\¥0 2020/175451 1 卩（：17 2020 /007391 明 細 書

発明の名称 ： 環状べプチド系抗菌化合物

技術分野

[0001 ] 本発明は、 新規のぺプチド系化合物及びそのスクリーニ ング方法に関する 。 具体的には、 メナキノン等に作用し、 抗菌作用を示すペプチド系化合物及 び当該ペプチド系化合物を含む薬学的組成物 に関する。 また、 本発明は、 細 菌膜に存在する物質と相互作用して抗菌活性 を示すぺプチド系化合物のスク リーニング方法に関する。

背景技術

[0002] 近年、 多様な耐性菌の出現が報告されており、 従来の抗生物質とは異なる 作用機序並びに、 従来よりも低濃度で抗菌活性及び治療効果を 示す化合物の 創出が求められている。 また、 新規作用機序を示す化合物として、 メナキノ ン結合性抗生物質の存在が報告されているが 、 これらの抗生物質は、 抗菌活 性を示す濃度が十分低いとは言えず、 意図しない副作用等を誘発する可能性 が高まる。

[0003] 近年、 パクテリア膜に存在するメナキノンと相互作 用し抗菌活性を示す化 合物としてライソシン巳が発見され、 この物質は真核生物に対しては無害で ある （非特許文献 1） 。 この物質の作用機序は既知の抗生物質の作用 機序と は異なり、 細菌の呼吸鎖に不可欠な要素であるメナキノ ンとの選択的相互作 用により、 細菌膜の機能的完全性を破壊することが知ら れている。

ライソシン巳はメシチリン耐性ブドウ球菌に 対して有効であることが知ら れているが （非特許文献 2） 、 より高い抗菌活性を示す化合物の開発は引き 続き重要である。

[0004] 一方、 メナキノン結合性べプチド化合物を迅速に合 成 ·選出する方法は報 告されていない。 個別の化合物の合成及び特性の調査には長大 な時間を要す るため、 スクリーニングとして要求されるレベルを満 たすものではない。 先行技術文献 \¥02020/175451 2 卩（：17 2020 /007391 特許文献

[0005] 特許文献 1 :特開 201 4-2 1 7322号公報

非特許文献

[0006] 非特許文献 1 : Hamamoto H, Urai M, Ishii K, Yasukawa J, Paudel A, Murai

M, Kaj i T, Kuranaga T, Hamase K, Katsu T, Su J, Adachi T, Uchida R, Tomoda H, Yamada M, Souma M, Kur i hara H, Inoue M, Sekimi zu. Nat. Chem

. 6 ^' |〇1. 2015, 11 (2): 127-133.

非特許文献 2 : Murai 1门〇 1 Int. Ec!· 已叩し 2015、 54 (5) : 1556-1560

発明の概要

発明が解決しようとする課題

[0007] 本発明は、 優れたメナキノン結合能を示し、 優れた抗菌活性を示すぺプチ ド系抗菌化合物及びそのスクリーニング方法 を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段

[0008] 即ち、 本発明は、

[1 ] 以下の一般式 (丨 ) で表される化合物又はその塩。

〇 2020/175451 卩(：170? 2020 /007391

（—般式 （丨） において、

基から選択され；

水素原子、 炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒド ロキシ基を表す）

は、 同一又は異なっていてもよく、 各々独 立して、 水素原子、 炭素数 1〜 3のアルキル基を表し、 各出現におい て同一又は異なっていてもよく、 各々独立して、 水素原子又は炭素数 1〜 3 のアルキル基を表し、 は、 〇〜 2の整数を表す）

〇 2020/175451 4 卩(：170? 2020 /007391

(5)

（式 （5） において、 水素原子、 炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒ ドロキシ基を表す）

（式 （6） において、 ［¾ は、 水素原子、 炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒ ドロキシ基を表し、 は、 存在する場合は、 ベンゼン環上に存在する同一 又は異なる一価の置換基を表し、

又は

炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基

式 （1） 〜 （6） において、 -は結合部位を表す：

であり ：

る置換基から選択され：

(4)

は、 水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表す 20/175451 5 卩（：170? 2020 /007391

（式 （6） において、 ［¾ は、 水素原子、 炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒ ドロキシ基を表し、 は、 存在する場合は、 ベンゼン環上に存在する同一 又

