Campo de la invención La presente invención se relaciona con nanopartículas recubiertas de gelatina, en donde la gelatina está unida covalentemente, el proceso de obtención de dichas nanopartículas, así como su uso en técnicas de diagnóstico por imagen y en la liberación controlada de fármacos. Antecedentes de la invención

En los últimos años, ha aumentado el uso de nanopartículas de óxido de hierro, que presentan comportamiento superparamagnético, en aplicaciones biomédicas tales como agentes de contraste para imagen por resonancia magnética (MRI), reconocimiento celular y administración de fármacos, así como el uso de up-converting nanophosphors (UCNP, nanopartículas fosforescentes de conversión ascendente) para imagen por fluorescencia óptica.

Las nanopartículas desnudasen general no son estables en agua a pH neutro o en fluidos fisiológicos, en donde tienden a aglomerarse y precipitar, por ello es necesario estabilizar estas nanopartículas, ya sea mediante estabilización estérica o electrostática.

Se han estudiado diferentes recubrimientos para modificar la superficie de las nanopartículas que permitan además estabilizarlas, aumentar su biocompatibilidad y mejorar la captación celular [Laurent S. et al. Future Med. Chem. 2010, 2, 427-449]. La estabilización y solubilización en agua generalmente se realiza por recubrimiento con moléculas orgánicas, incluyendo moléculas orgánicas pequeñas, tensioactivos, polímeros, biomoléculas, recubrimientos inorgánicos tales como sílica, sustancias metálicas o no metálicas, óxido de metal o sulfuro de metal. La funcionalización con polímeros permite diseñar las propiedades de las nanopartículas.

Se han descrito nanopartículas de óxido de hierro solubles en agua funcionalizadas con ácido azelaico, por oxidación de nanopartículas de óxido de hierro recubiertas con ácido oleico [Herranz F. et al. Contrast Media Mol. Imaging 2008, 3, 215-222]. Dichas nanopartículas son compatibles con medios acuosos. También se han descrito nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de gelatina [Gaire B. et al. J. Microencapsul. 2011, 28, 240-247], en donde la carga superficial inducida por el pH de la gelatina se utiliza para la adsorción de la misma sobre la superficie de la nanopartícula de óxido de hierro. Las nanopartículas obtenidas son estables, solubles en agua y presentan una distribución estrecha del tamaño de partícula. Las ventajas mencionadas en este documento en relación al recubrimiento de gelatina son una disminución de la toxicidad y un aumento de la captación celular.

Wu y colaboradores [Wu W. et al. Nanoscale Res. Lett. 2008, 3, 397-415] han descrito nanopartículas de óxido de hierro funcionalizadas con materiales orgánicos o inorgánicos y mencionan también la posibilidad de funcionalizar las nanopartículas con gelatina, lo que proporcionaría las ventajas de su uso como agente gelificante, emulsionante hidrofílico así como una mayor biocompatibilidad.

El documento WO 2009/040811 describe nanopartículas magnéticas compuestas de gelatina/óxido de hierro, en donde la gelatina proporciona estabilización adicional frente a la aglomeración de las nanopartículas, así como la presencia de grupos funcionales para la unión de ligandos apropiados, como por ejemplo adriamicina.

El documento WO 2009/072982 describe el recubrimiento de nanopartículas de óxido de hierro/gelatina con gelatina que se somete a una etapa posterior de reticulación por acción de una transglutaminasa. Las principales ventajas descritas para las nanopartículas de óxido de hierro recubiertas con gelatina es una estabilización adicional frente a la aglomeración así como la presencia de grupos funcionales para la unión de ligandos.

A pesar de que se han descrito nanopartículas recubiertas con moléculas orgánicas, existe la necesidad de desarrollar nuevas nanopartículas para mejorar la estabilidad en medios acuosos, toxicidad, biocompatibilidad y sobre todo el tiempo de permanencia en sangre de las nanopartículas descritas en el estado de la técnica, a la vez que se proporciona una unión fuerte y duradera entre el recubrimiento y el núcleo de la nanopartícula. Los autores de la presente invención han resuelto esta necesidad proporcionando nanopartículas en donde el núcleo de las mismas está unido covalentemente a un recubrimiento de gelatina.

Sumario de la invención En un primer aspecto, la invención se relaciona con una nanopartícula que comprende un núcleo y un recubrimiento de gelatina, en donde la gelatina está unida covalentemente al núcleo y en donde el núcleo se selecciona de entre un núcleo de óxido de hierro y un núcleo de UC P.

En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento de obtención de nanopartículas según se han definido en el primer aspecto, que comprende: (a) dispersar nanopartículas en donde el núcleo de las mismas se selecciona de entre un núcleo de óxido de hierro y un núcleo de UCNP y dicho núcleo está recubierto de un ácido monocarboxílico insaturado de fórmula (II),o una sal del mismo, en un disolvente, en donde n y m se seleccionan independientemente de un número de 1 a 10;

(b) tratar con un oxidante la dispersión de obtenida en la etapa (a);

(c) tratar la mezcla resultante de la etapa (b) con una disolución acuosa; y

(d) proveer gelatina y hacerla reaccionar con las nanopartículas obtenidas en la etapa (c) en presencia de un activador de ácido carboxílico, en donde la gelatina opcionalmente está unida covalentemente a un fármaco.

En un tercer aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende nanopartículas según se han definido en el primer aspecto, en donde las nanopartículas son monodispersas.

En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con un agente de contraste que comprende las nanopartículas definidas en el primer aspecto.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de las nanopartículas definidas en el primer aspecto, o del agente de contraste definido en el cuarto aspecto, para el diagnóstico por imagen de una patología del sistema cardiovascular. En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de las nanopartículas definidas en el primer aspecto, en donde dichas nanopartículas comprenden además un fármaco unido covalentemente a la gelatina, para preparar un medicamento.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de las nanopartículas definidas en el primer aspecto, en donde dichas nanopartículas comprenden además un fármaco unido covalentemente a la gelatina, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad que requiera dicho medicamento.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de de las nanopartículas definidas en el primer aspecto, en donde dichas nanopartículas comprenden además un fármaco unido covalentemente a la gelatina, para la liberación controlada del fármaco unido covalentemente a la gelatina.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de detección in vitro de una metaloproteinasa de la matriz extracelular en una muestra que comprende:

(a) contactar la muestra con nanopartículas según se han definido en el primer aspecto; y

(b) detectar un cambio en al menos una propiedad de la nanopartícula,

en donde la metaloproteinasa de la matriz extracelular es una gelatinasa.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el análisis termogravimétrico de las nanopartículas recubiertas de ácido azelaico obtenidas en el ejemplo 3 y de las nanopartículas recubiertas de gelatina obtenidas en el ejemplo 6 a partir de las nanopartículas del ejemplo 3.

La Figura 2 muestra las imágenes TEM de las nanopartículas recubiertas de gelatina del ejemplo 6 obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3.

La Figura 3 muestra las imágenes TEM de las nanopartículas recubiertas de gelatina del ejemplo 6 obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3.

La Figura 4 muestra el espectro de FTIR de nanopartículas recubiertas de gelatina del ejemplo 6 obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3 en comparación con la gelatina libre. La Figura 5 muestra las medidas del Magnetómetro de Muestra Vibrante (VSM) de las nanopartículas recubiertas de gelatina del ejemplo 6 obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3.

La Figura 6 muestra la intensidad de la señal de nanopartículas recubiertas de gelatina del ejemplo 6 obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3 en el hígado.

La Figura 7 muestra los valores de R ₂ en sangre de nanopartículas recubiertas de gelatina del ejemplo 6 obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3.

La Figura 8 muestra imágenes cinéticas de IRM (imagen por resonancia magnética) de nanopartículas de óxido de hierro sin gelatina obtenidas en el ejemplo 3.

La Figura 9 muestra imágenes cinéticas de IRM de nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de gelatina del ejemplo 6 obtenidas a partir de nanopartículas del ejemplo 3.

La Figura 10 muestra la biodistribución de las nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de gelatina del ejemplo 6 obtenidas a partir de nanopartículas del ejemplo 3.

La Figura 11 muestra la evolución del tamaño hidrodinámico y el potencial zeta de las nanopartículas de núcleo de Fe ₃ C"4 en función de la concentración de gelatina estudiado en el ejemplo 9.

La Figura 12 muestra los valores de T ₂ de nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de gelatina en función de la concentración de MMP-2 obtenidos en el ejemplo 10.

La Figura 13 muestra los valores de T ₂ de nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de gelatina en función de la concentración de MMP-1 obtenidos en el ejemplo 12.

Descripción detallada de la invención

Nanopartículas recubiertas de gelatina En un primer aspecto, la invención se relaciona con una nanopartícula que comprende un núcleo y un recubrimiento de gelatina, en donde la gelatina está unida covalentemente al núcleo y en donde el núcleo se selecciona del grupo que consiste en un núcleo de óxido de hierro y núcleo de UCNP.

La protección de nanopartículas de óxido de hierro y UCNP desnudas es un procedimiento habitual en el estado de la técnica ya que las nanopartículas de óxido de hierro y UCNP presentan una razón entre la superficie y el volumen elevada, hecho que implica una elevada energía superficial. En consecuencia, tales nanopartículas desnudas tienden a agregarse para minimizar la energía superficial. Además, las nanopartículas de óxido de hierro desnudas se oxidan fácilmente en presencia de aire, produciéndose con frecuencia una pérdida de magnetismo y dispersividad. Por ello es habitual proteger las nanopartículas con un recubrimiento con el fin de aumentar la estabilidad de las mismas.

Recubrimientos habituales conocidos por el experto en la materia son compuestos orgánicos que presentan un grupo hidrofílico, tales como un grupo hidroxilo (-OH), ácido carboxílico (-COOH), fosfato (-P(0)(OH) ₂ ), silanol (-SOH), entre otros, y un grupo hidrofóbico, tal como alquilo, alquenilo, alquinilo y arilo.

El término "alquilo" se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada lineal, cíclica o ramificada que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene insaturación, que tiene 1 a 30, preferiblemente de 5 a 20 átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo. Los radicales alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, por ejemplo F, Cl, Br y I, carbonilo y nitro.

El término "alquenilo" se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada lineal, cíclica o ramificada que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos un doble enlace, que tiene 2 a 30, preferiblemente de 5 a 20 átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo. Los radicales alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, por ejemplo F, Cl, Br y I, carbonilo y nitro.

