Die gezielte Inhibition der Genexpression definierter Gene ist eine der am meisten beforschten Technologie der Biotechnologie.

Die Expression von antisense-RNA ist dabei der am häufigsten ver- wendet Ansatz und vielfach beschrieben (u. a. EP-A1 0 458 367 ; EP-A1 0 140 308 ; van der Krol AR et al. (1988) BioTechniques 6 (10) : 658-676 ; de Lange P et al. (1995) Curr Top Microbiol Immu- nol 197 : 57-75). Antisense-RNA vermittelte Ansätze haben jedoch den Nachteil, dass stöchiometrische Mengen der antisense-RNA er- forderlich sind, um eine wirksame Inhibition der Ziel-mRNA zu be- wirken. Weitere Probleme stehen im Zusammenhang mit dem Einbrin- gen der antisense-RNA in ausreichenden Mengen in die Zellen und mit der Labilität der antisense-RNA. Ansätze basierend auf anti- sense-RNA sind daher meist ineffizient.

Ein weiterer Ansatz zur Genregulation ist die"Co-Suppression" und meint die Verminderung der Expression eines endogenen Ziel- gens durch transgene Expression einer sense-RNA dieses Zielgens (EP-A1 0 465 572). Der Co-Suppression liegen vermutlich mehr als ein Mechanismus zugrunde. Nachteilig ist die mangelnde Verläss- lichkeit und Reproduzierbarkeit des Verfahrens. In manchen Fällen erfolgt Suppression, während in anderen Fällen-bedingt durch die Expression der sense-RNA-die erwartete Überexpression er- folgt. Auch ist der erhaltene Phänotyp oft nicht stabil. Die An- wendung der Co-Suppression ist im wesentlichen auf Pflanzen be- schränkt.

Verschiedene Abwandlungen der Verfahren basierend auf antisense- RNA oder Cosuppression sind bekannt. So beschreibt WO 93/23551 ein Verfahren zur Inhibition mehrerer Gene durch Expression einer chimären antisense-RNA oder sense-RNA. Das Verfahren kann die üb- lichen mit antisense-RNA oder sense-RNA verbundenen Probleme nicht lösen und bleibt ineffizient.

WO 98/36083 und WO 99/15682 beschreiben die Regulation der Genex- pression mittels viraler Expressionssysteme ("virus induced gene

silencing"VIGS).

WO 99/32619 und WO 99/53050 beschreiben Verfahren zur Inhibition einzelner Zielgene unter Verwendung einer RNA mit doppelsträngi- ger Struktur, wobei das Zielgen und die Region der RNA Duplex zu- mindest eine teilweise Identität aufweisen (siehe auch : Montgom- ery MK et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95 : 15502- 15507 ; Sharp PA (1999) Genes & Development 13 (2) : 139-141 ; Fire A et al (1998) Nature 391 : 806-11). Das Verfahren wird heute auch als "RNA-Interference" (RNAi) bezeichnet und hat in Mechanismus und Wirkung Ähnlichkeiten mit dem oben erwähnten VIGS Verfahren.

Die beschriebenen Verfahren, insbesondere das RNAi-Verfahren, lö- sen zwar einige Probleme im Zusammenhang mit der Verminderung einzelner Zielgene. Für andere Probleme, insbesondere für die parallele Suppression mehrerer Zielgene, konnte jedoch bislang keine befriedigende Lösung bereit gestellt werden. Zahlreiche An- sätze in der Biotechnologie erfordern nicht nur die Verminderung eines einzelnen Zielgens, sondern mehrerer Zielgene, wie bei- spielsweise verschiedener Gene eines oder verschiedener Stoff- wechselwege oder ganzer Genfamilien. Bislang war dies nur mit er- heblichen Arbeits-und Zeitaufwand zu realisieren. Die Ansätze erforderten oft die individuelle Regulation der einzelnen Ziel- gene durch sukzessive Transformation beispielsweise mit verschie- denen Expressionskonstrukten, die jeweils für eine antisense RNA eines Zielgens kodierten. Neben dem erheblichen Arbeits-und Zeitaufwand, besteht dabei der Nachteil, das für viele Systeme und Organismen nur eine beschränkte Anzahl von Selektionsmarkern, geeigneten Promotoren etc. zur Verfügung steht, was multiple Transformationen erheblich erschwert und beispielsweise die Dele- tion der Marker nach der Transformation und Selektion erfordert.

Die mehrfache Verwendung eines Promotors hat oft unerwünschte Folgen, wie beispielsweise ein epigenetisches Gene-Silencing.

Hierbei kommt es infolge der mehrfach verwendeten Kontrollsequen- zen zu einer Inaktivierung derselben, vergleichbar der oben be- schriebenen Cosuppression.

Es stellte sich also die Aufgabe, neue Verfahren bereit zu stel- len, die eine effiziente Verminderung der Expression mindestens zweier endogener Zielgene in einer eukaryotischen Zelle oder ei- nem eukaryotischen Organismus ermöglichen. Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Ver- minderung der Expression von mindestens zwei verschiedenen, endo- genen Zielgenen in einer eukaryotischen Zelle oder einem eukaryo- tische Organismus durch Einbringen eines zumindest teilweise dop- pelsträngigen Ribonukleinsäuremoleküls in besagte eukaryotische

Zelle oder besagten eukaryotischen Organismus, wobei das doppel- strängige Ribonukleinsäuremolekül umfasst a) mindestens zwei"sense"-Ribonukleotidsequenzen, wobei jeweils mindestens eine dieser"sense"-Ribonukleotidsequenzen im we- sentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes eines jeden der besagten endogenen Zielgene und b)"antisense"-Ribonukleotidsequenzen, die zu besagten "sense"-Ribonukleotidsequenzen unter a) im wesentlichen kom- plementären sind.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung umfasst ein zumindest teil- weise doppelsträngiges Ribonukleinsäuremolekül, wobei das doppel- strängige Ribonukleinsäuremolekül umfasst a) mindestens zwei"sense"-Ribonukleotidsequenzen, wobei jeweils mindestens eine dieser"sense"-Ribonukleotidsequenzen im we- sentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes eines endogenen Zielgens, wobei je- doch nicht alle"sense"-Ribonukleotidsequenzen zu dem "sense"-RNA-Transkript eines einzigen endogenen Zielgens identisch sind, und b) "antisense"-Ribonukleotidsequenzen, die zu besagten "sense"-Ribonukleotidsequenzen unter a) im wesentlichen kom- plementären sind.

Umfasst ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen doppel- strängiges Ribonukleinsäuremolekül in einem der erfindungsgemäßen Verfahren.

Die vorliegende Erfindung löst die oben geschilderten Probleme und ermöglicht eine schnelle, besonders effiziente Methode zur Regulation der Expression verschiedener Zielgene. Insbesondere ergeben sich folgende Vorteile : a) Transgene Organismen oder Zellen, in denen mehr als ein Ziel- gen inhibiert wird, können in einer einzigen Transformation erzeugt werden. b) Die Transkriptionsrate für jeden Ribonukleotidsequenz der dsRNA ist gleich. Dadurch werden multiple Phänotypen durch unterschiedliche Expressionshöhen verhindert, wie sie bei in- dividueller Expression separater Ribonukleotidsequenzen- beispielsweise durch den unterschiedlichen Ort der Insertion

in das Genom-oft entstehen. Dieser Vorteil gewährleistet eine gleichbleibend hohe Inhibition aller Zielgene und ver- mindert dramatisch die erforderlichen Selektionsschritte zu Generierung eines Organismus, bei dem alle Zielgene effizient supprimiert werden. c) Ein ökonomischer Umgang mit Kontrollelementen wie Promotoren und Selektionsmarkern wird ermöglicht. Zudem erübrigen sich Probleme, wie sie bei der mehrfachen Verwendung eines be- stimmten Kontrollelementes,. insbesondere eines Promoters, entstehen können ("epigenic gene silencing"). d) Eine Segregation der einzelnen Ribonukleotidsequenzen bei nachfolgenden Züchtungs-und Kreuzungsschritten, wie sie bei der Verwendung mehrerer Expressionskonstrukte zwangsläufig entsteht, wird verhindert. Dadurch wird die nachfolgende Züchtung stabiler Linien erheblich erleichtert und beschleu- nigt. e) Organismen mit komplexen beispielsweise polyploide Genomen, wie beispielsweise manche Pflanzen, sind einer effizienten Gensuppression zugänglich. Aufgrund der zahlreichen Kopien für einzelne Gene sind diese Organismen klassischen verfahren der Mutagenese und Selektion nicht zugänglich.

Überraschenderweise konnte bei dem erfindungsgemäßen Verfahren keine störende Interferenz zwischen den einzelnen Ribonukleotid- sequenzabschnitte untereinander beobachtet werden.

"Endogenes Zielgen einer eukaryotischen Zelle oder eines eukaryo- tische Organismus"meint jede Nukleinsäuresequenz in einer euka- ryotischen Zelle, einem eükaryotische Organismus oder einem Teil, Organ, Gewebe, Samen etc. desselben, die zur Transkription befä- higt ist. Dabei kann es sich um natürlicherweise vorkommende oder aber künstlich eingeführte Sequenzen (wie beispielsweise trans- gene Sequenzen) handeln, wobei natürlicherweise vorkommende Se- quenzen bevorzugt sind. Natürlicherweise vorkommende Sequenzen sind bevorzugt und umfassen sowohl die eigenen Sequenzen der eu- karyotischen Zelle oder des eukaryotischen Organismus als auch Gene von Pathogenen, die in der eukaryotischen Zelle oder dem eu- karyotischen Organismus nach einem Befall durch ein Pathogen prä- sent sind. Das Zielgen kann in der chromosomalen DNA oder der DNA der Organellen (wie beispielsweise der Plastiden z. B. Chloropla- sten etc. ) lokalisiert sein oder aber sich extrachromosomal in der Zelle befinden. Die natürlicherweise vorkommenden, eigenen Sequenzen des eukaryotischen Organsimus umfassen bevorzugt Gene desselben, die stabil im Genom vorliegen, wobei das Genom die Ge-

samtheit der genetischen Information meint und sowohl die chromo- somale als auch die plastidäre DNA umfasst. Bevorzugt ist das en- dogene Zielgen ein natürlicherweise in der chromosomalen DNA vor- kommendes Gen. Bevorzugt sind Gene deren verminderte Expression zu einem veränderten Phänotyp führt.

"Verminderung"oder"vermindern"der Expression eines Zielgens ist im Zusammenhang weit auszulegen und umfasst die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbio- logische Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung der Expression des Zielgens oder der von ihm abgeleiteten RNA, mRNA, rRNA, tRNA und/oder des dadurch kodierten Proteinproduktes in ei- ner. Zelle oder einem Organismus oder einem davon abgeleiteten Teil, Gewebe, Organ, Zelle oder Samen. Eine Verminderung im Sinne der Erfindung umfasst die mengenmässige Verringerung einer vom Zielgen exprimierten RNA, mRNA, rRNA, tRNA und/oder des dadurch kodierten Proteinproduktes bis hin zu einem im wesentlichen voll- ständigen Fehlen derselben. Dabei wird die Expression einer be- stimmten RNA, mRNA, rRNA, tRNA und/oder des dadurch kodierten Proteinproduktes in einer Zelle oder einem Organismus im Ver- gleich zu der selben Zelle oder Organismus, die dem Verfahren nicht unterworfen wurden, bevorzugt um mehr als 50%, besonders bevorzugt um mehr als 80%, ganz besonders bevorzugt um mehr als 90%, am meisten bevorzugt mehr al 95% vermindert. Dabei kann die Verminderung durch dem Fachmann geläufigen Verfahren ermittelt werden. So kann die Verminderung der Proteinmenge beispielsweise durch immunologischen Nachweis des Proteins bestimmt werden. Wei- terhin können biochemische Techniken wie Northern-Hybridisie- <BR> <BR> rung, "nuclease protection assay", Reverse Transkription (quanti- tative RT-PCR), ELISA ("enzyme linked immunosorbent assay"), We- stern-Blotting, Radioimmunoassay (RIA) oder andere Immunoassays sowie"fluorescence activated cell analysis" (FACS) eingesetzt werden. Je nach Art des verminderten Proteinproduktes kann auch dess Aktivität oder der Einfluss auf den Phänotyp des Organismus oder der Zelle ermittelt werden.

"Proteinmenge"meinte die Menge eines bestimmten Polypeptides in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkom- partiment.

"Verminderung"der Proteinmenge meint die mengenmäßige Verminde- rung der Menge eines bestimmten Polypeptides in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment-bei- spielsweise durch das erfindungsgemäße Verfahren-im Vergleich zu dem Wildtyp derselben Gattung und Art auf den dieses Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonst gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter, Nährstoffzufuhr

etc. ). Der Verminderung beträgt dabei mindestens 10 %, bevorzugt mindestens 10% oder mindestens 20%, besonders bevorzugt um minde- stens 40% oder 60%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70% oder 80%, am meisten bevorzugt um mindestens 90% oder 95%. Ver- fahren zur Bestimmung der Proteinmenge sind dem Fachmann bekannt.

Beispielhaft seien zu nennen : Das Mikro-Biuret Verfahren (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5 : 218-222), die Folin-Ciocalteu- Methode (Lowry OH et al. (1951) J Biol Chem 193 : 265-275) oder die Messung der Adsorption von CBB G-250 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72 : 248-254).

"Verschieden"meint in Bezug auf zwei endogene Zielgene bevor- zugt, dass die von den beiden endogenen Zielgenen transkribierte RNA oder mRNA nicht identisch ist. Bevorzugt ist die Homologie der von den beiden endogenen Zielgenen transkribierte RNA oder mRNA geringer als 90%, bevorzugt geringer als, 80%, besonders be- vorzugt geringer als 70%, ganz besonders bevorzugt geringer als 60%, am meisten bevorzugt geringer als 50% über jeweils die ge- samte Länge der transkribierten RNA oder mRNA.

"Zumindest teilweise doppelsträngiges Ribonukleinsäuremolekül" (infolge dsRNA) meint Ribonukleinsäuremolekül, die ganz oder teilweise doppelsträngig sind. Bevorzugt ist die Ribonukleinsäu- resequenz überwiegend vollständig doppelsträngig."Überwiegend vollständig doppelsträngig"meint, dass zumindest 50%, bevorzugt 70%, besonders bevorzugt 80%, ganz besonders bevorzugt 90% der in dem Molekül vorhandenen Basen in Paarung mit einer anderen Base der dsRNA vorliegen oder-entsprechend der Sequenz der dsRNA und den Basenpaarregeln sowie gegebenenfalls einer RNA-Sekundärstruk- turvoraussage mittels eines geeigneten Computeralgorithmus-zu- mindest theoretisch vorliegen können.

"Im wesentlichen identisch"meint, dass eine"sense"-Ribonukleo- tidsequenz der dsRNA auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu der Sequenz des"sense"-RNA- Transkriptes eines endogenen Zielgens aufweisen kann. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Basen einer Nukleinsäuresequenz.

Bevorzugt beträgt die Homologie zwischen einer"sense"-Ribonu- kleotidsequenz einer dsRNA und mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkript eines endogenen Zielgens mindestens 60 %, bevorzugt mindestens 70 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 %, am meisten bevorzugt 95%. Die Sequenzen können auch identisch mit der korrespondierenden Sequenz des Zielgens sein. Eine 100% ige Sequenzidentität zwischen der"sense"-Ribonukleotidse- quenz der dsRNA und mindestens einem Teil des"sense"-Stranges der Transkriptes eines endogenen Gens ist bevorzugt, wenn gleich

nicht zwingend erforderlich, um eine effiziente Verminderung der Expression des endogenen Gens zu bewirken. Einzelne Mutationen werden toleriert. Das Verfahren ist demnach tolerant gegenüber Sequenzabweichungen, wie sie infolge genetischer Mutationen, Po- lymorphismen oder evolutionärer Divergenzen vorliegen können. So ist es beispielsweise auch möglich mit einer einzigen dsRNA, die ausgehend von einer bestimmten endogenen Gen generiert wurde, die Expression weiterer homologer endogener Gene des gleichen Orga- nismus oder aber auch die Expression homologer endogener Gene in anderen verwandten Arten zu unterdrücken.

Unter Homologie wird das Maß der Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid-, Ribonukleotid-oder Proteinsequenzen verstanden, die bevorzugt durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Ge- netics Computer Group (GCG), Madison, USA ; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 : 3389ff) unter Einstellung folgender Parme-. ter berechnet wird : Gap Weight : 50 Length Weight : 3 Average Match : 10 Average Mismatch : 0 Dem Fachmann ist bewusst, dass wenn die Homologie zwischen DNA (z. B. Genen) und RNA bestimmt wird, Thymin (T) in der DNA Sequenz als äquivalent zu Uracil (U) in der RNA Sequenz betrachtet wird.

"Teil des"sense"-RNA-Transkriptes eines endogenen Zielgens" meint Fragmente einer RNA oder mRNA transkribiert von einem endo- genen Zielgen. Dabei hat besagtes Teil bevorzugt eine Sequenz- länge von mindestens 10 Basen, bevorzugt mindestens 25 Basen, be- sonders bevorzugt mindestens 50 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Basen, am meisten bevorzugt mindestens 200 Basen oder mindestens 300 Basen. Umfasst ist auch die vollständige transkribierte RNA oder mRNA.

Alternativ, kann eine"im wesentlichen identische"dsRNA auch als Nukleinsäuresequenz definiert werden, die befähigt ist, mit einem Teil eines Transkriptes, bevorzugt der mRNA, eines endogenen Zielgenes zu hybridisieren (z. B. in 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA bei 50°C oder 70°C für 12 bis 16 h oder unter ande- ren Standardhybridisierungsbedingungen).

"Standardhybridisierungsbedingungen"ist breit zu verstehen und meint weniger stringente als auch-bevorzugt-stringente Hybri- disierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in

Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9. 57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6.3. 6. beschrieben.

Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von sol- chen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und- bevorzugt-solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20X SSC : 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7.0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtempe- ratur, ungefähr 22°C, bis zu-bevorzugt-stärker stringenten Be- dingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispiel- hafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind in- folge gegeben : (1) Hybridisierungbedingungen zum Beispiel aus nachfolgenden Be- dingungen ausgewählt sein : a) 4X SSC bei 65°C, b) 6X SSC bei 45°C, c) 6X SSC, 100 Ag/ml denaturierter, fragmentierte Fischsper- ma-DNA bei 68°C, f) 50% Formamid, 4X SSC bei 42°C, h) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), i) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 420C * (schwach' stringente Bedingung).

(2) Waschschritte können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingun- gen ausgewählt sein : a) 0,015 M NaCl/0, 0015 M Natriumcitrat/0, 1% SDS bei 50°C. b) 0, 1X SSC bei 65°C. c) 0, 1X SSC, 0, 5% SDS bei 68°C. d) 0,1X SSC, 0, 5% SDS, 50% Formamid bei 42°C. e) 0,2X SSC, 0, 1% SDS bei 42°C. f) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).

"Im wesentlichen komplementär"meint, dass die"antisense"-Ribo- nukleotidsequenzen der dsRNA auch Insertionen, Deletionen sowie

einzelne Punktmutationen im Vergleich zu dem Komplement der "sense"-Ribonukleotidsequenzen aufweisen kann. Bevorzugt beträgt die Homologie mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %, am meisten bevorzugt 100% zwischen den"antisense"-Ribonukleotidsequenzen und dem Komple- ment der"sense"-Ribonukleotidsequenzen. Komplement meint dabei- in der dem Fachmann geläufigen Weise-den entsprechend den Ba- senpaarregeln abgeleiteten Gegenstrang.

Die doppelsträngige Struktur der dsRNA kann ausgehend von einem einzigen, ganz oder teilweise selbstkomplementären RNA-Strang (bei dem die oben erwähnten"sense"-und"antisense"-Ribohukleo- tidsequenzen der dsRNA alle kovalent miteinander verbunden sind) oder ausgehend von zwei RNA-Strängen (indem die oben erwähnten "sense"-und"antisense"-Ribonukleotidsequenzen der dsRNA auf se- parate Stränge vorliegen), die zueinander ganz oder teilweise komplementär sind, gebildet werden. Bei zwei separaten Strängen können beispielsweise alle"sense"-Ribonukleotidsequenzen auf dem einen und alle"antisense"-Ribonukleotidsequenzen auf dem anderen Strang vorliegen. Die Sequenzen können aber auch anders auf die beiden Stränge verteilt sein. Die Ausbildung der doppelsträngigen Struktur kann in vitro aber auch in vivo-beispielsweise in der eukaryotischen Zelle selber-erfolgen. Bevorzugt liegt die dsRNA in Form eines einzigen, selbstkomplementären RNA-Stranges vor.

Die einzelnen"sense"-Ribonukleotidsequenzen können mit den kor- respondierenden, im wesentlichen komplementären"antisense"-Ribo- nukleotidsequenzen eine doppelsträngige RNA-Struktur mittels Ba- senpaarung ausbilden und bilden eine Untereinheit der dsRNA.

