PRETRAT AMIENTO DE CÉLULAS

Memoria descriptiva

Campo Técnico

La invención se relaciona al campo general de la biotecnología, y específicamente se relaciona al campo de la medicina regenerativa y a la manufactura de productos para terapia basados en células humanas (HCT/Ps, por sus siglas en inglés). Esta invención comprende una composición para el cultivo, expansión, preservación de células y/o pre-tratamiento de células en donde dicha composición es un medio, suplemento de medio y/o solución que comprende pterostilbeno, un antagonista del factor inhibidor de migración y un catión bivalente en combinación o por separado.

Estado del Arte

Actualmente, la terapia celular conforma un puente entre la investigación y la investigación clínica traslacional y constituye un avance respecto a la ingeniería de tejidos con el fin de reemplazar, regenerar y/o modificar células humanas, tejidos u órganos con el fin de recuperar la funcionalidad. Esta traslación está acompañada y fomentada por un número creciente de ensayos clínicos utilizando células madre, principalmente células madre mesenquimales (MSC, por sus siglas en inglés). Si bien el campo de la terapia celular ha avanzado vertiginosamente en diversas aplicaciones médicas, en su desarrollo existen diversos problemas técnicos que requieren mejores soluciones, que permitan por un lado abaratar los costos de estas tecnología, y hacerla además más eficiente y segura, de modo de poder ayudar a más personas y en nuevas aplicaciones, A continuación describiremos algunos de los problemas que persisten en la técnica actual que pueden ser solucionados o disminuidos con el medio, suplemento de medio o solución para el cultivo, expansión, preservación de células y/o pretratamiento de células de la invención.

Hasta ahora, la mayoría de los ensayos clínicos han utilizado MSC que se cultivan en medios que contienen suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés). Estos ensayos requieren una cantidad considerable de células y con el fin de evitar las complicaciones asociadas con el FBS (riesgo de transmisión de agentes infecciosos xenogénicos e inmunización), e¡ uso de suplementos alternativos o medios de cultivo libres de suero (serum free), y más aún libres de componentes animales (xeno free) es preferible y es altamente recomendado por los agentes reguladores [1 ].

Numerosos grupos han desarrollado composiciones de medios de cultivo libres de suero para el crecimiento y la expansión de MSC. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés) es un mitógeno celular potente y se ha informado que es un componente significativo del FBS que permite la proliferación celular in vitro [2 - 5]. Considerando este contexto, el Usado de plaquetas humanas (hPL, por sus siglas en inglés) se ha establecido como una alternativa adecuada al suero fetal bovino como complemento de medios de cultivo, permitiendo la proliferación eficiente de células madre humanas bajo condiciones libres de suero (SF, por sus siglas en inglés) en el contexto de la terapia celular e ingeniería de tejidos. Las plaquetas almacenan una serie de mediadores bioactivos, incluyendo quimlocinas y factores de crecimiento, tales como PDGF, factor de crecimiento transformante beta (TGF-b, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento similar a la insulina -1 (IGF-1 , por sus siglas en inglés), factor de crecimiento vascular (VEGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) entre otros [5 - 7]. No obstante las ventajas descritas, su uso tiene algunas desventajas asociadas, por ejemplo se debe utilizar en conjunto anticoagulantes como la heparina para prevenir la gelatinización de ios medios y se debe controlar las variaciones en las concentraciones de los factores de crecimiento que poseen, adicionalmente una desventaja importante es la baja disponibilidad de lotes de plaquetas para considerarlo como un suplemento de medio de cultivo consistente y escaiable. Por lo tanto, es deseable en la técnica encontrar alternativas para reemplazar, o al menos disminuir, su uso en ios medios de cultivo.

Por otra parte, algunas vesículas secretadas por las células durante el cultivo celular tienen un gran potencial para constituir terapias libres de células. Se ha estudiado la función de los exosomas en diversos ámbitos, entre ellos se ha encontrado que cumplen un rol importante en la comunicación intercelular, que tienen un efecto en la formación y/o modulación de enfermedades a través del contenido del exosoma y por último, los exosomas se han utilizado como vehículos para la entrega de diferentes drogas. Es por estas razones, que el desarrollo de terapias basadas en exosomas y en vesículas extracelulares cuenta con avances en estudios preclínicos y gran potencial de aplicación clínica. Sin embargo, para su producción las células se cultivan frecuentemente en medios suplementados con FBS que contienen vesículas inherentes de origen fetal bovino, y que potencialmente pueden interferir en el efecto terapéutico. Para evitar esta contaminación con vesículas de origen bovino, un método común usado en el arte previo es el cultivo de células con privación de suero, método que permite recolectar las vesículas directamente desde los medios de cultivo, sin embargo, este cultivo constituye un estrés ambiental para las células, el cual reduce la actividad celular basal e induce la apoptosis en algunas células [6,7]. Por lo tanto, para uso clínico, una eficiente expansión ex - vivo de células (MSGs, SCs, linfocitos u otras) en un medio serum free /xeno free que no someta a las células a estrés ambiental, es un requisito desafiante para la producción robusta, a gran escala y rentable de células y productos extraceluiares, como vesículas extracelulares, de grado clínico.

Por estas razones, las condiciones de cultivo libres de suero y mejor aún libres de componentes animales (xeno free} deben ser capaces de sustentar el aislamiento y la rápida expansión de distintos tipos celulares, para producir grandes cantidades de células y exosomas puros con grado clínico para terapia celular y terapias libres de células para diferentes enfermedades.

Además, con los avances de la medicina regenerativa y la terapia celular aparece también ia necesidad de un almacenamiento adecuado de productos celulares y biológicos con el fin de conservar al máximo las propiedades biológicas. En este sentido, las tecnologías de criopreservación (almacenamiento a temperaturas ultra bajas) y de biopreservación (almacenamiento bipotérmico) han surgido como una opción viable durante mucho tiempo para un transporte seguro en plazos y distancias cortas.

El diseño de soluciones de preservación (crio o bio) que permitan altas tasas de supervivencia celular compatibles con el mantenimiento de las propiedades biológicas de las células es un gran desafío para la industria de terapia celular (CT, por sus siglas en inglés). Actualmente, muchos de los agentes crioprotectores (CPA, por sus siglas en inglés) utilizados para proteger las estructuras celulares de daños durante los procesos de enfriamiento y descongelación no son suficientemente eficaces o no son compatibles con el uso clínico. El dimetilsulfóxido (DMSO) es un CPA intraceluiar utilizado para proteger las estructuras celulares durante el proceso de enfriamiento, pero su uso clínico está actualmente en discusión por su toxicidad [8]. Por lo tanto, desarrollar soluciones de criopreservación serum-free y/o xenoJree (dependiendo de la aplicación que serán usadas las células) que combinan bajos porcentajes de CPAs (o sin CPA) con inhibidores de la muerte celular inducida por refrigeración se presentan como un problema técnico a solucionar, para obtener un producto celular criopreservado "listo para usar" en terapias celulares. En otro aspecto, está ampliamente descrito que el estrés oxidativo puede afectar la longevidad y funcionalidad de las células. En diferentes tipos celulares, incluidas las MSCs, las condiciones de cultivo y expansión ex vivo producen cambios metabólicos a las células que pueden generar activación de señales de estrés oxidativo, producidas por la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) u especies reactivas de nitrógeno (RNS, por sus siglas en inglés). Por ejemplo, en MSCs, un incremento en la concentración de ROS inhibe la proliferación celular, incrementa la senescencia, afecta el potencial de diferenciación de MSCs, así como inhibe la inmunomodulación en este tipo celular. En consecuencia, la expansión ex vivo se reduce dramáticamente y así mismo afecta la estabilidad genómica de las células después de múltiples pasajes. El uso de medios de cultivo o agentes antioxidantes que puedan contrarrestar el efecto de ROS y del estrés oxidativo en MSCs y otros tipos celulares, manteniendo estable la funcionalidad y la estabilidad genómica, pueden ser usados apropiadamente para procedimientos de escalamiento productivo de cultivos celulares.

En este contexto, la invención descrita aquí resuelve todos estos problemas técnicos, proporcionando un medio, suplemento de medio y solución para el cultivo, expansión, preservación y/o pretratamiento de células, en donde el medio, suplemento de medio y solución comprende pterostilbeno y/o antagonistas de factor inhibidor de migración y/o un catión bivalente en combinación o por separado, como medio cultivo, suplemento de medio de cultivo o solución para potenciar el cultivo celular, expansión celular, preservación celular y obtención de productos extracelulares. Estas moléculas también pueden ser usadas para pretratamiento de células que serán expuestas a ambientes altamente oxidativos de acuerdo con los métodos y composiciones de la invención que se describen a continuación. El método y los medios descritos en el presente documento contribuirían en gran manera a la realización de protocolos de cultivo o soluciones mejorados para cumplir los criterios de eficacia en los próximos estudios clínicos y procedimientos de terapia celular.