（式 （7） において、 ［¾ ¹³ 、 同一又は異なっていてもよく 、 各々独立して、 水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表す） 又は

（式 （8） において は、 水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表し、 8 ¹⁷ は、 水素原子、 炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒドロキシ基を表す） 式 （1） 、 （4） 、 （6） 、 （7） 〜 （8） において、 -は結合部位 を表す：

ブチル基である。 ）

（4） で表される基であって、 かつ

、 で表される基であって、

物は除く。 〇 2020/175451 6 卩(：170? 2020 /007391

は、 以下で表される置換基から選択される、 ［1］ に記載の化合物又は その塩。

（但し、 ¹ が 3で表される置換基であり、 かつ、 ³ が 0で表される置換基 である化合物は除く。 ）

［3］ の組み合わせが以下の組み合わせから選択さ れる、 ［1］ 又は ［2］ に記載の化合物又はその塩。

（ 、 ： （八、 0） 、 （八、 V） 、 （＜、 V） 、 （V、 〇） 、 V） 、 （V、 0） 、 （丫、 〇） 、 （丫、 0） 、 （丫、 V） （1\1、 0） 、 （V 、 丫） 、 （V、 3） （1\1、 V） 、 （1\1、 0） 、 ⑴、 0） 、 ⑴、 丫） 、 （

〇, V）

ここで、 V、 0、 ［＜、 3、 1\1、 丫、 八、 〇、 0は、 請求項 2で定義した通り 20/175451 7 卩（：170? 2020 /007391

である。

[4] ( I ) が炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、 が式 (8) で表される置換基である、 (丨 丨 ) が炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基で あり、 (1 ) で表される置換基である、 又は、 (丨 丨 丨 ) ( 3) で表される置換基であり、 が式 (1 ) で表される置換基である、 [1 ] に記載の化合物又はその塩。

[5] [1 ] 〜 [4] のいずれか 1項に記載の化合物又はその薬学的に許容 される塩を含む、 感染症を治療するための薬学的組成物。

[6] [1 ] 〜 [4] のいずれか 1項に記載の化合物又はその薬学的に許容 される塩を含む抗菌剤。

[7] 細菌膜に存在する物質 と相互作用して抗菌活性を示すぺプチド系の 候補化合物のスクリーニング方法であって、

以下の工程：

( 1 ) 物質八と相互作用して抗菌活性を示すことが 知られているぺプチド系 化合物の類似化合物のライブラリーを提供す ること ；

(2) 前記ライブラリー中の類似化合物を物質 と接触させて、 各々の類似 化合物と物質 との錯体を形成させること ；

(3) (2) で得られた類似化合物と物質 との個々の錯体を分配し、 溶媒 を添加することにより当該錯体から物質 を溶離させること ；

(4) 各々の錯体から得られた各溶離液を採取して 、 各々の類似化合物につ いての物質 と錯体を形成した程度を分析すること ：

(5) 溶離液を採集した後に残った各々の類似化合 物を回収し、 各類似化合 物の抗菌活性を測定すること ；

を含む、 前記スクリーニング方法。

[8] 前記化合物八がメナキノンである、 [7] に記載のスクリーニング方 法。

[9] (4) の工程において、 各々の錯体から得られた溶離液の蛍光を測定 することにより、 各々の類似化合物についての物質 と錯体を形成した程度 〇 2020/175451 8 卩（：170? 2020 /007391

を分析する、 ［7］ 又は ［8］ に記載のスクリーニング方法。

［1 0］ 前記類似化合物が、 ビーズ結合型ペプチドである、 ［7］ 〜 ［9］ のいずれか 1項に記載のスクリーニング方法。

［1 1］ 類似化合物のライブラリーが、 〇巳〇（3法を用いて調製される、 ［ 1 0］ に記載のスクリーニング方法。

［1 2］ 物質 と相互作用して抗菌活性を示すことが知られ ているペプチド 系化合物が、 ライソシン巳である、 ［7］ 〜 ［1 1］ のいずれか 1項に記載 のスクリーニング方法。

