes de la façon suivante : 1) Dilution de laformulation lipidique On distribue 66 u. l de milieu aMEM dans chaque puits de la première colonne d'une plaque à 96 puits (puits Al à H1) et 60 ! 11 dans tous les autres puits. On rajoute 54 p1 de la solution à 0.747 mM de charges positives de la formulation lipidique obtenue selon l'exemple 1 ou 2 dans chaque puits de la première colonne. On effectue ensuite une dilution en série de la formulation lipidique en transférant 60 1ll de chaque puits de la colonne 1 au puits correspondant de la colonne 2, puis 60 ul de chaque puits de la colonne 2 au puits correspondant de la colonne 3, et ainsi de suite jusqu'à la colonne 8 (puits A8-H8).

2) Dilution du plasmide pCMV-ßGal On réalise différentes dilutions de la solution plasmidique dans une seconde plaque à 96 puits contenant chacun 70 gl de milieu aMEM. On rajoute 70 u. d'une solution contenant 80 pg de pCMV-bGal/ml de milieu aMEM dans chaque puits de la première rangée de la plaque (puits A1-A8). On effectue ensuite une dilution en série de la solution plasmidique en transférant 70 u. de chaque puits de la première rangée au puits correspondant de la deuxième rangée, puis 70 p1 de chaque puits de la deuxième rangée au puits correspondant de la troisième rangée, et ainsi de suite jusqu'à la huitième rangée (puits H1-H8).

3) Formation des complexes ADN-liposomes et transfection.

Les complexes pCMV-pGal-liposomes possédant différentes teneurs en ADN et en liposomes sont obtenus en transférant 60 u. l de chaque puits de la plaque contenant les plasmides dans le puits correspondant de la plaque contenant les liposomes. Après 10 minutes d'incubation, 100 ul des complexes résultants sont transférés sur les cellules. Les cellules sont incubées à 37°C en atmosphère humide comportant 5 % de C02. Au bout de la cinquième heure de transfection, on ajoute aux cultures du sérum de veau foetal (SVF) (par addition de 50 p1 de aMEM contenant 30 % de SVF dans chaque puits contenant des cellules). Au bout de 24 heures de culture on ajoute encore 100 ul de aMEM contenant 10 % de SVF dans tous les puits contenant des cellules.

4) Révélation de la transfection L'efficacité de transfection est mesurée à 48 heures après lyse des cellules par le dosage de la bêta-galactosidase codée par le plasmide pCMV-pGal. Le dosage de l'enzyme est réalisé en utilisant de l'ONPG (ortho nitrophényl galactoside) comme substrat pour détecter et mesurer selon une méthode colorimétrique l'activité de la bêta-galactosidase fabriquée par

les cellules transfectées. La bêta-galactosidase transforme l'ONPG incolore en galactose et orthonitrophénol coloré en jaune (adsorption à 405 nm).

Les résultats obtenus sont représentés sur les tableaux ci-après où on indique, pour chaque puits, la densité optique lue à 405 nm.

Pour chacun des deux tableaux, les puits de la 9colonne correspondent à des témoins négatifs représentant le bruit de fond, alors que les puits de la 10ème colonne sont utilisés pour faire une gamme étalon de bêta-galactosidase de 400 ng d'enzyme/ml (puits A10) à 3. 125 ng/ml (puits H10).