Im Falle eines selbstkomplementären Stranges ergeben sich ver- schiedene Möglichkeiten für die Primärstruktur der dsRNA. Nach- folgend aufgeführte sind beispielshaft, jedoch nicht einschrän- kend zu verstehen : a) Es können zunächst die"sense"-Ribonukleotidsequenzen (S) der einzelnen Untereinheiten aneinander gefügt werden, wodrauf dann eine Aneinanderreihung der im wesntlichen komplementären "antisense"-Ribonukleotidsequenzen (AS) folgt. Die Anzahl der Einheiten n ist größer oder gleich zwei. Es entsteht eine Struktur mit einer einzelnen Haarnadel. Die Primärstruktur der dsRNA kann dabei schematisch beispielsweise wie folgt aussehen : 5'-S (l)-S (2)-.....-S (n) -AS (n)-....-AS (2) -AS (1)-3'

Die bevorzugte Sekundärstruktur ist in Fig. 2-A wiedergege- ben. b) Es können zunächst die"sense"-Ribonukleotidsequenz (S) und die im wesentlichen komplementäre"antisense"-Ribonukleotid- sequenz (AS) der ersten Untereinheiten aneinander gefügt wer- den, wodrauf dann die Aneinanderreihung von"sense"-und"an- tisense"-Ribonukleotidsequenzen der weiteren Untereinheiten folgt. Die Anzahl der Einheiten n ist größer oder gleich zwei. Es entsteht eine Struktur mit mehreren Haarnadeln. Die Primärstruktur der dsRNA kann dabei schematisch beispiels- weise wie folgt aussehen : 5'-S (l)-AS (l)-S (2) -AS (2).....-S (n) -AS (n)-3' Die bevorzugte Sekundärstruktur ist in Fig. 2-B wiedergegeben.

Ist die dsRNA-bevorzugt-in der Lage eine Haarnadelstruktur auszubilden, so entspricht der Stamm der Haarnadel dem doppel- strängige Anteil der dsRNA, der durch Basenpaarung zwischen auf dem gleich RNA-Moleküle lokalisierten"sense"-und"antisense"- Ribonukleotidsequenz gebildet wird. Dabei werden"sense"-und "antisense"-Ribonukleotidsequenzen bevorzugt durch einen"Linker" verbunden. Der"Linker"ist bevorzugt ein Intron, das aus der dsRNA herausgespleißt werden kann. Selbstkomplementären dsRNA- Strukturen ausgehend von einem einzelnen RNA-Molekül sind bevor- zugt, da sie lediglich die Expression eines Konstruktes erfordern und die komplementären RNA-Stränge stets in einem äquimolaren Verhältnis umfassen.

Bei der Verwendung eines Linkers (I)-bevorzugt eines. Intron- seien nachfolgende schematische Primärstrukturen für die dsRNA beispielhaft genannt : c) Dies ist eine bevorzugte Variante von a), bei der an der Stelle der Haarnadelschlaufe ein Linker (I) -bevorzugt ein Intron-insertiert wird : 5'-S (l)-S (2)-.....-S (n) -I-AS (n)-....-AS (2) -AS (1)-3t Die bevorzugte Sekundärstruktur ist in Fig. 2-C wiedergege- ben. d) Dies ist eine bevorzugte Variante von b), bei der an der Stelle der jeder Haarnadelschlaufe ein Linker (I)-bevorzugt ein Intron-insertiert wird :

5'-S (1)-I-AS (1)-S (2) -I-AS (2).....-S (n) -I-AS (n)-3' Die bevorzugte Sekundärstruktur ist in Fig. 2-D wiedergege- ben.

Die dsRNA Moleküle sind jedoch auch ohne den Linker funktionell.

Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass die letzten ca. 10 Nu- kleotide der terminalen Untereinheit S (n) in diesem Fall nicht mehr korrekt paaren. In diesem Fall ist die Länge für diese Un- tereinheit um 10 Nukleotide zu ergänzen. Der Linker ist bevorzugt ein Intron, besonders bevorzugt ein Intron in sense-Orientierung.

Bevorzugt handelt es sich um ein Intron eines pflanzlichen Gens.

Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien zu nennen : Das In- tron 3 der Alkoholdehydrogenase 1 (Adhl) aus Mais (GenBank Acc.- No. : AF044293 ; GI : 2828164), das Intron 4 der beta-Conglycinin <BR> <BR> alpha Untereinheit aus Soja (GenBank Acc. -No. : AB051865) ; eines der Introns des rbcS-3A Gens für Ribulose-1.5-bisphosphatcarboxy- lase (RBC) kleine Untereinheit aus Erbse (GenBank Acc. -No. : X04333). Diese und weitere geeignete Introns sind dem Fachmann bekannt (McCullough AJ & Schuler MA (1997) Nuc Acids Res 25 : 1071-1077). Für die Anwendung in dem erfindungsgemäßen Verfah- ren wird das Intron bevorzugt in Kombination mit Spleißakzeptor- und Spleißdonorsequenzen eingesetzt, die ein späteres Heraus- spleißen aus der dsRNA ermöglichen. Diese Spleißsequenzen können die flankirenden Sequenzen des Intron selber sein, oder aber auch durch dentsprechende Sequenzen der überigfen dsRNA bereitgestellt werden.

Jede der einzelnen"sense"-Ribonukleotidsequenzen der dsRNA ist im wesentlichen identisch zu mindestens einem Teil des.

"sense"-RNA-Transkriptes eines endogenen Zielgens. Dabei sind je- doch nicht alle"sense"-Ribonukleotidsequenzen zu dem "sense"-RNA-Transkript eines einzigen endogenen Zielgens iden- tisch, sondern die jeweils maximale Identität von mindestens zwei der"sense"-Ribonukleotidsequenzen besteht zu den"sense"-RNA- Transkripten von unterschiedlichen endogenen Zielgenen. Dabei be- trägt die Homologie zwischen den Transkripten der beiden endoge- nen Zielgene unter 90%, bevorzugt unter 80%, besonders bevorzugt unter 70%, ganz besonders bevorzugt unter 60%, am meisten bevor- zugt unter 50%.

Mindestens zwei der in der erfindungsgemäßen dsRNA umfassten ein- zelnen"sense"-Ribonukleotidsequenzen sind unterschiedlich. Un- terschiedlich bedeutet zum einen, dass die Zielgene zu deren Transkripten sie die jeweils maximale Identität aufweisen, nicht identisch sind. Bevorzugt vermindert mindestens eine Untereinheit

der dsRNA die Expression eines anderen Gens als mindstens eine andere Untereinheit. Unterschiedlich kann zum anderen auch hei- ßen, dass die"sense"-Ribonukleotidsequenzen der Untereinheiten selber im wesentlichen nicht identisch sind und bevorzugt eine Homologie zu einander unter 60%, besonders bevorzugt unter 50% ganz besonders bevorzugt unter 40% aufweisen. Die dsRNA kann in einer weiteren Ausführungsform meherer Kopien einer Untereinheit enthalten. Weiterhin kann die dsRNA auch mehrere verschiedene Un- tereinheiten enthalten, die aber gegen das gleiche endogene Ziel- gens gerichtet sind und deren"sense"-Ribonukleotidsequenzen bei- spielsweise im wesentlichen identisch sind zu unterschiedlichen Teilen des"sense"-RNA-Transkriptes des besagten endogenen Ziel- gens.

Dabei kann jede der einzelnen"sense"-Ribonukleotidsequenzen auch zu dem Transkript mehrerer endogener Zielgene im wesentlichen identisch sein. Dies ist besonders dann der Fall, wenn die Ziel- gene über ähnliche Sequenzabschnitte verfügen, wie es beispiels- weise bei Mitgliedern von Genfamilien (z. B. Speicherproteinen) der Fall ist. Dies ist eine besonders vorteilhafte Anwendungs- form, da-bei entsprechender Wahl der Ribonukleotidsequenz einer Untereinheit-besagte Untereinheit die Expression von mehr als einem Zielgen vermindern kann.

Vorzugsweise wird die Sequenz der dsRNA so gewählt, dass die an- gestrebte dsRNA Struktur nach Ausbildung der Duplex-im Ver- gleich zu anderen möglichen Faltungsvarianten der Primärstruktur der dsRNA-die jeweils geringste freie Energie hat. Dies kann beispielsweise durch Vermeidung von Sequenzduplikationen etc. ge- währleistet werden. Die spezifische Sekundärstruktur kann bei- spielsweise mit geeigneten Computerprogrammen vorausgesagt und optimiert werden (z. B. FOLDRNA ; Zuker and Stiegler- (1981) Nucleic Acids Res 9 (1) : 133-48).

Jede Untereinheit der dsRNA hat in einer bevorzugten Ausführungs- form eine Länge von mindestens 20 Basenpaaren, bevorzugt minde- stens 50 Basenpaaren, besonders bevorzugt mindestens 100 Basen- paare, ganz besonders'bevorzugt mindestens 250 Basenpaare.

In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform hat jede Einheit eine Länge eine ganzzahligen Vielfachen von 21 oder 22 Basenpaa- ren, also beispielsweise 21,22, 42,43, 44,63, 64,65, 66,84, 85,86, 87, 88, 105,106, 107,108, 109,110, 126,127, 128,129, 131,132, 147,148, 149,150, 151,152, 153,154, 168,169, 170, 171,172, 173,174, 175,176, 189,190, 191,192, 193,194, 195, 196,197, 198, 210, 211,212, 213,214, 215,216, 217,218, 219 oder 220 Basenpaare, bevorzugt 21,22, 42,44, 63,66, 84,88,

105,110, 126,132, 147,154, 168,176, 189,198, 210 oder 220 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt 21,42, 63,84, 105,126, 147,168, 189 oder 210 Basenpaare, am meisten bevorzugt 180 oder 210 Basenpaare.

Die"sense"-und/oder"antisense"-Ribonukleotidsequenzen der ein- zelnen Untereinheiten können direkt oder aber durch einen"Spa- cer" (SP ; Abstandshalter) miteinander verbunden und/oder flan- kiert sein. Die einzelnen"Spacer" (SP) können dabei identisch oder aber auch unterschiedlich sein. Der"Spacer"genügt dabei bevorzugt den gleichen Längenanforderungen wie sie oben für die Länge der Untereinheiten selber gegeben sind. Der"Spacer"kann eine doppelstränge Struktur ausbilden, kann aber auch-bei- spielsweise in Form einer Blase-in ungepaarter Formation beste- hen, d. h. die Basen in Strang und Gegenstrang müssen nicht zwin- genderweise komplementär sein. Bevorzugte Ausführungsformen sind zum Beispiel durch nachfolgende Primärstrukturen beschrieben : e) Dies ist eine bevorzugte Variante von c) : 5'SP-S (l)-SP-S (2) -SP-.. -S (n) -AS (n) -SP-..-AS (2)-SP-AS (l)-SP-3 Die bevorzugte Sekundärstruktur ist in Fig. 3-A wiedergege- ben.

Der"Spacer"kann weitere Funktionselemente umfassen. Beispiel- haft jedoch nicht einschränkend sind zu nennen : i) Sequenzen kodierend für eine von einem Ribozym als Substrat erkannten Erkennungssequenz (RE). Beispielsweise kann die dsRNA nachfolgende lineare Struktur vor der Faltung einneh- men : 5'-S (1)- (RE)-S (2) -... -S (n) -AS (n)-..-AS (2)- (RE)-AS (1)-3' Die bevorzugte Sekundärstruktur ist in Fig. 3-B wiedergege- ben. Das entsprechende Ribozym (R) kann separat exprimiert werden kann aber auch auf der dsRNA selber kodiert sein. Da- bei ist die Sequenz kodierend für ein Ribozym bevorzugt so angeordnet, dass sie im gefalteten dsRNA Molekül einer Se- quenz gegenüber liegt, die für dieses Ribozym als Substrat fungieren kann. Beispielsweise kann die dsRNA nachfolgende lineare Struktur vor der Faltung einnehmen : 5'-S (1)- (R) (RE) -S (2) -...-S (n) -AS (n)-..-AS (2)- (R) (RE) -AS (1)-3'

Die bevorzugte Sekundärstruktur ist in Fig. 3-C wiedergege- ben. Durch die genannten Ausführungsformen werden nach Tran- skription die einzelnen Untereinheiten durch Wirkung des Ri- bozym voneinander getrennt. Diese Trennung ist vorteilhaft, jedoch nicht zwingend erforderlich. Entsprechend nutzbare Ri- bozyme und Erkennungssequenzen sind dem Fachmann bekannt.

Ribozyme meint katalytische RNA-Moleküle. Ribozyme können an jede beliebige Ziel-RNA angepasst werden und spalten das Phosphodiester-Gerüst an spezifischen Positionen, wodurch die Ziel-RNA funktionell deaktiviert wird (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23 (3) : 257-275). Das Ribozym wird dadurch nicht selber modifiziert, sondern ist in der Lage, weitere Ziel- RNA-Moleküle analog zu spalten, wodurch es die Eigenschaften eines Enzyms erhält. Der Einbau von Ribozymsequenzen in"an- tisense"-RNAs verleiht eben diesen"antisense"-RNAs diese en- zymähnliche, RNA-spaltende Eigenschaft und steigert so deren Effizienz bei der Inaktivierung der Ziel-RNA. Die Herstellung und Verwendung entsprechender Ribozym-"antisense"-RNA-Mole- küle ist beispielsweise beschrieben bei Haseloff et al.

(1988) Nature 334 : 585-591. Auf diese Art können Ribozyme (z. B. "Hammerhead"-Ribozyme ; Haselhoff und Gerlach (1988) Na- ture 334 : 585-591) verwendet werden, um die eines bestimmte RNA katalytisch zu spalten. Verfahren zur Expression von Ri- bozymen zur Verminderung bestimmter Proteine sind beschrieben in (EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257). In pflanzli- chen Zellen ist eine Ribozym-Expression ebenfalls beschrieben (Steinecke P et al. (1992) EMBO J 11 (4) : 1525-1530 ; de Feyter R et al. (1996) Mol Gen Genet. 250 (3) : 329-338). Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei"Stei- necke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds, Academic Press, Inc. (1995), S. 449-460" beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym-und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al. (1992) Plant Mol Biol. 18 (2) : 353-361 ; Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol Gen Genet. 242 (6) : 653-657). Beispiels- weise können Derivate der Tetrahymena L-19 IVS RNA kon- struiert werden, die komplementäre Bereiche zu der mRNA des zu den Spacersequenzen aufweisen (siehe auch US 4,987, 071 und US 5,116, 742). Alternativ können solche Ribozyme auch über einen Selektionsprozess aus einer Bibliothek diverser Ribo- zyme identifiziert werden (Bartel D und Szostak JW (1993) Science 261 : 1411-1418). ii) Sequenzen kodierend für Erkennungssequenzen für RNAasen Der"Spacer"kann Erkennungssequenzen für RNAsen, bevorzugt sequenzspezifische RNAsen wie beispielsweise RNAse III ent-

halten. RNAse III schneidet am Motiv 5'-AGNN-3, wenn vier dieser Motive in einer Schleife vorhanden sind (Nagel R & Ares M (2000) RNA 6 : 1142-1156). Die RNase kann eine pflanze- neigene RNAse sein, oder-wie beispiuelsweise für bakte- rielle RNase III Proteine-auch transgen exprimiert werden. iii) Sequenzen kodierend für Intronspeißsignale (IS). Dabei sind die Spleißdonor und Spleißakzeptorsequenzen bevorzugt so lo- kalisiert, dass jeweils die Untereinheit als Intron heraus- gespleißt wird. Intronspleißsignale sind in Meritt et al. (1997) Plant Journal 12 : 937-943 oder in Egoavil et al.

(1997) Plant Journal 12 : 971-980 beschrieben.

Die dsRNA bzw. ihre Vorläufermoleküle können auf verschiedene dem Fachmann geläufige Weise in einen Organismus oder eine Zelle ein- gebracht werden."Einbringen"-ist breit zu verstehen und umfasst im Rahmen der Erfindung alle Verfahren, die dazu geeignet eine dsRNA bzw. ihre Vorläufermoleküle, direkt oder indirekt, in einen Organismus oder eine Zelle, Kompartiment, Gewebe, Organ oder Sa- men desselben einzuführen oder dort zu generieren. Die Einbrin- gung kann zu einer vorübergehenden (transienten) Präsenz einer dsRNA führen oder aber auch zu einer dauerhaften (stabilen). Um- fasst sind Verfahren der direkten Transfektion oder Transforma- tion der Zelle mit der als auch die Transformation oder Trans- fektion der Zelle mit Expressionskassetten, die befähigt sind, die der dsRNA zugrundeliegenden Ribonukleinsäuresequenzen in der Zelle zu exprimieren (infolge dsRNA-Expressionssystem). Die Ex- pression der dsRNA kann transient oder-beispielsweise nach In- tegration in das Genom des Organismus-permanent erfolgen. Die Duplex-Bildung der dsRNA kann entweder außerhalb der Zelle oder innerhalb derselben initiiert werden.

Die dsRNA wird in einer Menge eingeführt, die zumindest eine Ko- pie pro Zelle ermöglicht. Höhere Mengen (z. B. mindestens 5,10, 100,500 oder 1000 Kopien pro Zelle) können ggf. eine effizienter Verminderung der Expression der Zielgene bewirken. Da dsRNA eine außerordentlich gute Mobilität innerhalb eines Organismus hat, ist es nicht zwingend erforderlich die dsRNA in jede Zelle des Organismus zu applizieren. Es ist ausreichend, die dsRNA in eine oder wenige Zellen einzubringen oder zu exprimieren, wobei die erfindungsgemäße Wirkung dann auch in anderen Zellen des gleichen Organismus erzielt werden kann.

Eine dsRNA-beispielsweise zur Verwendung in einer direkten Transformation oder Transfektion-kann kann in vivo oder in vi- tro, durch enzymatische, molekularbiologische oder chemisch-syn- thetische Verfahren synthetisiert werden. Dazu können eukaryoti-

sche, prokaryotische oder Bakteriophagen RNA Polymerasen (wie z. B. T3-, T7-oder SP6 RNA-Polymerase) verwendet werden. Entspre- chende Verfahren zu in vitro Expression von RNA sind beschrieben (WO 97/32016 ; US 5,593, 874 ; US 5,698, 425, US 5,712, 135, US 5,789, 214, US 5,804, 693). Eine chemisch oder enzymatisch in vitro synthetisierte dsRNA kann vor der Einführung in eine Zelle, Ge- webe oder Organismus aus dem Reaktionsgemisch beispielsweise durch Extraktion, Präzipitation, Elektrophorese, Chromatographie oder Kombinationen dieser Verfahren ganz oder teilweise aufgerei- nigt werden. Die dsRNA kann direkt in die Zelle eingeführt werden (beispielsweise durch Partikelbeschuß oder Mikroinjektion) oder aber extrazellulär (z. B. in den interstitial Raum, das Gefäßsy- stem, das Verdauungssystem o. ä.) appliziert werden. Auch eine Ap- plikation beispielsweise von dsRNA exprimierenden Organismen in Form von Nahrung ist denkbar. Es ist bekannt, dass dsRNA eine gute Zellgängigkeit und ausreichende Stabilität hat. Durch die hohe Wirksamkeit der dsRNA sind auch wenige Moleküle ausreichend, um eine gute Wirkung im Sinne der Erfindung zu erzielen.

Es können ferner Modifikationen sowohl des Zucker-Phosphat-Gerü- stes als auch der Nukleoside in der dsRNA vorliegen. Beispiels- weise können die Phosphodiesterbindungender der RNA dahingehend modifiziert sein, dass sie zumindest ein Stickstoff oder Schwe- fel-Heteroatom umfassen. Basen können dahingehend modifiziert werden, dass die Aktivität beispielsweise von Adenosindeaminase eingeschränkt wird. Die dsRNA kann enzymatisch oder ganz oder teilweise chemisch-synthetisch hergestellt werden.

Bevorzugt wird die dsRNA jedoch ausgehend von entsprechenden Ex- pressionssystemen in der Zelle exprimiert. Ein weiterer Gegen- stand der Erfindung betrifft besagte dsRNA-Expressionssysteme.

Wird die dsRNA als ein einzelner, selbstkomplementären RNA-Strang exprimiert, so umfasst das Expressionssystem eine Expressionskas- sette mit einer für den selbstkomplementären RNA-Strang kodieren- den DNA Sequenz in funktioneller Verknüpfung mit einen Promotor, der geeignet ist, die Expression in der jeweiligen eukaryotischen Zelle zu gewährleisten. Optional kann die Expressionskassette weitere funktionelle Elemente wie beispielsweise Transkriptions- terminatoren und/oder Polyadenylierungssignale umfassen. Derar- tige Expressionskassetten sind ebenfalls Gegenstand der Erfin- dung.

Wird die dsRNA in Form von zwei separaten Strängen exprimiert, die zueinander ganz oder teilweise komplementär sind, so umfasst das Expressionssystem zwei Expressionskassetten, wobei jeder der beiden Stränge in funktioneller Verknüpfung mit einen Promotor steht, der geeignet ist, die Expression in der jeweiligen euka-

ryotischen Zelle zu gewährleisten. Optional können die Expres- sionskassetten weitere funktionelle Elemente wie beispielsweise Transkriptionsterminatoren und/oder Polyadenylierungssignale um- fassen. Die Kombination der beiden Expressionskassetten zu dem erfindungsgemäßen Expressionssystem kann auf verschiedene dem Fachmann geläufige Art geschehen. Beispielhaft seien zu nennen : a) Transformation der Zelle oder Pflanze mit einem Vektor, der Expressionskassetten für beide RNA-Stränge umfasst, b) Kotransformation der Zelle oder Pflanze mit zwei Vektoren, wobei jeweils ein Vektor für jeweils einen der beiden Stränge der dsRNA kodiert. c) Kreuzung von zwei Pflanzen, die mit jeweils einem Vektor transformiert wurden, wobei jeweils ein Vektor für jeweils einen der beiden Stränge der dsRNA kodiert.

Es ist auch möglich, das eine Expressionskassette einzusetzten, bei der die für die dsRNA kodierende DNA-Sequenz zwischen zwei Promotoren mit entgegengerichteter Transkriptionsrichtung lokali- siert ist und so von beiden Seiten transkribiert wird.