El término "alquinilo" se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada lineal, cíclica o ramificada que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos un triple enlace, que tiene 2 a 30, preferiblemente de 5 a 20 átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo. Los radicales alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, por ejemplo F, Cl, Br y I, carbonilo y nitro.

El término "arilo" significa un radical hidrocarbonado monocíclico o policíclico que comprende 1, 2, 3 ó 4 núcleos aromáticos, dichos núcleos estando unidos con, y/o covalentemente enlazados uno con el otro, cada uno de dichos núcleos estando opcional e independientemente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, por ejemplo F, Cl, Br y I, carbonilo y nitro.

El término "covalente", "unión covalente", "unido/a covalentemente", debe entenderse como la formación de un enlace entre dos átomos o grupos de átomos por compartición de pares de electrones.

La unión covalente entre el recubrimiento de gelatina y el núcleo de la nanopartícula de la presente invención se refiere a la unión a través de un enlace covalente entre un grupo amino o ácido carboxílico de la gelatina del recubrimiento y un grupo de la capa de protección de la nanopartícula capaz de formar un enlace covalente con dicho grupo amino o ácido carboxílico de la gelatina, tal como un ácido carboxílico, un amino, un hidroxilo, un aldehido, una cetona, un haloalquilo, etc.

En una realización de la invención, la unión covalente de la gelatina al núcleo es a través de un puente de ácido dicarboxílico de fórmula (I),

(I)

en donde n es un número de 1 a 10, más preferiblemente n se selecciona de un número de 3 a 7, aún más preferiblemente n es 5.

El compuesto de fórmula (I) puede estar opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes, preferentemente 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo, preferentemente un alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, tere- butilo, pentilo y hexilo; halógeno, tal como F, Cl, Br y I; grupo nitro (-N0 ₂ ); grupo amino (- H ₂ ); hidroxilo (-OH); y grupo mercapto (-SH). Preferentemente, los sustituyentes se seleccionan del grupo que consiste en alquilo, preferentemente un alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, tere-butilo, pentilo y hexilo; halógeno, tal como F, Cl, Br y I; y grupo nitro (-

N0 ₂ ).

La unión covalente entre la gelatina del recubrimiento y el núcleo de la nanopartícula que se produce a través del ácido dicarboxílico de fórmula (I) hace referencia a la formación de un enlace amida -CO- H- a partir de uno de los grupos - COOH del compuesto de fórmula (I) y un grupo -NH ₂ de la gelatina, es decir, la gelatina se une al compuesto de fórmula (I) por el punto (a) que se muestra en la estructura (III) (en donde la línea discontinua indica el enlace formado). Por otra parte, el otro grupo -COOH del compuesto de fórmula (I) interacciona con la superficie del núcleo de óxido de hierro de forma iónica/covalente, es decir, el núcleo de óxido de hierro se une al compuesto de fórmula (I) por el punto (b) que se muestra en la estructura (III) (en donde la línea discontinua indica el enlace formado).

(III) El núcleo de las nanopartículas de la presente invención es de óxido de hierro o

UC P.

El tipo de óxido de hierro se puede seleccionar de cualquiera de los habituales en el campo de las nanopartículas y que son conocidos por el experto en la materia, como por ejemplo, Fe ₃ 0 ₄ (magnetita), a-Fe ₂ 0 ₃ (hematita), y-Fe ₂ 0 ₃ (maghemita), FeO (wustita), 8-Fe ₂ 0 ₃ y P-Fe ₂ 0 ₃ , entre otros. En una realización preferida de la invención, el óxido de hierro se selecciona de Fe ₃ 0 ₄ y y-Fe ₂ 0 ₃ .

El término "up-converting nanophosphor" o "UCNP" o "nanopartículas fosforescentes de conversión ascendente" hace referencia a nanopartículas de tierras raras que presentan la capacidad de convertir energía de luz del infrarrojo cercano (NIR, mar infrared) en luz visible o NIR de mayor energía. Ejemplos de UCNP son aquellas cuyo núcleo es de NaYF ₄ , NaGdF ₄ o NaGdFYb@NaGdF4,dopados con Yb, Er, Tb y/o Tm. Preferiblemente, las UNCP son NaGdF Yb _25% ,Tm _0; 5 _% @NaGdF , es decir, un núcleo de NaGdF ₄ dopado con Yb y Tm y alrededor una capa de NaGdF ₄ .

En el contexto de la presente invención, debe entenderse por "nanopartícula" una partícula de un tamaño hidrodinámico de desde 1 hasta 1000 nm, preferiblemente de 30 nm a 250 nm, aún más preferiblemente entre 30 nm y 100 nm o entre 90 nm y 140 nm, lo más preferido de 60 nm o 150 nm.

El término "tamaño hidrodinámico" hace referencia al diámetro del núcleo de las nanopartículas más el surfactante en la superficie. El tamaño hidrodinámico se determina para las nanopartículas en suspensión en un electrolito. En dicha suspensión se produce una distribución de iones del electrolito alrededor de la superficie de la nanopartícula. Un primera monocapa de iones de signo contrario unidos electrostáticamente a la nanopartícula y una zona alrededor de disolución envolvente que tiene un exceso de iones de signo contrario al de la nanopartícula, fuera de esta zona la concentración de iones es constante en todos los puntos e igual a la del electrolito. El diámetro de la monocapa y la zona envolvente es el tamaño hidrodinámico. El tamaño se mide en tampón fosfato 10 mM, a 25 °C, pH 7, 1, en un equipo Zetasizer nanoZS de Malvern.

Las nanopartículas de óxido de hierro se pueden clasificar en nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas (SPIO, supermagnetic iron oxide), que presentan un tamaño hidrodinámico mayor que 50 nm, y nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas ultrapequeñas (USPIO, ultrasmall superparamagnetic iron oxide), que presentan un tamaño hidrodinámico menor que 50 nm.

En una realización preferida de la invención, el potencial zeta de las nanopartículas recubiertas de gelatina definidas de la presente invención está comprendido entre -5 mV y -60 mV. Preferiblemente, el potencial zeta de las nanopartículas está comprendido entre -5 mV y -25 mV en el caso de nanopartículas cuyo tamaño hidrodinámico está comprendido entre 30 nm y 70 nm, preferiblemente 60 nm. Preferiblemente, el potencial zeta de las nanopartículas está comprendido entre -30 mV y -60 mV en el caso de nanopartículas cuyo tamaño hidrodinámico está comprendido entre 90 nm y 140 nm, preferiblemente 110 nm. Más preferiblemente, el potencial zeta de las nanopartículas está comprendido entre -10 mV y -15 mV en el caso de nanopartículas cuyo tamaño hidrodinámico está comprendido entre 30 nm y 70 nm, preferiblemente 60 nm. Más preferiblemente, el potencial zeta de las nanopartículas está comprendido entre -40 mV y -50 mV en el caso de nanopartículas cuyo tamaño hidrodinámico está comprendido entre 90 nm y 140 nm, preferiblemente 110 nm.

El término "potencial zeta" o ζ hace referencia a una medida de la carga superficial de las nanopartículas, determinado. El potencial zeta se determina para las nanopartículas en suspensión en un electrolito. En dicha suspensión se produce una distribución de iones del electrolito alrededor de la superficie de la nanopartícula. Un primera monocapa de iones de signo contrario unidos electrostáticamente a la nanopartícula y una zona alrededor de disolución envolvente que tiene un exceso de iones de signo contrario al de la nanopartícula, fuera de esta zona la concentración de iones es constante en todos los puntos e igual a la del electrolito. La diferencia de potencial entre la monocapa y la zona envolvente es el potencial zeta. El potencial zeta determina el grado de repulsión entre nanopartículas adyacentes de carga del mismo signo. Si baja más de un valor determinado, las fuerzas de atracción exceden a las de repulsión y las nanopartículas se agregan. El potencial se midió en disoluciones de las partículas con KN03 0.01 M, midiendo la movilidad electroforética en equipo Zetasizer nanoZS del Malvern

En una realización preferida de la invención, las nanopartículas unidas covalentemente a gelatina cuyo núcleo es de óxido de hierro definidas anteriormente, presentan una relajatividad transversal comprendida entre 40 mM ^' V ¹ y 80 mM ^' V ¹ , preferiblemente entre 50 mM ^' V ¹ y 60 mM ^' V ¹ .

En una realización particular de la invención, las nanopartículas unidas covalentemente a gelatina cuyo núcleo es de UNCP definidas anteriormente, presentan una relajatividad longitudinal comprendida entre 0,5 mM ^' V ¹ y 15 mM ^' V ¹ .

El término "relajatividad transversal" o r ₂ y el término "relajatividad longitudinal" o r¡ hacen referencia a una medida de la capacidad de las nanopartículas de disminuir el tiempo de relajación transversal (T ₂ ) y longitudinal (Γ/), respectivamente, de los protones circundantes por unidad de concentración de nanopartícula. Esta capacidad es relevante en el diseño de agentes de contraste para técnicas de diagnóstico por imagen como la imagen por resonancia magnética (IRM). La IRM utiliza los espines magnéticos de los núcleos de hidrógeno alineados por un campo magnético externo. Un pulso de radiofrecuencia perturba el alineamiento de los espines en el equilibrio, y la relajación del espín de vuelta al equilibrio se monitoriza a elevada resolución temporal. Ocurren dos procesos de relajación, la relajación longitudinal (Γ/) y la relajación transversal (T ₂ ). Se pueden monitorizar independientemente los anteriores procesos de relajación para generar diferentes imágenes de resonancia magnética. Las variaciones locales en la densidad del espín de los protones, atribuidas en gran medida a moléculas de agua y causadas por variaciones en el entorno biológico, afectan a las respuestas de relajación a partir de las cuales se pueden construir las imágenes. Una mejora en el contraste de la IRM se puede lograr utilizando nanopartículas magnéticas que disminuyen los tiempos de relajación T¡ yT ₂ . Las nanopartículas de óxido de hierro afectan el tiempo de relajación transversal (T ₂ ) del agua. La eficacia de una nanopartícula como agente de contraste se caracteriza midiendo la relajatividad {r¡ y r ₂ ) de los protones de agua que rodean a la nanopartícula. Dicha relajatividad es inversamente proporcional al tiempo de relajación individuales medidas a lo largo de un rango de concentraciones del contraste. Las propiedades magnéticas de los núcleos de óxido de hierro influyen tanto sobre los valores de r¡ como sobre los valores de r ₂ . Cuanto mayor es el valor de r ₂ mejor es el contraste negativo de las imágenes y cuando mayor es el valor de r¡ mejor es el contraste positivo. Según el valor de la relación r ₂ lr¡ se puede realizar contraste positivo también con las partículas de óxido de hierro si dicho valor es pequeño. Estos valores de relajatividad varían en función del tamaño de las nanopartículas.

