LA PIEL Y MUCOSAS

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se encuentra dentro del sector farmacéutico, y más concretamente en el campo de las composiciones para el tratamiento de infecciones bacterianas de la piel con compuestos antibacterianos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La piel humana sana está colonizada por numerosos microorganismos que son responsables del mantenimiento de su equilibrio microbiano natural. De hecho, su microbiota normal está constituida por poblaciones residentes o transitorias de bacterias y diversas especies de hongos (en particular levaduras), algunas de ellas muy estables. Los microorganismos residentes más habituales de la piel se limitan a algunos géneros de bacterias Gram+, cuyas especies pueden llegar a representar hasta el 50%. Entre ellos destacan las pertenecientes al Phylum Firmicutes con bajo contenido en G+C (géneros Streptococcus y Staphylococcus) y al Phylun Actinobactería (géneros Corynebacteríum y Propionibacteríum). Los restantes grupos bacterianos, incluidas las bacterias Gram-, son mucho más transitorios ya que alrededor del 70% sufren cambios con el paso del tiempo y las condiciones del individuo. Hay, sin embargo, una serie de bacterias causantes de infecciones cutáneas como la mastitis y el acné, entre las que destacan por su frecuencia S. aureus y Propionibacteríum acnés, respectivamente. La mastitis infecciosa de las glándulas mamarias se caracteriza por múltiples síntomas locales y sistémicos en madres lactantes. Es causada principalmente por S. aureus y especies de Streptococcus, que suelen ser multirresistentes a los antibióticos, por lo que el tratamiento mediante antibioterapia es, en muchos casos, insatisfactorio y el problema tiende a ser recurrente. Su incidencia oscila entre el 3-33% de ellas, y determina un alto porcentaje de cese de la lactancia. Por su parte, el acné común (acné vulgaris) es una infección de la piel, en particular de aquellas áreas con mayor densidad de folículos sebáceos. Se trata de la infección cutánea más común entre los seres humanos, debida a cambios de los folículos pilosos y las glándulas sebáceas asociadas, que tienen lugar principalmente en la pubertad (el 85% de los adolescentes padecen en algún grado este problema), como una respuesta multifactorial que incluye mecanismos hormonales, microbiológicos e inmunológicos. El empleo de péptidos antibacterianos producidos por bacterias (bacteriocinas) frente a infecciones bacterianas, se está consolidando como alternativa a la falta de quimioterápicos, debido a la resistencia a los antibióticos. Las bacteriocinas están hoy en el punto de mira de novedosos estudios sobre su aplicación frente a patógenos comunes en clínica, por lo que es ya una tendencia creciente en el campo de las composiciones farmacéuticas y en los métodos de tratamiento antibacterianos (revisado por Montalban- López, M., Sánchez-Hidalgo, M., Valdivia, M., Martinez- Bueno, M., and Maqueda, M. 201 1 . Are bacteriocins underexploited? Novel applications for ancient antimicrobials. Curr. Pharm. Biotechnol. 12: 1205-1220). Ejemplos de ello son las patentes existentes protegiendo el uso de péptidos antibióticos (W09957281 , WO2004082701 , US5635594, CA24531 12) o de bacteriocinas producidas por bacterias (Mutacin CA2268744 y S6521596, gallidermin CA1338310 (C)- 1996-05-07 y de la Enterocin L50A/B producida por E. faecalis SL-5 que ha sido registrada como Lactopadt™ Acné como ingrediente cosmético (INCI) (CTFA file No. 9082) por Cell Biotech Co. Ltd. (KOSDAQ) con el objetivo de utilizarla con propósitos cosméticos, en las capas superiores de la piel).

Las composiciones que integran bacteriocinas tienen la ventaja de evitar el desarrollo de resistencias por patógenos que colonizan e infectan la piel. Por este motivo hay algunas publicaciones sobre la habilidad de algunas bacteriocinas para inhibir a P. acnés, reduciendo las lesiones inflamatorias causadas por esta bacteria. Tal es el caso de las producidas por Lactococcus sp. HY 449 o Enterococcus faecalis SL-5 antes comentada. De forma similar se ha descrito la utilización de bacteriocinas, incluida AS- 48, frente a diferentes cepas MRSA de Staphylococcus, y/o aquéllas productoras de mastitis.