Expressionskassette meint chimäre DNA-Moleküle in denen eine für das dsRNA-Molekül (bzw. für einen der Stränge desselben) kodie- rende Nukleinsäuresequenz mit mindestens einem genetischen Kon- trollelement (beispielsweise einem Promotor, Enhancer, Silencer, Splice-Donor oder-Akzeptor, Polyadenylierungssignal) derart ver- knüpft ist, das die Transkription des dsRNA-Moleküls (bzw. eines der Stränge desselben) in der eukaryotischen Zelle oder Organis- mus gewährleistet ist. Entsprechend vorteilhafte Konstruktionen sind weiter unten beschrieb. Eine Polyadenylierung ist möglich, jedoch nicht erforderlich, ebenso müssen keine Elemente zur In- itiierung einer Translation vorhanden sein.

Soll das Expressionskonstrukt in eine Pflanze eingeführt und die dsRNA in plantae erzeugt werden, so sind pflanzenspezifische ge- netische Kontrollelemente (beispielsweise pflanzenspezifis. che Promotoren) bevorzugt. Die dsRNA kann jedoch auch in anderen Or- ganismen oder in vitro erzeugt und dann in die Pflanze einge- bracht werden.

Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu transkri- bierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Ele- mente wie zum Beispiel einem Terminator und/oder Polyadenylie- rungssignalen derart, dass jedes der regulativen Elemente seine

Funktion bei der Transkription der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforder- lich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Se- quenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positio- nen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu transkribie- rende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent mit- einander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäu- resequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt klei- ner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die zu transkribierende Nukleinsäuresequenz so hinter dem Promotor loka- lisiert, das der Transkriptionsstart identisch ist mit dem ge- wünschten Beginn der dsRNA.

Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung als auch die Her- stellung einer Expressionskassette kann mittels gängiger Rekom- binations-und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo- ratory, Cold Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML und En- quist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience und bei Gelvin et al. (1990) In : Plant Mo- lecular Biology Manual beschrieben sind.

Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruk- tionen zu verstehen, bei denen zum Beispiel eine Nukleinsäurese- quenz kodierend für eines dsRNA derart hinter einen endogenen Promotor platziert werden, dass der gleiche Effekt auftritt.

Beide Ansätze führen zu Expressionskassetten im Sinne der Erfin- dung.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regula- tionssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden, solange sie die Expression in dem Zielorganismus gewährleisten. Darüberhinaus können auch syntheti- sche Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Es können weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimieren- den Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Eukaryoten oder in Prokaryoten, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen.

Die in den erfindungsgemässen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promoter funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemässen Ex- pressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizie- ren zum Beispiel die Transkription in prokaryotischen oder euka- ryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäs- sen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen pflanzenspe- zifischen Promoter und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls wei- tere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans- latierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Ge- nen. Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktio- nen bei der Regulation der Genexpression spielen können. Kon- trollsequenzen umfassen ferner Polyadenylierungssignale sowie Terminatorsequenzen.

Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte"enhancer Sequenzen"funktionell verknüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nu- kleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteil- hafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Ele- mente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nuklein- säuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkon- strukt enthalten sein.

Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom er- lauben. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewe- bespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Ex- pressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods. 14 (4) : 381-92). Hier werden bestimmte flankierende

Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.

Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Ver- knüpfung von Promoter und zu transkribierender Nukleinsäurese- quenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Bei- spiel Transformation-nach einem der unten beschriebenen Verfah- ren-in die eukaryotische Zelle oder Organismus eingebracht wer- den. Die nachfolgende Expression kann transient sein oder aber auch-bevorzugt-stabil nach Insertion (beispielsweise unter Verwendung von Selektionsmarkern) der Expressionskassetten in das Genom erfolgen. Bevorzugt wird das dsRNA-Expressionssystem stabil in das Genom-beispielsweise die chromosomale DNA oder die DNA der Organellen (z. B. der Plastiden, Mitochondrien etc.)-einer Zelle integriert.

Die Einführung einer erfindungsgemässen transgenen Expressions- kassette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zel- len, Gewebe, Organe, Teile oder Samen) kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die transge- nen Expressionskassetten enthalten sind. Vektoren können bei- spielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobakte- rien sein. Die transgenen Expressionskassetten können in den Vek- tor (bevorzugt ein Plasmidvektor) über eine geeignete Restrikti- onsschnittstelle insertiert werden. Der entstandene Vektor wird zunächst in E. coli eingeführt. Korrekt transformierte E. coli wer- den selektioniert, gezüchtet und der rekombinante Vektor mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu über- prüfen. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integra- tion der Expressionskässette in das Wirtsgenom ermöglichen.

Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entspre- chende DNA (z. B. der Expressionsvektor) oder RNA in die entspre- chende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185 : 527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bom- bardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt wer- den. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylen- glycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protopla- stenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist

eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabili- sert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispiels- weise bei Bilang et al. (1991) Gene 100 : 247-250 ; Scheid et al.

(1991) Mol Gen Genet 228 : 104-112 ; Guerche et al. (1987) Plant Science 52 : 111-116 ; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75 : 30-36 ; Klein et al. (1987) Nature 327 : 70-73 ; Howell et al.

(1980) Science 208 : 1265 ; Horsch et al. (1985) Science 227 : 1229-1231 ; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91 : 694-701 ; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds. ) Academic Press Inc. (1988) ; and Methods in Plant Molecular<BR> Biology (Schuler and Zielinski, eds. ) Academic Press Inc.<BR> <P>(1989)).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Zellen, die eines der erfindungsgemäßen dsRNA Moleküle, Expressionssysteme, Expres- sionskassetten oder Expressionsvektoren enthalten. Die Zelle kann von einem Organismus abgeleitet oder in diesem enthalten sein, meint aber auch einzellige Organismen wie Mikroorganismen. Die Zelle kann prokaryotisch oder eukarypotischer Natur sein. Wobei das erfindungsgemäße Verfahren auf eukaryotische Organismen ange- wendet wird. Dennoch können prokaryotische Organismen die erfin- dungsgemäßen Expressionssysteme beispielsweise zum Zwecke der dsRNA-Produktion enthalten. Auch können prokaryotische Organis- men, beispielsweise Agrobakterien, vorteilhaft als Vehikel für die Transformation beispielsweise pflanzlicher Organismen einge- setzt werden.

Bevorzugte Prokaryoten sind vor allem Bakterien wie Bakterien der Gattung Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Clostrridium, Proionibacterium, Butyrivibrio, Eubacterium, Lactobacillus, Erwi- nia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes, Phaeodactylum, Colpidium, Mortierella, Entomophthora, Mucor, Crypthecodinium oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis. Be- vorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemässen Kon- strukte befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agrobacterium tumefaciens.

Eukaryotische Zellen und Organismen umfasst pflanzliche und tie- rische, nicht-menschliche Organismen und/oder Zellen sowie euka- ryotische Mikroorganismen wie beispielsweise Hefen, Algen oder Pilze. Eine entsprechender transgener Organismus kann beispiels- weise durch Einführung der entsprechenden Expressionssysteme in

eine Zygote, Stammzelle, Protoplast oder eine andere geeignete von dem Organismus abgeleitete Zelle hergestellt werden.

"Tierische Organismus"meint nicht-menschliche Vertebraten oder Invertebraten. Bevorzugte Vertebraten umfassen beispielsweise Fi- scharten, nicht-menschliche Säugetiere wie Rind, Pferd, Schaf, Ziege, Maus, Ratte oder Schwein, sowie Vögel wie Huhn oder Gans.

Bevorzugte tierische Zellen umfassen CHO, COS, HEK293 Zellen. In- vertebraten umfassen Nematoden oder andere Würmer sowie Insekten.

Invertebraten umfassen Insektenzellen wie Drosophila S2 und Spo- doptera Sf9 oder Sf21 Zellen.

Bevorzugt sind ferner Nematoden, die in der Lage sind Tiere oder Menschen zu befallen, wie solche der Gattungen Ancylostoma, Asca- ridia, Ascaris, Bunostomum, Caenorhabditis, Capillaria, Chaber- tia, Cooperia, Dictyocaulus, Haemonchus, Heterakis, Nematodirus, Oesophagostomum, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Strongylus, To- xascaris, Trichuris, Trichostrongylus, Tfhchonema, Toxocara oder Uncinaria. Ferner bevorzugt sind solche, die in der Lage sind' pflanzliche Organismen zu befallen wie beispielsweise Bursapha- lenchus, Criconemella, Diiylenchus, Ditylenchus, Globodera, Heli- cotylenchus, Heterodera, Longidorus, Melodoigyne, Nacobbus, Para- tylenchus, Pratylenchus, Radopholus, Rotelynchus, Tylenchus oder Xiphinema. Bevorzugte Insekten umfassen solche der Gattungen Co- leoptera, Diptera, Lepidoptera und Homoptera.

Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neu- rospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr.

Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 be- schriebene Pilze. Besonders bevorzugt ist der filamentöse Hemia- scomycet Ashbya gossypii.

Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pi- chia, besonders bevorzugt sind Saccharomyces cerevisiae oder Pi- chia pastoris (ATCC Accession No. 201178).

Als transgene Organismen bevorzugt sind vor allem pflanzliche Or- <BR> <BR> ganismen. "Pflanzlicher Organismus"umfasst jeden Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist, sowie die von diesem abgeleitete Zellen, Gewebe, Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte). Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gat- tungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzen- reiches. Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sowie Gymnospermen sind bevorzugt. Eingeschlossen sind reife Pflanze, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abge- leitete Teile, Vermehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte) und Kulturen, zum Beispiel Zell-oder Kalluskulturen.

Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungs- stadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, un- reife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.

"Pflanze"im Rahmen der Erfindung meint alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches. Einge- schlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermeh- rungsgut, Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder struktu- rellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebi- gen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.

"Pflanze"umfasst alle einjährigen und mehrjährige, monokotyledo- nen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispielhaft jedoch nicht einschränkend solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigo- nella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidop- sis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyo- scyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, An- tirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennise- tum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Gly- cine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Se- cale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.

Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien : Amarant- haceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Pa- pilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubia- ceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.

Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Alfalfa, Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidear- ten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.

Die Erfindung wird ganz besonders bevorzugt aus dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel

- Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr, - Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr, - Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Em- peror (Broccoli) und weitere Kohlarten ; und der Gattung Arabi- dopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Ca- nola und andere mehr, - Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr, - Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr - Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispiels- weise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffestrauch) und andere mehr, - Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz be- sonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) sowie Tabak oder Paprika und andere mehr, - Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie bei- spielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr, - Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispiels- weise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch). und an- dere mehr, - Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karrotte)) und Apium (ganz besonders die Art gra- veolens dulce (Selarie)) und andere mehr ; und die Gattung Cap- sicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr, sowie Lein, Soya, Baumwolle, Hanf, Flachs, Gurke, Spinat, Möhre, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss-und Weinarten, ins- besondere Banane und Kiwi.

Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen, Nutz-oder Zierbäume, Blu- men, Schnittblumen, Sträucher oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum

Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose) ; Pteridophy- ten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden ; Gymnospermen wie Ko- niferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, So- lanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachen- baum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.

Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin wei- tere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Bei- spiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt ist Synechocystis.

Am meisten bevorzugt sind a) Pflanzen, die zur Ölproduktion geeignet sind, wie beispiels- weise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel (Carthamus tinc- torius), Ölbaum, Soja, Mais, Erdnuß, Rizinus, Ölpalme, Wei- zen, Kakaostrauch oder verschiedene Nussarten wie beispiels- weise Walnuss, Kokosnuß oder Mandel. Unter diesen wieder be- sonders bevorzugt sind dikotyledonen Pflanzen, insbesondere Raps, Soja und Sonnenblume. b) Pflanzen, die der Stärkeproduktion dienen, wie beispielsweise Mais, Weizen oder Kartoffel. c) Pflanzen, die als Nahrungs-und/oder Futtermittel und/oder Nutzpflanze genutzt werden und bei denen eine Resistenz gg.

Pathogene vorteilhaft wäre, wie beispielsweise Gerste, Rog- gen, Reis, Kartoffel, Baumwolle, Flachs, Lein. d) Pflanzen, die zur Produktion von Feinchemikalien wie bei- spielsweise Vitaminen und/oder Carotinoiden dienen können, wie beispielsweise Raps.

Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirts- organismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüch- tet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Me- dium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente

wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwi- schen 10°C bis 60°C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann batch weise, semi batch weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nach gefüttert wer- den.

Nachfolgende Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens seien beispielhaft jedoch nicht einschränkend zu nennen : I. Pflanzenbiotechnologie Bevorzugt wird das er. findungsgemäße Verfahren im Rahmen der Pflanzenbiotechnologie zur Erzeugung von Pflanzen mit vorteilhaf- ten Eigenschaften eingesetzt. So kann Eignung der Pflanzen oder deren Samen als Nahrungs-oder Futtermittel verbessert werden, beispielsweise über eine Veränderung der Zusammensetzungen und/ oder des Gehalt an Metaboliten, insbesondere Proteinen, Ölen, Vi- taminen und/oder Stärke. Auch können Wachstumsrate, Ertrag oder die Resistenz gegen biotische oder abiotische Stressfaktoren er- höht werden. Nachfolgende Anwendungen im Bereich der Pflanzenbio- technologie sind insbesondere vorteilhaft. Die angegebenen mögli- chen Zielgene sind beispielhaft jedoch nicht einschränkend zu verstehen : 1. Verbesserter Schutz gegen abiotische Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Trockenheit, erhöhte Feuchtigkeit, Umweltgifte, UV- Strahlung). Bevorzugt werden Gene in iherer Expression ver- mindert, die am Stressreaktionen beteiligt sind.

2. Modifikation der Zusammensetzung und/oder des Gehaltes an Fettsäuren, Lipiden oder Ölen Eine Veränderung des Fettsäuregehalten oder der Fettsäurezu- sammensetzung, vorzugsweise in einer Ölfrucht wie Raps oder Sonnenblume, kann beispielsweise erreicht werden durch Ver- minderung der Genexpression von Genen der Fettsäurebiosynt- hese vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ge- nen kodierend für Acetyltransacylasen, Acyltransportproteinen ("acyl carrier protein"), Desaturasen wie Stearyldesaturasen oder mikrosomale A12-Desaturasen insbesondere Fad2-1 Gene, Malonyltransacylase, ß-Ketoacyl-ACP-synthetasen, 3-Keto-ACP- reduktasen, Enoyl-ACP-hydrasen, Thioesterasen wie Acyl-ACP- thioesterases, Enoyl-ACP-reduktasen. Verschiedene weitere vor-

teilhafte Ansätze zur Modifizierung der Lipidzusammensetzung sind beschrieben (Shure M et al. (1983) Cell 35 : 225-233 ; Preiss et al. (1987) Tailoring Genes for Crop Improvement (Bruening et al., eds. ), Plenum Press, S. 133-152 ; Gupta et al. (1988) Plant Mol Biol. 10 : 215-224 ; Olive et al. (1989) Plant Mol Biol 12 : 525-538 ; Bhattacharyya et al. (1990) Cell 60 : 155-122 ; Dunwell JM (2000) J Exp Botany 51Spec No : 487-96 ; Brar DS et al. (1996) Biotech Genet Eng Rev 13 : 167-79 ; Kis- hore GM und Somerville CR (1993) Curr Opin Biotech 4 (2) : 152-8). Bevorzugt sind insbesondere Fad2 Gene (z. B. be- schrieben durch Genbank Acc.-Nr. : AF124360 (Brassica cari- nata), AF042841 (Brassica rapa), L26296 (Arabidopsis tha- liana), A65102 (Corylus avellana) ). Weitere vorteilhafte Gene und Verfahren zur Modifikation des Lipidgehaltes sind bei- spielsweise beschrieben in US 5,530, 192 und WO 94/18337. Ein erhöhter Lipidgehalt kann auch erreicht werden durch Vermin- derung des Stärkegehalte bespielsweise infolge verminderter Expression von von Enzymen des Kohlenhydratstoffwechsels (z. B. ADP-Glucosepyrophosphorylasen).

3. Modifikation der Kohlenhydratzusammensetzung Eine Modifikation der Kohlehydratzusammensetzung kann bei- spielsweise erreicht werden durch Verminderung der Genexpres- sion von Genen des Kohlenhydratstoffwechsels oder der Kohlen- hydratbiosynthese, beispielsweise der Biosynthese von Amy- lose, Pektinen, Cellulose oder Zellwandkohlenhydraten. Da- durch kann eine Vielzahl zellulärer Prozesse (Reifung, Halfe- stigkeit, Stärkezusammensetzung oder-gehalt etc. ) in vor- teilhafter Weise beeinflusst werden. Als Zielgene seien bei- spielhaft jedoch nicht einschränkend zu nennen Phosphoryla- sen, Stärkesynthetasen, Q-Enzyme, Sucrose-6-phosphatsyntheta- sen, Sucrose-6-phosphatphosphatasen, ADP-Glucosepyrophospho- rylasen, Branching-Enzyme, Debranching-Enzyme sowie diverse Amylasen. Die entsprechenden Gene sind beschrieben (Dunwell JM (2000) J Exp Botany 51Spec No : 487-96 ; Brar DS et al.

(1996) Biotech Genet Eng Rev 13 : 167-79 ; Kishore GM und Somer- ville CR (1993) Curr Opin Biotech 4 (2) : 152-8). Vorteilhafte Gene zur beeinflussung des Kohlenhydratstoffwechsels-insbe- sondere der Stärkebiosynthese-sind beschrieben in WO 92/11375, WO 92/11376, US 5,365, 016 und WO 95/07355.

4. Veränderung der Farbe oder Pigmentierung Veränderung der Farbe oder Pigmentierung vorzugsweise von Zierpflanzen kann beispielsweise erreicht werden durch Ver- minderung der Genexpression von Genen der Flavonoid-Biosynt-

hese wie beispielsweise Chalconsynthasen, Chalconisomerasen, Phenylalaninammonialyasen, Dehydrokaempferol (flavone) hydroxy- lasen wie Flavanon-3-hydroxylasen oder Flavanon-2-hydroxyla- sen, Dihydroflavonolreduktasen, Dihydroflavanol-2-hydroxyla- sen, Flavonoid-3'-hydroxylasen, Flavonoid-5'-hydroxylasen, Flavonoidglycosyltransferasen (z. B. Glucosyltransferasen wie UDPG : Flavonoid- 3-0-glucosyltransferasen, UDPG : Flavo- nol-7-0-glucosytransferasen oder Rhamnosyltransferasen), Fla- vonoidmethyltransferasen (wie z. B. SAM : Anthocyani- din-3- (p-coumaroyl)-rutinosid-5-glucosid-3', 5'-0-methyltrans- ferasen) und Flavonoidacyltransferasen (Hahlbrock (1981) Bio- <BR> <BR> chemistry of Plants, Vol. 7, Conn (Ed. ) ; Weiring and de Vla-<BR> ming (1984)"Petunia", KC Sink (Ed. ), Springer-Verlag, New York). Geeignet sind insbesondere die in EP-A1 522 880 be- schriebenen Sequenzen.

5. Verminderung des Gehaltes von Speicherproteinen Die Verminderung der Genexpression von Genen kodierend für Speicherproteine (infolge SP) hat zahlreiche Vorteile, wie beispielsweise Verminderung des allergene Potentials oder Veränderung in der Zusammensetzung oder Menge anderer Metabo- lite. Speicherproteine sind u. a beschrieben in EP-A 0 591 530, WO 8. 7/47731, WO 98/26064, EP-A 0 620 281 ; Kohno-Murase J et al. (1994) Plant Mol Biol 26 (4) : 1115-1124.

SP dienen zur Speicherung von Kohlenstoff, Stickstoff und Schwefel, die für das schnelle heterotrophe Wachstum bei Kei- mung von Samen oder Pollen benötigt werden. Sie haben meist keine enzymatische Aktivität. SP werden dabei nur im Embryo während der Samenentwicklung synthetisiert und akkumulieren dabei zum einen in Proteinspeichervakuolen (PSV) von unter- schiedlich differentzierten Zellen im Embryo bzw. Endosperm.

"Speicherprotein"meint allgemein ein Protein, das mindestens eine der nachfolgenden wesentlichen Eigenschaften aufweist : i) Speicherproteine werden im wesentlichen nur im Embryo während der Samenentwicklung exprimiert."Im wesentli- chen"bedeutet dabei, dass in dem besagten Stadium minde- stens 50%, bevorzugt mindestens 70%, ganz besonders be- vorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95% der Gesamtexpression über die Lebensdauer einer Pflanze hinweg stattfindet.

ii) Speicherproteine werden während der Keimung des Samen wieder abgebaut. Dabei beträgt der Abbau während der Kei- mung mindestens 20%, bevorzugt mindestens 50%, ganz be- sonders bevorzugt mindestens 80%. iii) Speicherproteine machen einen wesentlichen Anteil am Ge- samtproteingehalt des nicht-keimenden Samens aus. Bevor- zugt macht das Speicherprotein in dem nicht-keimenden Sa- men der Wildtyp-Pflanze mehr als 5 Gew. % des Gesamtpro- teins aus, besonders bevorzugt mindestens 10 Gew. %, ganz besonders bevorzugt mindestens 20 Gew. %, am meisten be- vorzugt mindestens 30 Gew.-%.

Bevorzugt weisen Speicherproteine 2 oder alle der oben ge- nannten wesentlichen Eigenschaften i), ii) oder iii) auf.