Las relajatividades transversal y longitudinal se determinan empleando un relaxómetro minispec mq60 de Bruker con una campo de 1.5 T.

El término "gelatina" de las nanopartículas de la presente invención se refiere a una proteína obtenida por hidrólisis parcial de colágeno. Generalmente, el colágeno se extrae de la piel, huesos, tejido conectivo, órganos o intestinos de algunos animales tales como vacas, cerdos, pollos, entre otros.

En otra realización preferida, la gelatina unida covalentemente en las nanopartículas de la invención presenta una fuerza Bloom comprendida entre 50 g Bloom y 500 g Bloom, preferiblemente entre 50 g Bloom y 200 g Bloom.

La "fuerza Bloom" hace referencia a la fuerza de la gelatina. Esta fuerza determina el peso (en gramos) necesario por una sonda (de un diámetro 1,27 cm) para desviar la superficie de la gelatina 4 mm sin romperla. En otra realización, la invención se dirige a nanopartículas según se han definido anteriormente, que comprenden además un fármaco unido covalentemente a la gelatina.

La gelatina presenta grupos amino (-NH ₂ ) y ácido carboxílico (-COOH) que se pueden unir covalentemente a fármacos mediante reacciones conocidas por el experto en la materia.

El término "fármaco" hace referencia a un compuesto químico que induce un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. Ejemplos de fármacos que pueden unirse a las nanopartículas de la presente invención son analgésicos/antipiréticos para el tratamiento del dolor, estados febriles, artritis reumatoide, artrosis, osteoporosis, espondilitis anquilosante, síndromes reumatoides, dismenorrea, alteraciones musculoesqueléticas, cefaleas, lumbalgias y odontalgias, tales como aspirina, acetaminofeno, ibuprofeno, naproxeno, buprenorfina, propoxifeno, meperidina, hidromorfona, morfina, oxicodona, codeína, dihidrocodeína, pentazocina, hidroxodona, levorfanol, diflunisal, salicilato de trolamina, nalbufina, ácido mefenámico, butorfanol, salicilato de colina, butalbital, feniltoloxamina, metotrimeprazina, cinamedrina, y meprobamato; antiasmáticos para el tratamiento de asma, rinitis y afección cutánea alérgica, tales como ketotifeno, y traxanox; agentes para el tratamiento de patologías pulmonares como por ejemplo EPOC y ALI, tales como ipratropio, tiotropio, teofilina, infliximab, beclometasona, prednisona, hidrocortisona, metilprednisolona, cortisona, dexametasona, y prednisolona; antibióticos para el tratamiento de infecciones bacterianas como por ejemplo tuberculosis, brucelosis, peste, endocarditis por estreptococo, infección urinaria, gonorrea, diarrea, enteritis, salmonella, meningitis, bacteriemia, uretitis, brucelosis, psitacosis, tifus exantemático, tales como neomicina, estreptomicina, cloranfenicol, cefalosporina, ampicilina, penicilina, tetraciclina, ciprofloxacino, amikacina, aztreonam, cloranfenicol, ciprofloxacina, clindamicina, metronidazol, gentamicina, lincomicina, tobramicina, vancomicina, polimixina B, colistimetato, y colistina; antidepresivos para el tratamiento de trastornos psiconeuróticos y depresiones, como por ejemplo neurosis, depresión reactiva, depresión ansiosa, depresión psicótica, depresión endógena, temblores, disquinesias y trastorno de ansiedad, tales como nefopam, oxipertina, doxepino, amoxapina, trazodona, amitriptilina, maprotilina, fenelzina, duloxetina, desipramina, nortriptilina, tranilcipromina, fluoxetina, imipramina, isocarboxazida, trimipramina, y protriptilina; agentes antifúngicos para el tratamiento de infecciones fúngicas, por ejemplo por dermatofitosis, onicomicosis, pitiriasis, candidasis, paracoccidioidomicosis, hitoplasmosis, coccidioidomicosis, blastomicosis, queratitis fúngica, aspergilosis, esporotricosis y cromomicosis, tales como griseofulvina, ketoconazol, itraconazol, anfotericina B, nistatina, y candicidina; agentes antihipertensivos para el tratamiento de la hipertensión, tales como propanolol, propafenona, oxprenolol, nifedipina, reserpina, trimetafán, fenoxibenzamina, pargilina, deserpidina, diazoxida, guanetidina, minoxidilo, rescinamina, alseroxilona, y fentolamina; agentes antiinflamatorios no esteroideos para el tratamiento de artritis reumatoide, osteoartritis, artrosis, espondilitis anquilosante, bursitis, tendinitis y sinovitis, tales como indometacina, ketoprofeno, aspirina, diclofenaco, ketorolaco, flurbiprofeno, naproxeno, ibuprofeno, ramifenazona, piroxicam, celecoxib, y rofecoxib; agentes antiinflamatorios esteroideos, tales como cortisona, dexametasona, hidrocortisona, prednisolona, y prednisona; antineoplásicos para el tratamiento del cáncer, por ejemplo linfomas, leucemias, cáncer de mama, de ovario, de cérvix uterino, de pulmón, de estómago, de testículo, de próstata, de colon, de páncreas, de vejiga, melanomas, colorrectal, hepatocelular, óseo, cerebral y linfoma no Hodgkin, tales como ciclofosfamida, actinomicina, bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, mitomicina, metotrexato, fluorouracilo, gemcitabina, carmustina, etopósido, canfotecina y sus derivados, paclitaxel y sus derivados, docetaxel y sus derivados, vinblastina, vincristina, goserilina, cisplatino, carboplatino, leuprólido, tamoxifeno, y ácido retinoico; ansiolíticos para el tratamiento de trastornos del sueño, neurosis y ansiedad, tales como lorazepam, buspirona, prazepam, oxazepam, diazepam, hidroxizina, alprazolam, droperidol, halazepam, clormezanona, y dantroleno; agentes inmunosupresores para el tratamiento de uveítis endógenos, psoriasis, síndrome nefrótico, artritis reumatoide, dermatitis atópica, inmunosupresión tras trasplante de órganos, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, dermatomiositis, poliomiositis, hepatitis crónica autoinmune, poliarteritis nodosa, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopénica idiopática y pioderma gangrenoso, tales como ciclosporina, azatioprina, mizoribina, y tacrolimus; agentes antimigrañosos para el tratamiento de migrañas y cefaleas, tales como triptanos, por ejemplo sumatriptán, ergotamina, propanolol, y dicloralfenazona; sedantes/hipnóticos para el tratamiento del insomnio, tales como barbituratos, por ejemplo pentobarbital y secobarbital, y benzodiazapinas, por ejemplo flurazepam, triazolam, y midazolam; antianginosos para el tratamiento de angina de pecho, cardiopatía isquémica, insuficiencia coronaria, taquicardia paroxística supraventricular y fibrilación/flutter auricular, tales como bloqueantes beta- adrenérgicos, bloqueantes del canal de calcio, por ejemplo nifedipino y diltiazem, y nitratos, por ejemplo nitroglicerina, dinitrato de isosorbida, tetranitrato de pentaeritritol y tetranitrato de eritritilo; agentes antipsicóticos para el tratamiento de esquizofrenia, psicosis paranoides, ansiedad, estados maníacos, delirium tremens, tics motores, tartamudeo, síntomas del s. Gilíes de la Tourette y corea, tales como haloperidol, loxapina, tioridazina, tiotixeno, flufenazina, trifluoperazina, clorpromazina, perfenazina, y proclorperazina; agentes antiarrítmicos para el tratamiento de taquicardias y arritmias, tales como bretilio, esmolol, verapamilo, amiodarona, encainida, digoxina, digitoxina, mexiletina, disopiramida, procainamida, quiñi dina, flecainida, tocainida, y lidocaína; agentes antiartríticos para el tratamiento de artritis reumatoides, artrosis, poliartritis y espondilitis anquilosante, tales como fenilbutazona, sulindaco, penicilamina, salsalato, piroxicam, azatioprina, indometacina, meclofenamato, ketoprofeno, auranofina, aurotioglucosa, y tolmetina; agentes para el tratamiento de la gota, tales como alopurinol y colchicina; anticoagulantes y trombolíticos para el tratamiento de afecciones del sistema venoso superficial, trombosis venosas, tromboembolismo arterial, trombosis coronarias, derrames pleurales, embolismo pulmonar e ictus isquémico, tales como heparina, warfarina, uroquinasa, estreptoquinasa y alteplasa; agentes antifibrinolíticos para el tratamiento de hemorragias, tales como ácido aminocaproico; agentes hemoreológicos para el tratamiento de trastornos circulatorios, trastornos vasculares, por ejemplo, úlceras distales de las extremidades inferiores, gangrena, enfermedad vascular periférica, trastornos vasculares de la retina, del nervio óptico y auditivos, tales como pentoxifilina; agentes anticonvulsivos para el tratamiento de epilepsias, tales como ácido valproico, fenitoína, clonazepam, primidona, fenobarbital, carbamazepina, amobarbital, metarbital, mefenitoína, etosuximida, fensuximida, etotoína, secobarbital, clorazepato, y trimetadiona; antihistamínicos/antipruríticos para el tratamiento de reacciones alérgicas como por ejemplo prurito, urticaria y rinitis alérgica, tales como hidroxizina, difenhidramina, clorfeniramina, bromfeniramina, ciproheptadina, terfenadina, clemastina, triprolidina, carbinoxamina, difenilpiralina, fenindamina, azatadina, tripelenamina, dexclorfeniramina, y metdilazina; agentes antivirales para el tratamiento de infecciones víricas como por ejemplo VIH, gripe, hepatitis C crónica y herpes, tales como interferón alfa, beta o gamma, zidovudina, amantadina, ribavirina, y aciclovir; compuestos esteroideos y hormonas para el tratamiento de endometriosis, agioedema, hipogonadismos masculino, menopausia, anemia aplásica, osteoporosis, carcinoma de mama, trastorno del deseo sexual, amenorrea, esterilidad, dismenorrea, endometriosis, anticoncepción e hipotiroidismo , tales como andrógenos, por ejemplo danazol, testosterona, fluoximesterona, etiltestosterona, y metiltestosterona, estrógenos, por ejemplo estradiol y estropipato, progestinas, por ejemplo medroxiprogesterona y noretindrona, y hormonas tiroideas, por ejemplo levotiroxina; corticoesteroides para el tratamiento de tiroiditos, osteoartritis, artritis reumatoide, bursitis, epicondilitis, artritis, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, dermatitis, psoriasis, colitis ulcerativa, enteritis, sarcoidosis y queloides, tales como triamcinolona, betametasona, dexametasona, prednisona, metilprednisolona, triamcinolona, hidrocortisona, fludrocortisona, parametasona, y prednisolona; agentes hipoglucemiantes para el tratamiento de la diabetes, como por ejemplo diabetes mellitus tipo 2, tales como insulina, gliburida, clorpropamida, glipizida, tolbutamida y tolazamida; agentes hipolimidémicos para disminuir los niveles de lípidos en sangre por ejemplo en hipercolesterolemia, tales como clofibrato, dextrotiroxina, probucol, pravastatina, atorvastatina, lovastatina y niacina; agentes antiulcerosos para el tratamiento de úlceras gástricas, intestinales y esofágicas, tales como famotidina, cimetidina y ranitidina; inhibidores de la bomba de protones para el tratamiento de dispepsia, úlcera péptica, reflujo gastroesofágico y síndrome de Zollinger-Ellison, tales como omeprazol; agentes para el tratamiento de la disfunción eréctil, tales como sildenafilo, vardenafilo, tadalafilo y alprostadilo; y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En una realización preferida de la invención, el fármaco se selecciona del grupo que consiste en ketotifeno, traxanox, ipratropio, tiotropio, teofilina, infliximab, beclometasona, prednisona, hidrocortisona, metilprednisolona,cortisona, dexametasona, prednisolona, doxorubicina, fluorouracilo, clofibrato, dextrotiroxina, probucol, pravastatina, atorvastatina, lovastatina, niacina, insulina, gliburida, clorpropamida, glipizida, tolbutamida, tolazamida, propanolol, propafenona, oxprenolol, nifedipina, reserpina, trimetafán, fenoxibenzamina, pargilina, deserpidina, diazoxida, guanetidina, minoxidilo, rescinamina, alseroxilona, y fentolamina.