El pterostilbeno es una molécula antioxidante de la familia de los estilbenos, es análogo del resveratrol, y deriva de las bayas pequeñas como arándanos y uvas. Este compuesto se utiliza como agente terapéutico, en particular para el tratamiento y/o la prevención del cáncer. Por ejemplo, el documento WO2017012774 (A1 ) describe una combinación que comprende pterostilbeno o fosfato de pterostilbeno o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un agente eliminador de glutatión y un agente quimioterapéutico para este efecto. Los antagonistas del factor de migración celular, se escogen entre ISO-1 , ISO-66, ISO-92 p425, K664-1 , K-647, K-679, K-680, K-664.1 , OXIM-1 1 , D-T4, T-614 o Iguratimod. En una realización preferida se emplea es ISO-1 , o también conocido como antagonista MIF, es un inhibidor de la actividad de la citoquina D-dopachrome tautomerasa (D-DT) in vitro y en células. Bloquea la activación de la secreción de NF-kb y TNF-a a partir de macrófagos tratados con LPS. El antagonista de MIF es usualmente usado para mejorar la supervivencia de ratones que presentan sepsis, demuestra efectos protectores en sus vías respiratorias y en su inflamación gastrointestinal.

Los cationes bivalentes que se pueden agregar opcionalmente al medio de la invención se escoge entre Zn ⁺² ion zinc, Be ⁺² ion berilio, Cd ⁺² ion cadmio, Mg ⁺² ion magnesio, Cu ⁺² ion cobre (II) (cúprico), Ca ⁺² ion calcio, Ni ⁺² ion níquel (II) (niqueloso), Pb ⁺² ion plomo (II) (plumboso), Sn ⁺² ion estaño (II) (estanoso) ,Hg ⁺² ion mercurio (II) (mercúrico), Co ⁺² ion cobalto (II) (cobaltoso), Fe ⁺² ion fierro (II) (ferroso), Mn ⁺² ion manganeso (II) (manganoso), Ba ⁺² ion bario, Sr ⁺² ion estroncio, Cr ⁺² ion cromo (II), Sr ⁺² ion estroncio, Ra ⁺² ion Radio.. En una realización preferida, se emplea Zn como catión bivalente, los medios clásicos no suelen contener Zn (+2) en sus formulaciones básales. Actualmente no se ha descrito su aplicación para la crio y/o biopreservación.

1 , A robust and reproducible animal serum-free culture method for clinical-grade bone marrow-derived mesenchymal stromal cells

Anita Laitinen · Sofía Oja · Lotta Kilpinen ^« Tanja Kaartinen · Johanna Mo ^' Her · Saara Laitinen · Matti Korhonen · Johanna Nystedt 2015

2 Capelli C, Domenghini M, Borlen G, Bellavita P, Poma R, Carobbio A et al (2007) Human platelet lysate allows expansión and clinical grade production of mesenchymal stromal cells from small samples of bone marrow aspirates or marrow filter washouts. Bone Marrow Transpl 40(8):785-791 . doi:10.1038/sj.bmt.1705798

3 J Transí Med. 2015 Jul 17;13:232. doi: 10.1 186/s12967-015-0561 -6.

4 Scalable efficient expansión of mesenchymal stem cells in xeno free media using commercially available reagents. Riordan NH1 , Madrigal M2,3,4, Reneau J5, de Cupeiro K6, Jiménez N7, Ruiz S8, Sánchez N9, lchim TE10, Silva F1 1 , Patel AN

5. Human platelet lysate: Replacing fetal bovine serum as a gold standard for human cell propagation?

Thierry Burnouf a, Dirk Strunk b, c, ^** , Mickey B.C. Koh d, e, Katharina Schallmoser. Biomaterials 76 (2016) 371 e387 E.M. Golebiewska, A.W. Poole, Platelet secretion: from haemostasis to wound healing and beyond, Blood Rev. 29 (2015) 153e162

A.T. Nurden, P. Nurden, M. Sánchez, I. Andia, E. Anitua, Platelets and wound healing, Front. Biosci. 13 (2008) 3532e3548.

6 Pirkmajer S, Chibalin AV. Serum starvation: caveat emptor. Am J Physiol Cell Physiol 201 1 ; 301 : C272-9.

Szekeres, T., Fritzer-Szekeres, M., Saiko, P. et al. Pharm Res (2010) 27: 1042. doi: 10.1 007/s1 1095-01 0-0090- 1

7. Serum deprivation elevates the levels of microvesicles with different size distributions and selectively enriched proteins in human myeloma cells in vitro

Li SUN1 , #, Hong-xiang WANG2, #, Xiao-jian ZHU1 , Pin-hui WU3, Wei-qun CHEN4, Ping ZOU1 , ^* , Qiu-bai LI 1 , ^* , Zhi-chao CHEN1 Breve descripción de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición para el cultivo, expansión, preservación, pre-tratamiento de células y/u obtención de productos extracelulares, donde dicha composición es un medio o suplemento de medio o una solución. La presente invención se refiere a una composición que comprende al menos pterostilbeno o derivados del mismo, y/o un antagonista de factor de migración y opcionalmente un catión bivalente.

En una realización, la invención se refiere a un medio de cultivo o suplemento de medio de cultivo para el cultivo y/o expansión de células, caracterizado por ser libres de suero y/o libres de agentes animales, que comprenden pterostilbeno o derivados del mismo y/o un antagonista de factor de migración y opcionalmente un catión bivalente.

En otra realización, la invención se relaciona con un método para producir vesículas extracelulares (VE, por sus siglas en inglés), incluidos exosomas, en donde las células se cultivan preferiblemente en un medio de la invención exento de suero y los exosomas y/o vesículas extracelulares se recolectan por métodos conocidos en el arte.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una solución, que corresponde solución de grado clínico para la preservación de células. Dicha solución se caracteriza por ser libre de suero y/o libre de agentes animales, comprende pterostilbeno o derivados del mismo y/o un antagonista de factor de migración y opcionalmente un catión bivalente.

En otra realización, la invención está relacionada con una solución para la preservación de células, y un método para la preservación de células el que comprende el contacto de las células con una solución de la invención que comprende pterostilbeno o derivados del mismo, un antagonista de factor inhibidor de migración y un catión bivalente en combinación o por separado.

En un tercer aspecto, la invención se relaciona con un medio o suplemento de medio que comprende pterostilbeno o derivados del mismo, un antagonista del factor inhibidor de migración y un catión bivalente en combinación o por separado. En donde el medio es un medio de cultivo, un medio de cultivo libre de suero, un medio de cultivo libre de componentes animales o una solución de grado clínico para el pretratamiento de células. En una segunda realización, la invención estípula el método para el pretratamiento de células para mejorar las condiciones de cultivos que serán sometido a condiciones oxidativas y/o de estrés oxidativo. Finalmente, la invención se refiere a un método para el cultivo, expansión, preservación y/o pre tratamiento de células donde las células se cultivan, expanden, preservan o pre-tratan en contacto con un medio de cultivo, suplemento de medio o solución que comprende pterostübeno o sus derivados, y/o un antagonista de factor inhibidor de migración y opcionalmente un catión bivalente.

Descripción de las figuras

Figura 1 . Expansión de MSC en medio de cultivo de la invención con hPL.

A) Población acumulada después de 3 pasajes de MSGs de cordón umbilical medidos por prueba de exclusión celular para proliferación con azul tripán cultivadas en DMEM/F12 suplementario con 25 pg/L de bFGF, 2 pg/L de TGF , 2% de Usado de plaquetas humano y concentraciones nanomolares de pterostübeno (F1 : 100 nM, F2: 250 nM, F3: 500 nM F4: hasta 1000 nM) . B) Análisis morfológico de MSCs de cordón umbilical cultivadas en DMEM/F1 2 suplementario con 25 pg/L de bFGF, 2 pg/L de TGFp, 2% de Usado de plaquetas humano y concentraciones nanomolares de pterostübeno (de F1 a F4, 1 00 nM a 1000 nM, respectivamente). C) Análisis de marcadores de identidad y pureza a través de citometría de flujo de los marcadores caracterísicos de MSC: GDI 05, CD90, CD75, CD45, CD34, CD19, CD14 Y HLA-DR. D) Análisis del potencial de tri diferenciación de MSC, las células mantienen su potencial de íridiferenciadón. FBS: Suero fetal bovino, Ptsb: Pterostübeno, hPL: Usado de plaquetas humano.

Figura 2, Expansión de IVISC en medio de cultivo de la invención SF/XF,

A) Población acumulada después de 3 pasajes de MSCs de cordón umbilical medidos por prueba de exclusión para proliferación celular con azul tripán cultivadas en DMEM/F12 suplementario con 25 pg/L de bFGF, 2 pg/L de TGFp y concentraciones nanomolares de pterosíilbeno (F1 ; 100 nM, F2: 250 nM, F3: 500 nM F4: hasta 1000 nM). B) Análisis morfológico de MSGs de cordón umbilical cultivadas en DMEM / F12 suplementario con 25 pg/L de bFGF, TGF 2 pg/L y concentraciones nanomolares de pterostübeno (F1 : 100 nM, F2: 250 nM, F3: 500 nM F4: hasta 1000 nM), muestra que ios cultivos en presencia de antioxidantes son más confluentes que la condición control y en ausencia de Pterosíilbeno, además conservan la morfología fibroblastoide típica de MSC (Figura 2B). FBS: Suero fetal bovino, Ptsb: Pterostübeno, hPL: Usado de plaquetas humano. Figura 3: Cultivo celular en macrocarriers de células madre y otros tipos de células para la producción de EV y exosomas en condiciones libres de componentes animales y en condiciones SF /X F.

