CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una combinación de procianidinas específica, presente en los extractos de pepita de uva y útil para el tratamiento y/o prevención del síndrome metabólico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El síndrome metabólico es frecuente en el mundo occidental y combatirlo es importante, pues se considera como un estado previo al desarrollo de Ia diabetes y de enfermedades cardiovasculares. Se dice que un individuo sufre síndrome metabólico cuando presenta al menos tres de los síntomas siguientes: sobrepeso, resistencia a Ia insulina, dislipemia, hiperglucemia, hipertensión, inflamación y disfunción endotelial.

Se han descrito diversas propiedades saludables de los extractos de procianidinas de pepita de uva, que los hacen buenos candidatos para Ia prevención del síndrome metabólico, y de las patologías vinculadas al mismo. Dichos extractos tienen una gran diversidad de compuestos con distintas estructuras, muy similares entre ellas y que hacen que sea difícil comprender su bioactividad frente al síndrome metabólico. No obstante, se conoce que las procianidinas de estructuras sencillas poseen elevadas propiedades antioxidantes, y que las estructuras de bajo peso molecular y elevado grado de galoilación parecen más activas como agentes antiproliferativos. Sin embargo, hasta Ia fecha no se han identificado los compuestos presentes en los extractos responsables de su bioactividad frente al síndrome metabólico.

Por tanto, sería interesante identificar dichos compuestos para poder desarrollar composiciones farmacéuticas o suplementos dietéticos, que los contengan útiles para el tratamiento y/o prevención del síndrome metabólico,

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) y otras condiciones o patologías asociadas al mismo. Dichas condiciones relacionadas con el síndrome metabólico incluyen diabetes tipo II, dislipoproteinemia, infarto de miocardio, ataque cerebral y otras enfermedades arterioscleróticas, así como factores de riesgo de estas enfermedades, incluyendo resistencia a Ia insulina en general, obesidad abdominal causada por acumulación de grasa abdominal, niveles elevados de lípidos y glucosa en suero, hipertensión y presión arterial diastólica y/o sistólica elevada.

De este modo, entre otras ventajas, Ia administración de estas composiciones concretas, evitaría por ejemplo los efectos antagónicos que puedan ejercer determinadas moléculas, identificadas o no que forman parte del extracto total y por otro lado se optimizaría Ia eficiencia de las moléculas identificadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 Gráfica que representa Ia bioactividad del extracto de partida y de Ia composición combinación de un dímero-galato y un trímero.

Figura 2 Representa el análisis de masas

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona en un aspecto con una composición que comprende una combinación de un dímero-galato y un trímero, en Ia que el dímero-galato es una procianidina B-galato, distinta de B2-galato, y presenta Ia fórmula general:

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

y el trímero es una procianidina C que presenta Ia fórmula general:

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) y donde las líneas con curvas indican una estereoquímica α o β

Dicha composición es obtenible mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas: - partir de un extracto de pepita de uva que presenta una riqueza en procianidas del 76% y una composición de: 1.6% ácidos fenólicos, 20.9% de monómeros, 20.7% dímeros + epigalocatequin-galato, 17.3% trímeros y 39.4% de formas oligoméricas de 4 o más unidades;

- fraccionar dicho extracto mediante Cromatografía a Bajas Presiones en Columna Abierta utilizando como fase estacionaria Sílica precondicionada con el solvente acetona:hexano 65:35;

- elución con dicho solvente de los monómeros de flavanoles,

- establecimiento de un gradiente con el solvente acetona:hexano 80:20 hasta llegar al 100%, y recogida de 100 fracciones de 15-20 mi cada una; - fraccionamiento ulterior de Ia fracción que presenta un factor de retención de 0,18 mediante HPLC con el siguiente sistema: solventes: A (ácido fórmico 4.5%); B (acetonitrilo: solvente A 90:10); gradiente: 0-40% B (0-10 min), 40-60% B (10-35 min), 60-100% B (35-50 min), 100% B (50-60 min); - elución de Ia composición que comprende Ia combinación dímero-trímero a un tiempo de retención de18.2 min que se colecta,

- evaporación y liofilización.