En una realización aún más preferida de la invención, el fármaco se selecciona del grupo que consiste en doxorubicina y fluorouracilo.

El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a cualquier sal farmacéuticamente aceptable, que, tras administración al receptor puede proporcionar (directa o indirectamente) un fármaco tal como se describe en el presente documento. La preparación de sales, puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables de compuestos proporcionados en el presente documento pueden ser sales de adición de ácidos, sales de adición de bases o sales metálicas, y pueden sintetizarse a partir del compuesto original que contiene un resto básico o ácido mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, tales sales, se preparan por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de base o ácido libre de esos fármacos con una cantidad estequiométrica de ácido o base apropiados en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de las sales de adición de ácidos incluyen sales de adición de ácidos minerales tales como, por ejemplo clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato, y sales de adición de ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato. Ejemplos de sales de adición de álcali incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, amonio, y sales alcalinas orgánicas tales como, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, Ν,Ν-dialquilenetanolamina, trietanolamina, glucamina y sales de aminoácidos básicos. Ejemplos de sales metálicas incluyen, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y litio. Además, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen normalmente una reacción no deseada alérgica o similar, tal como molestias gástricas, mareos y similares, cuando se administra a un ser humano. Preferiblemente, tal como se utiliza en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o de un estado o enumerado en la Farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales y más particularmente en seres humanos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende nanopartículas según se han definido anteriormente, en donde las nanopartículas son monodispersas.

El término "monodispersa" hace referencia a nanopartículas que presentan un valor de PDI (índice de polidispersividad) igual o menor de 0,25, es decir, presentan sustancialmente el mismo tamaño hidrodinámico, en donde al menos el 75% de las nanopartículas presentan el mismo tamaño, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, aún más preferiblemente al menos el 99%. Debe entenderse por "sustancialmente el mismo tamaño hidrodinámico" una variación de ± 25% del tamaño hidrodinámico definido, preferiblemente ± 20%, más preferiblemente ± 15%), más preferiblemente ± 10%, más preferiblemente ± 5%, aún más preferiblemente ± 1%.

Procedimiento de obtención de las nanopartículas recubiertas de gelatina

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de las nanopartículas de la invención definidas anteriormente. Las principales ventajas de dicho procedimiento es su gran reproducibilidad, especialmente en relación al tamaño y composición de la superficie de las nanopartículas obtenidas mediante dicho procedimiento.

Dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:

(a) dispersar nanopartículas en donde el núcleo de las mismas se selecciona de entre un núcleo de óxido de hierro y un núcleo de UC P y dicho núcleo está recubierto de un ácido monocarboxílico insaturado de fórmula (II),o una sal del mismo, en un disolvente, en donde n y m se seleccionan independientemente de un número de 1 a 10;

(b) tratar con un oxidante la dispersión de obtenida en la etapa (a);

(c) tratar la mezcla resultante de la etapa (b) con una disolución acuosa; y

(d) proveer gelatina y hacerla reaccionar con las nanopartículas obtenidas en la etapa (c) en presencia de un activador de ácido carboxílico, en donde la gelatina opcionalmente está unida covalentemente a un fármaco.

La primera etapa del procedimiento, etapa (a), es la dispersión de nanopartículas, recubiertas de un ácido monocarboxílico insaturado de fórmula (II), o una sal del mismo, en un disolvente. Las nanopartículas pueden ser de óxido de hierro o UC P, tal como se ha definido anteriormente. Preferiblemente, las nanopartículas son de óxido de hierro.

Las nanopartículas de óxido de hierro hacen referencia al núcleo de óxido de hierro según se ha definido anteriormente, es decir, el tipo de óxido de hierro se puede seleccionar de cualquiera de los habituales en el campo de las nanopartículas y que son conocidos por el experto en la materia, como por ejemplo, Fe ₃ 0 ₄ (magnetita), a-Fe ₂ 0 ₃ (hematita), y-Fe ₂ 0 ₃ (magh emita), FeO (wustita), 8-Fe ₂ 0 ₃ y P-Fe ₂ 0 ₃ , entre otros, preferiblemente Fe ₃ 0 ₄ y y-Fe ₂ 0 ₃ .

Las nanopartículas de UCNP hacen referencia a aquellas definidas anteriormente, cuyo núcleo es de NaYF ₄ , NaGdF ₄ o NaGdFYb@NaGdF4, dopados con Yb, Er, Tb y/o Tm. Preferiblemente, las UNCP son NaGdF Yb ₂ 5 _% ,Tm _0; 5 _% @NaGdF , es decir, un núcleo de NaGdF dopado con Yb y Tm y alrededor una capa de NaGdF .

En una realización preferida de la invención, en el ácido monocarboxílico insaturado de la etapa (a) n=m y se seleccionan de un número de 3 a 7. Más preferiblemente n=m=5.

El compuesto de fórmula (II) puede estar opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes, preferentemente 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo, preferentemente un alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo y n-hexilo; halógeno, tal como F, Cl, Br y I; grupo nitro (-N0 ₂ ); grupo amino (-NH ₂ ); hidroxilo (-OH); y grupo mercapto (-SH). Preferentemente, los sustituyentes se seleccionan del grupo que consiste en alquilo, preferentemente un alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, tere-butilo, pentilo y hexilo; halógeno, tal como F, Cl, Br y I; y grupo nitro (- N0 ₂ ).

El disolvente utilizado para la dispersión de la etapa (a) puede ser cualquier disolvente habitual conocido por el experto en la materia. Ejemplos no limitativos de dichos disolventes son aléanos lineales, cíclicos o ramificados de 5 a 15 átomos de carbono, preferiblemente de 5 a 7 átomos de carbono, como por ejemplo, w-pentano, n- hexano, ciclohexano, «-ciclohexano, w-heptano y «-octano; disolventes clorados de 1 a 10 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono, con de 1 a 6 átomos de cloro, preferiblemente de 1 a 4 átomos de cloro, como por ejemplo cloroformo y diclorometano; y mezclas de los mismos. Preferiblemente el disolvente se selecciona de alcano w-hexano, ciclohexano, cloroformo, diclorometano y mezclas de los mismos. Más preferiblemente, el disolvente se selecciona de w-hexano, cloroformo y mezclas de los mismos.

Las nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de ácido monocarboxílico insaturado de fórmula (II) utilizadas en la etapa (a) se pueden obtener por procedimientos conocidos por el experto en la materia y descritos en el estado de la técnica. Un ejemplo de tales procedimientos es la coprecipitación en medio acuoso, en donde se mezclan iones férricos y ferrosos en soluciones de elevada basicidad a temperatura ambiente o a temperatura elevada, dicha coprecipitación se puede realizar en presencia de un agente protector o tensoactivo o se puede recubrir posteriormente las nanopartículas obtenidas con dicho protector o tensoactivo. Otro método habitual de obtención de nanopartículas de óxido de hierro es la descomposición térmica de compuestos orgánicos de hierro, tales como N-nitrosofenilhidroxilamina de hierro (Fe(cup) ₃ ), acetilacetonato de hierro (Fe(acac) ₃ ), pentacarbonilo de hierro (Fe(CO) ₅ ), tricloruro de hierro (FeCl ₃ ), oleato de hierro, y oleato sódico/tricloruro de hierro, a elevada temperatura. Generalmente la descomposición térmica se realiza en presencia de un tensoactivo. Otro procedimiento habitual para la síntesis de nanopartículas de óxido de hierro es la síntesis sonoquímica, en donde los precursores de hierro se descomponen por acción de una frecuencia elevada (por ejemplo, de 20 KHz a 10 MHz). En todos estos métodos el ácido monocarboxílico insaturado de fórmula (II) puede estar presente, formándose in situ las nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de dicho ácido monocarboxílico insaturado de fórmula (II) o alternativamente se pueden sintetizar las nanopartículas de óxido de hierro y recubrirlas posteriormente con dicho ácido monocarboxílico insaturado de fórmula (II).

En una realización preferida, las nanopartículas de óxido de hierro recubiertas con el ácido monocarboxílico insaturado de fórmula (II)se obtienen por descomposición térmica de un compuesto orgánico de hierro seleccionado del grupo que consiste en N- nitrosofenilhidroxilamina de hierro, acetilacetonato de hierro, pentacarbonilo de hierro, tricloruro de hierro, en presencia de dicho ácido monocarboxílico insaturado de fórmula (II) y un tensoactivo, en un disolvente a una temperatura comprendida entre 150 °C y 400 °C, preferiblemente entre 150 °C y 300 °C, aún más preferiblemente a 200 °C.