Tableau 1 : résultats obtenus avec les liposomes de 2Cl6OAc de l'exemple 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 2µg ADN 0.117 0.113 0.170 0.156 0.156 0.127 0.130 0.133 0.218 3.227 B 1µg ADN 0.115 0.114 0.176 0.218 0.197 0.166 0.131 0.129 0.180 3.132 C 0. 5µg ADN 0.113 0.131 0.200 0.408 0.318 0.199 0. 142 0.126 0.154 2.144 D 0. 25µg ADN 0.111 0.113 0.157 0. 534 0.896 0.198 0.130 0.124 0.149 1.158 E 0. 1251lg ADN 0.124 0.113 0.199 0.484 0.903 0.300 0.133 0.151 0.153 0.700 F 0. 062 µg ADN 0.112 0.119 0.131 0.209 0.456 0.412 0. 166 0.128 0.175 0.478 G 0. 031 µg ADN 0.114 0.110 0.125 0. 160 0.208 0.197 0.140 0.117 0.206 0.359 H 0. 015 µg ADN 0.115 0.119 0.124 0.131 0.144 0.138 0.148 0.150 0.258 0.326 Nbre de nmoles de charges + 17 8. 5 4. 25 2. 13 1. 06 0. 53 0. 27 0. 13 Tableau 2 : résultats obtenus avec des liposomes de 2Cz6OAc/DOPE de l'exemple 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 2pgADN 0.221 0.560 2.616 1.595 0.606 0.348 0.171 0.152 0.231 3.279 B lggADN 0.155 0.308 1.558 1.149 0.481 0.328 0.187 0.161 0.186 3.204 C 0. 5µg ADN 0.164 0.399 1.352 1.973 0.546 0.214 0.173 0.151 0.171 2.192 D 0. 25µg ADN 0.159 0.651 1.840 2.116 1.121 0.321 0.206 0.200 0.166 1.140 E 0. 125pgADN 0.125 0.554 1.214 1.576 0.954 1.043 0.318 0.253 0.162 0.674 F 0. 062pgADN 0.132 0.323 0.423 0.817 0.982 0.960 0.462 0.250 0.175 0.484 G 0. 031 µg ADN 0.122 0.191 0.215 0.362 0.439 0.407 0.287 0.205 0.219 0.371 H 0. 015 µg ADN 0.123 0.135 0.153 0.190 0.207 0.206 0.180 0.189 0.270 0.345 Nbre de nmoles de charges + 17 8.5 4.25 2.13 1.06 0.53 0.27 0.13

Exemple 4 : Transfection du plasmide pCMV-Luc dans des cellules CHO à l'aide des liposomes préparés à l'exemple 1 ou 2, comportant le 2C16OAc.

Les liposomes de l'exemple 1 sont dilués dans du milieu aMEM de manière à obtenir des concentrations de 0.084 mM et 0.042 mM en 2Cl60Ac et les liposomes de l'exemple 2 sont dilués pareillement de manière à obtenir une concentration de 0.042 mM en 2C16OAc.

On prépare des complexes ADN-liposomes en ajoutant 40 ug de pCMV-Luc (soit env.

0.12 µmole de groupements phosphates anioniques) dilué dans 1 ml de milieu aMEM à 1 ml des suspensions de liposomes diluées en aMEM comme indiqué ci-dessus. Le rapport des charges cationiques sur anioniques au sein des complexes ADN-liposomes peut alors

être estimé à 0.7 pour les préparations à 0.084 mM en 2Cl60Ac et à 0.35 pour les préparations à 0.042 mM en 2Cl60Ac.

Après 10 minutes d'incubation, on dépose, en duplicats, lml des complexes formés sur des cellules CHO en culture à environ 40 % de confluence dans des boîtes de Pétri de 60 mm de diamètre. Au bout de 4.5 heures de transfection, 0.5 ml de milieu aMEM contenant 30 % de SVF est ajouté dans chacune des boîtes. On ajoute encore 1 ml de milieu aMEM contenant 10 % de SVF 24 heures après la transfection. L'efficacité de la transfection est appréciée à 48 heures, après lyse des cellules par le dosage de la luciférase codée par le plasmide pCMV-Luc. Le dosage de l'enzyme est réalisé selon la technique décrite par De Wet et al., Mol. Cell Biol. (1987) 7 : 725, en utilisant de la luciférine comme substrat pour détecter et mesurer par luminescence l'activité de la luciférase fabriquée par les cellules transfectées.

Les résultats sont exprimés dans le tableau 3 ci-dessous en activité luciférase par puits (RLU/10 secondes ; Moyenne de doublets).

Tableau 3 Agent transfectant Activité luciférase moyen. (RLU/10 sec. ) 2Cl6OAc 0.084 mM 439626 2Cl6OAc 0.042 mM 151514 2Cl6OAc/DOPE ; 0.042 mM en 2Cl6OAc 5579151 Exemple 5 : Influence de la présence d'acetylcoline estérase sur le pouvoir transfectant des liposomes préparés dans l'exemple 1 ou 2.