Speicherproteine können in Untergruppen entsprechend weiterer charakteristischer Eigenschaften, wie beispielsweise ihrem Sedimentationskoeffizienten oder der Löslichkeit in verschie- denen Lösungen (Wasser, Salzlösung, Alkohol) aufgeteilt wer- den. Die Bestimmung des Sedimentationskoeffizienten kann in der dem Fachmann vertrauten Weise mittels Ultrazentrifugation durchgeführt werden (z. B. beschrieben bei Correia JJ (2000) Methods in Enzymology 321 : 81-100).

Insgesamt können vier grosse Genfamilien für Speicherproteine aufgrund ihrer Sequenzen zugeordnet werden : 2S-Albumine (Na- pin-ähnlich), 7S-Globuline (Phaseolin-ähnlich), 11S/12S-Glo- buline (Legumin-/Cruciferin-ähnlich) und die Zein-Prolamine.

2S Albumine sind weit verbreitet in Samen von Dikotyledonen, einschliesslich wichtiger kommerzieller Pflanzenfamilien wie Fabaceae (z. B. Sojabohne), Brassicaceae (z. B. Raps), Euphor- biaceae (z. B. Rizinus) oder Asteraceae (z. B. Sonnenblume). 2S Albumine sind kompakte globuläre Proteine mit konservierten Cysteinresten, die oft Heterodimere bilden.

7S-Globuline liegen in trimerer Form vor und enthalten keine Cysteinreste. Nach ihrer Synthese werden sie wie die 2S-Albu- mine in kleinere Fragmente gespalten und glykosyliert. Trotz Unterschiede in der Polypeptidgrösse sind die verschiedenen 7S-Globuline hoch konserviert und gehen vermutlich wie die 2S-Albumine auf einen gemeinsames Vorläuferprotein zurück.

Die 7S-Globuline sind nur in geringen Mengen in Monokotyledo- nen vorhanden. In Dikotyledonen ist ihr Anteil immer kleiner verglichen mit den 11S/12S-Globulinen.

llS/12S-Globuline stellen neben den 2S-Albuminen die Haupt- fraktion der Speicherproteine in Dikotyledonen. Die hohe Ähn- lichkeit der verschiedenen 11S-Globuline aus verschiedenen Pflanzengattungen lassen wiederrum auf einen gemeinsames Vor- läuferprotein in der Evolution schliessen.

Bevorzugt ist das Speicherprotein ausgewählt aus den Klassen der 2S-Albumine (Napin-ähnlich), 7S-Globuline (Phaseolin-ähn- lich), llS/12S-Globuline (Legumin-/Cruciferin-ähnlich) oder Zein-Prolamine.

Besonders bevorzugte 2S-Albumine umfassen i) 2S-Albumine aus Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt die 2S-Albumine mit der SEQ ID NO : 2,4, 6 oder 8, am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO : 1, 3,5 oder 7 kodierten Proteine, ii) 2S-Albumine aus Arten der Gattung Brassica, wie bei- spielsweise Brassica napus, Brassica nigra, Brassica jun- cea, Brassica oleracea oder Sinapis alba, ganz besonders bevorzugt die 2S-Albumine mit der SEQ ID NO : 32,34, 36, 38,40, 46 oder 48, am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO : 31,33, 35,37, 39,45 oder 47 kodierten Proteine, iii) 2S-Albumine aus Soja, ganz besonders bevorzugt die 2S-Al- bumine mit der SEQ ID NO : 42 oder 44, am meisten bevor- zugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO : 41 oder 43 kodierten Proteine, iv) 2S-Albumine aus Sonnenblume (Helianthus annus), ganz be- sonders bevorzugt die 2S-Albumine mit der SEQ ID NO : 50 oder 52, am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO : 49 oder 51 kodierten Proteine, sowie die entsprechenden Homologen und funktionellen Äquiva- lente zu i) oder ii) oder iii) oder iv) aus identischen oder anderen Pflanzenarten, insbesondere Raps, Sonnenblume, Lein, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja oder verschiedene Nussar- ten. Funktionelle Äquivalente zeichnen sich bevorzugt neben den oben genannten wesentlichen Eigenschaften durch charakte- ristische Eigenschaften wie einen 2S-Sedimentationskoeffi- zienten und/oder durch eine Löslichkeit in Wasser aus.

Funktionelle Äquivalente der 2S-Albumine haben in einer wei- teren bevorzugten Ausführungsform eine Homologie von minde- stens 60%, bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95% zu einer der Proteinsequenzen mit der SEQ ID NO : 2,4, 6,8, 32,34, 36,38, 40,42, 44,46, 48,50 oder 52 wobei die Homologie sich bevorzugt über eine Länge von mindestens 30 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren besonders bevorzugt über 100 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die gesamte Länge der jeweiligen Proteine erstreckt, und weisen die gleichen wesentlichen Eigenschaften eines Speicherproteins und-be- vorzugt-die charakteristischen Eigenschaften eines 2S-Spei- cherproteins auf.

Besonders bevorzugte 7S-Globuline umfassen solche aus Arabi- dopsis oder Soja, ganz besonders bevorzugt die Proteine mit der SEQ ID NO : 94 oder 96, am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO : 93 oder 95 kodierten Proteine.

Funktionelle Äquivalente zeichnen sich bevorzugt neben den oben genannten wesentlichen Eigenschaften durch charakteri- stische Eigenschaften wie einen 7S-Sedimentationskoeffizien- ten und/oder durch eine Löslichkeit in Salzlösung aus. Als weitere charakteristische Eigenschaft können 7S-Globuline keine Cysteinreste enthalten.

Funktionelle Äquivalente der 7S-Globuline haben in einer wei- teren bevorzugten Ausführungsform eine Homologie von minde- stens 60%, bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95% zu einer der Proteinsequenzen mit der SEQ ID NO : 94 oder 96 wobei die Homologie sich bevorzugt über eine Länge von mindestens 30 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren besonders bevorzugt über 100 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die gesamte Länge der jeweiligen Proteine erstreckt, und weisen die gleichen wesentlichen Eigenschaften eines Speicherpro- teins und-bevorzugt-die charakteristischen Eigenschaften eines 7S-Speicherproteins auf.

Besonders bevorzugte 11S/12S-Globuline umfassen bevorzugt 11S-Globuline aus Raps, Soja und Arabidopsis insbesondere i) 11S-Globuline aus Raps mit der SEQ ID NO : 10,12, 14,16 oder 18, am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO : 9,11, 13,15 oder 17 kodierten Pro- teine,

ii) die 11S-Globuline. aus Soja mit der SEQ ID NO : 20,22, 24, 26 oder 28, am meisten bevorzugt die durch die Nuklein- säuren gemäß SEQ ID NO : 19, 21,23, 25 oder 27 kodierten Proteine, iii) die 11S-Globuline aus Arabidopsis thaliana mit der SEQ ID NO : 60,62, 64,66, 68 oder 70 am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO : 59,61, 63,65, 67 oder 69 kodierten Proteine, sowie die entsprechenden Homologen und funktionellen Äquiva- lente aus anderen Pflanzenarten, insbesondere Raps, Sonnen- blume, Lein, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja oder verschie- dene Nussarten, wie beispielsweise das Sonnenblume 11S Spei- cherprotein (SEQ ID NO : 30), insbesondere das durch die Nu- kleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 29 kodierte Protein. Funk- tionelle Äquivalente zeichnen sich bevorzugt neben den oben genannten wesentlichen Eigenschaften durch charakteristische Eigenschaften wie einen 11S-oder 12S-Sedimentationskoeffi- zienten und/oder durch eine Löslichkeit in Salzlösung (PBS ; phosphatgepufferte Salzlösung) und/oder eine schlechte Lös- lichkeit in Wasser aus.

Funktionelle Äquivalente der 11S-oder 12S Albumine haben in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Homologie von mindestens 60%, bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders be- vorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95% zu einer der Proteinsequenzen mit der SEQ ID NO : 10,12, 14, 16,18, 20,22, 24,26, 28,30, 60,62, 64,66, 68 oder 70 wobei die Homologie sich bevorzugt über eine Länge von minde- stens 30 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren be- sonders bevorzugt über 100 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die gesamte Länge der jeweiligen Proteine erstreckt, und weisen die gleichen wesentlichen Eigenschaften eines Spei- cherproteins und-bevorzugt-die charakteristischen Eigen- schaften eines 11S-oder 12S-Speicherproteins auf.

Besonders bevorzugte Zein-Prolamine umfassen bevorzugt solche aus monokotyledonen Pflanzen, insbesondere Mais, Rais, Hafer, Gerste oder Weizen. Ganz besonders bevorzugt sind die Mais Zein-Prolamine beschrieben durch SEQ ID NO : 98,100, 102 oder 104-insbesondere die durch SEQ ID NO 97,99, 101 oder 103 kodierten Protein-, das Reis Prolamin gemäß SEQ ID NO : 106- insbesondere das durch SEQ ID NO 105 kodierte Protein-, das Hafer Prolamin gemäß SEQ ID NO : 108-insbesondere das durch SEQ ID NO 107 kodierte Proteine-, das Gerste Prolamin gemäß SEQ ID NO : 110 und/oder 111-insbesondere das durch SEQ ID

NO 109 kodierte Protein-und das das Weizen Prolamin gemäß SEQ ID NO : 113-insbesondere das durch SEQ ID NO 112 ko- dierte Protein. Funktionelle Äquivalente zeichnen sich bevor- zugt durch eine Löslichkeit in 70% iger ethanolischer Lösung und eine schlechte Löslichkeit in Wasser oder Salzlösung aus.

Funktionelle Äquivalente der Zein-Prolamine haben in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Homologie von min- destens 60%, bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevor- zugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95% zu einer der Proteinsequenzen mit der SEQ ID NO : 98,100, 102, 104,106, 108,110, 111 oder 113 wobei die Homologie sich be- vorzugt über eine Länge von mindestens 30 Aminosäuren, bevor- zugt mindestens 50 Aminosäuren besonders bevorzugt über 100 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die gesamte Länge der jeweiligen Proteine erstreckt, und weisen die gleichen we- sentlichen Eigenschaften eines Speicherproteins und-bevor- zugt-die charakteristischen Eigenschaften eines Zein-Prola- mine auf.

Funktionelle Äquivalente meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen der obengenannten Speicherproteine so- wie homolöge Polypeptide aus anderen Pflanzen, die die glei- chen wesentlichen und-bevorzugt-charakteristischen Eigen- schaften aufweisen. Bevorzugt sind homologe Polypeptide aus oben beschriebenen bevorzugten Pflanzen. Die zu den im Rahmen dieser Erfindung offenbarten Speicherproteinen homologen Se- quenzen aus anderen Pflanzen-beispielsweise solchen deren genomische Sequenz ganz oder teilweise bekannt ist, wie bei- spielsweise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nico- tiana tabacum oder Solanum tuberosum-durch Homologiever- gleiche aus Datenbanken auffinden. können z. B. durch Daten- banksuche oder Durchmustern von Gen-Banken-unter Verwendung der beispielhaft aufgeführten Speicherprotein-Sequenzen als Suchsequenz bzw. Sonde-leicht aufgefunden werden.

Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Aminosäurere- ste.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung umfasst ein zumindest teilweise doppelsträngiges Ribonukleinsäuremolekül, wobei das doppelsträngige Ribonukleinsäuremolekül umfasst i) einen"sense"-RNA-Strang umfassend mindestens zwei Ribo- nukleotidsequenzabschnitte, wobei jeweils mindestens ei- ner dieser Ribonukleotidsequenzabschnitte im wesentlichen

identisch ist zu mindestens einem Teil des"sense"-RNA- Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 1, 3,5, 7,9, 11,13, 15,17, 19,21, 23,25, 27,29, 31,33, 35,37, 39,41, 43,45, 47,49, 51,59, 61,63, 65,67, 69,71, 93,95, 97,99, 101,103, 105,107, 109 oder 112 oder eines funktionellen Äquiva- lentes derselben, wobei jedoch nicht alle Ribonukleotid- sequenzabschnitte zu dem"sense"-RNA-Transkript eines einzigen einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz iden- tisch sind, und ii) einen"antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-sense-Strang unter i) im wesentlichen komplementären ist.

Bevorzugt haben zumindest zwei der Speicherprotein-Nuklein- säuresequenzen, zu deren"sense"-RNA-Transkript die besagten Ribonukleotidsequenzabschnitte im wesentlichen identisch~ sind, untereinander eine Homologie von unter 90%, bevorzugt unter 80%, ganz besonders bevorzugt unter 60% am meisten be- vorzugt unter 50% über die gesamte Länge ihrer kodierenden Nukleotidsequenz.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die dsRNA mehrere Sequenzabschnitte, die eine gleichzeitige Sup- pression mehrerer Speicherproteine, bevorzugt von Speicher- proteinen aus verschiedenen Klassen-wie beispielsweise ei- nem 2S-Albumin, 7S-Globuline, 11S/12S-Globulin oder die Zein- Prolamine-bewirken.

Am meisten bevorzugt sind doppelsträngige RNA Moleküle be- schrieben durch die Ribonukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 84,86 oder 88. Diese werden bevorzugt kodiert durch Nukleo- tidsequenzen entsprechend SEQ ID NO : 83,85 oder 87.

5. Erreichen einer Resistenz gegen pflanzliche Pathogene Eine Resistenz gegen pflanzliche Pathogene wie Arachniden, Pilze, Insekten, Nematoden, Protozoen, Viren, Bakterien und Krankheiten kann erreicht werden durch Verminderung der Ge- nexpression von Genen, die für das Wachstum, Überleben, be- stimmte Entwicklungsstufen (beispielsweise Verpuppung) oder die Vermehrung eine bestimmten Pathogens essentiell sind.

Eine entsprechende Verminderung kann eine vollständige Inhi- bition vorgenannter Schritte aber auch eine Verzögerung der- selben bewirken. Dies können pflanzliche Gene sein, die dem Pathogen beispielsweise das Eindringen ermöglichen, können aber auch pathogen-eigene Gene sein. Bevorzugt ist die dsRNA

gg. Gene des Pathogens gerichtet. Als anti-Pathogenes Agens kann dabei die dsRNA selber, jedoch auch die Expressionssy- steme, Expressionskassetten oder transgenen Organismen wir- ken. Pflanzen können beispielsweise mit geeigneten Formulie- rungen vorgenannter Agentien behandelt, beispielsweise be- sprüht oder estäubt werden Die Pflanzen selber können jedoch in Form eines transgenen Organismus die Agentien beinhalten und diese-beispielsweise in Form eines Fraßgiftes-an die Pathogene weitergeben. Verschiedene essentielle Gene diverser Pathogene sind dem Fachmann bekannt (z. B. für Nematodenresi- stenz WO 93/10251, WO 94/17194).

Am meisten bevorzugt als Pathogen sind Pilzpathogene wie Phy- tophthora infestans, Fusarium nivale, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Blumeria graminis, Magnaporthe grisea, Sclerotinia sclerotium, Septoria nodorum, Septoria tritici, Alternaria brassicae, Phoma lingam, bakte- rielle Pathogene wie Corynebacterium sepedonicum, Erwinia ca- rotovora, Erwinia amylovora, Streptomyces scabies, Pseudomo- nas syringae pv. tabaci, Pseudomonas syringae pv. phaseoli- cola, Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas campestris pv. malvacearum und Xanthomonas campestris pv. oryzae, und Nematoden wie Globodera rostochiensis, G. pallida, Hetero- dera schachtii, Heterodera avenae, Ditylenchus dipsaci, An- guina tritici und Meloidogyne hapla.

Eine Virusresistenz kann beispielsweise durch Verminderung der Expression eines viralen Hüllproteins, einer viralen Re- plikase, einer viralen Protease etc. erreicht werden. Zahl- reiche Pflanzenviren und entsprechende Zielgene sind dem Fachmann bekannt.

6. Verhinderung von Halmbruch Eine verminderte Anfälligkeit gegen Halmbruch kann beispiels- weise erreicht werden durch Verminderung der Genexpression von Genen des Kohlenhydratstoffwechsels (s. o. ). Vorteilhafte Gene sind beschrieben (u. a. WO 97/13865) und umfassen geweb- spezifische Polygalacturonasen oder Cellulasen.

7. Verzögerung der Fruchtreifung Eine verzögerte Fruchtreifung kann beispielsweise erreicht werden durch Verminderung der Genexpression von Genen ausge- wählt aus der Gruppe bestehend aus Polygalacturonasen, Pecti- nesterasen, ß- (1-4) glucanasen (Cellulasen), ß-Galactanasen ( ß-Galactosidasen), oder Gene der Ethylenbiosynthese wie

1-Aminocyclopropan-1-carboxylatsynthase, Gene der Carotinoid- biosynthese wie z. B. Gene derPrephytoen-oder Phytoenbiosynt- hese beispielsweise Phytoendesaturasen. Weitere vorteilhafte Gene sind bespielsweise in WO 91/16440, WO 91/05865, WO 91/16426, WO 92/17596, WO 93/07275 oder WO 92/04456.

8. Erzielen einer männlichen Sterilität ("male sterility"). Ent- sprechende Zielgene sind beschrieben u. a. in WO 94/29465, W089/10396, WO 92/18625.

9. Verminderung unerwünschter oder toxischer Pflanzeninhalts- stoffe wie z. B. Glucosinolaten. Entsprechende Zielgene sind beschrieben (u. a. in WO 97/16559).

10. Verzögerung von Alterserscheinungen. Entsprechende Zielgene sind u. a. Cinnamoyl-CoA : NADPH-Reduktasen oder Cinnamoylalko- holdehydrogenasen. Weitere Zielgene sind beschrieben (u. a. in WO 95/07993).

11. Modifikation der Lignifikation und/oder des Ligningehaltes vor allem in Baumarten. Entsprechende Zielgene sind beschrie- ben u. a. in WO 93/05159, WO 93/05160.

12. Modifikation des Faseranteils in Nahrungsmitteln vorzugsweise in Samen durch Verminderung der Expression der Coffeinsäure- 0-methyltransferase oder der Cinnamoylalkoholdehydrogenase.

13. Modifaktion der Faserqualität in Baumwolle. Entsprechende Zielgene sind beschrieben u. a. in US 5,597, 718.

14. Verminderung der Stoßanfälligkeit von beispielsweise Kartof- feln durch Verminderung beispielsweise der. Polyphenoloxidase (WO 94/03607) etc.

15. Steigerung der Vitamin E Biosynthese beispielsweise durch Verminderung der Expression von Genen aus dem Homogentisatab- bauweg wie z. B. der Homogentisat-1, 2-dioxygenase (HGD ; EC-Nr. : 1.13. 11.5), der Maleylacetoacetatisomerase (MAAI ; EC-Nr. : 5.2. 1.2.) oder der Fumarylacetoacetathydrolase (FAAH ; EC-Nr. : 3.7. 1.2).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung umfasst ein zumindest teilweise doppelsträngiges Ribonukleinsäuremolekül, wobei das doppelsträngige Ribonukleinsäuremolekül umfasst

i) einen"sense"-RNA-Strang umfassend mindestens zwei Ribo- nukleotidsequenzabschnitte, wobei jeweils mindestens ei- ner dieser Ribonukleotidsequenzabschnitte im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des"sense"-RNA- Transkriptes eines Gens aus dem Homogentisatabbauweg ge- mäß SEQ ID NO : 115,116, 118 oder 120 oder eines funktio- nellen Äquivalentes derselben, wobei jedoch nicht alle Ribonukleotidsequenzabschnitte zu dem"sense"-RNA-Trans- kript eines einzigen einer Speicherprotein-Nukleinsäure- sequenz identisch sind, und ii) einen"antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-sense-Strang unter i) im wesentlichen komplementären ist.

16. Verminderung des Nikotingehaltes beispielsweise in Tabak durch verminderte Expression beispielsweise der N-Methyl-pu- trescinoxidase und der Putrescin-N-methyltransferase.

17. Verminderung des Coffeingehaltes in der Kaffeebohne (Coffea arabica) durch durch Verminderung der Genexpression von Genen der Coffeinbiosynthese wie 7-Methylxanthine-3-methyltransfe- rase.

18. Verminderung des Theophyllin-Gehaltes im Tee (Camellia sinen- sis) durch durch Verminderung der Genexpression von Genen der Theophyllin-Biosynthese wie beispielsweise 1-Methylxant- hin-3-methyltransferase.

19. Erhöhung des Methioningehaltes durch Verminderung der Threo- ninbiosynthese, beispielsweise durch Verminderung derExpres- sion der Threoninsynthase (Zeh M et al. (2001) Plant Physiol 127 (3) : 792-802).

Weitere Beispiele für vorteilhafte Gene sind zum Beispiel genannt bei Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000 ; 51 Spec No ; Seite 487-96.

Jede der oben genannten Anwendungen kann als solche isoliert an- gewendet werden. Natürlich können auch mehr als eine der oben ge- nannten Ansätze gleichzeitig angewendet werden. Dabei wird bei allen Anwendungen die Expression von mindestens zwei unterschied- lichen Zielgenen, wie oben definiert, vermindert. Diese Zielgene können dabei aus einer einzigen für eine Anwendung bevorzugten Gruppe von Genen stammen oder aber auch unterschiedlichen Anwen-. dungsgruppen zugeordnet sein.

Zur Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren stehen dem Fachmann geläufige Werkzeuge, wie Expressionsvektoren mit für Pflanzen ge- eigneten Promotoren, sowie Verfahren zur Transformation und Rege- neration von Pflanzen zur Verfügung. Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzentei- len, -zellen, -geweben,-kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar oder entwick- lungsabhängig sein. Bevorzugt sind : a) Konstitutive Promotoren "Konstitutive"Promotoren meint solche Promotoren, die eine Ex- pression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten (Benfey et al. (1989) EMBO J 8 : 2195-2202). Vorzugsweise verwendet man ins- besondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21 : 285-294 ; Odell et al. (1985) Na- ture 313 : 810-812 ; Shewmaker et al. (1985) Virology 140 : 281-288 ; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6 : 221- 228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352, 605 ; WO 84/02913 ; Benfey et al. (1989) EMBO J 8 : 2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Pro- motor ist der"Rubisco small subunit (SSU)"-Promotor (US 4, 962, 028), der LeguminB-Promotor (GenBank Acc. -Nr. X03677), der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Dop- pelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacte- rium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29 : 637-649), den Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al.