El término "tensoactivo" hace referencia a sustancias que influyen por medio de la tensión superficial en la superficie de contacto entre dos fases. Los tensoactivos se componen de una parte hidrófoba y un parte hidrófita. Ejemplos de tensoactivos son alquilmonoaminas primarias, secundarias o terciarias, alquilmonoalcoholes primarios, secundarios o terciarios, alquildioles, ésteres de ácidos alquilmonocarboxílicos, ésteres de glicol, en donde además dichos tensoactivos pueden estar etoxilados y en donde alquilo es como se ha definido anteriormente. Preferiblemente, los tensoactivos se seleccionan de alquilmonoaminas y alquildioles, más preferiblemente de alquilmonoaminas y alquildioles C10-C30, más preferiblemente el tensoactivo es una monoalquilamina Cio-C ₃ o- En una realización particular de la invención el tensoactivo es oleilamina.

El disolvente utilizado en la obtención de las nanopartículas de óxido de hierro recubiertas con el ácido monocarboxílico insaturado de fórmula (II) es un disolvente de punto de ebullición elevado, preferiblemente de punto de ebullición superior a la temperatura a la que se realiza dicha descomposición térmica, cuya temperatura se ha definido anteriormente de entre 150 °C y 400 °C. Por ejemplo, si la descomposición térmica se realiza a 150 °C, el disolvente debe presentar un punto de ebullición superior a 150 °C. Preferiblemente, el disolvente tiene un punto de ebullición superior a 150 °C, más preferiblemente superior a 200 °C, más preferiblemente superior a 250 °C, más preferiblemente superior a 300 °C, más preferiblemente superior a 350 °C, aún más preferiblemente superior a 400 °C. Ejemplos de disolventes preferidos son benciléter, feniléter, octadeceno, o-diclorobenceno, octiléter, triolctilamina y mezclas de los mismos. En una realización particular de la invención el disolvente es feniléter. Las nanopartículas UCNP se obtienen por descomposición hidrotermal de precursores metálicos. Dichos precursores pueden ser nitratos, óxidos, cloruros y, más a menudo, fluoros. La fuente de F también puede variar mucho, empleándose HF, NH ₄ F, NH ₄ HF ₂ , NaBF ₄ , KBF ₄ o tetrafluorborato de 1-butil, 2-metilimidazolonio.

La siguiente etapa en el procedimiento de obtención de nanopartículas según la invención es la etapa (b), es decir, el tratamiento de la dispersión de nanopartículas obtenidas en la etapa (a) definida anteriormente, preferiblemente nanopartículas de óxido de hierro, con un oxidante.

El término "oxidante" debe entenderse como un reactivo o mezcla de reactivos capaz de producir una ruptura oxidativa de la insaturación o doble enlace presente en el ácido monocarboxílico de fórmula (II), rindiendo un compuesto de fórmula (I) que presenta un grupo ácido carboxílico en el carbono sobre el que se ha producido dicha ruptura oxidativa, según se muestra en el esquema 1 a continuación. Este tipo de oxidantes son ampliamente conocidos por el experto en la materia y se describen, por ejemplo en M.B. Smith y J. March, "March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure", 2007, 6 ^a edición, Wiley-Interscience, New Jersey (EE.UU.), págs. 1736-1745.

Esquema 1 En una realización preferida de la invención, el oxidante de la etapa (b) se selecciona del grupo que consiste en KMn0 ₄ , Os0 ₄ /03, NaI0 ₄ /Ru0 ₂ /NaTi0 ₄ , O3, RUCI3/O3 y PdCyCuC . En una realización todavía más preferida, el oxidante de la etapa (b) es KMn0 ₄ .

La siguiente etapa del procedimiento, la etapa (c), es el tratamiento de la mezcla resultante de la etapa anterior, etapa (b), con una disolución acuosa. El término "disolución acuosa" hace referencia a una disolución en la que el disolvente es agua o mayoritariamente agua, es decir, en donde al menos el 55% del volumen del disolvente respecto al volumen total de disolvente es agua, preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80%), más preferiblemente al menos el 90%, aún más preferiblemente al menos el 95%), aún más preferiblemente al menos el 99%. El disolvente de dicha disolución acuosa comprende agua como componente mayoritario pero además puede comprender otros disolventes miscibles en agua, tales como alcoholes, por ejemplo, metanol, etanol, isopropanol, éteres, como por ejemplo tetrahidrofurano, 2-metiltetrahidrofurano, dioxano y mezclas de los mismos. Preferiblemente, el disolvente de la disolución acuosa es agua.

La disolución acuosa puede contener además ácidos, bases o sales disueltas en el disolvente.

En una realización preferida de la invención, la disolución acuosa de la etapa (c) es una disolución acuosa ácida.

Debe entenderse por "disolución acuosa ácida" una disolución acuosa según se ha definido anteriormente, que presenta un pH inferior a 7, preferiblemente un pH comprendido en el rango de 2,5 a 4,5, más preferiblemente un pH comprendido en el rango de 2,8 a 3,0. La disolución acuosa ácida comprende un ácido o tampón ácido disuelto en la misma. Ejemplos de ácidos son ácido clorhídrico, ácido acético, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, entre otros. El "tampón ácido" hace referencia a la mezcla de un ácido débil y su base conjugada, generalmente la sal sódica, que tiene la propiedad de mantener estable el pH de una disolución frente a la adición de cantidades relativamente pequeñas de ácidos o bases fuertes, tales como el tampón ácido acético/acetato, ácido cítrico/ci trato, tampón fosfato, etc.

En una realización más preferida de la invención, la disolución acuosa ácida de la etapa (c) es un tampón de ácido acético/acetato.

En otra realización preferida de la invención, la disolución acuosa de la etapa (c) es una disolución acuosa básica.

Debe entenderse por "disolución acuosa básica" una disolución acuosa según se ha definido anteriormente, que presenta un pH superior a 7, preferiblemente un pH comprendido en el rango de 9 a 12, más preferiblemente un pH comprendido en el rango de 9 a 10. La disolución acuosa básica comprende una base o tampón básico disuelto en la misma. Ejemplos de bases son hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, carbonato de potasio, entre otros. El "tampón básico" hace referencia a la mezcla de una base débil y su ácido conjugado que tiene la propiedad de mantener estable el pH de una disolución frente a la adición de cantidades relativamente pequeñas de ácidos o bases fuertes, tales como el tampón amoniaco/cloruro amónico.

En una realización más preferida de la invención, la disolución acuosa básica de la etapa (c) es una disolución acuosa de NaOH.

La última etapa del procedimiento, la etapa (d), es proveer gelatina y hacerla reaccionar con las nanopartículas obtenidas en la etapa anterior, etapa (c), en presencia de un activador de ácido carboxílico, en donde la gelatina opcionalmente está unida covalentemente a un fármaco.

La unión de la gelatina a las nanopartículas, preferiblemente a las nanopartículas de óxido de hierro, es covalente, tal como se ha definido anteriormente. Dicha gelatina, puede comprender un fármaco unido covalentemente a la misma, tal como se ha definido anteriormente y en donde se proporcionan ejemplos de dichos fármacos. En una realización particular, el fármaco unido covalentemente a la gelatina se selecciona del grupo que consiste en doxorubicina y fluorouracilo.

La gelatina utilizada en la etapa (d) es como se ha definido anteriormente. En una realización particular, dicha gelatina presenta una fuerza Bloom comprendida entre 50 g Bloom y 500 g Bloom, preferiblemente entre 50 g Bloom y 200 g Bloom.

La reacción de la gelatina con las nanopartículas obtenidas en la etapa anterior, etapa (c), en donde dichas nanopartículas, preferiblemente de óxido de hierro, están recubiertas de un ácido de fórmula (II), según se ha definido anteriormente, consiste en la formación de un enlace covalente, enlace amida -CO- H- a partir de uno de los grupos -COOH del compuesto de fórmula (I) y un grupo -NH ₂ de la gelatina, es decir, la gelatina se une al compuesto de fórmula (I) por el punto (a), tal como se muestra anteriormente en la estructura (III).

La formación de amidas a partir de un ácido carboxílico y una amina es conocida por el experto en la materia, y se describe por ejemplo en M.B. Smith y J. March, "March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure", 2007, 6 ^a edición, Wiley-Interscience, New Jersey (EE.UU.), págs. 1430-1434. La mayoría de las reacciones de formación de amidas a partir de un ácido carboxílico y una amina comprenden la activación del ácido carboxílico, por ejemplo mediante formación del cloruro de ácido, anhídrido o éster del ácido carboxílico, por activación con activador de ácido carboxílico.

Un "activador de ácido carboxílico" debe entenderse como un compuesto que aumenta la reactividad química del grupo ácido carboxílico en la reacción de formación de amidas. Ejemplos de dichos activadores son carbodiimidas (compuestos que presentan el grupo -N=C=N-), tales como, N-(3-dimetilaminopropil)-N'- etilcarbodiimida (o l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, EDC) o una sal de adición de ácido de la misma, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y Ν,Ν'- diisopropilcarbodiimida (DIC); reactivos basados en fosfonio, tales como, hexafluorofosfato de (benzotriazol-l-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de (benzotriazol-l-iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de (7-azabenzotriazol-l-iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyAOP), hexafluorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBroP) y cloruro bis(2-oxo-3- oxazolidinil)fosfínico (BOP-C1); reactivos basados en uronio, tales como hexafluorofosfato de O-(benzotriazol- 1 -il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio(HBTU), tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU), hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HATU), tetrafluoroborato de O-(7-azabenzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TATU), hexafluorofosfato de O-(6-clorobenzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HCTU), tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(N-succinimidil)uronio (TSTU), tetrafluoroborato de O-(5-norborneno-2,3-dicarboximido)-N,N,N',N'-tetrametiluroni o (TNTU), tetrafluoroborato de O-[(etoxicarbonil)cianometilenamino]-N,N,N',N'- tetrametiluronio (TOTU), tetrafluoroborato de O-(2-oxo-l(2H)piridil)-N,N,N'N'- tetrametiluronio (TPTU) y tetrafluoroborato de O-(3,4-dihidro-4-oxo- 1,2,3 - benzotriazin-3-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio; carbonildiimidazol (CDI); 3- (dietilfosforiloxi)-l,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona (DEPBT); y hexafluorofosfato de cloro-N,N,N',N'-tetrametilformamidinio. Dichos activadores de ácido carboxílico pueden utilizarse además en presencia de un activador secundario de ácido carboxílico, tales como N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo- HS), N-hidroxisuccinimida ( HS), N- hidroxibenzotriazol (HOBt) y 4-(N,N-dimetilamino)piridina (DMAP). El término "sal de adición de ácido" debe entenderse que significa cualquier forma de un compuesto, de EDC en el presente caso, en los que asume una forma iónica o cargada, y se acoplan con un contraión (anión). Ejemplos de las sales de adición de ácidos incluyen sales de adición de ácidos minerales tales como, por ejemplo clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, nitrato, fosfato, y sales de adición de ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, acetato. Preferiblemente es un clorhidrato.