Producción de exosomas en medio de cultivo de la invención SF/XF, libre de plaquetas, permite el cultivo y proliferación celular, permitiendo una producción sostenida de vesículas extracelulares, sin someter a las células a cambios metabólicos. A) Cuantificación de partículas obtenidas de sobrenadante de cultivos celulares de células madre mesenquimales en 3D , los días 5, 8 y 12 en el medio de cultivo de la invención y mediante el cultivo con medio de cultivo comercial y FBS, mediante inducción. B) Rendimiento de obtención de vesículas extracelulares en cultivo 3D de células madre mesenquimales. Se cuantificaron las partículas totales y las vesículas extracelulares con un tamaño menor a 150 nm. El cultivo sostenido de la invención permite el enriquecimiento de partículas totales. El medio de la invención SF/XF proporciona 3.2 veces más partículas totales que el método convencional. Adicionalmente, el medio de cultivo de la invención promueve la producción de partículas menores a 150nm, siendo un 87.7% de las partículas totales, en comparación al 14,8% de las partículas totales obtenidas con la solución comercial.

Figura 4: Biopreservación de MSCs.

A) Células madre mesenquimales que fueron preservadas con solución comercial de biopreservación (CBS, por sus siglas en inglés) con la adición de la solución de la invención 0,1 mM de Pterostilbeno mejora significativamente la supervivencia de MSCs preservadas a 4°C por 3 días (Figura 4A). En paralelo CBS suplementada con 0,1 mM de Pterostilbeno y 2,5 mM de Zinc, mejora significativamente ia supervivencia de MSCs preservadas a 4°C por 3 días (Figura 4A). Se puede observar una mejora en la supervivencia de MSCs preservadas a 4°C por 3 días cuando se usa CBS suplementada con 2,5 mM de Zinc y 0,1 nM de lso-1 , y cuando se usa CBS supiementado con 0,1 mM pterostilbeno, 2,5 mM Zinc y 0,1 nM lso-1 (Figura 4A). B) Adherencia de células, posterior a biopreservación con la solución de la invención con Pterostilbeno, Zinc y/o ISO-1 en comparación la solución de biopreservación comercial (CBS), funcionalmente luego de 3 días de preservación las células tratadas con Pterostilbeno, zinc y/o ISO-1 son capaces de adherirse mejor que aquellas células preservadas solo con biopreservante comercial (CBS) C) Proliferación luego 3 días de preservación de células preservadas con CBS versus CBS con adición de la solución de la invención, funcionalmente luego de 3 días de preservación las células tratadas con Pterostilbeno pueden proliferar con mayor eficiencia que solución comercial sin el suplemento del medio de la invención (Figura 4C). D) Las células preservadas con Pterostilbeno, Zinc y/o ISO-1 además presentan mayor migración que las células preservadas con CBS, y cercano a las células frescas (Figura 4D). Pstb: Pterostííbeno, CBS: solución comercial para biopreservación.

Figura 5: Preservación de céiuias mediante ei uso de solución para criopreservación de la invención. A) células madre mesenquimales fueron preservadas con solución de criopreservación preparada en base a plaquetas humanas (95%), con 5% de crioprotector DMSO y suplementado con 2 mM de Pterostííbeno, dicha solución mejora la viabilidad celular con respecto a criopreservante comercial y presenta una viabilidad similar a la solución de criopreservación estándar (suero bovino fetal y 10% DMSO). (Figura 5A). B) El efecto del Pterostííbeno puede comprobarse en la figura 5B en la que la viabilidad es mayor en presencia del antioxidante en la solución de la invención para la criopreservación . C) Similarmente, la solución de criopreservación supiementada con 2 mM de Pterostííbeno mejora la adherencia post descongelación respecto a la solución estándar (figura 5C). SIC: Solución de la invención para criopreservación.

Figura 8: Células fueron cultivadas durante 4 horas en presencia de diferentes concentraciones de Pterostííbeno y posteriormente sometidas a estrés oxidativo por inducción con H2O2. El gráfico muestra el porcentaje de células vivas (evaluados por Anexin V/7AAD) después de la inducción con 1 ,5mM de H2O2, observándose una resistencia a estrés a 50 mM de Pterostííbeno. Ptsb: Pterostilbeno.

Descripción detallada de la invención

La invención se relaciona especialmente con el campo de la medicina regenerativa y la fabricación de productos de terapia basados en células de mamífero y/o específicamente células humanas (HCT/Ps), de modo que en un ámbito de la invención se refiere a una composición para el cultivo y expansión celular, obtención de productos extracelulares, preservación y tratamiento de células para la prevención de daño de estrés oxidativo, en donde dicha composición es un medio, suplemento de medio o solución. En una realización preferible, las células a cultivar, expandir, conservar o pretratar se eligen entre: células dendríticas, células CAR-T, células T-reg, células madre mesenquimales (MSCs), linfocitos T, células madre hematopoiéticas (HSC), células madre pluripotentes y/u otras células madre (CS) y/u otros tipos celulares diferentes de las células madre.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición para el cultivo, expansión, preservación, pretratamiento de células y/u obtención de productos extracelulares , en donde dicha composición es un medio, suplemento de medio o solución. La presente invención se refiere a una composición que comprende al menos pterostilbeno o derivados del mismo, y/o un antagonista de factor de migración y opcionalmente un catión bivalente.

En una realización, la invención se refiere a un medio de cultivo o suplemento de medio de cultivo caracterizado por ser libres de suero y/o libres de agentes animales, que comprenden pterostilbeno o derivados del mismo, y/o un antagonista de factor de migración y opcionalmente un catión bivalente.

En otra realización, la invención se relaciona con un método para producir vesículas extracelulares (VE, por sus siglas en inglés), incluidos exosomas, en donde las células se cultivan preferiblemente en un medio de la invención exento de suero y los exosomas y/o vesículas extracelulares se recolectan por métodos conocidos en el arte.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una solución, donde dicha solución corresponde a una solución de grado clínico para la preservación de células. La solución se caracteriza por ser libre de suero y/o libre de agentes animales, comprende pterostilbeno o derivados del mismo y/o un antagonista de factor de migración y opcionalmente un catión bivalente.

En otra realización, la invención está relacionada con un método para el cultivo y/o preservación de células, dicho método comprende el contacto de las células con el medio , suplemento de medio o solución de la invención que comprende pterostilbeno o derivados del mismo, antagonista de factor inhibidor de migración y un catión bivalente en combinación o por separado. Donde el método es para el crecimiento y expansión de células, o para criopreservación o biopreservación de células en soluciones de grado clínico en condiciones normales, libres de suero o libres de agentes animales.

En un tercer aspecto, la invención se relaciona con un medio o suplemento de medio que comprende pterostilbeno o derivados del mismo, un antagonista del factor inhibidor de migración y un catión bivalente en combinación o por separado. En donde el medio es un medio de cultivo, un medio de cultivo libre de suero, un medio de cultivo libre de componentes animales o una solución de grado clínico para el pretratamiento de células. En una segunda realización, la invención estipula el método para el pretratamiento de células para mejorar las condiciones de cultivos que serán sometido a condiciones oxidativas y/o de estrés oxidativo.

Definiciones:

El término "derivados dei mismos" se refiere a cualquier modificación química de la molécula de Pterostilbeno o del antagonista dei factor inhibidor de migración que no limite su actividad, así corno sus sales farmacéuticamente aceptables.

El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier sal de pterostilbeno o del antagonista del factor inhibidor de migración aprobada por un organismo regulador del gobierno federal o estatal o enumerada en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos. La preparación de sales se puede llevar a cabo por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos ilustrativos no limitantes de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, iactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oléalo, tannato, pantotenato, bitartarato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, giuconato, giucuronato, sacarato, formiato, benzoato, giutamato, metanosuifonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato.

- Como se usa en el presente documento, el término "cultivo" se refiere a cualquier crecimiento de células, organismos, entidades multicelulares o tejido en un medio. El término "cultivar" se refiere a cualquier método para lograr dicho crecimiento, y puede comprender múltiples etapas.

- Como se usa en el presente documento, el término "cultivo celular" se refiere a un crecimiento de células in vitro. En tal cultivo, las células proliferan, pero no se organizan en tejido. Como se usa en el presente documento, el término "medio de cultivo" o "medio” se reconoce en la técnica, y se refiere generalmente a cualquier sustancia o preparación utilizada para el cultivo de células vivas. El término“medio”, tal como se utiliza en referencia a un cultivo de células, incluye los componentes del entorno que rodea a las células. Los medios pueden ser sólidos, líquidos, gaseosos o una mezcla de fases y materiales. Los medios incluyen medios de crecimiento líquido, así como medios líquidos que no sostienen el crecimiento celular. Los medios también incluyen medios gelatinosos tales como agar, agarosa, gelatina y matrices de colágeno. Ejemplos de medios gaseosos incluyen la fase gaseosa al que las células están expuestas, cuando se crecen en una placa de petri u otro soporte sólido o semisólido.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "medio" también se refiere al material que está destinado a ser utilizado en un cultivo celular, incluso si todavía no ha sido puesto en contacto con las células. En otras palabras, un líquido rico en nutrientes preparado para cultivo bacteriano es un medio. De manera similar, una mezcla en polvo que cuando se mezcla con agua u otro líquido se convierte en adecuada para el cultivo celular puede denominarse un "medio pulverizado".