Aquí se propone el empleo de la bacteriocina AS-48 producida por especies de Enterococcus, en combinación con un agente potenciador, la lisozima, un enzima que hidroliza la pared celular de las bacterias, que incrementa la potencia de AS-48 con el fin de combatir especies patógenas causantes de infecciones en la piel, en concreto P. acnés y S. aureus. La posible explicación de esta sinergia es un efecto de barreras múltiples que se produce debido a que la aplicación simultánea, a dosis moderadas, de varios factores que actúan a diferentes niveles, resulta mucho más eficaz que la aplicación de uno sólo, que, al actuar a un solo nivel, requiere una dosis más alta (Leistner, L. 2000. Basic aspects of food preservation by hurdle technology. Int. J. Food Microbiol. 55: 181 -186).

La bacteriocina AS-48 es una proteína circular de síntesis ribosómica constituida por 70 aminoácidos naturales. Su naturaleza es fuertemente antipática lo que le permite adaptarse a diferentes condiciones ambientales. Así en soluciones acuosas, AS-48 adopta una forma dimérica (DF-I) en la que expone dominios hidrófilos, pero esta asociación cambia en ambientes hidrofobicos como sería el caso de la piel o la presencia de membranas celulares, adoptando una nueva forma dimérica (DF-II) en la que se exponen los dominios hidrófobos, lo que sin duda facilita su inserción en membranas fuertemente cargadas negativamente como ocurre en el caso de las bacteria, pero sin actividad frente a células eucariotas.

AS-48 ha sido reconocida como una de las bacteriocinas con mayor potencialidad, debido a su amplio espectro de acción frente a las membranas bacterianas de la mayoría de las bacterias Gram+ ensayadas y algunas bacterias Gram-. Favorece su actividad y por ende sus posibles aplicaciones biotecnológicas, la gran estabilidad que AS-48 presenta en amplios intervalos de pH, temperatura y tratamientos surfactantes, debido a sus características estructurales (una proteína circular), lo que justifica el éxito que tiene su empleo en la bioconservación de alimentos.

La lisozima, también llamada 1 ,4 N-acetil muramidasa, es un enzima hidrolítica que cataliza específicamente la hidrólisis de las uniones beta 1 ,4 existentes entre los residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina del peptidoglicano bacteriano, un compuesto mayoritario de la pared celular bacteriana, en particular de las bacterias Gram-positivas. Este enzima carece de actividad proteasa, quinasa, lipasa, amilasa o fosfatasa y se encuentra de forma natural en numerosas secreciones (lágrimas, mocos, saliva y leche) y en gran cantidad en la clara de huevo, que es su fuente de obtención para uso industrial (Sigma).

La aplicación de múltiples barreras en el control de los microorganismos puede tener un efecto inhibidor aditivo o incluso sinérgico, sobre todo si actúan sobre distintas dianas del microorganismo. Este es el caso que describimos en el que AS-48 forma poros en la membrana celular, y dicha actividad se favorecida por la acción de lisozima que al hidrolizar parcialmente la pared celular, facilita el acceso de AS-48 a su diana, la membrana citoplasmática bacteriana.

Actualmente hay un gran interés en la aplicación de bacteriocinas solas o en combinación con otros inhibidores y también con agentes físicos o químicos que actúan de forma sinérgica frente a bacterias patógenas y/o alterantes, permitiendo en algunos casos ampliar su espectro de acción a bacterias Gram-negativas. Así, la nisina se ha empleado conjuntamente con otras bacteriocinas y con conservantes químicos (nitritos) para el control de Clostrídium. Las altas presiones han sido combinadas con diversas bacteriocinas y cepas productoras de las mismas (nisina, lacticina 3147, lacticina 481 , AS-48, TAB 57, pediocina AcH y las enterocinas 1 , A y B) en diferentes alimentos para el control de la microbiota alterante y patógena. Se ha comprobado también que la nisina y la lisozima actúan sinérgicamente en el control de Lactobacillus y S. aureus y que su espectro puede ser ampliado a bacterias Gram- mediante la adición de agentes quelantes. De igual forma, AS-48 se ha combinado con éxito con otros antibacterianos, incluida la lisozima, para la eliminación de patógenos en alimentos.