Por lo tanto, en una realización preferida de la invención, la etapa (d) comprende: (di) mezclar un activador de ácido carboxílico con un disolvente;

(d2) tratar las nanopartículas obtenidas en la etapa (c) con la mezcla de la etapa (di) y la gelatina, en donde la gelatina opcionalmente está unida covalentemente a un fármaco; y

(d3) aislar las nanopartículas resultantes de la etapa (d2).

La etapa (di) comprende mezclar un activador de ácido carboxílico, definido anteriormente, con un disolvente. Disolventes adecuados para esta etapa de reacción se seleccionan de disolventes inertes en la reacción de formación de amidas a partir de un ácido carboxílico y una amina. Ejemplos de tales disolventes son dimetilformamida, diclorometano, dicloroetano, cloroformo, n-butanol, dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, dioxano, aguay mezclas de los mismos. Preferiblemente el disolvente utilizado en esta etapa es agua.

En una realización preferida de la invención, el activador de ácido carboxílico es una carbodiimida, por ejemplo EDC o una sal de adición de ácido de la misma, DCC o DIC, y opcionalmente comprende además un activador de ácido carboxílico secundario seleccionado del grupo que consiste en N-hidroxisulfosuccinimida, N- hidroxisuccinimida, N-hidroxibenzotriazol. Más preferiblemente, la carbodiimida es EDC o clorhidrato de EDC y el activador de ácido carboxílico secundario está presente. Aún más preferiblemente, la carbodiimida es el clorhidrato de EDC y el activador de ácido carboxílico secundario es sulfo-N-hidroxisuccinimida.

A continuación se tratan las nanopartículas obtenidas en la etapa (c), es decir, nanopartículas recubiertas de un ácido carboxílico de fórmula (I), preferiblemente de óxido de hierro, con la mezcla de la etapa (di) y la gelatina definida anteriormente. Este tratamiento rinde la unión covalente de la gelatina al núcleo por formación de un enlace amida a partir de uno de los grupos -COOH del compuesto de fórmula (I) que recubre las nanopartículas obtenidas en la etapa (c), preferiblemente de óxido de hierro, y un grupo - H ₂ de la gelatina (la unión tiene lugar por el punto (a), tal como se muestra anteriormente en la estructura (III)), tal como se ha definido anteriormente.

La última etapa del procedimiento es la etapa (d3), en donde las nanopartículas obtenidas en la etapa (d2), es decir, nanopartículas recubiertas de gelatina unida covalentemente al núcleo, preferiblemente de óxido de hierro, a través de un enlace amida con un ácido carboxílico de fórmula (I), se aislan. Este procedimiento de aislar las nanopartículas obtenidas puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por el experto en la materia, tales como filtración, centrifugación, separación mediante un imán, etc. Preferiblemente las nanopartículas obtenidas en la etapa (d2) se aislan por separación con ayuda de un imán.

Opcionalmente, las nanopartículas aisladas en la etapa (d3) se pueden purificar, por ejemplo mediante lavados con un disolvente, por ejemplo agua, hasta eliminar sustancialmente reactivos y/o residuos de las etapas anteriores del procedimiento.

Usos de las nanopartículas recubiertas de gelatina

El comportamiento magnético de las nanopartículas de la invención, su tamaño, biocompatibilidad, estabilidad en medios acuosos y en especial su elevado tiempo de circulación en sangre tras ser inyectadas en un organismo hacen que dichas nanopartículas sean adecuadas como agentes de contraste en técnicas de diagnóstico por imagen, tales como imagen por resonancia magnética e imagen por fluorescencia óptica.

La imagen por resonancia magnética es una técnica de diagnóstico no invasiva que utiliza el fenómeno de la resonancia magnética para obtener información sobre la estructura y composición del cuerpo a analizar. Esta información es procesada por ordenadores y transformada en imágenes del interior de lo que se ha analizado. Utiliza campos magnéticos para alinear la magnetización nuclear de (usualmente) protones del agua en el cuerpo. Los campos de radiofrecuencia se usan para sistemáticamente alterar el alineamiento de esa magnetización, causando que los núcleos de hidrógeno produzcan un campo magnético rotacional detectable por el escáner. Esa señal puede ser manipulada con adicionales campos magnéticos y así construir con más información las imágenes. La imagen por fluorescencia óptica es una técnica de diagnóstico no invasiva que utiliza el fenómeno de fluorescencia para obtener información sobre la composición del cuerpo a analizar. Esta técnica se basa en la excitación de las nanopartículas de núcleo de UCNP según se han definido anteriormente con radiación electromagnética en la zona del espectro del infrarrojo cercano (es decir, de longitud de onda comprendida entre 800 nm y 2500 nm), la conversión de dicha radiación electromagnética en radiación de mayor energía (preferiblemente de longitud de onda comprendida entre 400 nm y 900 nm).

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un agente de contraste que comprende nanopartículas según se han definido anteriormente. Dicho agente de contraste puede comprender tanto nanopartículas cuyo núcleo es de óxido de hierro, como nanopartículas cuyo núcleo es de UCNP, como mezcla de las mismas. Preferiblemente el agente de contraste comprende nanopartículas cuyo núcleo es de óxido de hierro.

El término "agente de contraste" hace referencia a una sustancia o composición que se usa para mejorar la visibilidad en las imágenes por resonancia magnética de estructuras o fluidos dentro del cuerpo.

Las propiedades magnéticas de los núcleos de óxido de hierro influyen sobre tanto sobre los valores de r¡ como sobre los valores de r ₂ , tal como se ha explicado anteriormente. Por lo tanto mejoran el contraste de las imágenes de resonancia magnética.

Las propiedades fluorescentes de las UCNP las hace adecuadas para su uso en imagen basada en fluorescencia. Además, la excitación se produce en el NIR mientras que la emisión se produce en luz de mayor energía, tal como el visible o el NIR (de mayor energía que la excitación). Las ventajas de las UCNP es una excitación menos perjudicial, sin autofluorescencia y con elevada capacidad de penetración.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de las nanopartículas o el agente de contraste de la presente invención en la fabricación de un agente de diagnóstico para el diagnóstico por imagen de una patología del sistema cardiovascular.

En otro aspecto, la invención se relaciona con o el agente de contraste de la presente invención, para su uso en el diagnóstico por imagen de una patología del sistema cardiovascular. El "sistema cardiovascular" hace referencia a la estructura anatómica que conduce y hace circular la sangre. En el ser humano, el sistema cardiovascular está formado por el corazón, los vasos sanguíneos (arterias, venas y capilares) y la sangre.

Las "patologías del sistema cardiovascular" son por ejemplo cardiopatía isquémica, enfermedad coronaria, coronariopatía, isquemia cardiaca o isquemia miocárdica, tales como angina de pecho, angina de Prinzmetal, infarto agudo de miocardio y síndrome de Dressler; afecciones de la circulación pulmonar, tales como hipertensión pulmonar, tromboembolismo pulmonar y cor pulmonale; afecciones del pericardio tales como pericarditis, efusión pericárdica y taponamiento pericárdico; afecciones del endocardio y valvulopatías, tales como endocarditis, insuficiencia mitral, prolapso mitral, estenosis mitral, insuficiencia aórtica, estenosis aórtica, insuficiencia tricuspídea, estenosis tricuspídea, insuficiencia pulmonar, estenosis pulmonar, síndrome hipereosinofílico, fibrosis endomiocárdica, endocarditis de Loeffler y válvula aórtica bicúspide; afecciones del miocardio tales como miocarditis, miocardiopatía, miocardiopatía extrínseca, miocardiopatía intrínseca, endocarditis de Loeffler y displasia arritmogénica; afecciones del sistema de conducción eléctrica del corazón, tales como bloqueo cardíaco, bloqueo atrioventricular, bloqueo de rama, bloqueo bifascicular, bloqueo trifascicular, síndrome de pre-excitación, síndrome de Wolff- Parkinson-White, síndrome de Lown-Ganong-Levine, síndrome del intervalo QT largo, síndrome de Adams-Stokes, parada cardiorrespiratoria, trastornos del ritmo cardíaco, taquicardia paroxística, flutter auricular, fibrilación, contracción prematura y síndrome del seno enfermo; afecciones cerebrovasculares tales como hemorragia intracraneal, hemorragia intracerebral, hemorragia extra-axial, hemorragia intraaxial, hemorragia intraventricular, hemorragia intraparenquimatosa, enfermedad de Binswanger y enfermedad de Moyamoya; patologías de arterias, arteriolas y capilares tales como aterosclerosis, estenosis de la arteria renal, disección de la aorta, aneurisma, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Buerger, arteritis, aortitis, arteritis de células gigantes, claudicación intermitente, fístula arteriovenosa, telangiectasia hereditaria hemorrágica y angioma aracniforme; patologías de venas tales como variz, hemorroide, variz esofágica, varicocele, váriz gástrica, caput medusae, síndrome de la vena cava superior, trombosis, flebitis, trombosis venosa profunda, síndrome de May-Thurner, trombosis de la vena porta, trombosis venosa, síndrome de Budd-Chiari, trombosis de la vena renal y enfermedad de Paget-Schroetter; insuficiencia cardiaca; hipertrofia cardíaca; hipertrofia auricular; e hipertrofia ventricular.

Una realización particular de la invención, se relaciona con el uso de las nanopartículas de la presente invención en la fabricación de un agente de diagnóstico para el diagnóstico por imagen de una patología del sistema cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en hipertensión pulmonar, estenosis aórtica, insuficiencia pulmonar, afecciones cerebrovasculares, trombosis, aterosclerosis e insuficiencia cardiaca.

En otro realización particular, la invención se relaciona con nanopartículas o el agente de contraste de la presente invención para su uso en el diagnóstico por imagen de una patología del sistema cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en hipertensión pulmonar, estenosis aórtica, insuficiencia pulmonar, afecciones cerebrovasculares, trombosis, aterosclerosis e insuficiencia cardiaca.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de nanopartículas de la presente invención, preferiblemente aquellos con núcleo de óxido de hierro, que presentan un fármaco unido a la gelatina para preparar un medicamento.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de nanopartículas de la presente invención, preferiblemente aquellos con núcleo de óxido de hierro, que presentan un fármaco unido a la gelatina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad que requiera dicho medicamento.