- Tal como se usa en el presente documento, el término "medio basal" se refiere a un medio que promueve el crecimiento de muchos tipos de microorganismos y células de mamíferos que no requieren ningún suplemento nutricional especial. La mayoría de los medios básales generalmente comprenden cuatro grupos químicos básicos: aminoácidos, carbohidratos, sales inorgánicas y vitaminas. Un medio basal generalmente sirve como base para un medio más complejo, a lo que se agregan suplementos tales como suero, tampones, factores de crecimiento, lípidos y similares. Los ejemplos de medios básales incluyen, pero no se limitan a, Medio Basal de Eagles, Medio Mínimo Basal, Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), Medio con mezcla de nutrientes HAM-F1 0 y HAM-F12, Me Coy’s 5A, Medio DMEM/F-1 2, RPMI 1640 y Medio Modificado de Dulbecco Iscove (IMDM). En el caso del medio basal para la producción de EV y exosomas, se prefiere el medio basal sin rojo fenol. Preferiblemente, el medio basal se selecciona de la lista que consiste en Medio Basal de Eagles, Medio Mínimo Basal, Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), Medio con mezcla de nutrientes HAM-F10 y HAM-F12, Me Coy’s 5A, Medio DMEM/F-12, RPMI 1640 y Medio Modificado de Dulbecco Iscove (IMDM).

- Tal como se usa en el presente documento, el término "suplemento para medio de cultivo" se refiere a una composición que puede agregarse a cualquier medio de cultivo incluyendo los medios de cultivos comerciales de modo de mejorar las propiedades de dicho medio de cultivo, ya sea para el cultivo mismo de células o para la expansión, preservación o pretratamiento de las células.

El término“solución”, se refiere a mezcla de diferentes componentes en un líquido.

El término“factor de crecimiento”, corresponde a toda aquella sustancia capaz de estimular el crecimiento, proliferación y diferenciación celular. Existen factores de crecimiento directos, es decir que inciden directamente el crecimiento, proliferación y diferenciación; como también existen factores de crecimiento indirectos, que mantienen la supervivencia celular en situaciones de estrés oxidativo. Para esta última situación, los factores de crecimiento utilizados en la invención corresponden a bFGF, TGF-b.

Como se refiere en el presente documento,“método de cultivo y expansión celular” se refiere a todos aquellos procesos para el correcto crecimiento y expansión de células. Los cuales pueden ser en un sistema de monocapa o 2D y/o un cultivo en suspensión o 3D. El método de cultivo y expansión en un sistema 3D comprende el uso de microcarriers, macrocarriers o beats de distintos materiales, tales como dextrano, colágeno y celulosa con diferentes entrecruzamientos. Entre ellos se puede mencionar el uso de macrocarriers comerciales tales como BioNOC y Fibra-cell dises, y el uso de microcarriers como Cytodex, Mobius, Hillex CT, Cytopore y Cytoline.

- Tal como se utiliza en el presente documento, el término "situaciones causantes de estrés oxidativo” se refiere a aquellas situaciones en las que hay aumento de las especies reactivas de oxígenos (ROS) y especies reactivas de nitrógeno (RNS). Los ROS son generados durante el metabolismo oxidativo de la mitocondria al igual que en respuesta a ciertos estímulos como a agentes xenobióticos, citoquinas e invasión bacteriana. El estrés oxidativo hace referencia a un desbalance entre el exceso de ROS u otro oxidante y la capacidad de la célula de su respuesta antioxidante. El estrés oxidativo desata daños a nivel de macromoléculas, y está implicado en varias enfermedades. Ejemplos de situaciones causantes de estrés oxidativo son enfermedades crónicas como aterosclerosis, cáncer, diabetes, artritis reumatoide, isquemia por reperfusión, infarto de miocardio, enfermedades cardiovasculares, inflamación crónica, accidente cerebrovascular y shock séptico, envejecimiento y otras enfermedades neurodegenerativas en humanos.

En general, el término "vesículas secretadas" se refiere a las vesículas extracelulares (EVs) secretadas y purificadas de la mayoría de las células eucariotas. Las EV son todas vesículas liberadas por células, conformadas por una bicapa lipídica que varía de 50 nm a 1000 nm de diámetro dependiendo de su origen y que se generan mediante la formación de brotes en la membrana plasmática. Por el contrario, los exosomas, que oscilan entre 30nm y 150nm, se derivan de la vía endolisosomal.

El término "catión divalente" se refiere a cualquier catión que tenga carga +2. Ejemplos ilustrativos no limitantes de cationes divalentes incluyen, pero no se limitan a Zn ⁺² , ion zinc; Be ⁺² , ion berilio; Cd ⁺² , ion cadmio; Mg ⁺² , ion magnesio; Cu ⁺² , ion cobre (II); Ca ⁺² , ion calcio; Ni ⁺² , ion níquel (II); Pb ⁺² , ion plomo (II); Sn ⁺² , ion estaño (II); Hg ⁺² , ion mercurio (II); Co ⁺² , ion cobalto (II); Fe ⁺² , ion fierro (II); Mn ⁺² , ion manganeso (II); Ba ⁺² , ion bario; Sr ⁺² , ion estroncio; Cr ⁺² , ion cromo (II); Sr ⁺² , ion estroncio; Ra ⁺² , ion Radio.

El término antagonista del factor de migración celular se refiere a aquellos compuestos naturales o sintéticos que inhiben la migración de células. Ejemplos ilustrativos no limitantes de antagonistas del factor de migración celular incluyen, pero no se limitan a ISO-1 , ISO-66, ISO-92 p425, K664-1 , K-647, K-679, K-680, K-664.1 , OXIM-1 1 , D-T ₄ , T-614 o Iguratimod.

El término "aproximadamente" se refiere a una variabilidad de ± 10%.

El término solución comercial de biopreservación (CBS), se refiere a una solución de capaz de preservar células a una temperatura de 2 a 8 ^S C. Ejemplos ilustrativos no limitantes de solución comercial de biopreservación incluyen, pero no se limitan a HypoThermosol-FRS, FGM (media), Normosol-R, Plasma-Lyte, AQIX, Celsior, Viaspan.

El término criopreservante se refiere a una solución de capaz de mitigar el estrés molecular generado por el cambio de temperatura tanto en el proceso de congelamiento como el de descongelamiento de células. Ejemplos ilustrativos no limitantes de solución comercial de biopreservación incluyen Cryostore CS2, Cryostore CS5, Cryostore CS10, ProFreeze, Aedesta, Cellvation, Cell Guardian, Synth-aFreeze Recovery, Sigma Freeze, FGM + 5% DMSO.

En particular, esta invención se refiere a! uso de pterostilbeno, que es un antioxidante de la familia de los estilbenos y análogo del resveratro!, en medios de cultivo libres de suero/libres de componentes animales (Serum Free/Xeno free; 8F/XF, por sus siglas en Inglés) para la expansión de células, tales como células dendríticas, iinfocitos T (modificadas o no modificadas), células hematopoyéticas , células T-reguladoras (T-reg), células madre mesenquímales (MSCs, por sus siglas en inglés), las células madre pluripotentes y/o otras células madre (SCs, por sus siglas en inglés) y / u otros tipos de células diferentes a las células madre.

En particular, la molécula de pterostilbeno proporciona condiciones 8F/XF enriquecidas para la expansión de diferentes células madre y/o de otros tipos de células, y esta molécula también puede usarse para la producción de vesículas exíracelulares (EVs, por sus siglas en inglés) incluyendo exosomas secretados por diferentes tipos celulares y que pueden ser purificados libres de vesículas contaminantes de otras fuentes como sueros de origen animal o humanos. En particular, proporciona soluciones de SF/XF para criopreservación y/o biopreservación para el almacenamiento a corto, mediano y largo plazo de productos de terapia celular (CT, por sus siglas en inglés) de grado clínico. En particular, ia invención demuestra que la exposición de Pterostilbeno en combinación con factores de crecimiento y/o proteínas carriers y/o hormonas y/o excipientes, son apropiados para la fabricación de productos de terapia celular de grado clínico. En particular, ia molécula de pterostilbeno también puede usarse como un pre-tratamiento de células para mejorar su resistencia a entornos altamente oxidativos, estas células pueden ser células dendríticas, iinfocitos T (modificadas o no modificadas), células hematopoyéticas , células T-reguladoras (T-reg), células madre mesenquimales (MSCs, por sus siglas en inglés), las células madre pluripotentes y/o otras células madre (SCs, por sus siglas en inglés) y/u otros tipos de células diferentes a las células madre.

Sorprendentemente, los inventores han encontrado que la presencia de pterostilbeno y/o de un antagonista de factor inhibidor de migración opcionalmente en combinación con un catión bivalente, en ios medios y/o soluciones de la invención mejoran tanto ia expansión celular como también ia viabilidad celular después de los procesos de criopreservación o biopreservación. Además, el efecto potenciador de pterostilbeno en el medio de cultivo es tan eficaz que permite obtener buenos resultados en cultivos de células en medios libres de suero animal (serum free) e incluso en medios completamente libres de agentes xenogénicos (xeno free), evitando de este modo cualquier contaminación animal en los cultivos, mejorando ia calidad del producto final. Por lo tanto, las células cultivadas y conservadas de acuerdo con los medios y métodos de ia invención tienen la ventaja de tener grado clínico para procedimientos terapéuticos, sin necesitar ningún tipo de procesamiento adicional.

Este efecto inesperado sobre la viabilidad y expansión celular permite incluso disminuir el uso de otros suplementos habituales en los cultivos de células animales, especialmente humanas, como por ejemplo el lisado de plaquetas. De este modo, la invención permite mejorar notablemente la manufactura de productos para terapia basados en células humanas en prácticamente todos los métodos asociados a este tipo de terapia.