No se puede dejar de mencionar la existencia de tratamientos que podrían ser considerados erróneamente como medicina naturopática u homeopática, como algunas aplicaciones caseras empleadas para combatir el acné mediante clara de huevo (por su riqueza en lisozima) así como con yogur, caliza o miel, por citar algunas. Sin embargo, estos tratamientos suelen ser tan inocuos como inefectivos para la eliminación de una bacteria como P. acnés de difícil acceso por estar localizada en las glándulas sebáceas.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

El objeto de la presente invención es una composición que comprende AS-48 en combinación con lisozima para el tratamiento y la profilaxis de infecciones bacterianas de la piel y mucosas. Además, esta composición permite eliminar totalmente las baterías P. acnés y S. aureus. Más concretamente, se describe el uso de estas composiciones, con los principios activos disueltos en extractos adecuados, frente a P. acnés y S. aureus, de forma estabilizada en un preparado farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con ensayos de actividad in vitro de los principios activos objeto de esta invención, disueltos en gel neutro o en soluciones acuosas, o bien emulsionados en una crema a base de glicerina, el vehículo más apropiado para la actividad es la crema, seguida del gel neutro y la solución acuosa, ambos por igual.

Estas composiciones permiten el control de bacterias, especialmente de las especies de Staphylococcus involucradas en infecciones y superinfecciones de la piel, así como de P. acnés, responsable de las lesiones inflamatorias {acné vulgarís), que en muchas ocasiones carecen del tratamiento antibiótico adecuado por haberse desarrollado resistencias.

Las composiciones se utilizarán preferentemente mediante aplicación tópica, dos o más veces al día, formulándose en crema, gel y/o disolución acuosa.

La invención propuesta presenta las siguientes ventajas:

• La actividad inhibidora de AS-48 se incrementa por un factor de 10 en presencia de lisozima

• Las composiciones no han producido, en ninguno de los casos ensayados in vivo, irritación (alergias, eritemas) en la piel, a pesar de haberse empleado tópicamente de forma repetida sobre personas sanas durante numerosos días.

• Los preparados no sufren disminución o pérdida de actividad durante su almacenamiento a diferentes temperaturas, o por interacción de las moléculas activas con compuestos cosméticos (emulsionantes y/o componentes lipidíeos o acuosos) ni tampoco por antagonismo entre los diferentes agentes empleados.

• Se ha comprobado que AS-48 sola o en combinación con lisozima carece de actividad hemolítica.

• También se ha confirmado la ausencia de citotoxicidad sobre la línea celular CCD18 de fibroblastos (procedente de colon humano normal) y sobre la línea epitelial de glándula mamaria humana MCF 10A. • Se ha confirmado que AS-48 es débilmente inmunogénica cuando se administra intramuscularmente a animales de experimentación, ya que la obtención de sueros inmunes requirió la administración repetida de AS-48 junto al coadyuvante de Freund (Maqueda et al., 1993. Neutralizing Antibodies against the Peptide Antibiotic AS-48". Antimicrobial Agent and Chemotherapy,

1993. 37, 148-15).

• Se ha seleccionado AS-48 como agente antibacteriano para infecciones de la piel por sus características bioquímicas y estructurales. El carácter antipático de AS-48 y su particular mecanismo de acción favorecido por las diferentes conformaciones que AS-48 adopta en función del ambiente en el que se encuentra, facilita su acceso a las diferentes capas de la piel donde se encuentran los estafilococos y también a los folículos sebáceos obstruidos por el exceso de sebo, donde se encuentra P. acnés.

• Debido a las características estructurales que AS-48 presenta, su actividad antibacteriana y estabilidad es muy superior a la de la mayoría de las bacteriocinas descritas frente a los patógenos propuestos, incluida L50A/B que ha sido registrada como Lactopadt™ Acné.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La concentración de un agente antibacteriano necesaria para eliminar completamente una bacteria se denomina "concentración mínima bactericida" (CMB). Esta CMB se expresa en función del logaritmo de las unidades formadoras de colonias (log de UFCs) resultantes, tras la incubación de la bacteria en presencia de compuestos antibacterianos a diferentes concentraciones, bien de forma conjunta y/o por separado.