を提供するものである。

発明の効果

［0009］ 本発明により、 優れたメナキノン結合能を示し、 優れた抗菌活性を示すぺ プチド系抗菌化合物を提供することができる 。

更に、 本発明により、 細菌膜に存在する物質と相互作用して抗菌活 性を示 すべプチド系化合物を有効にスクリーニング することができる方法を提供す ることができる。

図面の簡単な説明

［0010］ ［図 1］ライソシン巳の構造

［図 2］本発明のスクリーニング方法の基本的な� �キームを示す。

［図 33］ライソシン巳を基準化合物として〇巳〇� ��3法により類似化合物を合成 する概略図

［図 31）］ライソシン巳を基準化合物として〇巳� ��（3法により類似化合物を合成 する概略図

［図 4］ライソシン巳を用いたスクリーニング方� �の全体的模式図を示す。

［図 5］ビーズ結合型ライソシン巳の合成スキー� �

［図 6］ビーズ結合型ペプチド 3 0、 巳 1_ 1、 および巳 !_ 2の蛍光強度の測 定糸！］: ^

［図 7］ライソシン巳のメナキノン錯体形成アツ� �イ及び抗菌アツセイの測定結 果 〇 2020/175451 9 卩（：170? 2020 /007391

［図 8］ライソシン巳に基づく〇巳〇〇ライブラ� �ーの構築のスキーム

［図 9］ビーズ結合型ライソシン巳類似体のメナ� �ノンー複合体形成アッセイに よる化合物選定の模式図

［図 10］ビーズからのべプチドの開裂の手順の模� ��図

［図 1 1］ライソシン巳類似体の抗菌アッセイの評� �結果

［図 12］図 1 1の 3のプレートのビーズ結合型べプチドの構造

［図 13］図 1 1の匕のプレートのビーズ結合型べプチドの� �造

［図 14］図 1 1の〇のプレートのビーズ結合型ペプチドの� �造

［図 15］化合物 1、 八 1、 八2及び八3の ¹ 1 ^~ 1 IV! の化学シフトの比較

［図 16］化合物 1、 八 1、 八 2及び八 3の ^{1 3} 〇 IV! の化学シフトの比較

［図 17］全合成した 3 5種類のライソシン日類似体の抗菌活性の評� �結果

［図 183］ライソシン巳類似体八 1 ~八 1 4、 八 1 6 ~八 1 8の構造

［図 181）］ライソシン巳類似体八 1 5、 〇2の構造

発明を実施するための形態

［001 1］ 本明細書において、 「アルキル基」 は、 特に言及しない場合には例えば炭 素数 1〜 6個、 好ましくは炭素数 1〜 4個、 更に好ましくは炭素数 1〜 3個 程度の直鎖、 分枝鎖、 環状、 又はそれらの組み合わせからなるアルキル基 を 意味している。 より具体的には、 アルキル基として、 例えば、 メチル基、 エ チル基、 _プロピル基、 イソプロピル基、 シクロプロピル基、 _プチル 基、 3 6 0 -プチル基、 イソプチル基、 ㊀ 「 1: -プチル基、 シクロプロピ ルメチル基、 _n -ペンチル基、 n -ヘキシル基などを挙げることができる。

［0012］ 本明細書において 「ハロゲン原子」 という場合には、 フッ素原子、 塩素原 子、 臭素原子、 又はヨウ素原子のいずれでもよく、 好ましくはフッ素原子、 塩素原子、 又は臭素原子である。

［0013］ 1 . 一般式 （ I） で表される化合物

本発明の 1つの実施態様は、 以下の一般式 （丨） で表される化合物である 〇 2020/175451 10 卩（：170? 2020 /007391

[0014] —般式 （丨） の化合物は、 ライソシン巳を基準化合物として、 後述する本 発明のスクリーニング方法を用いて、 見出された化合物である。 ライソシン 巳は、 図 1で示すように 1 2のアミノ酸残基から構成される環状ペプチ� �化 合物であるが、 本発明者らは、 その個々の残基について、 当該化合物の生物 学的に重要な構造の変更を最小化し、 全体的な合成の効率も考慮して検討し たところ、 第 3番目の残基である！-— 36 「一 3、 第 6番目の残基である!_ — 1_ 6リー 6、 第 9番目の残基である 0—◦ 丨 n— 9及び第 1 1番目の残基 である！-— 丨 1 6- 1 1 を可変部位と決定し、 ミユーテーシヨンすることに より抗菌活性に優れた化合物を得られるので はないかと考えた。 そして、 第 3番目の残基の置換基、 第 6番目に残基の置換基、 第 9番目の残基の置換基 、 及び第 1 1番目の残基の置換基を、 夫々、 [¾ ² 、 [¾ ³ 、 及び ⁴ と規定 し （図 38参照） 、 ライソシン巳の類似化合物のライブラリーを 構築して、 スクリーニングを実施したところ、 ！_-!_ 6リー6、 ！_- 1 1 6- 1 1は強 力な抗菌活性に不可欠な残基である可能性が 高いことを見出した。