De este modo, las aplicaciones del medio, suplemento de medio o solución de la invención están relacionadas con: i. El uso como estimulante para mejorar la expansión celular en cultivo de células de mamífero, tales como células dendríticas, células CAR-T, células T-reg, células madre mesenquimales (MSCs), linfocitos T, células madre hematopoiéticas (HSC), células madre pluripotentes y / u otras células madre (CS) y / u otros tipos celulares diferentes de las células madre.

ii. El uso en una formulación de un medio de cultivo serum free/xeno free para la expansión a pequeña y gran escala de MSCs y otras SCs, para la fabricación de productos celulares y su aplicación en terapia celular.

iii. El uso en la producción de vesículas extracelulares (EV) incluyendo exosomas secretados por células madre o cualquier otro tipo celular bajo condiciones libres de componentes derivados de animales y sin restricción metabólica durante el cultivo celular. iv. El uso en la formulación de soluciones de grado clínico para criopreservación o biopreservación, manteniendo altos niveles de viabilidad y funcionalidad de los productos para terapia celular.

v. El uso como un pretratamiento para células que serán sometidas a ambientes altamente oxidativos.

Para el experto en el arte es evidente que los medios de cultivo para células animales, en especial para células humanas, y más especialmente para células humanas para terapias celulares, como células madre u otras, requieren medios de cultivo o preservación complejos, que incluyen nutrientes, tampón, factores de crecimiento, por indicar los más importantes. La adición del medio, suplemento de medio o solución de la invención en estos medios permite siempre mejorar los resultados de expansión y preservación de las células, incluso prescindiendo o disminuyendo componentes habituales de estos medios, como suero fetal bovino, Usado de plaquetas. La ventaja de eliminar estos componentes sería, evitar la contaminación en especial con vesículas del FBS, y la ventaja de disminuir el Usado de plaquetas reduce significativamente los costos del cultivo.

La base para el medio de cultivo serum free/xeno free es una combinación de factores de crecimiento mayores tales como: TGFb y bFGF, carriers de moléculas (Insulina, transferrina y ácido selénico), antioxidantes y cortisol, esta fórmula basal se aplica para cultivar SCs u otros tipos de células para la producción de EVs y exosomas, mientras que la suplementación de la fórmula basal con un bajo porcentaje (2%) de Usado de plaquetas humano se aplica para la expansión celular de MSCs/SCs autólogas o alogénicas de grado clínico con un uso potencial en ensayos clínicos y comercialización . Ambos medios de cultivo son suplementados con el medio o suplemento de medio de la invención.

Las evidencias sobre la invención muestran que las MSC derivadas del cordón umbilical (UC) cultivadas en condiciones sin suero con células cultivadas con el medio de cultivo de la invención con diferentes concentraciones de pterostilbeno y con suplemento de hPL al 2%, aumentaron su población celular en comparación con el control (medio basal, 10% de FBS). Las MSC derivadas de UC, expuestas a este medio, mantienen sus características morfológicas (Ejemplos 1 y 2; Figuras 1 y 2).

Mientras tanto, la misma fuente celular cultivada con la forma basal del medio de la invención, sin suplemento de hPL, se obtiene el mismo número de células y con las mismas características que en la condición control (Figura 2A). Finalmente, se observó que las células mantenían una morfología tipo fibroblastos, propia de MSC (Figura 2B). Todos los experimentos se realizaron durante pasaje 3, separando las células cada 5 días. En este caso, el medio de cultivo de la invención no requiere ningún suplemento de origen animal, y es apropiado para la fabricación de productos celulares de grado clínico, y al mismo tiempo para el cultivo de MSC y otros tipos celulares evitando inducción por inanición de cultivo celular para producción de VE y exosomas.

Tal como se puede observar en los siguientes aspectos de la invención, la solución de la invención, es especialmente útil para la biopreservación de células. La evaluación de parámetros como supervivencia, adhesión, proliferación y migración celular luego del proceso de biopreservación por 3 días, se ven mejorados con el uso de la solución de la invención.

Los inventores muestran que la solución de criopreservación de la invención mejora condiciones de viabilidad y adherencia celular, respecto a una solución criopreservante usada ampliamente.

Los inventores muestran que el tratamiento de células con el medio o suplemento de medio de la invención, y en especial en realizaciones que comprenden pterostilbeno, frente a un estrés oxidativo mejora la sobrevivencia de células tratadas.

De este modo la invención se refiere a una composición para el cultivo, expansión, preservación y/o pretratamiento de células, en que dicha composición es un medio o suplemento de medio o una solución que comprende: (a) pterostilbeno o sus derivados a una concentración entre 10 pM a 1 00 mM, y/o (b) un antagonista de factor inhibidor de migración en una concentración entre 0,01 nM a 1 nM, y opcionalmente un catión bivalente en una concentración entre 0,1 mM a 10 mM . Donde el medio o suplemento de medio es libre de suero y libre de componentes animales El antagonista de factor inhibidor de migración se escoge entre ISO-1 , ISO-66, ISO-92 p425, K664- 1 , K-647, K-679, K-680, K-664.1 , OXIM-1 1 , D-T4, T-614 o Iguratimod. Por otra parte el catión bivalente se escoge entre Zn+2 ion zinc, Be+2 ion berilio, Cd+2 ion cadmio, Mg+2 ion magnesio, Cu+2 ion cobre (II) (cúprico), Ca+2 ion calcio, Ni+2 ion níquel (II) (niqueloso), Pb+2 ion plomo (II) (plumboso) ,Sn+2 ion estaño (II) (estañoso) ,Hg+2 ion mercurio (II) (mercúrico), Co +2 ion cobalto (II) (cobaltoso), Fe+2 ion fierro (II) (ferroso), Mn+2 ion manganeso (II) (manganoso), Ba+2 ion bario, Sr+2 ion estroncio, Cr+2 ion cromo (II), Sr+2 ion estroncio, Ra+2, ion Radio. Adicionalmente, el medio o suplemento de medio es para el cultivo y/o expansión de células y comprende un medio basal con factores de crecimiento, hormonas, aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas e hidratos de carbono.

En una realización el medio o suplemento de medio es para cultivo y/o expansión de células, donde el pterostilbeno está en un rango de concentración de 100 nM a 1000 nM y comprende lisado de plaquetas humanas en una proporción menor al 10% del medio de cultivo, o menor al 5% del medio de cultivo.

En otra realización el medio o suplemento de medio es para producción de vesículas extracelulares (EV) incluyendo exosomas secretados por células madre o cualquier otro tipo celular bajo condiciones libres de componentes derivados de animales sin inducción por inanición de cultivo celular y sin uso de lisado humano de plaquetas.

En otra realización la composición de soluciones de la invención para la preservación de células, en especial para la biopreservación y la criopreservación, donde una solución de la invención comprende una solución de biopreservación celular (CBS) y Pterostilbeno en un rango de concentración de 10 nM a 10 mM. Donde la solución es para la biopreservación y comprende un medio con biopreservante (CBS), Pterostilbeno en un rango de concentración de 10 nM a 10 pM y Zinc en un rango de concentración de 0,1 pM a 10 pM. Donde una solución es usada para la biopreservación y comprende un medio con biopreservante (CBS), ISO-1 en un rango de concentración de 0,01 nM a 1 nM y Zinc en un rango de concentración de 0,1 pM a 10 pM. Adicionalmente la solución es usada para la biopreservación y comprende un medio con biopreservante (CBS), Pterostilbeno en un rango de concentración de 10 nM a 10 pM, ISO-1 en un rango de concentración de 0,01 nM a 1 nM y Zinc en un rango de concentración de 0,1 pM a 10 pM.

En otra realización la composición de soluciones de la invención para la preservación de células, en especial para la biopreservación y la criopreservación, donde una solución de la invención comprende una solución para la criopreservación. Donde la solución para la criopreservación comprende una solución con plaquetas humanas, crioprotector y pterostilbeno en un rango de concentración de 200 nM a 20 mM y heparina en concentraciones menores a 5 unidades, cada 500.000 células.

En otra realización el medio o suplemento de medio es para el pretratamiento de células que serán sometidas a estrés oxidativo y comprende pterostilbeno en un rango de concentración de 5 a 100 pM.

En otro aspecto la invención se refiere a un método para el cultivo, expansión, preservación y/o pretratamiento de células donde las células se cultivan, expanden, se preservan o pretratan en contacto con una composición que es un medio de cultivo, un suplemento de medio o una solución que comprende: (a) pterostilbeno o sus derivados a una concentración entre 10 pM a 100 mM, y/o (b) un antagonista de factor inhibidor de migración en una concentración entre 0,01 nM a 1 nM, y opcionalmente un catión bivalente en una concentración entre 0,1 pM a 10 pM.

Donde las células se escogen entre células madre mesenquimales, iPSC, células madre pluripotentes, células madre embrionarias humanas, células progenitoras, células CAR-T, células T reguladoras o células dendríticas. Y el cultivo se realiza en un medio libre de suero y libre de componentes animales.

En una realización las células son cultivadas y adicionalmente se separa el sobrenadante de este cultivo, el sobrenadante se somete a un proceso de purificación para obtener vesículas extracelulares y/o exosomas de las células cultivadas libres de componentes derivados de animales (serum free y xeno free). En otra realización las células son preservadas, en especial biopreservadas y criopreservadas. Y en otra realización las células son pretradas para soportar situaciones de estrés oxidativo y comprende contactarlas con pterostilbeno en un rango de concentración de 5 a 100 pM.