Esta nueva composición que comprende Ia combinación dímero- trímero es útil en el tratamiento y/o prevención del síndrome metabólico o de una patología asociada al mismo. Por tanto en otro aspecto Ia invención se refiere a dicha composición como medicamento.

En una realización particular dicho medicamento es adecuado para el tratamiento y/o prevención del síndrome metabólico o una patología asociada al mismo, más en particular dicho medicamento es adecuado para el tratamiento y/o profilaxis de Ia dislipemia.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) La invención también se refiere al el empleo de una composición que comprende dicha combinación de un dímero-galato y un trímero, en Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención del síndrome metabólico o de una patología asociada al mismo.

La composición combinación de un dímero-galato y un trímero, también es útil para Ia preparación de una composición alimenticia o alimento, un aditivo alimenticio o un suplemento dietético. Por Io tanto en otro aspecto Ia invención se relaciona con el empleo de una composición que comprende una combinación de un dímero-galato y un trímero, en Ia elaboración de un alimento, un aditivo alimenticio o un suplemento dietético.

En un aspecto adicional Ia invención se relaciona con un alimento, aditivo alimenticio o suplemento dietético que comprende Ia composición combinación de un dímero-galato y un trímero. En una realización particular dicho alimento o composición alimenticia, dicho aditivo alimenticio o dicho suplemento dietético se caracteriza por comprender al menos una cantidad efectiva de Ia composición combinación de un dímero-trímero para producir un efecto terapéutico y/o profiláctico en un ser humano o animal con síndrome metabólico o una patología asociada al mismo. En una realización particular dicha patología asociada es Ia dislipemia.

En el contexto de Ia presente invención una composición alimenticia o alimento se refiere a una composición que contiene proteína, carbohidratos y/o grasa que se utiliza en un organismo para sostener el crecimiento, y procesos de reparación vitales, además de aportar energía. Los alimentos pueden además contener sustancias suplementarias, tales como minerales, vitaminas y condimentos. Los alimentos en Ia presente invención incluyen alimentos adaptados para uso humano y veterinario. El término alimento incluye bebidas adaptadas para el consumo humano y animal. El término aditivo alimenticio, incluye aditivos directos e indirectos para alimentos según se define por ejemplo por Ia FDA (21 C.F.R. 170.3(e) (1)). Y el término

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) suplemento dietético es un producto destinado a complementar Ia dieta que contiene uno o más de los siguientes ingredientes dietéticos: una vitamina, un mineral, una hierba o elemento botánico, un amino ácido, una sustancia dietética, un concentrado, un metabolito, un extracto o combinación de estos elementos. Las composiciones mencionadas pueden prepararse de modo convencional.

Las composiciones pueden contener un vehículo o excipiente, que se elige en función de su uso: humano o veterinario, alimento, aditivo, suplemento dietético o farmacéutico.

Los medicamentos proporcionados por Ia presente invención pueden ser administrados opcionalmente junto con al menos otro ingrediente activo útil para el tratamiento del síndrome metabólico y/o otras patologías asociadas, en forma oral, bucal, nasal, rectal, intravenosa, parenteral, o tópica. Las formas farmacéuticas pueden ser sólidas o líquidas, como por ejemplo, cápsulas, comprimidos, polvos o granulos, emulsiones, suspensiones, pastas, cremas, espumas, geles etc., incluyendo formas de liberación controlada. Los excipientes pueden ser determinados en cada caso por un experto en Ia materia.

La composición que comprende una combinación de un dímero-galato y un trímero puede obtenerse mediante diversos procedimientos de purificación y/o de síntesis.

En una realización particular Ia composición se obtiene a partir de un extracto de pepita de uva comercial (vitaflavan®). Este extracto puede presentar ciertas variaciones de composición según lote, pero de forma genérica presenta una riqueza en procianidas del 76% y una composición de: 1.6% ácidos fenólicos, 20.9% de monómeros, 20.7% dímeros + epigalocatequín-galato (EGCG), 17.3% trímeros y 39.4% de formas

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) oligoméπcas de 4 o más unidades.