(1992) Plant Mol Biol 18 : 675-689 ; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86 : 9692-9696), den Smas Promotor, den Cinnamylal- koholdehydrogenase-Promotor (US 5,683, 439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines pro- linreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991), sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist. b) Gewebespezifische Promotoren Bevorzugt sind ferner Promotoren mit Spezifitäten für die Ant- heren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen.

Samenspezifische Promotoren wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504, 200 ; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9) : 839-53), des 2S Albumingens (Joseffson LG et al. (1987) J

Biol Chem 262 : 12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al.

(1989) Mol Gen Genet 215 (2) : 326-331), des USP (unknown seed protein ; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225 (3) : 459-67), des Napin Gens (US 5,608, 152 ; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199 : 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4 ; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225 : 121-128 ; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2 (2) : 233-9 ; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13 (10) : 1090f), der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-Promoter aus Brassica (WO 91/13980). Wei- tere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das"High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophosphatase (AG- Pase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promoto- ren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerstej Weizen,-Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteil- haft eingesetzt werden können der Promoter des lpt2 oder lptl-Gen (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren be- schrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens, des Glu- telin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin- Gens, des Glutelin-Gens, des Zein-Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens). Weitere samenspezifische Promotoren sind be- schrieben in W089/03887.

Knollen-, Speicherwurzel-oder Wurzel-spezifische Promotoren wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.

Blattspezifische Promotoren wie Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1, 5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al.. (1989) EMBO J 8 : 2445-2451).

Blütenspezifische Promotoren wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).

- Antheren-spezifische Promotoren wie den 5126-Promotor (US 5,689, 049, US 5,689, 051), den glob-1 Promotor und den 7-Zein Promotor. c) Chemisch induzierbare Promotoren Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierba- ren Promotor enthalten (Übersichtsartikel : Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48 : 89-108), durch den die

Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z. B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22 : 361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2 : 397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden. d) Stress- oder Pathogen-induzierbare Promotoren Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder ab- iotischen Stress induziert werden wie beispielsweise der patho- gen-induzierbare Promotor des PRP1-Gens (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22 : 361-366), der hitzeinduzierbare hsp70-oder hsp80-Promoter aus Tomate (US 5, 187, 267), der kälteinduzierare alpha-Amylase Promoter aus der Kartoffel (WO 96/12814), der licht-induzierbare PPDK Promotor oder der verwundungsinduzierte pinII-Promoter (EP375091).

Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden wie beispiels- weise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, ß-1, 3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89 : 245-254 ; Uknes, et al. (1992) The Plant Cell 4 : 645-656 ; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4 : 111-116 ; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9 : 335-342 ; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2 : 325-342 ; Somssich et al.

(1986) Proc Natl Acad Sci USA 83 : 2427-2430 ; Somssich et al.

(1988) Mol Gen Genetics 2 : 93-98 ; Chen et al. (1996) Plant J 10 : 955-966 ; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91 : 2507-2511 ; Warner, et al. (1993) Plant J 3 : 191-201 ; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1 : 961-968 (1989).

Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinII Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28 : 425-449 ; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14 : 494-498), des wunl und wun2-Gens (US 5,428, 148), des winl-und win2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215 : 200-208), des Systemin (McGurl et al. (1992) Science 225 : 1570-1573), des WIP1-Gens (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22 : 783-792 ; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323 : 73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994) The Plant J 6 (2) : 141-150) und dergleichen.

e) Entwicklungsabhängige Promotoren Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise fruchtreifung- spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung- spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP 409 625). Ent- wicklungsabhängige Promotoren schließt zum Teil die Gewebespe- zifischen Promotoren ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt.

Besonders bevorzugt sind konstitutive sowie samenspezifische Pro- motoren.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionsteu- ernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch geneti- sche Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expres- sion zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen.

Entsprechende Elemente-sind zum Beispiel, für Wasserstress, Absci- sinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991 ; 266 (26) : 17131 -17135) und Hitzestress (Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217 (2-3) : 246-53,1989) beschrieben.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans- latierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Ge- nen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adhl-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein : The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt wor- den, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-un- translatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15 : 8693-8711) und derglei- chen. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant. J 15 : 435-440).

Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tu- mefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al. (1984) EMBO J 3 : 835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für be- sonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Syn- thase) -Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Terminator.

Eine Expressionskassetten und die von ihr abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funkti- onselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente,

die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemässen Expressionskassetten, Vektoren oder transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen : a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolis- musinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456), Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Bei- spiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphi- notricin etc. verleihen. Besonders bevorzugte Selektionsmar- ker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen.

Beispielhaft seien genannt : DNA Sequenzen, die für Phosphi- nothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren und Glutaminsynt- haseinhibitoren inaktivieren (bar und pat Gen), 5-Enolpyru- vylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosate (N-(phosphonomethyl) glycin) verleihen, das für das Glyphosat degradierende Enzyme kodie- rende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase), das deh Gen (kodie- rend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert), Sulfo- nylurea-und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie bxn Gene, die für Bromoxynil degradierende Nitrilaseen- zyme kodieren, das aasa-Gen, das eine Resistenz gegen das An- tibiotikum Apectinomycin verleih, das Streptomycinphospho- transferase (SPT) Gen, das eine Resistenz gegen Streptomycin gewährt, das Neomycinphosphotransferas (NPTII) Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleiht, das Hy- gromycinphosphotransferase (HPT) Gen, das eine Resistenz ge- gen Hygromycin vermittelt, das Acetolactatsynthas Gen (ALS), das eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleiht (z. B. mutierte ALS-Varianten mit z. B. der S4 und/oder Hra Mu- tation). b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodie- ren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind da- bei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Bio- technol. 1999 ; 13 (1) : 29-44) wie das"green fluorescence pro- tein" (GFP) (Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5) : 777-784), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Ow et al.

(1986) Science 234 : 856-859), das Aequorin-Gen (Prasher et al.

(1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3) : 1259-1268), die ß-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuro- nidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6 : 3901-3907).

c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsge- mässen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sam- brook et al. : Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed.

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzen- transformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.

Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch trans- formierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selek- tionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Bei- spiel ein Herbizid),. einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglu- cose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5 : 81-84).

Verschiedene Methoden und Vektoren zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sowie zur Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen sind bekannt (Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapi- tel 6/7, S. 71-119 (1993) ; White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ; in : Transgenic Plants, Bd. 1, Enginee- ring and Utilization, Hrsgb. : Kung und Wu R, Academic Press, 15-38 ; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in : Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb. : Kung und R. Wu, Academic Press, S. 128-143 ; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42 : 205-225 ; Halford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56 (1) : 62-73). Dazu zählen beispielhaft die oben erwähnten. Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Me- thoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, die Liposomen vermittelte Transformation (wie z. B. in US 4,536, 475 beschrieben), biolistische Verfahren mit der Gen- kanone ("particle bombardment"Methode ; Fromm ME et al. (1990) Bio/Technology. 8 (9) : 833-9 ; Gordon-Kamm et al. (1990) The Plant Cell 2 : 603), die Elektroporation, die Inkubation trockener Em- bryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion. Im Falle dieser"direkten"Transformationsmethoden sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plas-

mide wie die der pUC-Reihe, pBR322, M13mp Reihe, pACYC184 etc. können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforder- lich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.

Neben diesen"direkten"Transformationstechniken kann eine Trans- formation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium (z. B. EP 0 116 718), virale Infektion mittels viraler Vektoren (EP 0 067 553 ; US 4,407, 956 ; WO 95/34668 ; WO 93/03161) oder mittels Pollen (EP 0 270 356 ; WO 85/01856 ; US 4,684, 611) durchge- führt werden.

Die für die. Agrombacterium-Transformation meist verwendeten Stämme Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes eine auch durch bakterielle Infektion mittels'enthalten ein Plas- mid (Ti bzw. Ri Plasmid), das auf die Pflanze nach Agrobaterium- Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T- DNA (transferred DNA), wird in das Genom der Pflanzenzelle inte- griert. Alternativ können durch Agrobakterium auch binäre vekto- ren (Mini-Ti-Plasmide) auf Pflanzen übertragen und in deren Genom integriert werden. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die direkten Transformationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen. Verfahren zur Agrobakterium vermittelten Trans- formation sind beispielsweise beschrieben bei Horsch RB et al.

(1985) Science. 225 : 1229f. Werden Agrobacterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch : shuttle or interme- diate vector) oder einen binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden.

Für die Agrobacterium Tranformation werden bevorzugt binäre Vek- toren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Se- lektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können di- rekt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al.

(1978) Mol Gen Genet 163 : 181-187). Das Selektionsmarkergen er- laubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptII Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin ver- leiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agro- bacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthal- ten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche

Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwen- dung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist inten- siv untersucht und beschrieben (EP 120 516 ; Hoekema, In : The Bi- nary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblas- serdam, Chapter V ; An et al. (1985) EMBO J 4 : 277-287). Verschie- dene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell er- hältlich wie zum Beispiel pBI101. 2 oder pBINl9 (Clontech Labora- tories, Inc. USA ; Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12 : 8711), pBinAR, pPZP200 oder pPTV.

Die'mit einem solchen Vektor transformierten Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, ins- besondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Raps, verwendet wer- den, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschliessend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist beschrieben (White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ; in Transgenic Plants, Vol. 1, Enginee- ring and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38 ; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in : Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, S. 128-143 ; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42 : 205- 225). Aus den transformierten Zellen der ver- wundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die integriert die oben beschriebenen erfindungsgemässen Expressionssysteme enthalten.

Stabil transformierte Zellen d. h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von un- transformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann bei- spielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibio- tika oder Herbizide (wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc. ) zu verleihen vermag (s. o. ). Transfor- mierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransfor- mierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind oben genannt und umfassen bevorzugt das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphi- notricin verleiht. (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21 (5) : 871-884), das nptII Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von trans- formierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986)

Plant Cell Reports 5 : 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Ge- nerationen sollten vorzugsweise kultiviert werden, um sicherzu- stellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.

Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann be- kannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zell- massen kann die Bildung von Spross und'Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden. Entsprechende Verfahren sind beschriebe (Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11 : 567-570 ; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14 : 273-278 ; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89 : 525-533).

Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nuklein- säuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermeh- rung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsme- thoden ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe verän- derte Expression eines Zielgens und die Auswirkung auf den Phän- ptyp der Pflanze an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden II. Medizinische Anwendungen Die erfindungsgemäß bereitgestellten dsRNA, Expressionssy- steme oder Organismen eignen sich zur Herstellung von Arznei- mitteln zur Behandlung von menschlichen und tierischen Er- krankungen. Für eine effizient Therapie ist es oft unzurei- chend nur ein einzelnes Zielgen zu vermindern. Das erfin- dungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Behandlung von - Pathogenbefall, wie beispielsweise virale oder bakte- rielle Erkrankungen. In diesen Fällen führen Ansätze, die lediflich gegen ein molekulares Ziel gerichtet sind, oft zu der Ausbildung von Resistenzen. Eine Kombinationthera- pie, die mehrere Ziele abdeckt, ist jedoch kompliziert zu koordinieren und v. a. nur sehr aufwendig in klinischen Experimenten zu evaluieren. Das erfindungsgemäße Verfah- ren ermöglicht hier eine vorteilhafte Alternative. Die inhibitorische dsRNA kann dabei in'der dem Fachmann ge- läufigen Weise appliziert werden. dsRNA verfügt über eine erstaunliche Stabilität und effiziente Wirkung und kann beispielsweise durch Verfütterung entsprechender dsRNA exprimierenden Bakterien appliziert werden. Das Verfahren

eignet sich insbesondere zur Behandlung von viralen In- fektionen z. B. mit dem"human immunodeficiency virus" (HIV), indem gleichzeitig die Expression von mindestens zwei viralen Gene vermindert wird, beispielsweise bei HIV- von Genen wie gp41, die für den Zelleintritt verantwort- lich sind, und der viralen Replikase oder reversen Trans- kriptase.

Behandlung von Krebs (beispielsweise solider Tumore und/ oder Leukämien). Zahlreiche potentialle Zielgene sind hier dem Fachmann bekannt (z. B. Oncogene wie ABL1, BCL1, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSF1R, ERBA, ERBB, EBRB2, FGR, FOS, FYN, HRAS, JUN, LCK, LYN, MYB, MYC, NRAS, RET oder SRC ; Tumorsuppressorgene wie BRCA1 oder BRCA2 ; Adhäsions- moleküle ; Cyclinekinasen und deren Inhibitoren).

Weitere potentiell mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behan- delbare Erkrankungen und die entsprechenden Zielgene sind dem Fachmann ohne weiteres zugänglich und umfassen beuspielsweise Erkrankungen des Herz/Kreislaufsystems wie Bluthochdruck, Er- krankungen des zentralen oder peripheren Nervensystems wie Alzheimer, Parkinson oder multiple Sklerose usw. Auch ist es durch das erfindungsgemäße Verfahren möglich, mehr als eine Erkrankung parallel zu behandeln, wie beispielsweise ein Herzkreilauferkrankung und eine Erkrankung des zentralen Ner- vensystems, was durch klassische Ansätze nicht möglich ist.

Derartige Ansätze sind v. a. bei multiplen Erkrankungen wie sie oft im fortgeschrittenen Alter auftreten vorteilhaft.

Beispielhaft sei die parallele Behandlung von Bluthochdruck und z. B. Alzheimer oder seniler Demenz zu nennen. Dabei kann dieser Anwendungen als solche isoliert angewendet werden. Na- türlich können. auch mehr als eine der oben genannten Ansätze gleichzeitig angewendet werden. Dabei wird bei allen Anwen- dungen die Expression von mindestens zwei unterschiedlichen Zielgenen vermindert. Diese Zielgene können dabei aus der. für eine Anwendung bevorzugten Gruppe von Genen stammen oder aber auch unterschiedlichen Anwendungsgruppen zugeordnet sein.

III. Biotechnologische Anwendungen Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich vorteilhaft in bio- technologischen Verfahren anwenden. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend sei zu nennen die Optimierung von Stoffwechsel- wegen in fermentativ genutzten Hefen, Pilzen oder anderen eu- karyotischen Mikroorganismenoder Zellen zur Herstellung von Feinchemikalien wie Aminosäuren (z. B. Lysin oder Methionin), Vitaminen (wie Vitamin B2, Vitamin C, Vitamin E), Carotinoi-

den, Ölen und Fetten, polyungesättigten Fettsäuren, Biotin usw. Dabei kann dieser Anwendungen als solche isoliert ange- wendet werden. Natürlich können auch mehr als eine der oben genannten Ansätze gleichzeitig angewendet werden. Dabei wird bei allen Anwendungen die Expression von mindestens zwei un- terschiedlichen Zielgenen vermindert. Diese Zielgene können dabei aus der für eine Anwendung bevorzugten Gruppe von Genen stammen oder aber auch unterschiedlichen Anwendungsgruppen zügeordnet sein.

Als Vektoren zur Expression in E. coli sind bevorzugt pQE70, pQE60 und pQE-9 (QIAGEN, Inc. ) ; pBluescript Vektoren, Phagescript Vek- toren, pNH8A, pNH16a, pNHl8A, pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.). ; ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia. Bio- tech, Inc.).

Bevorzugte Vektoren zur eukaryotischen Expression umfassen <BR> <BR> pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 und pSG (Stratagene Inc. ) ; pSVK3,<BR> pBPV, pMSG und pSVL (Pharmacia Biotech, Inc. ). Als induzierbare Vektoren seien pTet-tTak, pTet-Splice, pcDNA4/TO, pcDNA4/TO/ LacZ, pcDNA6/TR, pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ, pcDNA4/TO/Myc-His A, pcDNA4/TO/Myc-His B, pcDNA4/TO/Myc-His C, pVgRXR (Invitrogen, Inc. ) oder die pMAM-Serie (Clontech, Inc. ; GenBank Accession No. : U02443) zunennen. Diese stellen bereits das induzierbare regula- torische Kontrollelement beispielsweise für eine chemisch, indu- zierbare Expression eines DSBI-Enzyms zur Verfügung. In diese Vektoren kann die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein DSBI-En- zym direkt insertiert werden.

Vektoren für die Expression in Hefe umfassen beispielhaft pYES2, pYDl, pTEFl/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pP-IC9, pPIC3. 5, PHIL-D2, PHIL-Sl, pPIC3SK, pPIC9K, und PA0815 (Invitro- gen, Inc.).

Vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise die gram-posi- tiven Promotoren amy und SP02, und die Hefe-oder Pilzpromotoren ADC1, MFa, AC, P-60,. CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

Klonierungsvektoren und Techniken zur genetischen Manipulation von Ciliaten und Algen sind dem Fachmann bekannt (WO 98/01572 ; Falciatore et al. (1999) Marine Biotechnology 1 (3) : 239-251 ; Duna- hay et al. (1995) J Phycol 31 : 10004-1012).

Als Selektionsmarker können prinipiell viele der auch für Pflan- zen bevorzugten Selektionssysteme verwendet werden. Insbesondere bevorzugt sind für Säugerzelle die Neomycin (G418) Resistenz, die Hygromycin-Resistenz, die Zeocin-Resistenz oder die Puromycin-Re-

sistenz. Für Prokaryoten ist insbesondere die Ampicillin-Resi- stenz, die Kanamycin-Resistenz oder die Tetracyclin-resistent be- vorzugt.

Prinzipiell sind für die Transformation tierischer Zelle oder von Hefezellen ähnliche Verfahren wie für die"direkte"Tranformation von pflanzlichen Zellen anzuwenden. Insbesondere Verfahren wie die Calciumphosphat oder Liposomen vermittelte Transformation oder aber Elektroporation sind bevorzugt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemässen, transgenen Organismen und der von ihnen abge- leitete Zellen, Zellkulturen, Teile-wie zum Beispiel bei trans- genen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.-, und trans- genes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs-oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, wie beispielsweise Enzymen, Vitaminen, Aminosäuren, Zucker, Fett- säuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma-und Farb- stoffe. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Triaclyglyce- riden, Lipiden, Ölen, Fettsäuren, Stärke, Tocopherolen und Toco- trienolen sowie Carotinoiden. Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemässe, genetisch veränderte Pflanzen können auch bei- spielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden.