En otro aspecto, la invención se relaciona con nanopartículas de la presente invención que presentan un fármaco unido a la gelatina para su uso en medicina.

La enfermedad a tratar dependerá del fármaco unido a las nanopartículas de la invención, es decir, será una enfermedad susceptible de ser tratada con dicho fármaco. En base a los fármacos unidos a las nanopartículas y las enfermedades que se pueden tratar con los mismos definidos anteriormente, se determinará la enfermedad que será tratada con las nanopartículas unidas a un fármaco según la invención. Por ejemplo, los antineoplásicos doxorubicina y fluorouracilo se utilizan para tratar el cáncer. Por lo tanto, en una realización particular de la presente invención se dirige el uso de las nanopartículas según la invención que presentan un fármaco seleccionado de entre doxorubicina y fluorouracilo unido covalentemente para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En otra realización particular, la invención se relaciona con nanopartículas de la presente invención que presentan un fármaco seleccionado de entre doxorubicina y fluorouracilo unido covalentemente para su uso en el tratamiento del cáncer. En otra realización particular, la invención se relaciona con un método de tratamiento del cáncer en un sujeto que padece dicha enfermedad que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de nanopartículas de la presente invención que presentan un fármaco seleccionado de entre doxorubicina y fluorouracilo unido covalentemente.

En el sentido utilizado en esta descripción "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de principio activo calculada para producir el efecto deseado y estará determinada generalmente, entre otros motivos, por las propias características del principio activo utilizado y el efecto terapéutico que va a obtenerse.

Las nanopartículas de la presente invención, preferiblemente aquellas con núcleo de óxido de hierro, que presentan un fármaco unido a la gelatina, también se utilizan en otro aspecto de la invención para la liberación controlada del fármaco unido covalentemente a la gelatina. El fármaco unido a la gelatina se ha definido anteriormente.

Por "liberación controlada" se entiende que el fármaco libera en un sitio concreto de un organismo. Dicha liberación controlada se logra a través de las propiedades magnéticas de las nanopartículas de la presente invención con el uso de una atracción magnética externa o por funcionalización de las nanopartículas con moléculas que reconocen dianas sobre las que actuar. La liberación controlada permite reducir la dosis del fármaco y desaparición de efectos secundarios no deseados sobre otras células o tejidos sanos, así como facilitar el paso del fármaco a través de las barreras biológicas, como por ejemplo la barrera hematoencefálica.

Método de detección in vitro de metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMP)

Es conocido que un sustrato adecuado para determinar la actividad de las MMP es la gelatina. Por lo tanto, las NP de la invención resultan de utilidad para detectar en una muestra la presencia de actividad MMP puesto que la degradación de la cubierta de gelatina dará lugar a un cambio en las propiedades de las partículas que puede ser fácilmente detectable. Dicha detección de actividad MMP es selectiva de gelatinasas, preferiblemente MMP-2 o MMP-9, frente a otras MMP como son las colagenasas. Por tanto, en otro aspecto de la invención se relaciona con un método de detección in vitro de MMP en una muestra, que comprende:

(a) contactar la muestra con nanopartículas según se han definido anteriormente; y (b) detectar un cambio en al menos una propiedad de la nanopartícula,

en donde la metaloproteinasa de la matriz extracelular es una gelatinasas, como por ejemplo MMP-2 y MMP-9.

Las "MMP" o "metaloproteinasas de la matriz extracelular" son endopeptidasas dependientes de zinc. Ejemplos de MMP son MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP- 16, MMP- 17, MMP- 18, MMP- 19, MMP-20, MMP-21, MMP-23A, MMP-23B, MMP- 24, MMP-25, MMP-26, MMP-27 y MMP-28. Están involucradas en la escisión de receptores de la superficie celular, liberación de ligandos apoptóticos y activación/desactivación de quimiocinas/citocinas. También están relacionadas con procesos fisiológicos y patológicos tales como morfogénesis, angiogénesis, reparación tisular, cirrosis, artritis y metástasis. Se cree que MMP-2 y MMP-9 son relevantes en metástasis y MMP-1 en artritis reumatoide y osteoartritis.

Las "gelatinasas" hacen referencia a enzimas capaces de degradar la gelatina a polipéptidos de menor tamaño y/o a sus aminoácidos constitutivos. Ejemplos de gelatinasas son MMP-2 y MMP-9.

El método de detección in vivo de MMP definido anteriormente, las MMP se seleccionan de entre gelatinasas, preferiblemente MMP-2 y MMP-9, más preferiblemente MMP-2.

La etapa (a) que consiste en contactar la muestra con las nanopartículas de la invención, ya sea con nanopartículas según se ha definido anteriormente con núcleo de óxido de hierro o con núcleo de UC P se realiza por cultivo de dichas nanopartículas con la muestra, preferiblemente a una temperatura comprendida entre 5 °C y 38 °C, más preferiblemente entre 35 °C y 38 °C, y preferiblemente durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 min y 3 h.

El cambio detectado en la etapa (b) es un cambio en las propiedades físicas de las nanopartículas debido a la interacción de la gelatina que recubre las nanopartículas con la MMP cuándo dichas MMP están presentes en la muestra a analizar, es decir, debido a la degradación de la gelatina por dichas MMP. La degradación de la gelatina que recubre las nanopartículas conlleva un cambio en las propiedades de dichas nanopartículas. Dicho cambio es preferiblemente un cambio en al menos una de las propiedades de las nanopartículas, seleccionadas del grupo que consiste en el tamaño hidrodinámico, el potencial zeta, la relajatividad transversal (r ₂ ) y relajación transversal (T ₂ ) (en el caso de nanopartículas cuyo núcleo es de óxido de hierro), la relajatividad longitudinal (r¡) y relajación longitudinal (Ti) (en el caso de nanopartículas cuyo núcleo es de UC P), tal como se han definido anteriormente, y la fluorescencia (en el caso de nanopartículas cuyo núcleo es de UCNP). En una realización preferida el cambio es en fluorescencia de las nanopartículas, y por lo tanto las nanopartículas utilizadas en la etapa (a) tienen un núcleo de UCNP. En otra realización preferida, el cambio es en la relajación transversal, y por lo tanto las nanopartículas utilizadas en la etapa (a) tienen un núcleo de Fe ₃ 04.

El cambio hace referencia tanto a un aumento como a una disminución de la propiedad detectada en la etapa (b) respecto a la misma propiedad en las nanopartículas antes de interaccionar con la muestra.

Un cambio en la fluorescencia de las nanopartículas de núcleo de UCNP hace referencia a un cambio entre la intensidad y/o longitud de onda de la emisión de fluorescencia tras una excitación entre 800 nm y 1200 nm de las nanopartículas antes de interaccionar con la muestra respecto a las intensidad y/o longitud de onda de la emisión de fluorescencia tras una excitación entre 800 nm y 1200 nm de la mezcla de nanopartículas y muestra en la etapa (b).

En el contexto de la presente invención, al expresar el rango de valores de un parámetro comprendido entre dos valores o extremos, dichos rangos incluyen los valores de los extremos además de los valores intermedios definidos por dichos extremos.

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no se deben considerar como limitativos de la invención. Ejemplos

Métodos de caracterización de las nanopartículas. El tamaño y forma de las partículas se estudió empleando un microscopio de transmisión electrónica 200-KeV JEOL-2000 FXII. En una rejilla de cobre, recubierta con carbón y secada a 50 °C se colocó una gota de una suspensión diluida de las nanopartículas en hexano (las hidrófobas) o en agua (para las partículas oxidadas y las recubiertas con gelatina).

La caracterización del diámetro hidrodinámico se llevó a cabo mediante medidas de dispersión dinámica de luz empleando un Nano Sizer ZS (Malvern) y dispersiones de nanopartículas a una concentración de 0,5 mM Fe en agua.

Para la medida del potencial Z se diluyeron las partículas (0,5 mM Fe) en una disolución 0,01 M de KNO ₃ . Para las variaciones de pH durante la medida del potencial zeta se emplearon HNO ₃ o KOH.

Las muestras se analizaron por espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR) empleando un equipo Perkin Elmer 400, por medida directa de las muestras en polvo.

El análisis termogravimétrico de las nanopartículas, en forma de polvo, se realizó en un equipo Seiko TG/ATD 320U, SSC 5200. El análisis se realizó desde temperatura ambiente hasta los 1000 °C a razón de 10°C/min en un flujo de aire constante de 100 mL/min.

Para la evaluación de las prestaciones de las partículas como agentes de contraste en imagen por resonancia se empleó un MINISPEC MQ60 (Bruker) a 37 °C con un campo magnético de 1,5 T. Las velocidades de relajación R _Í (1/T _Í , s ^"1 , i = 1, 2) se obtuvieron de la medida directa de los tiempos de relajación (Ti, s). El ajuste lineal de los datos, Ri frente a la concentración de Fe o Gd, permite obtener los valores de relajatividad para las distintas nanopartículas ( , s^raM ^"1 ).

Ejemplo 1. Síntesis del núcleo de óxido de hierro.

Se empleó acetilacetonato de hierro (Fe(acac)3)como precursor y feniléter como disolvente. Una mezcla de 0,71 g de Fe(acac) ₃ (2 mmol), 2,38 g de 1,2-hexadecanodiol (10 mmol), 1,69 g de ácido oleico (6 mmol), 1,6 g de oleilamina (6 mmol) y 20 mL de feniléter fueron mezclados en una matraz de tres bocas. A continuación la mezcla se calentó con agitación mecánica y flujo de nitrógeno hasta una temperatura de 200 °C. Se mantuvo esta temperatura durante 120 minutos y a continuación se aumentó a reflujo, 254 °C, durante 30 minutos en atmósfera de nitrógeno. Finalmente se enfrió la reacción a temperatura ambiente. Para eliminar los subproductos formados la reacción se añadió a la mezcla etanol y se centrifugó a 8500 rpm durante 10 minutos. Finalmente, las partículas se mezclaron con 20 mL de hexano para obtener una suspensión estable.

Ejemplo 2. Síntesis del núcleo de las nanopartículas fosforescentes de conversión ascendente (UCNP).