De acuerdo con esta realización particular se parte de 0,5 gramos del extracto comercial que se fraccionan mediante Cromatografía a Bajas Presiones en Columna Abierta. La fase estacionaria consiste en Sílica (35-

70 mesh, Interchim, Monlugon, Francia) precondicionada con el solvente A (acetona:hexano 65:35). Tras eluir con este solvente los monómeros de flavanoles, se establece un gradiente con el solvente B (acetona:hexano 80:20) hasta llegar al 100%, y en total se recogen con un colector automático 100 fracciones de 15-20 mi cada una. El contenido de cada fracción se analiza por Cromatografía en Capa Fina en placas de PolyGram silica gel 0.2 mm con indicador de fluorescencia UV ₂₅₄ (Macherey-Nagel, Hoerdt, Francia), con Ia mezcla tolueno:acetona: acido acético (3:3:1 , v/v), usándose el reactivo de anisaldehído para el revelado. A partir de los resultados de Ia Capa Fina se agrupan los tubos en 11 fracciones, que responden también a crecientes grados medios de polimerización. La fracción 8 correspondía a un factor de retención de Rf=O ₁ 18. Esta fracción 8 se fracciona ulteriormente mediante HPLC semipreparativo (Varían, modelo 210) con una columna 4x250mm Ulreasep RP18 (Bischoff, Leonberg, Alemania) con el siguiente sistema: solventes: A (ácido fórmico 4.5%); B (acetonitrilo: solvente A 90:10); gradiente: 0-40% B (0-10 min), 40-60% B (10-35 min), 60-100% B (35-50 min), 100% B (50-60 min). La detección se monítoriza a 286 y 306 nm con un detector UV-vis (Varían, modelo 345). Los compuestos de interés eluyen a un tiempo de retención tR=18.2 min se colectan, se evaporan y se liofilizan. Se guardan a -2O ⁰ C.

Mediante el análisis por HPLC-ESI-MS se determinan las masas moleculares exactas de los compuestos de interés. Dichas masas son m/Z=

729 y 865 como se describe en el Ejemplo 1 , y se muestra el espectro de Ia Figura 2. Los inventores han identificado que estos pesos moleculares, que corresponden a Ia estructura de un dímero-galato y de un trímero,

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) respectivamente son los componentes capaces de reproducir significativamente el efecto previamente descrito del extracto total.

Por tanto los inventores han encontrado, sorprendentemente, que dicha combinación específica de un dímero-galato y de un trímero presenta efectos metabólicos, ya que actúa estimulando Ia captación de glucosa en adipocitos, y frenando Ia secreción de colesterol por hepatocitos y Ia secreción de triacilgliceroles por hepatocitos (Figura 1). Para llevar a cabo estos ensayos se utilizaron los cultivos celulares y las mediciones que se describen en detalle en el Ejemplo 2, y se estudió el efecto de Ia combinación de dímero-galato y trímero de Ia invención, sobre Ia estimulación de Ia captación de glucosa sobre adipocitos 3T3-L1 y Ia secreción de triglicéridos y colesterol total por hepatocitos HepG2.

La combinación específica de un dímero-galato y de un trímero reproduce Ia bioactividad que presenta el extracto de pepita de uva total.

A continuación se presentan ejemplos ilustrativos de Ia invención que se exponen para una mejor comprensión de Ia invención y en ningún caso deben considerarse una limitación del alcance de Ia misma.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 : Caracterización de las estructuras

La determinación de las estructuras presentes en Ia composición se ha llevado a cabo mediante análisis de espectrometría de masas de Ia composición, el cual pone de manifiesto que se trata de Ia combinación de un trímero (PM= 865) y un dímero-galato (PM= 729).