Sequenzen 1. SEQ ID NO : 1 Nukleinsäuresequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S sub- unit 1 (GenBank Acc. -No. : M22032) 2. SEQ ID NO : 2 Proteinsequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S subunit 1 3. SEQ ID NO : 3 Nukleinsäuresequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S sub- unit 3 (GenBank Acc. -No. : M22035) 4. SEQ ID NO : 4 Proteinsequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S subunit 3 5. SEQ ID NO : 5 Nukleinsäuresequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S sub- unit 2 (GenBank Acc. -No. : M22034) 6. SEQ ID NO : 6 Proteinsequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S subunit 2 7. SEQ ID NO : 7 Nukleinsäuresequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S sub- unit 4 (GenBank Acc. -No. : M22033) 8. SEQ ID NO : 8 Proteinsequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S subunit 4 9. SEQ ID NO : 9 Nukleinsäuresequenz kodierend für B. napus Cruciferin Spei- cherprotein (GenBank Acc. -No. : X59294) 10. SEQ ID NO : 10 Proteinsequenz kodierend für B. napus Cruciferin Speicherpro- tein 11. SEQ ID NO : 11 Nukleinsäuresequenz kodierend für Brassica napus Cruciferin (GenBank Acc. -No. : X14555) 12. SEQ ID NO : 12 Proteinsequenz kodierend für Brassica. napus Cruciferin

13. SEQ ID NO : 13 Nukleinsäuresequenz kodierend für B. napus BnC2 Cruciferin Speicherprotein (GenBank Acc. -No. : X59295) 14. SEQ ID NO : 14 Proteinsequenz kodierend für B. napus BnC2 Cruciferin Spei- cherprotein 15. SEQ ID NO : 15 partielle Nukleinsäuresequenz kodierend für B. napus Crucife- rin cru4 subunit (GenBank Acc. -No. : X57848) 16. SEQ ID NO : 16 partielle Proteinsequenz kodierend für B. napus Cruciferin cru4 subunit 17. SEQ ID NO : 17 Nukleinsäuresequenz kodierend für B. napus crul Cruciferin subunit (GenBank Acc. -No. : X62120) 18. SEQ ID NO : 18 Proteinsequenz kodierend für B. napus crul Cruciferin subunit 19. SEQ ID NO : 19 Nukleinsäuresequenz kodierend für Glycinin A-la-B-x subunit aus des Sojabohne (GenBank Acc. -No. : M36686) 20. SEQ ID NO : 20 Proteinsequenz kodierend für Glycinin A-la-B-x subunit aus des Sojabohne 21. SEQ ID NO : 21 Nukleinsäuresequenz kodierend für Sojabohne Glycinin subunit G2 (GenBank Acc. -No. : X15122') 22. SEQ ID NO : 22 Proteinsequenz kodierend für Sojabohne Glycinin subunit G2 23. SEQ ID NO : 23 Nukleinsäuresequenz kodierend für Sojabohne A5A4B3 Glycinin subunits (GenBank Acc. -No. : X02626) 24. SEQ ID NO : 24 Proteinsequenz kodierend für Sojabohne A5A4B3 Glycinin sub- units

25. SEQ ID NO : 25 Nukleinsäuresequenz kodierend für Sojabohne (G. max) Glycinin Speicherprotein subunit A3-B4 (GenBank Acc. -No. : M10962) 26. SEQ ID NO : 26 Proteinsequenz kodierend für Sojabohne (G. max) Glycinin Spei- cherprotein subunit A3-B4 27. SEQ ID NO : 27 Nukleinsäuresequenz kodierend für Sojabohne Glycinin sübunit G3 (GenBank Acc. -No. : X15123) 28. SEQ ID NO : 28 Proteinsequenz kodierend für Sojabohne Glycinin subunit G3 29. SEQ ID NO : 29 Nukleinsäuresequenz kodierend für Sonnenblume 11S Speicher- protein (G3-D1) (GenBank Acc.-No. : M28832) 30. SEQ ID NO : 30 Proteinsequenz kodierend für Sonnenblume 11S Speicherprotein (G3-D1) 31. SEQ ID NO : 31 Nukleinsäuresequenz kodierend für Raps (B. napus) Napin (Gen- Bank Acc. -No. : J02586) 32. SEQ ID NO : 32 Proteinsequenz kodierend für Raps (B. napus) Napin 33. SEQ ID NO : 33 Nukleinsäuresequenz kodierend für Brassica juncea 2S Spei- cherprotein (GenBank Acc. -No. : X65040) 34. SEQ ID NO : 34 Proteinsequenz kodierend für Brassica juncea 2S Speicherpro- tein 35. SEQ ID NO : 35 Nukleinsäuresequenz kodierend für Brassica oleracea 2S Spei- cherprotein (GenBank Acc. -No. : X65038) 36. SEQ ID NO : 36 Proteinsequenz kodierend für Brassica oleracea 2S Speicher- protein

37. SEQ ID NO : 37 Nukleinsäuresequenz kodierend für Brassica napus cv. Topas Napin (GenBank Acc.-No. : U04945) 38. SEQ ID NO : 38 Proteinsequenz kodierend für Brassica napus cv. Topas Napin 39. SEQ ID NO : 39 partielle Nukleinsäuresequenz kodierend für Sinapis alba sinl Speicherprotein (GenBank Acc.-No. : X91799) 40. SEQ ID NO : 40 partielle Proteinsequenz kodierend für Sinapis alba sinl Speicherprotein 41. SEQ ID NO : 41 Nukleinsäuresequenz kodierend für Sojabohne (Glycine max) na- pin-type 2S Albumin 1 (GenBank Acc. -No. : U71194) 42. SEQ ID NO : 42 Proteinsequenz kodierend für Sojabohne (Glycine max) napin- type 2S Albumin 1 43. SEQ ID NO : 43 Nukleinsäuresequenz kodierend für Sojabohne (Glycine max) 2S Albumin (GenBank Acc.-No. : AF005030) 44. SEQ ID NO : 44 Proteinsequenz kodierend für Sojabohne (Glycine max) 2S Albu- min 45. SEQ ID NO : 45 Nukleinsäuresequenz kodierend für Brassica nigra 2S Speicher- protein (GenBank Acc.-No. : X65039) 46. SEQ ID NO : 46 Proteinsequenz kodierend für Brassica nigra 2S Speicherpro- tein 47. SEQ ID NO : 47 Nukleinsäuresequenz kodierend für Sinapis alba sin5 Speicher- protein (GenBank Acc.-No. : X91798) 48. SEQ ID NO : 48 Proteinsequenz kodierend für Sinapis alba sin5 Speicherpro- tein

49. SEQ ID NO : 49 Nukleinsäuresequenz kodierend für Sonnenblume HaG5 2 S Albu- min (GenBank Acc. -No. : X06410) 50. SEQ ID NO : 50 proteinsequenz kodierend für Sonnenblume HaG5 2 S Albumin 51. SEQ ID NO : 51 partielle Nukleinsäuresequenz kodierend für Sonnenblume (He- lianthus annuus) 2S Albumin (GenBank Acc. -No. : X76101) 52. SEQ ID NO : 52 partielle Proteinsequenz kodierend für Sonnenblume (Heliant- 'hus annuus) 2S Albumin 53. SEQ ID NO : 53 Nukleinsäuresequenz kodierend für dsRNA zur Suppression von Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AtCru3 (Insert von Vektor pCR2. 1-AtCRU3-RNAi) 54. SEQ ID NO : 54 Ribonukleinsäuresequenz kodierend für dsRNA zur Suppression von Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AtCru3 55. SEQ ID NO : 55 Nukleinsäuresequenz kodierend für dsRNA zur Suppression von Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AtCral 56. SEQ ID NO : 56 Ribonukleinsäuresequenz kodierend für dsRNA zur Suppression von Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AtCral 57. SEQ ID NO : 57 Nukleinsäuresequenz kodierend für dsRNA zur Suppression von Arabidopsis thaliana 2S Speicherprotein At2S2 58. SEQ ID NO : 58 Ribonukleinsäuresequenz kodierend für dsRNA zur Suppression von Arabidopsis thaliana 2S Speicherprotein At2S2 59. SEQ ID NO : 59 Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis thaliana 12S Cruciferin Speicherprotein (ATCRU3 ; GenBank Acc. -No. : U66916)

60. SEQ ID NO : 60 Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis thaliana 12S Cruci- ferin Speicherprotein (ATCRU3) 61. SEQ ID NO : 61 Nukleinsäuresequenz kodierend für A. thaliana 12S Speicherpro- tein (CRA1 ; GenBank Acc.-No. : M37247) 62. EQ ID NO : 62 Proteinsequenz kodierend für A. thaliana 12S. Speicherprotein (CRA1) 63. SEQ ID NO : 63 Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AT5g4412Q/MLNl4 (GenBankAcc.-No. : AY070730) 64. SEQ ID NO : 64 Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis thaliana 12S Spei- cherprotein AT5g44120/MLN1_4 65. SEQ ID NO : 65 Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis 12S Speicher- protein (CRB ; GenBank Acc.-No. : X14313 ; M37248) 66. SEQ ID NO : 66 Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis 12S Speicherprotein (CRB) 67. SEQ ID NO : 67 Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis thaliana puta- tives 12S Speicherprotein (aus GenBank Acc. -No. : AC003027) 68. SEQ ID NO : 68 Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis thaliana putatives Speicherprotein (Proteinid="AAD10679. 1) 69. SEQ ID NO : 69 Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis thaliana Cruci- ferin 12S Spwicherprotein (Atlg03890) (GenBank Acc.-No. : AY065432) 70. SEQ ID NO : 70 Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis thaliana Cruciferin 12S Speicherprotein (Atlg03890)

71. SEQ ID NO : 71 Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis thaliana Prohi- bitin 1 (Atphbl) (GenBank Acc.-No. : U66594) 72. SEQ ID NO : 72 Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis thaliana Prohibitin 1 (Atphbl) 73. SEQ ID NO : 73 Oligonukleotidprimer OPN1 74. SEQ ID NO : 74 Oligonukleotidprimer OPN2 75. SEQ ID NO : 75 Oligonukleotidprimer OPN3 76. SEQ ID NO : 76 Oligonukleotidprimer OPN4 77. SEQ ID NO : 77 Oligonukleotidprimer OPN5 78. SEQ ID NO : 78 Oligonukleotidprimer OPN6 79. SEQ ID NO : 79 Oligonukleotidprimer OPN7 80. SEQ ID NO : 80 Oligonukleotidprimer OPN8 81. SEQ ID NO : 81 Oligonukleotidprimer OPN9 82. SEQ ID NO : 82 Oligonukleotidprimer OPN10 83. SEQ ID NO : 83 Nukleinsäuresequenz kodierend für sRNAi4-dsRNA zur Suppres- sion mehrerer Speicherproteine 84. SEQ ID NO : 84 Ribonukleinsäuresequenz kodierend für sRNAi4-dsRNA zur Sup- pression mehrerer Speicherproteine 85. SEQ ID NO : 85 Nukleinsäuresequenz kodierend für sRNAi8-dsRNA zur Suppres- sion mehrerer Speicherproteine 86. SEQ ID NO : 86 Ribonukleinsäuresequenz kodierend für sRNAi8-dsRNA zur Sup- pression mehrerer Speicherproteine 87. SEQ ID NO : 87 Oligonukleotidprimer OPN11

88. SEQ ID NO : 88 Oligonukleotidprimer OP12 89. SEQ ID NO : 89 Oligonukleotidprimer OPN13 90. SEQ ID NO : 90 Oligonukleotidprimer OPN15 91. SEQ ID NO : 91 Oligonukleotidprimer OPN16 92. SEQ ID NO : 92 Oligonukleotidprimer OPN17 93. SEQ ID NO : 93 Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis thaliana"glo- bulin-like protein" (GenBank Acc.-No. : NM_119834) 94. SEQ ID NO : 94 Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis thaliana"globulin- like. protein" (Protein_id="NP_195388. 1) 95. SEQ ID NO : 95 Nukleinsäuresequenz kodierend für Glycine max 7S Samenglobu- lin (GenBank Acc.-No. : U59425) 96. SEQ ID NO : 96 Proteinsequenz kodierend für für Glycine max 7S Samenglobulin 97. SEQ ID NO : 97 Nukleinsäuresequenz kodierend für Zea mays 19kD Zein (GenBank Acc. -No. : E01144) 98. SEQ ID NO : 98 Proteinsequenz kodierend für Zea mays 19kD Zein 99. SEQ ID NO : 99 Nukleinsäuresequenz kodierend für Zea mays 19kD alpha Zein B1 (GenBank Acc.-No. : AF371269) 100. SEQ ID NO : 100 Proteinsequenz kodierend für Zea mays 19kD alpha Zein B1 101. SEQ ID NO : 101 Nukleinsäuresequenz kodierend für Zea mays 19kD alpha Zein B2 (GenBank Acc. -No. : AF371270) 102. SEQ ID NO : 102 Proteinsequenz kodierend für Zea mays 19kD alpha Zein B2

103. SEQ ID NO : 103 Nukleinsäuresequenz kodierend für Zea mays 22kD alpha-zein (GenBank Acc.-No. : X61085) 104. SEQ ID NO : 104 Proteinsequenz kodierend für Zea mays 22kD alpha-zein 105. SEQ ID NO : 105 Nukleinsäuresequenz kodierend für Oryza sativa Prolamin (GenBank Acc.-No. : AB016503) 106. SEQ ID NO : 106 Proteinsequenz kodierend für Oryza sativa Prolamin 107. SEQ ID NO : 107 Nukleinsäuresequenz kodierend für A. sativa Avenin (GenBank Acc. -No. : M38446) 108. SEQ ID NO : 108 Proteinsequenz kodierend für A. sativa Avenin 109. SEQ ID NO : 109 Nukleinsäuresequenz kodierend für Hordeum vulgare C-Hordein (GenBank Acc. -No. : M36941) 110. SEQ ID NO : 110 Proteinsequenz Teil 1 kodierend für Hordeum vulgare C-Hordein 111. SEQ ID NO : 111 Proteinsequenz Teil 2 kodierend für Hordeum vulgare C-Hordein 112. SEQ ID NO : 112 Nukleinsäuresequenz kodierend für Triticum aestivum LMW Glu- tenin-1D1 (GenBank Acc.-No. : X13306) 113. SEQ ID NO : 113 Proteinsequenz kodierend für Triticum aestivum LMW Glute- nin-1D1 114. SEQ ID NO : 114 Binärer Expressionsvektor für Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation pSUN2-USP.

115. SEQ ID NO : 115 Partielle Nukleinsäuresequenz kodierend für Homogenti- sat-1, 2-dioxygenase aus Brassica napus (HGD ; EC-Nr. : 1.13. 11.5) 116. SEQ ID NO : 116 Nukleinsäuresequenz kodierend für Homogentisat-1, 2-dioxyge- nase aus Arabidopsis thaliana (HGD ; EC-Nr. : 1.13. 11.5) 117. SEQ ID NO : 117 Proteinsequenz kodierend für Homogentisat-1, 2-dioxygenase aus Arabidopsis thaliana (HGD ; EC-Nr. : 1.13. 11.5) 118. SEQ ID NO : 118 Nukleinsäuresequenz kodierend für Maleylacetoacetatisomerase aus Arabidopsis thaliana (MAAI ; EC-Nr. : 5.2. 1.2.) 119. SEQ ID NO : 119 Proteinsequenz kodierend für Maleyl'acetoacetätisomerase aus Arabidopsis thaliana (MAAI ; EC-Nr. : 5.2. 1.2.) 120. SEQ ID NO : 120 Nukleinsäuresequenz kodierend für Fumarylacetoacetathydrolase aus Arabidopsis thaliana (FAAH ; EC-Nr. : 3.7. 1.2) 121. SEQ ID NO : 121 Proteinsequenz kodierend für Fumarylacetoacetathydrolase aus Arabidopsis thaliana (FAAH ; EC-Nr. : 3.7. 1.2) 122. SEQ ID NO : 122 Nukleinsäuresequenz kodierend für Supressionskonstrukt 2 (p3300. 1-Toc159-GFP-RNAi) 123. SEQ ID NO : 123 Oligonukleotidprimer OPN18 124. SEQ ID NO : 124 Oligonukleotidprimer OPN19 125. SEQ ID NO : 125 Oligonukleotidprimer OPN20 126. SEQ ID NO : 126 Oligonukleotidprimer OPN21 Abbildungen 1. Fig. 1 : Schematische Darstellung der Speicherprotein-Suppres- sionskonstrukte.

Insert aus Vektor pCR2.1-sRNAi4 (1) (vgl. Beispiel 2d) und pCR2.1-sRNAi8 (2) (vgl. Beispiel 2e) kodierend für eine die AtCru3-, AtCRB und At2S3-Expression supprimierende dsRNA.

In den beiden Konstrukten sind die"sense"-Ribonukleotidse- quenzen und die komplementären"antisense"-Ribonukleotidse- quenzen (symbolisiert durch auf dem Kopf stehende Buchstaben) für die einzelnen zu supprimierenden Zielgene (AtCru3 ; AtCRB, At2S3) unterschiedlich angeordnet. Schraffierte Bereiche (I1, I2 etc. ) stellen Intronsequenzen (Linker) dar.

2. Fig. 2A-D : Symbolische Darstellung verschiedener dsRNAs in ih- rer Sekundärstruktur.

S1, S2,. .. S (n) :"sense"-Ribonukleotidsequenz AS1, AS2,... AS (n) :"ant. isense"-Ribonukleotidsequenz I : Intronsequenz Die Anordnung der einzelnen"sensen-Ribonukleotidsequenzen und"antisense"-Ribonukleotidsequenzen kann so erfolgen, dass zunächst alle"sense"-Ribonukleotidsequenzen aneinander ge- reiht werden und so quasi einen"sense"-Strang bilden, wo- drauf dann alle"antisense"-Ribonukleotidsequenzen aneinander zu einem"antisense"-Strang zusammengefügt werden (A und C).

Alternativ kann die Anordnung der einzelnen"sense"-Ribonu- kleotidsequenzen und"antisense"-Ribonukleotidsequenzen so erfolgen, dass Paare von jeweils komplementären"sense"-Ribo- nukleotidsequenzen und"antisense"-Ribonukleotidsequenzen an- einander gefügt werden (B und D).

"sense"-Ribonukleotidsequenzen und"antisense"-Ribonukleotid- sequenzen können direkt aneinandergefügt sein (A und B) oder aber durch weitere Sequenzen beispielsweise Introns (I) von- einander getrennt sein (C und D).

3. Fig. 3A-C : Symbolische Darstellung verschiedener dsRNAs in ih- rer Sekundärstruktur.

S1, S2,... S (n) :"sense »-Ribonukleotidsequenz AS1, AS2,... AS (n) :"antisense"-Ribonukleotidsequenz SP :"SPACER" RE : Erkennungssequenz für Ribozym R : Ribozym

"sense"-Ribonukleotidsequenzen und"antisense"-Ribonukleotid- sequenzen können durch weitere Sequenzen ("SPACER" ; SP) von- einander getrennt sein (A). Der Spacer kann beispielsweise eines Erkennungssequenz für ein Ribozym sein. Das korrespon- dierende Ribozym kann separat exprimiert werden (B) oder aber auch ebenfalls von dem Spacer kodiert sein (C).

4. Fig. 4 : Abbildung des Supressionskonstrukts mit den entspre- chenden Restriktionsenzymschnittstellen : 5. Fig. 5A : Identifikation einer Pflanze, die den Albino-Phänotyp zeigt (links). Der Phänotyp ist identisch zur ppi2 Mutante, die Tocl59 nicht mehr exprimieren kann. Als Kontrolle Pflan- zen mit Wildtyp Phänotyp, die parallel gewachsen sind.

Fig. 5B : Fluoreszenz-Analyse der Pflanzen aus Fig. 5A. Anre- gung der Fluoreszenz durch Licht im Wellenlängenbereich 470-490 nm. Es wurde dieselbe Vergrösserung gewählt wie in Fig. SA.

Beispiele Allgemeine Methoden : Alle Chemikalien, wenn nicht anders erwähnt, stammen von den Fir- men Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen). Restriktionsenzyme, DNA-mo- difizierende Enzyme und Molekularbiologie-Kits wurden von den Firmen Amersham-Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen), Roche (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Qiagen (Hilden), Stratagen (Amsterdam, Niederlande), Invitrogen (Karlsruhe) und Ambion (Cambridgeshire, United Kingdom). Die verwendeten Reagen- zien wurden entsprechend der Angaben des Herstellers eingesetzt.

Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2.

Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs- schritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektropho- rese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Frag- menten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press ; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequen- zierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluo- reszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von San- ger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 : 5463-5467).

Beispiel 1 : Allgemeine Verfahren Die Pflanze Arabidopsis thaliana repräsentiert ein Mitglied der höheren Pflanzen (Samenpflanzen). Diese Pflanze ist eng verwandt mit anderen Pflanzenarten aus der Familie der Cruciferen wie z. B.

Brassica napus, aber auch mit anderen Pflanzenfamilien der Diko- tyledonen. Aufgrund des hohen Grades an Homologie ihrer'DNA-Se- quenzen bzw. Polypeptidsequenzen kann Arabidopsis thaliana als Modellpflanze für andere Pflanzenarten eingesetzt werden. a) Anzucht von Arabidopsis Pflanzen Die Pflanzen werden entweder auf Murashige-Skoog Medium mit 0, 5 % Saccharose (Ogas et al. (1997) Science 277 : 91-94) oder auf Erde gezogen (Focks & Benning (1998) Plant Physiol 118 : 91-101). Um einheitliche Keimungs-und Blühzeiten zu erreichen, werden die

Samen nach Ausplattieren bzw. Ausstreuen auf Erde zwei Tage bei 4° C stratifiziert. Nach der Blüte werden die Schoten markiert. Ent- sprechend der Markierungen werden dann Schoten mit einem Alter von 6 bis 20 Tagen nach der Blüte geerntet. b) Isolierung von total RNA und poly-A+ RNA aus Pflanzen Für die Herstellung von Supressionskonstrukten wird RNA bzw. polyA+ RNA isoliert. RNA wurde aus Schoten von Arabidopsis Pflan- zen nach folgender Vorschrift isoliert : Schotenmaterial im. Alter von 6 bis 20 Tage nach Blühte wurde geerntet und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Das Material wurde vor der weiteren Verwendung bei-80°C gelagert. 75 mg des Materials wurde im ge- kühlten Mörser zu einem feinem Pulver gemahlen und mit 200 WL des Lysis-Puffers aus dem Ambion RNAqueos-Kit versetzt. Die Isolie- rung der totalen RNA wurde dann nach Herstellerangaben durchge- führt. Die RNA wurde mit. 50 FL Elutionspuffer (Ambion) eluiert und die Konzentration durch Absorption einer 1 zu 100 verdünnten Lösung am Photometer (Eppendorf) bei 260 nm bestimmt. 40 Ag/ml RNA entspricht dabei einer Absorption von 1. Die RNA-Lösungen wurden mit RNAse freiem Wasser auf eine Konzentration von 1 gg/gL eingestellt. Die Konzentrationen wurden durch Agarosegelelektro- phorese überprüft. Zur Isolierung von polyA+ RNA wurde oligo (dT)-Zellulose von Amersham Pharmacia nach Herstellerangaben verwendet. RNA bzw. polyA+ RNA wurde bei-70°C gelagert. c) Konstruktion der cDNA-Bank Zur Konstruktion der cDNA-Bank aus Arabidopsis Schoten-RNA wurde die Erststrangsynthese unter Verwendung von Reverser Transkrip- tase aus Maus-Leukämie-Virus (Clontech) und Oligo-d (T)-Primern, die Zweitstrangsynthese durch Inkubation mit DNA-Polymerase I, <BR> <BR> Klenow-Enzym und RNAse H-Spaltung bei 12°C (2 Std.), 16°C (1 Std. )<BR> und 22°C (1 Std. ) erzielt. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 65°C (10 min) gestoppt und anschließend auf Eis überführt.