L'acetylcoline estérase est une enzyme capable de lier et d'hydrolyser l'extrémité acéthylcholine du 2Cl6OAc pour exposer la fonction alcool primaire de la choline à l'extrémité de la tête polaire du 2Cl6OAc. Il a été décrit, que suite à l'exposition de cette fonction alcool, la molécule de 2Cl6OAc se réorganise en éjectant une de ses chaînes grasses par attaque intramoléculaire de l'hydroxyle sur l'une des liaisons carbonyle de la molécule. Il se forme ainsi un dérivé à une chaîne grasse, capable de déstabiliser les bicouches des liposomes (Menger & Johnston, Jr, J. Am. Chem. Soc. (1991) 113 : 5467).

On s'attend donc à ce que l'acetylcoline estérase détruise les liposomes contenant le 2Ci60Ac et dénature les complexes formés entre le 2Cl60Ac et l'ADN, ce qui devrait se traduire par une diminution de l'activité de transfection.

Une solution stock d'acetylcoline estérase est préparée en dissolvant l'acetylcoline estérase type V-S de chez Sigma de manière à obtenir une solution d'enzyme à 10-5 M dans du tampon 25 mM en phosphate de sodium, pH 7.2, contenant 50 % (v/v) de glycérol.

L'enzyme est ensuite introduite à des concentrations croissantes de 0-10-9 M-10-8 M-10- 7 M dans le milieu de culture des cellules par dilution de la solution enzymatique stock dans le milieu de culture de ces cellules.

Deux situations différentes sont étudiées : 1) L'acétylcholine estérase à 0-10-9 M 10-8 M-10-7 M dans 1 ml de milieu de culture aMEM sans sérum est incubée avec les cellules CHO pendant les 30 minutes précédant la transfection puis le milieu contenant l'acetylcoline estérase est éliminé et remplacé par le milieu contenant les complexes ADN-liposomes. Le protocole de transfection se poursuit alors en absence d'enzyme comme dans l'exemple 3.

2) Après les 30 minutes de pré-incubation, le milieu de pré-incubation contenant les concentrations croissantes d'acetylcoline estérase n'est pas retiré mais dilué directement au demi avec 1 ml de milieu contenant les complexes ADN- liposomes. La transfection se poursuit alors comme dans l'exemple 3 mais en présence d'enzyme.

Dans les deux cas, l'efficacité de transfection est appréciée 48 heures après, comme dans l'exemple 3, et est exprimée en % de l'efficacité de transfection du contrôle (transfection réalisée dans les mêmes conditions que ci-dessus mais en absence d'acetylcoline estérase).

Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-après : [Acétylcholine Activité luciférase (% contrôle) estérase] dans le 2Cl6OAc 2Cl6OAc 2Cl6OAc/DOPE milieu en M 0.084 mM 0.042 mM 0.042 mM en 2C160Ae 0 (contrôle) 100 100 100 10- (pré-incubation) 90. 5 78. 6 73. 6 10-9 (pré-incubation + ND ND ND transfection) 10-8 (pré-incubation) 121 49. 7 55. 4 10-' (pré-incubation + 8.1 5. 145 transfection) 10-7 (pré-incubation) 32. 7 25.5 45 10-7 (pré-incubation + 6. 3 15. 7 113 transfection)

ND = Non Déterminé La diminution de l'activité de transfection en présence de concentrations croissantes d'acetylcoline estérase suggère que les complexes 2C160Ac-ADN sont dénaturés et montre que le lipide cationique est susceptible de lier un récepteur (ici l'acetylcoline estérase) même lorsqu'il est engagé dans un complexe avec un polynucléotide (ici le plasmide pCMV-Luc).

Lorsque le 2Cl6OAc est combiné à un excès de DOPE, l'activité de transfection des complexes ADN-liposomes parait moins sensible à la présence d'acetylcoline estérase soluble, les variations d'activité luciférase d'un facteur inférieur ou égal à 2, étant considérées comme non-significatives.