Un primer aspecto de la invención se refiere a un medio de cultivo o un suplemento de medio, en lo sucesivo medio de cultivo de la invención, que comprende: a) pterostilbeno,

b) factores de crecimiento,

c) una hormona tal como cortisol, d) medio basal enriquecido que promueve el crecimiento de células de mamíferos y comprende cuatro grupos químicos básicos: aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, carbohidratos y otros compuestos.

e) suplemento compuesto por insulina, transferrina y ácido selenoso (ITS).

f) opcionalmente lisado de plaquetas humano (hPL), dependiendo de la aplicación.

Preferiblemente, el medio de cultivo, el suplemento de medio y soluciones de la invención se fabrican cumpliendo con Buenas Prácticas de Manufactura (GMP, por sus siglas en inglés).

Medio de cultivo con pterostilbeno y bajo en hPL

Los resultados descritos en el ejemplo 1 muestran que el enriquecimiento con pterostilbeno de un medio basal permite el cultivo de MCS sin suero fetal bovino (FBS) con un porcentaje muy reducido de lisado de plaquetas humano obteniendo así un medio de cultivo libre de suero animal.

En una realización preferida de la invención, el medio de cultivo de la invención es un medio de cultivo libre de suero/libre de agentes xenogénicos, en lo sucesivo el medio de cultivo de la invención, en el que el medio basal comprende una mezcla de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sin glucosa y mezcla nutritiva de Ham's F12 (DMEM / F12), solución IT, bFGF, TGF-b, cortisol, pterostilbeno y lisado de plaquetas humano.

En una realización preferida, el medio basal del medio de cultivo de la invención se prepara mezclando el 50% de volumen para cada medio (medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y mezcla de nutrientes Ham's F12).

En otra realización preferida, el medio de cultivo de la invención o cualquiera de los otros medios definidos en el primer aspecto, comprende además una mezcla de insulina humana, transferrina humana y ácido selenoso (dicha mezcla se denomina comercialmente “ITS”), y más preferiblemente dicho ITS, comprende preferiblemente insulina humana recombinante, preferiblemente transferrina humana recombinante y preferiblemente ácido selenoso. Preferiblemente la solución ITS, se encuentra a un rango de concentración entre 0,5X a 5X, más preferiblemente a una concentración de 1 X. Preferiblemente la insulina está en un intervalo de concentración de aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 50 mg/L, y más preferiblemente de aproximadamente 20 mg/L, preferiblemente transferrina humana recombinante, y más preferiblemente, dicha transferrina está en un intervalo de concentración de aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 750 mg/L, y más preferiblemente de aproximadamente 550 mg/L, preferiblemente ácido selenoso, y más preferiblemente, dicho ácido selenoso está en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,30 mg/L a aproximadamente 0,80 mg/L, y más preferiblemente de aproximadamente 0,70 mg/L.

En otra realización preferida, el medio de cultivo o cualquiera de los otros medios definidos en el primer aspecto, comprende además el Factor de Crecimiento de Fibroblastos Básico (bFGF), más preferiblemente el Factor de Crecimiento de Fibroblastos Humano Básico Recombinante, y más preferiblemente dicho bFGF está en un rango de concentración de aproximadamente 1 pg/L a aproximadamente 75 pg/L, y más preferiblemente de aproximadamente 25 pg/L.

En otra realización preferida, el medio de cultivo o cualquiera de los otros medios definidos en el primer aspecto, además comprende el factor de crecimiento transformante (TGF-b, por sus siglas en inglés), más preferiblemente el factor de crecimiento transformante b recombinante (TGF-b), y más preferiblemente dicho TGF-b está en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,5 pg/L a aproximadamente 5 pg/L, y más preferiblemente de aproximadamente 2 pg/L.

En otra realización preferida, el medio de cultivo libre de suero o cualquiera de los otros medios definidos en el primer aspecto, comprende además cortisol, y más preferiblemente, dicho cortisol está en un intervalo de concentración de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 00 nM y más preferiblemente de aproximadamente 50 nM.

En otra realización preferida, el pterostilbeno está en un intervalo de concentración de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 100 pM, más preferiblemente está en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.001 pM a 10 pM. Aún más preferiblemente el pterostilbeno se encuentra a 5 pM.

En una realización preferida de la invención, el medio de cultivo de la invención solo se complementa con lisado de plaquetas humano en una cantidad menor al 10%, preferiblemente menor al 7,5%, más preferiblemente menor al 5%, volumen/volumen del total del medio de cultivo.

En otra realización preferida, dicho medio de cultivo es utilizado para la expansión celular, tanto en cultivos de monocapa como de suspensión. En el ejemplo 1 se describe el método y uso del medio de cultivo para el cultivo y expansión celular de células madre mesenquimales provenientes de cordón umbilical, se observa que el medio de la invención sirve para el óptimo crecimiento celular, sin observarse una pérdida de las características propias de las células.

Medio de cultivo con pterostilbeno Los resultados descritos en el ejemplo 2 muestran que el enriquecimiento con pterostilbeno de un medio basal permite el cultivo de MCS sin suero fetal bovino (FBS), manteniendo el crecimiento celular y permitiendo la obtención de productos celulares como vesículas extracelulares, libres de componentes animales.

En una realización preferida de la invención, el medio de cultivo de la invención es un medio de cultivo libre de suero/libre de componentes de origen animal en lo sucesivo el medio de cultivo SF/ XF de la invención, en el que el medio basal comprende una mezcla de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sin glucosa y mezcla nutritiva de Ham's F12 (DMEM / F12), solución ITS, bFGF, TGF-b, cortisol, pterostilbeno y lisado de plaquetas humano.

En una realización preferida, el medio basal del medio de cultivo de la invención se prepara mezclando el 50% de volumen para cada medio (medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y mezcla de nutrientes Ham's F12).

En otra realización preferida, el medio de cultivo de la invención o cualquiera de los otros medios definidos en el primer aspecto, comprende además una mezcla de insulina humana, transferrina humana y ácido selenoso (dicha mezcla se denomina comercialmente “ITS”), y más preferiblemente dicho ITS, comprende preferiblemente insulina humana recombinante, preferiblemente transferrina humana recombinante y preferiblemente ácido selenoso. Preferiblemente la solución ITS, se encuentra a un rango de concentración entre 0,5X a 5X, más preferiblemente a una concentración de 1 X. Preferiblemente la insulina está en un intervalo de concentración de aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 50 mg/L, y más preferiblemente de aproximadamente 20 mg/L, preferiblemente transferrina humana recombinante, y más preferiblemente, dicha transferrina está en un intervalo de concentración de aproximadamente 150 mg/L a aproximadamente 750 mg/L, y más preferiblemente de aproximadamente 550 mg/L, preferiblemente ácido selenoso, y más preferiblemente, dicho ácido selenoso está en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,30 mg/L a aproximadamente 0,80 mg/L, y más preferiblemente de aproximadamente 0,70 mg/L.

En otra realización preferida, el medio de cultivo o cualquiera de los otros medios definidos en el primer aspecto, comprende además el Factor de Crecimiento de Fibroblastos Básico (bFGF), más preferiblemente el Factor de Crecimiento de Fibroblastos Humano Básico Recombinante, y más preferiblemente dicho factor de crecimiento de Fibroblasto Básico está en un rango de concentración de aproximadamente 1 pg/L a aproximadamente 75 pg/L, y más preferiblemente de aproximadamente 25 pg/L. En otra realización preferida, el medio de cultivo o cualquiera de los otros medios definidos en el primer aspecto, además comprende el factor de crecimiento de transformación (TGF-b, por sus siglas en inglés), más preferiblemente el factor de crecimiento de transformación recombinante (TGF-b), y más preferiblemente , dicho Factor de Crecimiento Transformación (TGF-b) está en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,5 pg/L a aproximadamente 5 pg/L, y más preferiblemente de aproximadamente 2 pg/L.

En otra realización preferida, el medio de cultivo libre de suero o cualquiera de los otros medios definidos en el primer aspecto, comprende además cortisol, y más preferiblemente, dicho cortisol está en un intervalo de concentración de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM y más preferiblemente de aproximadamente 50 nM.

En otra realización preferida, el pterostilbeno está en un intervalo de concentración de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 100 pM, más preferiblemente está en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,001 pM a 10 pM. Aún más preferiblemente el pterostilbeno se encuentra aproximadamente a 5pM.

En otra realización preferida, dicho medio de cultivo es utilizado para la expansión celular, tanto en cultivos de monocapa como de suspensión y para la obtención de productos extracelulares como microvesículas. En el ejemplo 2 se describe el método y uso del medio de cultivo para el cultivo y expansión celular de células madre mesenquimales provenientes de cordón umbilical, se observa que el medio de la invención sirve para el óptimo crecimiento celular, sin observarse una pérdida de las características propias de las células. Además se describe la obtención de microvesículas, como la obtención de exosomas íntegros, los cuales son evaluados a través de la obtención de número de partículas totales y de partículas menores a 150 nm a partir del cultivo.

Cultivo celular de células madre y otros tipos de células para la producción de EV y exosomas en condiciones SF /X F.

En otra realización, la invención se refiere a producción y purificación de EVs secretadas que incluyen exosomas aislados de tipos de células de mamíferos, preferiblemente células madre, más preferiblemente MSCs cultivadas utilizando el medio de cultivo de la invención para la expansión celular.