Doppelsträngige DNA-Moleküle wurde mit T4-DNA-Polymerase (Ro- che, Mannheim) bei 37°C (30 min) mit glatten Enden versehen. Die Nukleotide wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Sepha- dex-G50-Zentrifugiersäulen entfernt. EcoRI/XhoI-Adapter (Pharma- cia, Freiburg, Deutschland) wurden mittels T4-DNA-Ligase (Roche, 12°C, über Nacht) an die cDNA-Enden ligiert, mit XhoI nachge- schnitten und durch Inkubation mit Polynukleotidkinase (Roche, 37°C, 30 min) phosphoryliert. Dieses Gemisch wurde der Trennung auf einem Low-Melting-Agarose-Gel unterworfen. DNA-Moleküle über 300 Basenpaaren wurden aus dem Gel eluiert, Phenol-extrahiert, auf Elutip-D-Säulen (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland) konzentriert und an Vektorarme ligiert und in lambda-ZAPII-Phagen

oder lambda-ZAP-Express-Phagen unter Verwendung des Gigapack Gold-Kits (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) verpackt, wobei Material des Herstellers verwendet und seine Anweisungen befolgt wurden. d) Isolierung von genomischer DNA aus Pflanzen wie Arabidopsis thaliana oder Brassica napus (CTAB-Methode) Zur Isolierung genomischer DNA aus Pflanzen wie Arabidopsis tha- liana oder Brassica napus werden ca. 0,25 g Blattmaterial junger Pflanzen im vegetativen Stadium in flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver gemörsert. Das pulverisierte Pflanzenmaterial wird zusam- men mit 1 ml 65°C-warmem CTAB I-Puffer (CTAB : Hexadecyltrimethy- lammoniumbromid, auch genannt Cetyltrimethylammoniumbromid ; Sigma Kat.-Nr. : H6269) und 20 A1 ß-Mercaptoethanol in einen vorgewärm- ten zweiten Mörser gegeben und nach vollständiger Homogenisierung wird der Extrakt in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß überführt und für 1 h bei 65°C unter regelmäßiger, vorsichtiger Durchmischung inku- biert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird der Ansatz mit 1 ml Chloroform/Octanol (24 : 1, mit 1M Tris/HCl, pH 8,0 ausgeschüttelt) durch langsames Invertieren extrahiert und zur Phasentrennung für 5 min bei 8,500 rpm (7,500 x g) und Raumtemperatur zentrifugiert.

Anschließend wird die wässrige Phase erneut mit 1 ml Chloroform/ Octanol extrahiert, zentrifugiert und durch Invertieren mit 1/10 Volumen auf 65°C vorgewärmtem CTAB II-Puffer sorgfältig gemischt.

Anschließend wird der Ansatz durch vorsichtiges Schwenken mit 1 ml Chloroform/Octanol-Gemisch (siehe oben) versetzt und zur er- neuten Phasentrennung für 5 min bei 8,500 rpm (7,500 x g) und Raumtemperatur zentrifugiert. Die wässrige untere Phase wird in ein frisches Eppendorf-Gefäß überführt und die obere organische Phase wird in einem frischen Eppendorf-Gefäß erneut für 15 min bei 8,500 rpm (7,500 x g) und Raumtemperatur zentrifugiert. Die hieraus resultierende wässrige Phase wird mit der wässrigen Phase des vorherigen Zentrifugationsschrittes vereinigt und der gesamte Ansatz mit exakt demselben Volumen vorgewärmtem CTAB III-Puffer versetzt. Es folgt eine Inkubation bei 65°C, bis die DNA in Flocken ausfällt. Dies kann bis zu 1 h dauern oder durch Inku- bation bei 37°C über Nacht erfolgen. Das aus dem anschließenden Zentrifugationsschritt (5 min, 2000 rpm (500 x g), 4°C) resul- tierende Sediment wird mit 250 F1 auf 65°C vorgewärmtem CTAB IV-Puffer versetzt und für mindestens 30 min bzw. bis zur voll- ständigen Auflösung des Sediments bei 65°C inkubiert. Anschließend wird die Lösung zur Fällung der DNA mit 2,5 Volumina eiskaltem Ethanol vermischt und für 1h bei-20°C inkubiert. Alternativ kann der Ansatz mit 0.6 Volumina Isopropanol vermischt und ohne weitere Inkubation sofort für 15 min bei 8,500 rpm (7,500 x g) und 4°C zentrifugiert werden. Die sedimentierte DNA wird durch

Invertieren des Eppendorf-Gefäßes zweimal mit je 1 ml 80% igem eiskaltem Ethanol gewaschen, nach jedem Waschschritt erneut zen- trifugiert (5 min, 8,500 rpm (7,500 x g), 4°C) und anschließend für ca. 15 min luftgetrocknet. Abschließend wird die DNA in 100 jul TE mit 100 fg/ml RNase resuspendiert und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA Lösung ist nach einer weiteren Inkubationsphase über Nacht bei 4°C homogen und kann für weiter- führende Experimente. verwendet werden.

Lösungen für CTAB : Lösung I (für 200 ml) : 100 mM Tris/HCl pH 8,0 (2,42 g) 1,4 M NaCl (16,36 g) 20 mM EDTA (8,0 ml von 0,5 M Stammlösung) 2 % (w/v) CTAB (4,0 g) Jeweils vor der Verwendung werden frisch zugesetzt : 2 % ß-Mercaptoethanol (20 Al für 1 ml Lösung I).

Lösung II (für 200 ml) : 0,7 M NaCl (8,18 g) 10 % (w/v) CTAB (20 g) Lösung III (für 200 ml) : 50 mM Tris/HCl pH 8,0 (1,21 g) 10 mM EDTA (4 ml 0,5 M von 0,5 M Stammlösung) 1 % (w/v) CTAB (2,0 g) Lösung IV (High-salt TE) (für 200 ml) : 10 mM Tris/HCl pH 8,0 (0,242 g) 0,1 mM EDTA (40 Al 0.5 M Stammlösung) 1 M NaCl (11,69 g) Chloroform/Octanol (24 : 1) (für 200 ml) : 192 ml Chloroform 8 ml Octanol Die Mischung wird 2x mit 1 M TrisHCl pH 8,0 ausgeschüttelt und vor Licht geschützt gelagert.

Beispiel 2 : Herstellung von Suppressionskonstrukten Ausgehend von der genomischer Arabidopsis thaliana DNA oder cDNA wurden über PCR mittels der aufgeführten Oligonukleotide folgende Fragmente von Speicherproteinsequenzen amplifiziert. Dabei kam nachfolgendes PCR Protokoll zum Einsatz :

Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 H. L) : 5, 00 LLL Template cDNA oder genomische DNA (ca. 1 Ag) 5, 00 FL 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2 5, 00 FL 2mM dNTP 1, 25 RL je Primer (10 pmol/L) 0, 50 AL Advantage-Polymerase (Clontech) PCR-Programm : Anfangsdenaturierung für 2 min bei 95°C, dann 35 Zy- klen mit 45 sec 95°C, 45 sec 55°C und 2 min 72°C. Abschliessende Extension von 5 min bei 72°C. a) Ausgangsvektor pCR2. 1-AtCRU3-RNAi Aus genomischer Arabidopsis thaliana DNA wird mit nachfolgendem Oligonukleotid-Primerpaar ein Exonbereich mit dem vollständigen anschließenden Intron einschließlich der an das Intron anschlie- ßenden Spleiß-Akzeptorsequenz des 12S Speicherprotein AtCRU3 (Basenpaar 1947 bis 2603 der Sequenz mit der GenBank Acc. -No : U66916) amplifiziert : ONP1 (SEQ ID NO : 134) : 5-ATAAGAATGCGGCCGCGTGTTCCATTTGGCCGGAAACAAC-3' ONP2 (SEQ ID NO : 135) : 5-CCCGGATCCTTCTGTAACATTTGACAAAACATG-3' Das PCR-Produkt wird in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) ge- mäss Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem pCR2. 1-1 Vektor und die Sequenz überprüft.

Für die den antisense-Strang der dsRNA kodierende Sequenz wird aus Arabidopsis thaliana cDNA lediglich das gleiche Exon wie oben (Basenpaar 1947 bis 2384) mit dem nachfolgenden Primerpaar ampli- fiziert : ONP3 (SEQ ID NO : 136) : 5ATAAGAATGCGGCCGCGTGTTCCATTTGGCCGGAAACAAC-3' ONP4 (SEQ ID NO : 137) : 5 ATAAGAATGCGGCCGCGGATCCACCCTGGAGAACGCCACGAGTG-3' Das PCR-Produkt wird in den pCR2. 1-TOPO Vektor (Invitrogen) ge- mäss Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem pCR2.1-2 Vektor und die Sequenz überprüft.

0, 5 Rg von Vektor pCR2. 1-1 werden mit dem Restriktionsenzym BamHI (New England Biolabs) für 2 Stunden nach Herstellerangaben inku- biert und dann für 15 min mit alkalischer Phosphatase (New Eng- land Biolabs) dephosphoryliert. Der so präparierte Vektor (1 FL) wird dann mit dem aus Vektor pCR2.1-2 gewonnenen Fragment li- giert. Dazu werden 0, 5 Rg von Vektor pCR2.1-2 2 Stunden mit BamHI (New England Biolabs) verdaut und die DNA-Fragmente per Gelelek- torphorese aufgetrennt. Das neben dem Vektor (3,9 kb) entstandene 489 bp grosse Stück wird aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem "Gelpurification"-Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben aufgerei- nigt und mit 50 fL Elutionspuffer eluiert. 10 fL des Eluats werden mit Vektor pCR2. 1-1 (s. o. ) über Nacht bei 16°C ligiert (T4 Ligase, New England Biolabs). Die Ligationsprodukte werden dann in TOP10 Zellen (Stratagene) nach Herstellerangaben transformiert und ent- sprechend selektioniert. Positive Klone werden mit dem Primerpaar ONP1 und ONP2 durch PCR verifiziert. Der. erhaltene Vektor wird pCR2. 1-AtCRU3-RNAi genannt. Die für die dsRNA kodierdende Nu- kleinsäuresequenz ist durch SEQ ID NO : 105 beschrieben. b) Ausgangsvektor pCR2.1-AtCRB-RNAi Mit nachfolgendem Oligonukleotid-Primerpaar wird ein Exonbereich des 12S Speicherprotein AtCRB (SEQ ID NO : 117 bzw. 118 ; Basenpaar 601 bis 1874 der Sequenz mit der GenBank Acc.-No : M37248) aus Arabidopsis thaliana cDNA amplifiziert : ONP5 (SEQ ID NO : 138) : 5 ATAAGAATGCGGCCGCGGATCCCTCAGGGTCTTTTCTTGCCCACT-3' ONP6 (SEQ ID NO : 139) : 5-CCGCTCGAGTTTACGGATGGAGCCACGAAG-3' Das PCR-Produkt wird in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen)-ge- mäss Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem pCR2.1-3 Vektor und die Sequenz überprüft.

Für den als Linker fungierenden Bereich wird aus Arabidopsis tha- liana genomischer DNA ein Intron mit den entsprechenden Spliceak- zeptor und-donorsequenzen der flankierenden Exons (Basenpaar 1874 bis 2117 der Sequenz mit der GenBank Acc. -No : M37248) mit dem nachfolgenden Primerpaar amplifiziert : ONP7 (SEQ ID NO : 140) : 5-CCGCTCGAGGTAAGCTCAACAAATCTTTAG-3' ONP8 (SEQ ID NO : 141) : 5-ACGCGTCGACGCGTTCTGCGTGCAAGATATT-3'

Das PCR-Produkt wird in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) ge- mäss Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem pCR2.1-4 Vektor und die Sequenz überprüft.

Das Konstrukt für AtCRB wird in einer ähnlichen Strategie wie für AtCRU3 erläutert, erstellt. Vektor pCR2. 1-3 wird mit mit XhoI (New England Biolabs) für 2 Stunden inkubiert und dephosphory- liert (alkalische Phosphatase, New England Biolabs). Vektor pCR2.1-4 wird ebenfalls mit XhoI in derselben Weise inkubiert und die Gelfragmente per Gelelektrophorese aufgetrennt. Die entspre- chenden Fragmente werden in der unter AtCRU3 beschriebenen Art und Weise aufgereinigt und ligiert, resultierend nach Bakterien- transformation in dem Vektor pCR2.1-AtCRB Exon/Intron. Dieser Vektor wird für 2 Stunden mit XbaI (NEB), anschliessend für 15 min mit Klenow-Fragment (NEB), dann für 2 Stunden mit SalI inku- biert und zuletzt 15 min mit alkalischer Phosphatase (NEB) behan- delt. Parallel wird der Vektor pCR2.1-3 mit BamHI (NEB), dann 15 min mit Klenow-Fragment und anschliessend 2 Stunden mit XhoI (NEB) inkubiert. Das Exon-Fragment von AtCRB wird nach Gelelek- torphorese isoliert, gereinigt und zur Ligation eingesetzt. Beide Fragmente wurden dann ligiert und der Vektor pCR2.1-AtCRB-RNAi resultierte. Der erhaltene Vektor wird pCR2.1-AtCRB-RNAi genannt.

Die für die dsRNA kodierdende Nukleinsäuresequenz ist durch SEQ ID NO : 107 beschrieben. c) Ausgangsvektor pCR2.1-At2S3-RNAi Mit nachfolgendem Oligonukleotid-Primerpaar wird ein Exonbereich des 2S Speicherprotein At2S3 (SEQ ID NO : 3 bzw. 4 ; Basenpaar 212 bis 706 der Sequenz mit der GenBank Acc. -No : M22035) amplifi- ziert : ONP9 (SEQ ID NO : 142) : 5-ATAAGAATGCGGCCGCGGATCCATGGCTAACAAGCTCTTCCTCGTC-3' ONP10 (SEQ ID NO : 143) : 5-ATAAGAATGCGGCCGCGGATCCCTAGTAGTAAGGAGGGAAGAAAG-3' Das PCR-Produkt wird in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) ge- mäss Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem pCR2.1-5 Vektor und die Sequenz überprüft. Für den als Linker fungierenden Bereich wird das gleiche Intron wie unter b) mit den Primern OPN 7 und OPN 8 amplifiziert eingesetzt.

Das Konstrukt für At2S3 wird in einer ähnlichen Strategie wie für AtCRU3 erläutert, erstellt. Vektor pCR2.1-5 wird mit mit XhoI (New England Biolabs) für 2 Stunden inkubiert und dephosphory- liert (alkalische Phosphatase, New England Biolabs). Vektor

pCR2.1-3 werden ebenfalls mit XhoI in derselben Weise inkubiert und die Gelfragmente per Gelelektrophorese aufgetrennt. Die ent- sprechenden Fragmente werden in der unter AtCRU3 beschriebenen Art und Weise aufgereinigt und ligiert, resultierend nach Bakte- rientransformation in dem Vektor pCR2.1-At2S3 Exon/Intron. Dieser Vektor wird für 2 Stunden mit SalI (NEB), anschliessend für 15 min mit Klenow-Fragment (NEB) inkubiert und zuletzt 15 min mit al- kalischer Phosphatase (NEB) behandelt. Parallel wird der Vektor pCR2.1-5 mit BamHI (NEB) und dann 15 min mit Klenow-Fragment in- kubiert. Das Exon-Fragment von At2S3 wird nach Gelelektorphorese isoliert, gereinigt und zur Ligation eingesetzt. Beide Fragmente werden dann ligiert und der Vektor pCR2.1-At2S3-RNAi resultierte.

Die für die dsRNA kodierdende Nukleinsäuresequenz ist durch SEQ ID NO : 109 beschrieben. d) Herstellung von Super-Supressionskonstrukt 1 Die Vektoren pCR2.1-AtCRU3-RNAi und pCR2.1-4 (siehe oben) werden mit den Restriktionsenzymen XhoI und SalI für 2 Stunden bei 37°C inkubiert, die DNA-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese auf- getrennt und sowohl der Vektor als auch das PCR-Insert aus pCR2. 1-4 ausgeschnitten und mit dem"Gelpurification"-Kit von Qiagen nach Herstellerangaben aufgereinigt und mit 50 AL Eluti- onspuffer eluiert. Vom Vektor wird 1 p. L, vom PCR-Insert aus pCR2.1-4 8 AL der Eluate für die Ligation eingesetzt, resultie- rend in dem Konstrukt pCR2.1-sRNAil. Dieser Vektor wird für 2 Stunden mit dem Restriktionsenzym XhoI und dann für 15 min mit Klenow-Fragment inkubiert.

Der Vektor pCR2.1-AtCRB-RNAi (siehe oben) wird mit dem Enzym EcoRI für 2 Stunden inkubiert und ebenfalls 15 min mit Klenow- Fragement behandelt. Beide Inkubationsansätze werden durch Gel- elektrophorese aufgetrennt und jeweils der Vektor (pCR2. 1-sRNAil) bzw. das Insert (aus pCR2.1-AtCRB-RNAi) aus dem Agarosegel ausge- schnitten und die DNA-Fragmente wie oben beschrieben aufgerei- nigt. Für die Ligation werden 1 pL des Eluates vom Vektor und 8 FL des Eluates vom Insert eingesetzt und bei 4°C über Nacht inku- biert. Das resultierende Konstrukt wird mit pCR2.1-sRNAi2 be- zeichnet. Der resultierende Vektor wird mit dem Enzym XbaI und anschliessend mit Klenow-Fragment inkubiert. Der Vektor pCR2.1-4 wird mit den Enzymen EcoRV und XbaI und anschliessend mit Klenow- Fragment inkubiert. Nach Gelelektrophorese und-reinigung wird das Fragment aus pCR2.1-4 mit dem Vektor pCR2.1-sRNAi2 ligiert, resultierend in dem Konstrukt pCR2. 1-sRNAi3. Der resultierende Vektor wird dann mit dem Enzym ApaI für 2 Stunden und dann mit Klenow-Fragment für 15 min inkubiert. Als Insert wird der Vektor pCR2.1-At2S3-RNAi mit dem Enzym EcoRI für 2 Stunden und dann mit

Klenow-Fragment für 15 min inkubiert. Nach Gelelektrophorese und - reinigung werden die Eluate ligiert, resultierend in dem Vektor pCR2. 1-sRNAi4. Aus diesem Vektor wird dann das sRNAi4-Fragment (SEQ ID NO : 144 ; vgl. Fig. 1 (1)), kodierend für die super-suppri- mierende dsRNA, durch Inkubation mit HindIII und PvuI ausge- schnitten und in den binären Vektor pSUN-USP (SEQ ID NO : 179) li- giert. Das Konstrukt dient der gleichzeitigen Suppression von Arabidopsis thaliana Speicherproteinen CRB (SEQ ID NO : 4), CRU3 (SEQ ID NO : 112) und At2S3 (SEQ ID NO : 118).

Der verwendete Vektor pSUN-USP ist ein binärer Vektor zur Pflan- zentransformation auf Basis von pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Science 66 : 221-230). Eine gewebespezifische Expres- sion Im Samen läßt sich unter Verwendung des gewebespezifischen Promotors USP-Promotors erzielt. e) Herstellung von Super-Supressionskonstrukt 2 Ausgehend von Arabidopsis thaliana cDNA wird ein Fragment aus dem Speicherprotein AtCRU3 (SEQ ID NO : 111,112) mit dem nachfolgen- den Oligonukleotid-Primerpaar unter den in Beispiel 2 angegebenen PCR-Bedingungen amplifiziert : OPN 11 : 5'-AAAAGGCCTGTGTTCCATTTGGCCGGAAACAAC-3' (SEQ ID NO : 148) OPN 12 : 5-AAAGATATCACCCTGGAGAACGCCACGAGTG-3' (SEQ ID NO : 149).

Das erhaltene Fragment wird in den Vektor pCR2.1-TOPO Vektor (In- vitrogen) gemäss Herstellerangaben kloniert, resultierend in den pCR2.1-6 und die Sequenzen überprüft.

Ausgehend von Arabidopsis thäliana cDNA wird ein Fargment aus dem Speicherprotein At2S3 (SEQ ID NO : 3,4) mit dem nachfolgenden Oligonukleotid-Primerpaar unter den in Beispiel 2 angegebenen PCR-Bedingungen amplifiziert : OPN 13 : 5-AAAAGGCCTATGGCTAACAAGCTCTTCCTCGTC-3' (SEQ ID NO : 150) OPN 14 : 5-AAAGATATCCTAGTAGTAAGGAGGGAAGAAAG-3' (SEQ ID NO : 151).

Das erhaltene Fragment wird in den Vektor pCR2. 1-TOPO Vektor (In- vitrogen) gemäss Herstellerangaben kloniert, resultierend in den pCR2.1-7 und die Sequenzen überprüft.

Aus den pCR2.1-3, pCR2.1-4 (siehe Beispiel 2) und pCR2.1-6 und pCR2.1-7 werden dann die Konstrukte folgendermassen zusammen li- giert : Der Vektor pCR2.1-3 wird 2 Stunden mit EcoRV inkubiert und anschliessend 15 min mit alkalischer Phosphatase dephosphory- liert. Der Vektor pCR2.1-6 wird mit den Enzymen StuI und EcoRV

für 2 Stunden inkubiert und das PCR-Insert über Gelelektrophorese und-reinigung isoliert. Vektor pCR2.1-3 und Insert aus pCR2.1-6 werden dann. über Nacht bei 4°C ligiert, resultierend in dem Kon- strukt pCR2. 1-sRNAi5. Dieser Vektor wird dann mit EcoRV inkubiert und dephosphoryliert-und mit dem StuI/EcoRV inkubierten und ge- laufgereinigten Fragment aus pCR2.1-7 ligiert, resultierend in dem Konstrukt pCR2.1-sRNAi6. Dieser Vektor wird dann mit XhoI in- kubiert und dephosphoryliert. Der Vektor pCR2.1-4 wird mit SalI und XhoI inkubiert und das Insert aus pCR2.1-4 mit dem vorberei- teten Vektor pCR2.1-sRNAi6 ligiert, resultierend in dem Konstrukt pCR2.1-sRNAi7. Ausgehend von pCR2.1-sRNAi7 wird eine PCR mit den nachfolgenden Primerpaar unter den in Beispiel 2 gegebenen Bedin- gungen durchgeführt : OPN 15 : 5 CCGCTCGAGCTCAGGGTCTTTTCTTGCCCACT (SEQ ID NO : 152) OPN 16 : 5-CCGGTCGACCTAGTAGTAAGGAGGGAAGAAAG. (SEQ IDNO : 153).