En las figuras 1 y 2 se exponen la concentración mínima bactericida (CMB) de AS-48 ensayada sola (fig. 1 ) y en presencia de lisozima (fig. 2) frente a P. acnés a lo largo del tiempo (144 h) en un cultivo de laboratorio a 37 ^e C. En la figura 3 se expone el efecto sinérgico de la lisozima y AS-48 en la eliminación de S. aureus CECT 976 en un cultivo de laboratorio (BHI a 37 ^e C).

Figura 1.- Determinación de la CMB de AS-48 frente a P. acnés en BHI. La viabilidad de P. acnés se expresa en UFC/ml. Figura 2.- Determinación de la CMB de AS-48 combinada con 4 mg/ml de lisozima frente a P. acnés en BHI. La viabilidad de P. acnés se expresa en UFC/ml.

Figura 3.- Determinación de la CMB de AS-48 (10 μg/ml) en combinación con lisozima (8 mg/ml) frente a S. aureus CECT 976 en medio BHI a 37 ^e C. La viabilidad de S. aureus se expresa como log de las UFC/ml.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe composiciones que comprenden la bacteriocina AS- 48, una molécula muy estable que posee una amplia actividad antibacteriana, en combinación con lisozima, un enzima con actividad muramidasa, que potencia de forma significativa la actividad de la primera, para el control de Propionibacterium acnés, Staphylococcus aureus y otras bacterias involucradas en infecciones de la piel.

Entre las afecciones producidas por infecciones bacterianas que se pueden tratar con las composiciones de la presente invención se incluyen las lesiones producidas por P. acnés {acné vulgaris) y las infecciones y/o superinfecciones dérmicas debidas a S. aureus, una bacteria que es también el agente infeccioso más importante en los pacientes que sufren eczema atópico.

El compuesto activo AS-48 incrementa sensiblemente su actividad en presencia de lisozima, mientras que la lisozima, por sí sola, no presenta actividad en las condiciones de ensayo).

El efecto sinérgico que tiene esta aplicación conjunta permite reducir de forma significativa la dosis necesaria de AS-48 para obtener el mismo efecto inhibidor, tanto "in vivo" como "in vitro" en el control de infecciones por los mencionados patógenos.

Las composiciones de la presente invención, cuya débil inmunogenicidad y escasa toxicidad ha sido confirmada (Maqueda, M. et al. "Neutralizing Antibodies against the Peptide Antibiotic AS-48". Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 1993. 37, 148-15) están formuladas preferentemente para aplicaciones tópicas. Las composiciones contienen los principios activos y reúnen las propiedades físico-químicas más convenientes para su aplicación tópica, considerando las características de las infecciones a tratar.

Visto el comportamiento de AS-48 en las diferentes formulaciones, y los diferentes niveles de sensibilidad de las bacterias ensayadas, se considera que, en el tratamiento frente a S. aureus, es más apropiado utilizar una base grasa como la crema a base de vaselina, para su aplicación a las concentraciones que luego se indican.

En el caso de P. acnés una formulación con compuestos grasos está contraindicado porque incidiría en el aumento de grasa en la piel, por lo que se recomienda el uso de gel neutro o solución acuosa, a las concentraciones después expuestas.

MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN La bacteriocina usada en las composiciones y métodos de la presente invención es AS-48 obtenida de sobrenadantes de la cepa probiotica UGR10 de Enterococcus faecalis aislada de quesos (Cebrián, R., Baños, A, Valdivia, E., Pérez-Pulido, R , Martínez- Bu en o, M , Maqueda M. 2012. Characterization of functional, safety, and probiotic properties of Enterococcus faecalis UGRA10, a new AS-48-producer strain. Food Microbiol. 30, 59-67).

Como medio de cultivo de la cepa productora se emplearán residuos de la industria láctea en las condiciones previamente optimizadas en nuestro laboratorio. La lisozima utilizada es comercial y se obtiene a partir de clara de huevo (Sigma L6876).

Formulaciones/composiciones desarrolladas Composición frente a S. aureus

Crema: emulsión de vaselina filante fundida con los agentes antibacterianos en proporción entre 100 y 200 μg AS-48 y 8 mg de lisozima por g de crema. La emulsión se lleva a cabo empleando un homogenizador. Composición frente a P. acnés

Gel neutro adicionado de los agentes antibacterianos en proporción entre 10 y 20 μg de AS-48 y 4 u 8 mg de lisozima (Sigma) por g de gel. La disolución se llevará a cabo empleando un homogenizador.