Exemple 5 : Transfection du plasmide pVR-Luc+ dans le muscle quadriceps de souris BALB/c à l'aide des liposomes préparés dans l'exemple 1 ou 2, comportant le 2Cl60Ac.

On réalise un transfert de gène marqueur in vivo en injectant des complexes ADN- liposomes directement dans le muscle quadriceps de souris. Dans cet essai on utilise le

plasmide pVR-Luc+ codant pour la luciférase et dont la construction a été décrite dans Haensler et al., Vaccine (1999) 17 : 628. Six jours après l'injection, on sacrifie les souris pour prélever les quadriceps et mesurer l'expression du plasmide pVR-Luc+ en dosant l'activité enzymatique de la luciférase produite après l'avoir libéré par broyage du muscle dans un tampon de lyse adéquat à l'aide d'un broyeur à billes. Les détails de ce protocole sont décrits dans Haensler et al. (supra). La teneur du muscle en luciférase est calculée en reportant l'activité enzymatique mesurée par chimioluminescence sur une courbe-étalon construite à partir de muscles quadriceps broyés en présence de quantités connues de luciférase pure commercialisée par Analytical Luminescence Labs, San Diego, CA.

Les formulations testées sont une formulation contenant des liposomes tels que ceux obtenus à l'exemple 1, une formulation contenant des liposomes tels que ceux obtenus à l'exemple 2, une formulation contenant un lipide cationique de l'art antérieur, le DC-Chol, les liposomes de DC-Chol ayant été préparés selon le même procédé et à la même concentration que les liposomes de l'exemple 1, et une formulation contenant le plasmide pVR-Luc+ nu, c'est-à-dire dépourvu d'agent complexant.

On prépare les complexes ADN-liposomes on rajoutant 500 u. l de suspension liposomique diluée au demi (0.373 mM en lipide cationique) ou au 1/lOème (0.075 mM en lipide cationique) sur 500 ftl d'eau désionisée contenant 200 ug de plasmide pVR-Luc+. Le mélange est incubé de 0.5 à 2 heures avant d'être injecté dans le quadriceps de souris BALB/c sous anesthésie à raison de 50 ßl (soit 10 ug d'ADN) par quadriceps. Le rapport des charges cationiques sur charges anioniques au sein des complexes ADN-liposomes est estimé à 0.3 pour les préparations à 0.373 mM en 2Cl6OAc et à 0.06 pour les préparations à 0.075 mM en 2CI60Ac. Chaque produit est testé sur un groupe de 3 souris. On injecte le produit dans les deux quadriceps de chacune des souris. Six jours après les injections, les quadriceps sont prélevés et traités séparément pour mesurer la quantité de luciférase produite. Les résultats moyennés sur 6 quadriceps sont présentés sur le tableau 5 ci-dessous en ng de luciférase par muscle. Formulation testée Prod. moyenne (n=6) de luciférase (ng/quadriceps) PVR-Luc nu (contrôle) 1. 7 PVR-Luc-2Cz60Ac (0.0373 mM) 5. 8 PVR-Luc-2Cl60Ac (0.075 mM) 6. 9 PVR-Luc-2Cl60Ac/DOPE (0.0373 mM 2. 0 en 2Cl60Ac) PVR-Luc-2Cl60Ac/DOPE (0.075 mM 4. 7 en 2C160Ac) PVR-Luc-DC-Chol (0.0373 mM en 1. 6 DC-Chol) PVR-Luc-DC-Chol (0.075 mM en 0. 9 DC-Chol)

Ces résultats indiquent que, contrairement aux agents de transfection à base de lipides cationiques de l'art antérieur (i. a., DC-Chol), qui inhibent généralement le transfert de gène lorsqu'on injecte l'ADN directement dans le muscle sous forme de complexes avec ces lipides cationiques, le 2Cl60Ac augmente de manière significative le transfert de gène dans le muscle. Ces résultats indiquent que les récepteurs à l'acéthylcholine et l'acetylcoline estérase présents en grande quantité dans les tissus musculaires peuvent participer activement au mécanisme de transfection en favorisant la rétention des complexes ADN- 2Cl6OAc dans le muscle et la libération d'ADN actif (non dégradé) de ces complexes.