Das resultierende PCR-Produkt wird mit den Enzymen XhoI und SalI inkubiert. Das Fragment wird dann in den Vektor pCR2.1-sRNAi7 (inkubiert mit XhoI) ligiert, resultierend in dem Konstrukt pCR2.1-sRNAi8. Aus diesem Vektor wird dann das sRNAi8-Fragment (SEQ ID NO : 146 ; vgl. Fig. 1 (2)), kodierend für die super-suppri- mierende dsRNA, durch Inkubation mit HindIII und XbaI ausge- schnitten und in den binären Vektor pSUN-USP (SEQ ID NO : 179) li- giert. Das Konstrukt dient der gleichzeitigen Suppression von Arabidopsis thaliana Speicherproteinen CRB (SEQ ID NO : 4), CRU3.

(SEQ ID NO : 112) und At2S3 (SEQ ID NO : 118).

Beispiel 3 : Transformation von Agrobacterium Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung der Agrobacterium tumefaciens-Stämme GV3101 (pMP90) (Koncz und Schell (1986) Mol Gen Genet 204 : 383- 396) oder LBA4404 (Clontech) durchgeführt werden. Die Transfor- mation kann durch Standard-Transformationstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al. (1984) Nucl Acids Res 13 : 4777-4788).

Beispiel 4 : Pflanzentransformation Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann unter Verwendung von Standard-Transformations-und Regenerationstechni- ken durchgeführt werden (Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht : Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur : BT11-P ISBN 0-7923-2731-4 ; Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods

in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton : CRC Press, 1993,360 S., ISBN 0-8493-5164-2).

Die Transformation mittels Agrobacterium von Arabisopsis thaliana wird durch die Methode nach Bechthold et al., 1993 (C. R. Acad.

Sci. Ser. III Sci. Vie., 316,1194-1199) durchgeführt.

Beispielsweise kann Raps mittels Kotyledonen-oder Hypokotyl- transformation transformiert werden (Moloney et al., Plant Cell Report 8 (1989) 238-242 ; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989) 694-701). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobac- terium-und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transforma- tion verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab. Die Rapsselektion wird gewöhnlich unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker durchgeführt.

Der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer in Lein (Linum usita- tissimum) läßt sich unter Verwendung von beispielsweise einer von Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13 : 282-285 beschriebe- nen Technik durchführen.

Die Transformation von Soja kann unter Verwendung von beispiels- weise einer in EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) oder in EP-A-0 0397 687, US 5,376, 543, US 5,169, 770 (University Toledo) beschriebenen Technik durchgeführt werden.

Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchenbe- schuß, Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder über die Siliziumcarbonatfaser-Technik ist beispielsweise beschrieben von Freeling und Walbot"The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York).

Beispiel 5 : Untersuchung. der Expression eines rekombinanten Genproduktes in einem transformierten Organismus Die Aktivität eines rekombinanten Genproduktes im transformierten Wirtsorganismus wurde auf der Transkriptions-und/oder der Translationsebene gemessen.

Ein geeignetes Verfahren zur-Bestimmung der Menge an Transkrip- tion des Gens (ein Hinweis auf die Menge an RNA, die für die Tranlation des Genproduktes zur Verfügung steht) ist die Durch- führung eines Northern-Blots wie unten ausgeführt (als Bezugs- stelle siehe Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley : New York, oder den oben erwähnten Beispielteil), wobei ein Primer, der so gestaltet ist, daß er an das Gen von In- teresse bindet, mit einer nachweisbaren Markierung (gewöhnlich radioaktiv oder chemilumineszent) markiert wird, so daß, wenn die

Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix transferiert und mit dieser Sonde inkubiert wird, die Bindung und das Ausmaß der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge der mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information zeigt den Grad der Transkription des transformierten Gens an. Zelluläre Gesamt-RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen mit mehreren Verfahren, die alle im Fachge- biet bekannt sind, wie zum Beispiel das von Bormann, E. R., et al.

(1992) Mol. Microbiol. 6 : 317-326 beschriebene, präpariert werden.

Northern-Hybridisierung : Für die RNA-Hybridisierung wurden 20 Ag Gesamt-RNA oder 1 Ag poly (A) +-RNA mittels Gelelektrophorese in Agarosegelen mit ei- ner Stärke von 1,25 % unter Verwendung von Formaldehyd, wie be- schrieben in Amasino (1986, Anal. Biochem. 152,304) aufgetrennt, mittels Kapillaranziehung unter Verwendung von 10 x SSC auf posi- tiv geladene Nylonmembranen (Hybond N+, Amersham, Braunschweig) übertragen, mittels W-Licht immobilisiert und 3 Stunden bei 68°C unter Verwendung von Hybridisierungspuffer (10 % Dextransulfat Gew. /Vol., 1 M NaC1, 1. % SDS, 100 mg Heringssperma-DNA) vorhybri- disiert. Die Markierung der DNA-Sonde mit dem Highprime DNA labe- ling-Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) erfolgte während der Vor- hybridisierung unter Verwendung von alpha-32P-dCTP (Amersham Phar- macia, Braunschweig, Deutschland). Die Hybridisierung wurde nach Zugabe der markierten DNA-Sonde im gleichen Puffer bei 68°C über Nacht durchgeführt. Die Waschschritte wurden zweimal für 15 min unter Verwendung von 2 X SSC und zweimal für 30 min unter Verwen- dung von 1 X SSC, 1 % SDS, bei 68°C durchgeführt. Die Exposition der verschlossenen Filter wurde bei-70°C für einen Zeitraum von 1 bis 14 T durchgeführt.

Zur Untersuchung des Vorliegens oder der relativen Menge an von dieser mRNA translatiertem Protein können Standardtechniken, wie ein Western-Blot, eingesetzt werden (siehe beispielsweise Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley : New York). Bei diesem Verfahren werden die zellulären Gesamt-Pro- teine extrahiert, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Matrix, wie Nitrozellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, der spezifisch an das gewünschte Protein bin- det, inkubiert. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumi- neszenten oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen läßt. Das Vorliegen und die Menge der beobach- teten Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gewünsch- ten, in der Zelle vorliegenden mutierten Proteins an.

Beispiel 6 : Analyse der Auswirkung der rekombinanten Proteine auf die Produktion des gewünschten Produktes Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen, Pilzen, Algen, Ciliaten oder auf die Produktion einer gewünschten Verbin- dung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modi- fizierten Mikroorganismen oder die modifizierte Pflanze unter ge- eigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d. h. von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünn- schichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzyma- tische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromato- graphie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd.

A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH : Weinheim (1985) ; Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry"in : Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17 ; Rehm et <BR> <BR> al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III : "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH : Weinheim ; Belter, P. A., et al. (1988) Bioseparations : downstream processing for Biotechnö- logy, John Wiley and Sons ; Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S.

(1992) Recovery processes for biological Materials ; John Wiley and Sons ; Shaeiwitz, J. A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Se- parations, in : Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3 ; Kapitel 11, S. 1-27, VCH : Weinheim ; und Dechow, F. J.

(1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 96 (22) : 12935-12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152 : 141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid-oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/ Scotland : Oily Press (Oily Press Lipid Library ; 2) ; Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide- Ayr, Scotland : Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library ; 1) ;"Progress in Lipid Research, Oxford : <BR> <BR> Pergamon Press, 1 (1952) -16 (1977) u. d. T. : Progress in the Che- mistry of Fats and Other Lipids CODEN.

Zusätzlich zur Messung des Endproduktes der Fermentation ist es auch möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu ana- lysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen-und Nebenprodukte, um die Gesamteffizienz

der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (z. B. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Io- nen), Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion üblicher Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Mi- crobial Physiology ; A Practical Approach, P. M. Rhodes und P. F.

Stanbury, Hrsgb., IRL Press, S. 103-129 ; 131-163 und 165-192 (ISBN : 0199635773) und darin angegebenen Literaturstellen be- schrieben.

Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen : FAME, Fettsäuremethylester ; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie-Mas- senspektrometrie ; TAG, Triacylglycerin ; TLC, Dünnschichtchromato- graphie).

Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäureproduk- ten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard- Analyseverfahren erhalten werden : GC, GC-MS oder TLC, wie ver- schiedentlich beschrieben von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in : Advances on Lipid Methodology, Vierte Aufl. : Christie, Oily Press, Dundee, 119-169 ; 1998, Gaschromatographie- Massenspektrometrie-Verfahren, Lipide 33 : 343-353).

Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Mate- rial muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2 % Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten Öl-und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethy- lester werden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC- Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fu- sed Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Tempera- turgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethyle- ster muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d. h. Sigma), definiert werden.

Für die Öl-Analyse der mit den Supressionskonstrukten transfor- mierten Arabidopsis Pflanzen wird folgendes Protokoll angewendet :

Die Extraktion der Lipide aus Samen wird nach der Methode von Bligh & Dyer (1959) Can J Biochem Physiol 37 : 911 durchgeführt.

Dazu werden 5 mg Arabidopsis Samen in 1,2 ml Qiagen-Microtubes (Qiagen, Hilden) auf einer Sartorius (Göttingen) Mikrowaage abge- wogen. Das Samenmaterial wird mit 500 uL Chloroform/Methanol (2 : 1 ; enthält Mono-C17-glycerin von Sigma als internen Standard) in der Rätschmühle MM300 der Firma Retsch (Haan) homogenisiert und 20 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 500 uL 50 mM Kalium- phosphatpuffer pH 7,5 erfolgt die Phasentrennung. Von der organi- schen Phase werden 50 AL abgenommen, mit 1500 uL Chloroform ver- dünnt und 5 FL auf die Kapillaren Chromarods SIII der Firma Ia- troscan (SKS, Bechenheim) aufgetragen. Nach Auftrag der Proben werden diese für 15 min in einer Dünnschichtkammer, die gesättigt ist mit 6 : 2 : 2 Chloroform : Methanol : Toluol in einem ersten Schritt aufgetrennt. Nach Ablauf der Zeit werden die Kapillaren 4 min bei Raumtemperatur getrocknet und dann für 22 min in eine Dünnschichtkammer, die gesättigt ist mit 7 : 3 n-Hexan : Dieethyle- ther gestellt. Nach einem weiteren Trocknungsschritt für 4 min bei Raumtemperatur werden die Proben in einem Iatroscan MK-5 (SKS, Bechenheim) entsprechend Fraser & Taggart, 1988 J. Chroma- togr. 439 : 404 analysiert. Folgende Parameter wurden für die Mes- sungen eingestellt : Slice width 50 msec, Treshold 20 mV, Noise 30, Skim ratio 0. Die Quantifizierung der Daten erfolgte anhand des internen Standards Mono-C17-glycerin (Sigma) sowie einer er- stellten Eichkurve mit Tri-C17-glycerin (Sigma) mittels des Pro- gramms ChromStar {SKS, Beichenheim).

Für die quantitative Bestimmung der Ölgehalte werden Samen von jeweils 10 Pflanzen derselben unabhängigen transgenen Linie ana- lysiert. Insgesamt wurde der Ölgehalt von 30 transgene Linien der T1 Generation, 10 transgene Linien mit je 10 Pflanzen der T2 Ge- neration und 5 transgene Linien mit je 10 Pflanzen der T3 Linien bestimmt. Dabei zeigen die transgenen Pflanzen einen signifikant höheren Ölgehalt als entsprechend gleichbehandelte Kontrollpflan- zen.

Beispiel 7 : Zum Nachweis der Funktionalität der multiplen RNAi Konstrukte wurden Gene ausgewählt, deren Supression einen deutlichen phäno- logischen Effekt hervorrufen. Ein solches Gen ist zum Beispiel Toc159. Dieses Gen ist essentiell für die Entwicklung und Funk- tionalität von Chloroplasten in Arabidopsis (Bauer et al. Nature, 403,203-207). Ein Ausschalten dieses Gens führt zu chlorophyll- defizienten Pflanzen, deren Blatt-Erscheinungsbild dann hell-grün bis weiss ist. Dieser Albino-Phänotyp ist sehr leicht zu unter- scheiden von normalen Pflanzen.

Als weiteres visuelles Reprotergen wurde GFP, das grün-fluores- zierende Protein aus der Qualle Aequorea victoria eingesetzt.

Dieses Reportergen ist ein häufig verwendetes Reportergen in Pflanzen (siehe z. B. Stewart, Plant Cell Rep 2001 20 (5) : 376-82).

Ausgehend von Arabidopsis thaliana cDNA oder vom Plasmid pEGFP (BD Clontech, Heidelberg, Genbank-Eintrag U476561) wurde über PCR mittels der aufgeführten Oligonukleotide erzeugt. Dabei wurde folgendes Protokoll eingesetzt : Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 LLL) : 5, 00 AL Template cDNA oder genomische DNA (ca. 1 Ag) 5, 00 FL 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl2 5, 00 gel 2mM dNTP 1, 25 AL je Primer (10 pmol/FL) 0,50 AL Advantage-Polymerase (Clontech) PCR-Programm : Anfangsdenaturierung für 2 min bei 95°C, dann 35 Zy- klen mit 45 sec 95°C, 45 sec 55°C und 2 min 72°C. Abschliessende Extension von 5 min bei 72°C. a) Ausgangsvektor pGEM-Toc159 : Ausgehend von Arabidopsis cDNA wurde mit nachfolgendem Oligonukleotid-Primerpaar ein Fragment aus Tocl59 (Genbank Acc. -No. T14P8.24) amplifiziert : ONP18 (SEQ ID NO : 123) : 5-CTCGAGGAATTCATGGACTCAAAGTCGGTTACTCCA ONP19 (SEQ ID NO : 124) : 5-GGATCCATAAGCAAGCTTTCTCACTCTCCCCATCTGTGGA Das PCR Produkt wurde in den Vektor pGEM-T easy von Promega (Mannheim) gemäss Herstellerangaben kloniert, resultierend in. dem pGEM-Toc159 Vektor und die Sequenz überprüft. b) Ausgangsvektor pGEM-GFP : Ausgehend von dem Plasmid pEGFP (BD Clontech, Heidelberg, GenbankAcc. -No. : U476561) wurde mit nach- folgendem Oligonukleotid-Primerpaar ein Fragment aus GFP amplifi- ziert : ONP20 (SEQ ID NO : 125) : 5-AAGCTTCCAACACTTGTCACTACTTT ONP21 (SEQ ID NO : 126) : 5-GGATCCTTAAAGCTCATCATGTTTGT Das PCR Produkt wurde in den Vektor pGEM-T easy von Promega (Mannheim) gemäss Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem pGEM-GFP Vektor und die Sequenz überprüft.

c) Herstellung des Konstruktes pGEM-159-GFP Der Vektor pGEM-GFP wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI für 2 Stunden inkubiert. Parallel wurde der Vektor pGEM-Toc159 mit den gleichen Restriktionsenzymen inkubiert, anschliessend dann zusätzlich für 15 min mit alkalischer Phosphatase behandelt. Die alkalische Phosphatase wurde anschliessend durch Erhitzen auf 95 oC für 10 min inaktiviert. Die entstandenen DNA-Fragmente aus beiden Ansät- zen wurden über Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Das 558 bp Fragment aus pGEM-GFP sowie das 3471 bp Fragment von pGEM-Tocl59 wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem"Gelpurifica- tion"-Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben aufgereinigt. Beide Fragmente wurden für 2 h bei 16°C ligiert (T4 Ligase, New England Biolabs) und anschliessend nach Herstellerangaben in E. coli DH5a Zellen (Stratagen) transformiert. Positive Klone wurden durch PCR mit dem Primerpaar OPN1 und OPN4 identifiziert und anschliessend verifiziert durch Sequenzierung. Der erhaltene Vektor wurde mit pGEM-159-GFP bezeichnet. d) Herstellung des Supressionskonstruktes 1 : Der Vektor pGEM-159-GFP wurde einerseits mit den Restriktionsenzymen XhoI und BamHI, ein weiterer Ansatz mit BamHI und SalI inkubiert. Der zweite Ansatz mit BamHI/SalI wurde anschliessend für weitere 15 min mit alkalischer Phosphatase inkubiert. Die DNA-Fragmente aus beiden Ansätzen wurden über Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und folgende Fragmente ausgeschnitten : Ansatz BamHI-XhoI das 1091 bp Fragment ; Ansatz BamHI-SalI das 4029 bp Fragment. Beide Frag- mente wurden nach Aufreinigung aus dem Agarose-Gel (siehe oben) für 2 h bei 16°C mit T4 Ligase inkubiert und anschliessend in E. coli DH5a Zellen (Stratagen) transformiert. Positive Klone wurden durch PCR mit dem Primerpaar OPN1 identifiziert und anschliessend verifiziert durch Sequenzierung. Der erhaltene Vektor wurde als Supressionskonstrukt 1 bezeichnet. e) Herstellung des Supressionskonstruktes 2 : Das Supressionskon- strukt 1 und der Vektor p3300.1 (Andreas Hilbrunner, Dissertation ETH Zürich, 2003) wurden für 2h Stunden mit dem Restriktionsenzym EcoRI inkubiert. Anschliessend wurde der Vektor p3300.1 15 min mit alkalischer Phosphatase behandelt. Beide Ansätze wurden ge- mischt und für 2 h bei 16°C mit T4 Ligase inkubiert. Der Ligati- onsansatz wurde dann in E. coli DH5a Zellen (Stratagen) transfor- miert. Das entstandene Supressionskonstrukt 2 wurde dann für die Agrobacterium-und Pflanzentransformation eingesetzt. Die Nu- kleinsäuresequenz kodierend für Supressionskonstrukt 2 (p3300. 1-Tocl59-GFP-RNAi) ist unter SEQ ID NO : 122 wiedergegeben.

Die Transformtion von Agrobakterien und Pflanzen wurde wie in Beispiel 3 bzw. 4 beschrieben durchgeführt. Zum Nachweis der Funktionalität des Supressionskonstruktes 2 wurde dieses durch die nach Bechtold et al., 1993 (C. R. Acad. Sci. Ser. III Sci.

Vie.,. 316,1194-1199) beschriebene Blüten-Transformationsmethode in Arabidopsis transformiert. Aus Ausgangsmaterial wurden Arabi- dopsis Pflanzen der Varietät Columbia-0 verwendet, die bereits die T-DNA des binären Vektors pBIN-35S-GFP enthielten.

Durch Anregung durch ultraviolettes Licht im Wellenlängenbereich 470-490 nm die grüne Fluoreszenz von GFP in diesen Pflanzen ange- regt werden und damit die Expression des eingebrachten Transgens überprüft werden. Dazu wurden Keimlinge 1 Woche nach Keimung oder Blattstücke bei älteren Pflanzen mit dem Fluoreszenzmikroskop MZFLIII von Leica analysiert. Zur Anregung von GFP wurden fol- gende Parameter eingestellt : Quecksilberlampe HBO 100W/DC, Filter GFP3, Bildbearbeitung Leica-Software. Speziell die Verwendung ei- nes Filters (GFP3), der oberhalb einer Wellenlänge von 525 nm nicht mehr durchlässig ist, ermöglicht die GFP-Analyse von grünen Blattmaterial. Ohne diesen Filter könnte die starke Autofluores- zenz des Blattfarbstoffes Chlorophyll nicht ausgeschlossen wer- den. Die zur Transformation verwendete Arabidopsis Linie zeigte eine starke GFP Expression nach mikroskopischer Analyse.

Transformierte Samen wurden direkt auf Erde ausgelegt und angezo- gen. Nach einer Woche wurde nach Keimlingen gesucht, die keinen oder einen reduzierten Anteil des Blattfarbstoffes Chlorophyll enthielten. Solche Pflanzen waren leicht an ihrer hellgrünen oder weisen Erscheinungsbild zu erkennen. Diese Pflanzen wurden dann weiter durch Fluoreszenz-Mikroskopie untersucht und mit entspre- chend parallel gewachsenen grünen Pflanzen verglichen. Fig. 5A zeigt beispielhaft ein solche identifizierte Pflanze, die sich deutlich in der Farbe der Blätter von parallel gewachsenen Pflan- zen unterscheidet. Dabei ist der Albino-Phänotyp (weisse Blätter) auf die Wirkung des Tocl59-Supressionskonstrukts zurückzuführen.

Die nicht transformierten Nachkommen der mit Agrobacerium-Suspen- sion behandelten Pflanzen zeigen den Albino-Phänotyp nicht. Der auftretende Albino-Phänotyp ist damit ein spezifischer Effekt des eingebrachten Supressionskonstruktes.

Die Fluoreszenz-mikroskopische Untersuchung der Albino-Pflanzen zeigte dann (Fig. 5B), dass keine GFP-Signale in solchen Pflanzen gefunden werden konnte. Im Vergleich dazu zeigten die parallel gewachsenen grünen Pflanzen deutliche GFP Signale. Die Abwesen- heit des GFP-Signals in allen identifizierten Albino-Pflanzen de- monstriert die Funktionalität des Supressionskonstruktes, denn nur die mit dem Supressionkonstrukt transformierten Pflanzen

zeigten keine GFP-Signale mehr. Es konnte keine Segregation der beiden angestrebten Phänotypen beobachtet werden. Damit konnte gezeigt werden, dass durch Verwendung von nur einem Kontrollele- ment (Promotor) zwei funktionell völlig unterschiedliche Gene, die ihrerseits durch unterschiedliche Kontrollelemente in ihrer Expression reguliert werden, ausgeschaltet werden konnten.