Solución acuosa adicionada de los agentes antibacterianos en proporción entre 10 y 20 μg de AS-48 y 4 u 8 mg de lisozima (Sigma) por mi. La mezcla se homogenizará bien antes del uso. Datos comparativos de la eficacia de AS-48 sola o en combinación sinérgica con lisozima

En las figuras se muestran la actividad de AS-48 ensayada a diferentes concentraciones, sola o en combinación con lisozima frente a P. acnés (figuras 1 y 2) y frente a S. aureus (figura 3)

Tabla 1.- Crecimiento de P. acnés (UFC/ml) en BHI a lo largo de 144 h de incubación en anaerobiosis en presencia de diferentes concentraciones de AS-48

Lisozima

4 mg/ml

+ 4,30 3,23 2,41 1 ,20 0 0 0

AS-48

0,1 μιτι/ml

Tabla 2 - Crecimiento de P. acnés (UFC/ml) en BHI a lo largo de 144 h de incubación en anaerobiosis en presencia de AS-48, lisozima o combinaciones de ambos

En la tabla 1 se proporcionan los datos de la CMB frente a P. acnés de distintas composiciones conteniendo concentraciones crecientes de AS-48 (de 0,01 a 10 μςΛπΙ) y en la tabla 2 los de la CMB de AS-48 combinada con lisozima (4 mg/ml) frente a la misma bacteria. Los controles sin agentes activos y con lisozima por separado, también se exponen.

• Los resultados asociados a la tabla 1 se presentan en la figura 1 y muestran que en un sistema cerrado como un cultivo de laboratorio, se requiere una concentración de 10 μg/ml de AS-48 para eliminar a P. acnés en 48 h. Concentraciones más bajas, como 5 o 1 μg/ml de AS-48 requieren de 96 h o 144 h respectivamente, para ejercer el mismo efecto.

• Sin embargo la actividad de AS-48 (figura 2) se incrementa por un factor de 10 en presencia de lisozima (4 mg/ml), siendo suficientes 0,1 μg/ml de AS-48 para eliminar a P. acnés en 48 h. Se observa, además, que la lisozima carece completamente de actividad en las condiciones del ensayo.

Tabla 3.- Crecimiento de S. aureus (UFC/ml) en BHI a lo largo de 24 h de incubación en presencia de AS-48, lisozima o combinaciones de ambos

En la tabla 3 se muestran los resultados obtenidos frente a S. aureus, con AS-48 sola y adicionada de lisozima (8 mg/ml).

• Como puede observarse en la figura 3, 10 μςΛηΙ de AS-48 no son capaces de eliminar a la bacteria, mientras que la adición de lisozima (8 mg/ml) a la misma concentración de AS-48, consigue su total eliminación en 14 h, confirmando así el efecto sinérgico entre ambos compuestos activos, en condiciones de laboratorio.

• Estos resultados ponen además de manifiesto que S. aureus es menos sensible que P. acnés a esta bacteriocina.

Se considera que, al tratarse de aplicaciones tópicas, las formulaciones, que serán diferentes para ambas bacterias, serán preparadas incrementando las concentraciones de los principios activos, de acuerdo con lo propuesto a continuación:

• Dada la inocuidad confirmada de los preparados y de acuerdo con la eficacia de los vehículos utilizados, que ha sido previamente confirmada en ensayos de actividad de los principios activos in vitro, es preferible aumentar al menos hasta al menos 1 mg/ml la concentración de AS-48 en los preparados neutros o acuosos (por la menor eficacia de éstos y la dificultad de acceso a la bacteria) y en la composición con base de vaselina filante, con el fin de que quede asegurada su eficacia in vivo frente a Propionibacterium acnés y Staphylococcus aureus, respectivamente.

• En el caso de la lisozima empleada con éxito a razón de 4 mg/ml frente a P. acnés, es preferible incrementar su concentración al doble (8 mg/ml o bien 8mg/g). En el caso de Staphylococcus aureus se mantiene la concentración ensayada (8 mg/ml o bien 8 mg/g) por los óptimos resultados que se obtienen.