En otra realización preferida, las EVs secretadas incluyen exosomas aislados de distintas fuentes celulares. En otra realización preferida, el proceso de producción de EV y/o Exosomas comprende: adhesión de las células a superficies plásticas en 2D (placas o frascos de cultivo) o 3D (microcarriers o macrocarriers), lavado del medio basal, crecimiento de las células adheridas, obtención de continua de sobrenadante y purificación de EVs y/o Exosomas.

En otra realización preferida, para la adhesión de las células superficies 3D, dichas células deben ser sembradas en una proporción de 4 millones células por 1 gr de Bionoc aproximadamente. Entendiéndose el término“aproximadamente” a una variación del 10 por ciento.

En otra realización preferida, para la adhesión de las células a las superficies 3D, se realiza en presencia de una solución de medio basal compuesta por DMEM con FBS al 10%. En otra realización preferida, para la adhesión de las células a las superficies 3D, se deben dejar las células con el medio mencionado en agitación suave y con control de temperatura por 24 horas aproximadamente. Entendiéndose el término“aproximadamente” a una variación del 10 por ciento.

En otra realización preferida, para el lavado del medio basal, posterior a qu e las células se encuentran adheridas, estas deben ser lavadas con solución de medio de cultivo SF/ XF de la invención al menos 2 veces. Posterior al lavado, se agrega nuevamente la solución de medio de cultivo SF/ XF de la invención para el crecimiento celular en agitación suave y con control de temperatura por al menos 3 días.

En otra realización preferida, para la obtención continua de EVs y/o exosomas a partir del sobrenadante del cultivo celular, cuando la confluencia de las células llega al menos a un 80% se procede a colectar el sobrenadante. Para mantenimiento del cultivo celular produciendo EVs y/o Exosomas se debe añadir medio de cultivo SF/ XF de la invención en la misma proporción al volumen extraído del sobrenadante. Este procedimiento puede realizarse de forma continua.

En otra realización preferida, la purificación de EVs y/o Exosomas a partir del sobrenadante obtenido se realiza en diferentes pasos: centrifugación, filtración, ultracentrifugación, lavados y resuspención. Preferentemente, el sobrenadante debe ser centrifugado a 600 g durante 10 minutos a 4°C aproximadamente. Para posteriormente ser filtrada utilizando de unidades de filtración PES de 0,22 um. Para posteriormente someter las muestras a ultracentirfugación a 100.000g durante 70 minutos a 4°C aproximadamente. Posteriormente, u na vez terminada a centrifugación y concentrados los EVs y/o exosomas, se elimina el sobrenadante y se conservan con PBS a 4°C durante la noche (lavado). Una vez terminada etapa de lavado se resuspende el pellet en PBS y se alícuota y finalmente se almacena a -80°C. Las EVs, son partículas extracelulares que varían en cuanto a su tamaño ya que van de 40 a 10OOnm. Por otra parte, los exosomas se caracterizan por su forma redondeada y por el tamaño que oscila entre 30-200 nm, preferiblemente entre 30 - 150 nm, más preferiblemente entre 50 y 100 nm y por la expresión de los marcadores HSP90, HSP70 y CD63. Cabe destacar que mediante el uso del medio de cultivo SF/ XF de la invención no se necesita someter a las células a periodos de restricción calórica (llamado “inducción” tradicionalmente) que alteran el metabolismo de la célula y por ende la calidad de los exosomas (Figura 3), permitiendo la recolección de exosomas de forma constante y periódica y en condiciones libres de componentes de origen animal, por las técnicas conocidas en el arte.

Criopreservación y biopreservación de productos de terapia celular de grado clínico.

En otro aspecto de la invención, los elementos de la invención se utilizan para una solución para preservación de células. En una realización preferida una solución de la invención es un aditivo para biopreservación. En otra realización preferida una solución de la invención es para preservación de células, específicamente la biopreservación y criopreservación de células.

En una realización preferida, la solución comprende pterostilbeno, un antagonista del factor inhibidor de migración y un catión bivalente en combinación o por separado, para ser utilizado como aditivo a las soluciones comerciales de biopreservación.

En una realización preferida, el pterostilbeno se encuentra en un rango de concentración de aproximadamente 0,00001 mM a 100 mM, más preferiblemente en un rango de concentración de aproximadamente 0,05 mM a 1 mM, y aún más preferiblemente a aproximadamente 0,1 mM.

En una realización preferida, el antagonista del factor inhibidor de migración corresponde a ISO- 1 , más preferiblemente se encuentra en un rango de concentración de aproximadamente 0,000001 mM a 0,001 mM, más preferiblemente en un rango de concentración de aproximadamente 0,000005 mM a 0,0005 mM, y aún más preferiblemente a aproximadamente 0,0001 mM.

En una realización preferida, el catión bivalente corresponde a Zinc, más preferiblemente se encuentra en un rango de concentración de aproximadamente 0,025mM a 250 mM, más preferiblemente en un rango de concentración de aproximadamente 0,25 mM a 25 mM, y aún más preferiblemente a aproximadamente 2,5 mM. En otra realización preferida, la solución criopreservante está compuesta por lisado de plaquetas humano, heparina, una solución crioprotectora y Pterostilbeno. Más preferiblemente, el lisado de plaquetas humano se encuentra en un rango de concentración de aproximadamente 90% y aproximadamente 99%, más preferiblemente a una concentración de 95%. La heparina preferiblemente se encuentra en un rango de concentración de entre 1 UI/mL - 1 0 UI/mL, y aún más preferiblemente se encuentra a una concentración de 2UI/mL. La solución crioprotectora preferiblemente es dimetilsulfóxido, preferiblemente se encuentra en un rango de concentración de entre 1 %-10%, y aún más preferiblemente se encuentra a una concentración de 5%. El pterostilbeno preferiblemente se encuentra en un rango de entre 0,5mM y 10mM, y aún más preferiblemente a una concentración de 2 mM.

Pretratamiento para células que serán sometidas a ambientes altamente oxidativos.

En un tercero aspecto de la invención el pterostilbeno se utiliza como pretratamiento para distintos tipos celulares en prevención de situaciones causantes de estrés oxidativo.

En una realización preferida las células se cultivan con medio basal y pterostilbeno por un tiempo antes de la exposición al estrés oxidativo. Preferiblemente el pterostilbeno se encuentra en un rango de concentración de aproximadamente 0,5mM y aproximadamente 100 mM, más preferiblemente a una concentración de 1 0-50 mM. Preferiblemente, el tiempo de cultivo se encuentra en un rango de aproximadamente 1 hora y 300 horas, más preferiblemente entre 1 hora y aproximadamente 72 horas.

La invención se percibirá más claramente y se comprenderá mejor a partir de los siguientes ejemplos específicos que están destinados a proporcionar ejemplos de ciertas realizaciones preferidas y que no limitan el alcance de la presente invención.

Ejemplos:

Ejemplo 1 : Expansión de MSC en medio de cultivo de la invención con hPL.

Células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical se expandieron con el medio de la invención desde pasaje 0 a pasaje 3, en donde los medios básales utilizados fueron el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sin glucosa y la mezcla de nutrientes F12 de Ham (DMEM/F12) complementada con 25 pg/L bFGF, 2pg/L TGFp y 2% de lisado humano de plaquetas (hPL) y pterostilbeno a distintas concentraciones ; 0 nM pterostilbeno (fO), 100 nM de pterostibeno (F1 ); 250 nM de pterostibeno (F2); 500nM de pterostibeno (F3) y 1000nM de pterostibeno (F4). La situación control corresponde al uso de los medios basal con 10% FBS. Todos los experimentos se realizaron por 3 pasajes, dividiendo las células cada 5 días. Después de los experimentos, se midió el número de células mediante la prueba de exclusión de azul de tripón.

Como se ve claramente en la figura 1 A, después de los 3 pasajes, el medio con peor expansión celular fue la condición solo con 2% hPL, sin adición de Pterostilbeno. Sorprendentemente, la segunda condición con menor expansión fue el medio con FBS al 10%, que es la media estándar para expansión celular a nivel internacional. Todas las condiciones de la invención obtienen mejores resultados, y el mejor resultado fue 2% hPL y 500nM de pterostilbeno (F3), logrando casi 200,000 células más que los medios con FBS. La Figura 1 B muestra imágenes de los cultivos al final de los experimentos, en todos los ensayos se mantienen las características morfológicas de las MSCs derivadas de cordón umbilical. Además, las células cultivadas después de tres pasajes mantienen el fenotipo de MSC, (Figura 1 C), así como el potencial de diferenciación (Figura 1 D).

Ejemplo 2: Expansión de MSC en medio de cultivo de la invención SF/XF.

Las células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical se expandieron en 6 condiciones diferentes, en donde los medios básales utilizados fueron el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sin glucosa y la mezcla de nutrientes F12 de Ham (DMEM / F12) complementada con 25 pg/L bFGF, 2pg/L TGF-b. Las condiciones fueron los medios básales más: 10% FBS; 0% de lisado de plaquetas humano (hPL) (incompleto); 0% de hPL y 100 nM de pterostilbeno (F1 ); 0% de hPL y 250 nM de pterostilbeno (F2); 0% de hPL y 500nM de pterostilbeno (F3) y 0% de hPL y 1000nM de pterostilbeno (F4). Todos los experimentos se realizaron por 3 pasajes, cosechando las células cada 5 días. Después de los experimentos, se midió el número de células mediante la prueba de exclusión de azul de tripón. Los resultados se muestran en la Figura 2A. Después de 3 pasajes, el medio con peor expansión celular fue la condición 0% hPL, es decir, el medio basal solamente. Los medios básales suplementados solo con Pterostilbeno tienen mejores resultados, y la condición F2 tiene mejores resultados que los medios con 10% de FBS. La Figura 2B muestra imágenes de los cultivos al final de los experimentos, en todos los ensayos se mantienen las características morfológicas de las MSC derivadas de UC. Ejemplo 3: Cultivo celular en macrocarriers de células madre y otros tipos de células para la producción de EV y exosomas en condiciones con componentes animales y en condiciones SF /X F.