En una primera aproximación se determinó mediante HPLC-ESI-MS el peso molecular utilizando un espectrómetro de masas "Platform II" de Micromass,

(Manchester. UK) con inyección por electrospray (ESI) acoplado a un

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) aparato de cromatografía líquida. La detección se hizo en modo ion negativo [M-H]-, ya que las proantocianidinas apantallan un protón fácilmente generando iones negativos. Se utilizó un voltaje bajo para evitar Ia fragmentación y los productos se identificaron por sus picos moleculares.

Los picos cromatográficos aislados en Ia HPLC semipreparativa se caracterizaron asimismo mediante Maldi-TOF. Los espectros MALDI-MS se obtuvieron con un espectrómetro de masas TofSpec Maldi-Tof de Micromass (Manchester, UK). El instrumento está equipado con un láser de N2 pulsado, que emite a 337 nm con una amplitud de 4ns, y dotado de una fuente de extracción retardada de iones. Los espectros fueron registrados en modo positivo con un reflectrón con un voltaje de aceleración de 20 kV.

Ejemplo 2 Cultivo celular:

Preadipocitos 3T3-L1 fueron cultivados e inducidos a diferenciarse como se describe en (Ardévol, A. et al., (2000). Changes ¡n lipolysis and hormone- sensitive upase expression caused by procyanidins ¡n 3T3-L1 adipocytes. Int J Obes, 24, 319-324). Diez días después de Ia diferenciación, los adipocitos plenamente diferenciadas se lavaron dos veces con PBS y se incubaron a

37 ⁰ C con DMEM que contenga 0,2% de BSA (medio de ayuno) durante 2 horas. Durante los últimos 30 minutos de este tratamiento, las células fueron tratadas con insulina o Ia combinación de moléculas indicada (C+B-galato).

Células HepG2 (ATCC código HB-8065. Manassas, VA, EE.UU.) se propagan en DMEM (Cambrex) y cultivadas como se describe en (Puiggros, F., et al., (2005). Grape Seed Procyanidins Prevent Oxidative Injury by Modulating the Expression of Antioxidant Enzyme Systems. J.Agric.Food Chem., 53(15), 6080-6086). La única modificación fue Ia adición de 25 mM HEPES (Sigma) en el medio de cultivo. Para los experimentos, las células

HepG2 fueron sembradas a 750,000 células /pocilio (placas de 12),

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) dejándolas crecer durante dos días (80% confluencia) en un medio de propagación. El medio fue sustituido 16 h antes del tratamiento.

Mediciones Captación de 2-Deoxiqlucosa: Ia captación de glucosa fue determinada por

Ia medida de Ia captación de 2-deoxi-D-[3H] glucosa, como se describe en (Pinent, M., et al., (2004). Grape seed-derived procyanidins have an antihyperglycemic effect ¡n streptozotocin-induced diabetic rats and insulinomimetic activity ¡n insulin-sensitive cell lines. Endocrinology, 145(11), 4985-4990) Cada condición se ha ejecutado en triplicado.

Análisis de lípidos: Para Ia síntesis de novo de los triglicéridos y colesterol, las células HepG2 fueron sembradas en 12 placas. El medio fue sustituido 16 horas antes del tratamiento. Las procianidinas y ¹⁴ C-acetato (0.6 μCi/ml) se añadieron a los medios y, a continuación, 6 horas después del tratamiento los medios de cultivo y las células fueron recogidas y los lípidos extraídos utilizando hexano: isopropanol (3:2). La cromatografía en capa fina se realizó utilizando éter de petróleo: dietil éter: NH3 (40:10:0.1) y con una separación adicional hexano/MTBE/NH3 (30:20:01) para obtener las fracciones colesterol libre, colesterol esterificado y triacilgliceroles. Cada fracción se raspó y cuantificó por contaje de centelleo líquido. Los valores fueron corregidos por mg de proteína, determinado según Ia metodología de Bradford (Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principie of protein- dye binding. Anal Biochem, 72, 248-254).

Cálculos y análisis estadístico:

Los resultados se expresan como Ia media ± SEM. Se evaluaron los efectos mediante el test T-test. Todos los cálculos se realizaron utilizando el software SPSS.

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