A una mezcla principal A de GdCl ₃ 6H ₂ 0 (0,8307g), YbCl ₃ 6H ₂ 0 (0,2906g) se añaden 25 mL de ácido oleico y se deja agitando intensamente a 110°C durante 60 minutos en atmósfera inerte de nitrógeno. Transcurrido este tiempo se añade una disolución B de TmCl ₃ 6H ₂ 0 (0,00573g), ácido oleico (5mL) y octadeceno (5mL) que previamente ha sido calentada durante 30 minutos a 150°C. Una vez mezclada la disolución A con B se deja reaccionando durante una hora y posteriormente se añaden 35 mL de octadeceno. Se deja enfriar hasta los 60°C y una vez alcanzada dicha temperatura se añade gota a gota una tercera disolución C de NaOH (0,3 g) y H ₄ F (0,446 g) disueltos en 30 mL de MeOH. La mezcla de las disoluciones A, B y C se deja reaccionando a 290°C durante 90 minutos, en atmósfera inerte y con agitación moderada observándose pequeñas explosiones durante este tiempo debido a la formación de los núcleos. Pasado este tiempo la mezcla se deja enfriar a temperatura ambiente. El producto generado se redispersa en etanol y se purifica centrifugando a 7000 rpm durante 25 minutos. Se repite el procedimiento 5 veces y el sólido obtenido se redispersa en 20 mi de hexano.

Ejemplo 3. Oxidación de las nanopartículas de óxido de hierro para estabilización en agua (vía ácida). Se disolvieron en cloroformo (60 mL), 0,3 g de ΚΜη0 ₄ (1,9 mmol) y 0,8 g (4,3 mmol) de cloruro de benciltrimetilamonio. Se añadió la mezcla a una disolución concentrada (10 mg/mL Fe) de nanopartículas hidrófobas obtenidas en el Ejemplo 1, la reacción se llevó a cabo con agitación mecánica y a reflujo durante 4 horas. Pasado ese tiempo se añadió 50 mL de tampón AcOH/AcO ^" (pH 2,9) y se continuó la agitación y calefacción durante 20 horas. Pasado ese tiempo se enfrió la reacción y se añadió NaHS0 ₃ (3 x 5 mL) para eliminar el resto de permanganato. Finalmente se lavó la dispersión varias veces con disolución de NaOH (1%) y agua para obtener una dispersión estable en agua.

El análisis termogravimétrico de las nanop articulas obtenidas se muestra en la Figura 1. Ejemplo 4. Oxidación de las nanopartículas de óxido de hierro para estabilización en agua (vía básica).

Se procede de igual manera que en el Ejemplo 3 pero, en lugar de 50 mL de tampón AcOH/AcO ^" (pH 2,9), se añadió 20 mL de NaOH (1%).

Ejemplo 5. Síntesis de UCNP estables en agua.

Se disolvieron en cloroformo (60 mL), 0,3 g de KMn0 ₄ (1,9 mmol) y 0,8 g (4,3 mmol) de cloruro de benciltrimetilamonio. Se añadió la mezcla a una disolución de nanopartículas hidrófobas obtenidas en el Ejemplo 2, la reacción se llevó a cabo con agitación mecánica y a reflujo durante 4 horas. Pasado ese tiempo se añadió 50 mL de tampón AcOH/AcO ^" (pH 2,9) y se continuó la agitación y calefacción durante 20 horas. Pasado ese tiempo se enfrió la reacción y se añadió NaHS0 ₃ (3 x 5 mL) para eliminar el resto de permanganato. Finalmente se lavó la dispersión varias veces con disolución de NaOH (1%) y agua para obtener una dispersión estable en agua.

Ejemplo 6. Método general para el recubrimiento con gelatina.

3 mL de una muestra nanopartículas de óxido hierro hidrófilas obtenidas en los Ejemplos 3 y 4 ( 1,9 mg/mL Fe) se mezclan con 12 mg (0,06 mmol) de EDC y seguidamente con 15 mg (0,07mmol) de sulfo-N-hidroxisucci dimida y se deja agitando vigorosamente en vortex durante 40 minutos y a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se añade sobre dicha mezcla 3 mg (1% m/v) de gelatina porcina (90-110 g Bloom) y se lleva nuevamente a vortex, donde se deja reaccionando a temperatura ambiente durante 90 minutos más. Posteriormente la disolución es purificada con ayuda de imán, retirando la fase acuosa una vez que no se observen nanopartículas en disolución. La muestra imantada se redispersa en 8 mL de tampón fosfato, 10 mM, a pH 7 y se repite el proceso de purificación 3 veces más. Finalmente a muestra dispersa en 8 mL de tampón fosfato y se sónica durante 3 horas para deshacer los posibles agregados formados.

Las nanopartículas recubiertas de gelatina (ejemplo 6) obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3 presentan un tamaño hidrodinámico (N=12) de 45,1 ± 11,6 nm, un potencial zeta de -14,8 ± 4,6 mV y un r ₂ de 49 mM ^' V ¹ .

El análisis termogravimétrico de las nanopartículas obtenidas se muestra en la Figura 1.

Las imágenes de microscopía de transmisión electrónica de nanopartículas recubiertas de gelatina (ejemplo 6) obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3 se muestran en la Figuras 2 y 3.

El espectro de FTIR de nanopartículas recubiertas de gelatina (ejemplo 6) obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3 se muestra en la Figura 4.

El comportamiento superparamagnético de nanopartículas recubiertas de gelatina (ejemplo 6) obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3 se muestra en la Figura 5.

Ejemplo 7. Tiempo de residencia en sangre. Se inyectaron 0,8 mL de nanopartículas del ejemplo 6 obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3 a una concentración de 1 mg/mL en ratas. Se midió la intensidad de la señal en el hígado mediante imagen por resonancia magnética (MRI). Se espera una reducción de la intensidad de la señal cuando las nanopartículas llegan al hígado indicando una pérdida de nanopartículas en sangre debido al reconocimiento por parte del sistema inmunitario. Se tomaron muestras de sangre de las ratas a diferentes tiempos, se mezclaron con heparina y se midieron los tiempos T ₂ con un relaxómetro Bruker mq60. La intensidad de la señal en el hígado en función del tiempo se muestra en la Figura 6. Los valores de R ₂ en sangre en función del tiempo se muestran en la Figura 7. Las imágenes de cinética IRM muestran los resultados obtenidos con las nanopartículas con y sin recubrir con gelatina (del ejemplo 3 y ejemplo 6 obtenidas a partir de la nanopar ^' ticulas del ejemplo 3, respectivamente) (Figuras 8 y 9).

Ejemplo 8. Biodistribución.

24 h después de haber finalizado el experimento del Ejemplo 7, se sacrificaron los ratones, y se extrajeron el hígado, bazo y pulmones. Los distintos órganos fueron homogeneizados y se tomó una alícuota del mismo. A dicha alícuota se le aplicó una mezcla de azul de prusia para la cuantificación de Fe por medidas colorimétricas. De esta forma se cuantificó la cantidad de Fe por célula en cada órgano. El resultado de la biodistribución de las nanopartículas del ejemplo 6 obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3 se muestra en la Figura 10.

Ejemplo 9. Estudio de la evolución del tamaño hidrodinámico y el potencial zeta de las nanopartículas de núcleo de Fe30 ₄ en función de la concentración de gelatina.

3 mL de una muestra de nanopartículas de óxido hierro hidrófitas obtenidas en los Ejemplos 3 y 4 ( 1,9 mg/mL Fe) se mezclan con 12 mg (0,06 mmol) de EDC y seguidamente con 15 mg (0,07mmol) de sulfo-N-hidroxisucci dimida y se deja agitando vigorosamente en vortex durante 40 minutos y a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se añade sobre dicha mezcla diferentes concentraciones de gelatina porcina (90-110 g Bloom), desde 1 mg/mL a 7 mg/mL y se lleva nuevamente a vortex, donde se deja reaccionando a temperatura ambiente durante 90 minutos más. Posteriormente la disolución es purificada con ayuda de imán, retirando la fase acuosa una vez que no se observen nanopartículas en disolución. La muestra imantada se redispersa en 8 mL de tampón fosfato, 10 mM, a pH 7 y se repite el proceso de purificación 3 veces más. Finalmente a muestra dispersa en 8 mL de tampón fosfato y se sónica durante 3 horas para deshacer los posibles agregados formados. Los resultados se muestran en la Figura 11. Ejemplo 10. Ensayo de detección de MMP-2.

Se utilizaron las nanopartículas del ejemplo 6 obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3 y se prepararon cinco disoluciones, cada una con 200 μΐ. de nanopartículas a 0.05 mg/mL de Fe, a las que se añadieron las MMP-2 a diferentes concentraciones (50, 37,5, 25, 6,25, 1,25 ng/mL). Todas las soluciones fueron dispersadas en una disolución de CaCl ₂ (0, 10 mM) en tampón fosfato (pH 7, 1, 10 mM) para obtener un volumen final en todas las muestras de 400 Finalmente las disoluciones fueron incubadas a 37 °C en tubos de relaxometría y el T ₂ fue medido cada 15 minutos en un relaxómetro durante 4 horas. Los resultados se muestran en la Figura 12.

Ejemplo 11. Ensayo de detección de MMP-9. Se utilizaron las nanopartículas del ejemplo 6 obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3 y se prepararon cinco disoluciones, cada una con 200 μΐ. de nanopartículas a 0,05 mg/mL de Fe, a las que se añadieron las MMP-9 a diferentes concentraciones (50, 37,5, 25, 6,25, 1,25 ng/mL). Todas las soluciones fueron dispersadas en una disolución de CaCl ₂ (0, 10 mM) en tampón fosfato (pH 7, 1, 10 mM) para obtener un volumen final en todas las muestras de 400 μL. Finalmente las disoluciones fueron incubadas a 37 °C en tubos de relaxometría y el T ₂ fue medido cada 15 minutos en un relaxómetro durante 4 horas. Los resultados obtenidos fueron similares a los representados en la figura 12. Un gran variación del T ₂ pasado el tiempo de incubación y proporcional a la concentración de MMP-9.

Ejemplo 12. Ensayo de detección de MMP-1.

Se utilizaron las nanopartículas del ejemplo 6 obtenidas a partir de las nanopartículas del ejemplo 3 y se prepararon cinco disoluciones, cada una con 200 μL de nanopartículas a 0,05 mg/mL de Fe, a las que se añadieron las MMP-1 a diferentes concentraciones (5000, 500, 25, y 1,25 ng/mL). Todas las soluciones fueron dispersadas en una disolución de CaCl ₂ (0, 10 mM) en tampón fosfato (pH 7, 1, 10 mM) para obtener un volumen final en todas las muestras de 400 Finalmente las disoluciones fueron incubadas a 37 °C en tubos de relaxometría y el T ₂ fue medido cada 15 minutos en un relaxómetro durante 4 horas. Los resultados se muestran en la Figura 13.