Se empleó el macrocarrier comercial, denominado Bionoc II, el que es pesado en condiciones de esterilidad, bajo campana, luego el macrocarrier es sometido a un tratamiento con luz UV durante 30 minutos. Posteriormente se colocaron los carriers en un matraz Erlenmeyer de 300 mi, y se sembraron las células en proporción de 4 millones células/gr.

Para el cultivo celular, las células se sembraron en 50 mi de medio DMEM + FBS al 10%, para ambos experimentos con la precaución de que el carrier quede completamente cubierto con medio. Los matraces Erlenmeyer se dejan en incubación con control de temperatura y CO2, sin agitación Over Night (O.N.), para que las células se adhieran al carrier.

Posteriormente para el medio de producción de exosomas tradicional se agreganl 50ml de medio DMEM+FBS al 10% al medio de cultivo correspondiente a cada matraz y se dejan en incubación con control de temperatura y CO2 y agitación constante de 20rpm. Por otra parte, para la producción de exosomas con el medio de cultivo SF/XF de la invención, se debe retirar todo el DMEM+FBS al 10% con 2 lavados con PBS y proceder a agregar 150ml de medio de medio de cultivo SF/XF de la invención al cultivo. Para determinar si las células se encuentran adheridas al Bionoc II se realiza una tinción de Hoechst (1 :2000), se incuba durante 10 minutos y se observa al microscopio.

El método tradicional de producción de exosomas del cultivo celular con DMEM necesita la alternación con medios de cultivo sin suplementos animales como FBS o hPL, por lo cual se realiza una“inducción por restricción calórica (starving)” en donde se cambia por el mismo volumen el medio DMEM+FBS, por DMEM sin rojo fenol con tal de inducir la producción de exosomas. El sobrenadante se puede recolectar un par de días después de la inducción. Si se requiere colectar más sobrenadante se debe repetir la inducción. Para este ejemplo los sobrenadantes fueron retirados a los días 8 y 1 2 del experimento, como se observa en la Fig.3A.

Por otra parte, el cultivo celular con el medio SF/XF de la invención, no requiere inducción por restricción calórica, por lo cual permite una producción sostenida de vesículas extracelulares sin someter a cambios metabólicos a la célula, por lo mismo el cultivo sostenido permite el enriquecimiento de partículas, especialmente a las de un tamaño menor a los 150 nm , como se puede apreciar en la Figura 3B. Del cultivo celular con el medio SF/XF de la invención de puede comenzar la recolección del sobrenadante de forma sostenida, en el ejemplo se recolectaron los días 5, 8 y 1 2, como se observa en la Figura 3A. Cada vez que se recolectó sobrenadante, se repuso el mismo volumen con el medio de cultivo de la invención.

El sobrenadante obtenido de los cultivos celulares fue centrifugado a 600g durante 10 minutos a 4°C y posteriormente filtrado utilizando unidades de filtración PES de 0,22 pm. Para luego ser congelados o procesados directamente en ultracentrífuga.

Los sobrenadantes se procesaron en ultracentrífuga a 100.000 g durante 1 hora y 10 min utos a 4°C, esta etapa se repitió hasta procesar el volumen total del sobrenadante. Se eliminó el sobrenadante y los pellets se soltaron utilizando un vortex. Posteriormente los pellets fueron sometidos a dos lavados con tal de eliminar posibles contaminantes. Para ello, se resuspendieron los pellets en PBS filtrado alcanzando un volumen final de 10 mi, y se centrifugaron a 100.000g a 4°C over night. Posteriormente se procedió a realizar el último lavado, para lo cual se eliminaron los sobrenadantes y se resuspendieron los pellets en un volumen final de 10ml y se procesaron por 1 hora y 10 minutos a 4°C en ultracentrífuga a 100.000 g. Finalmente se elimina el sobrenadante, los pellets se pasan por un vortex y se pueden alicuotar para su almacenamiento.

La cuantificación de partículas se hizo utilizando una dilución del pellet en PBS filtrado (1 :100), utilizando NanoSight NS300. Esta cuantificación permite demostrar que primero el medio SF/XF de la invención logra producir aproximadamente 1 ,6 veces más partículas totales que el método tradicional. Segundo, el medio SF/XF de la invención logra producir partículas menores a 150nm en una proporción de 23 veces más que la forma tradicional, al día 12.

Ejemplo 4: Biopreservación de productos de terapia celular de grado clínico

Aproximadamente 200,000 células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical se almacenaron en 200 mI de solución comercial de biopreservación (CBS), por sus siglas en inglés) como control y 200 mI de CBS complementados con el suplemento de medio de la invención. Las muestras se mantuvieron a 4°C por tres días. Las células se re suspendieron en DMEM base, y la viabilidad se evaluó mediante ensayo de exclusión de azul de tripón. El medio CBS con los distintos suplementos de medio de la invención (pterostilbeno, pterostilbeno + Zn ⁺² , ISO-1 + Zn ⁺² , pterostilbeno + ISO-1 + Zn ⁺² ) dieron una mejor viabilidad celular, para el caso de Pterostilbeno 0,1 mM es aproximadamente 10% mejor en comparación con CBS solo (P <0,01 ; prueba t de Student), Figura 4A. La adhesión celular se evaluó 24 horas después de que las células se sembraron en placas de 10 mm. Se observaron más células adheridas en la condición de CBS con el suplemento de medio de cultivo (pterostilbeno 0,1 mM, Zn 2,5 mM y/o ISO-1 0,1 nM), en comparación con CBS solo (Figura 4B), y más células mantuvieron su potencial de migración cuando se evaluaron aquellas células preservadas con el suplemento del medio de cultivo de la invención con CBS frente a CBS (Figura 4C). Finalmente, las células preservadas con CBS proliferaron menos que las preservadas en CBS con pterostilbeno (Figura 4D). Por lo tanto la solución de la invención mejora la funcionalidad de las células después de 3 días de biopreservacion.

Ejemplo 5: Criopreservación de productos de terapia celular de grado clínico.

Aproximadamente 500,000 células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical se almacenaron en 500 mI de una solución en base a plaquetas humanas, 2,5 unidades de heparina, 5% de DMSO y 2 mM de Pterostilbeno se comparó con una solución de criopreservación comercial y como control se usó suero bovino fetal (FBS) al 90% y 10% de DMSO. Las muestras fueron congeladas progresivamente 1 °Celsius/min hasta que alcanzaron -80 °C y se almacenaron a esa temperatura durante un día. Las muestras se sumergieron en nitrógeno líquido (-196 °C) y se mantuvieron criopreservadas durante más de 7 días.

Posteriormente, las muestras se descongelaron rápidamente y el medio para criopreservación se eliminó por centrifugación. Las células se re suspendieron en medio DMEM base y la viabilidad se evaluó mediante ensayo de exclusión de azul de tripón. Los resultados se muestran en la Figura 5.

La solución de criopreservación con 2 uM de pterostilbeno dio una viabilidad similar a la solución de criopreservación convencional (control FBS+10%DMSO), con la ventaja que esta solución es XF y presenta una reducción de 50% en la composición de DMSO que a concentraciones mayores a 5% puede ser toxico para el ser humano. Con respecto a la solución comercial el porcentaje de viabilidad fue significativamente mayor, en un 7% (Figura 5A). El efecto neto del pterostilbeno se observa en la figura 4B, donde se aprecia que la solución de criopreservación basada en plaquetas humanas sin pterostilbeno tiene un porcentaje de viabilidad aproximadamente 20% menor que la solución conteniendo Pterostilbeno. (P <0.05 mediante la prueba t de Student). Se sembraron células y se evaluó su morfología y adherencia durante una semana. Las células que fueron almacenadas con Pterostilbeno mostraron una mejor adherencia 24 horas después de ser sembradas frente a las que no fueron almacenadas en esta condición (Figura 5C). Las células preservadas con el medio de cultivo para criopreservación de la invención, presentan también una mejor capacidad de migración frente a aquellas que fueron criopreservadas con otro método.

Ejemplo 8: Efecto preventivo antioxidante de Pterostilbeno en cultivo de células.

Células madre mesenquimales provenientes obtenidas de cordón umbilical, que se encontraban en pasaje 4 se cultivaron en presencia de pterostilbeno como método de pretratamienio frente a un estrés oxidativo. 100.000 células fueron sembradas en cada pocilio, durante 4 horas en presencia de diferentes concentraciones de Pterostilbeno y posteriormente sometidas a estrés oxidativo por inducción con 1 ,5mM, H2O2. En la figura 5, se observa un gráfico que muestra el porcentaje de células vivas (Anexin V/7AAD) después de la inducción con 1 ,5mM de H2G2, observándose una resistencia a estrés oxidativo a 50 mM de pterostilbeno.

Los ejemplos descritos deben ser considerados ilustrativos y no limitativos, y demuestran las ventajas de la invención en todos los aspectos indicados para la manufactura de productos para terapia basados en células humanas del medio, suplemento para medio y solución de la invención y los métodos que la emplean, los que se protegen en las reivindicaciones adjuntas.