[0015] —般式 （ I） において、 以下の式 （1） 〜 （6） 表される置換基、 〇 2020/175451 11 卩(：170? 2020 /007391

又は炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基から選択される。

[0016]

[0017]

(2) 式 （2） において、 水素原子、 炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒド ロキシ基を表し、 好ましくは、 水素原子である。

[0018]

(3)

式 （3） において、 は、 同一又は異なっていてもよく、 各々独 立して、 水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表す。 各出現にお いて同一又は異なっていてもよく、 各々独立して、 水素原子又は炭素数 1〜

3のアルキル基を表す。 及び は、 好ましくは、 いずれも水素原子 である。

〇〜 2の整数を表し、 好ましくは 2である。 ここで、 が 0の場合 は、 は存在しない。

[0019]

(4) 〇 2020/175451 12 卩(：170? 2020 /007391

式 （4） において、 は、 水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表し

、 好ましくは、 水素原子である。

[0020]

( 5 ) 式 （5） において、 水素原子、 炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒ ドロキシ基を表し、 好ましくは、 水素原子である。

式 （6） において、 [¾ は、 水素原子、 炭素数 1〜 3のアルキル基又はヒ ドロキシ基を表し、 好ましくは、 水素原子である。

[¾ ^{1 2} は、 存在する場合は、 ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価 の 置換基を表す。 一価の置換基としては、 炭素数 1〜 3のアルキル基、 ヒドロ キシ基等が挙げられる。

好ましくは、 0である。 即ち、 好ましい側面に おいては、 ベンゼン環上に置換基は存在しない。

[0022] 炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基としては、 メチル基、 エチル基、 プロピ ル基が挙げられるが、 好ましくは、 メチル基である。

[0023] 式 （1） 〜 （6） において、 -は、 式 （丨） で表される化合物への結 合部位を表す。

[0024] イソプチル基である。

[0025] -般式 （丨） において、 は、 以下の式 （1） 、 （4） 、 （6） 、 （7）

、 （8） で表される置換基から選択される。 \¥02020/175451 13 卩(：17 2020 /007391 したのと同様である。

式 （7） において、 [¾ ¹³ 、 同一又は異なっていてもよく 、 各々独立して、 水素原子、 炭素数 1〜 3のアルキル基を表す。 及び ¹⁵ は、 好ましくは、 いずれも水素原子である。

[0030]

〇 2020/175451 14 卩（：170? 2020 /007391 式 （8） において、 は、 水素原子又は炭素数 1〜 3のアルキル基を表 し、 好ましくは、 水素原子である。 [¾ ^{1 7} は、 水素原子、 炭素数 1〜 3のアル キル基又はヒドロキシ基を表し、 好ましくは、 水素原子である。

[0031 ] 式 （7） 〜 （8） において、 -は、 式 （丨） で表される化合物への結 合部位を表す。 、 、 が式 （4） で表される基であっ 式 （8） で表される基であって ^{1 6} 及

[0034] 及び の両方が式 （4） で表される基、 または、 式 （6） で表される 基である場合は、 ³ の各基は同一であっても異なる基であっ てもよい

[0035] 本発明の 1つの好ましい態様においては、 一般式 （丨） において、 は、 以下で表される置換基から選択され；

（八）

は、 以下で表される置換基から選択される、 化合物である。 〇 2020/175451 15 卩（：170? 2020 /007391

但し、 ¹ が 3で表される置換基であり、 かつ、 ³ が 0で表される置換基 である化合物は除く。

[0036] （a） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、 （8） で表される置換基で ある化合物である。

（匕） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、 （1） で表される置換基で ある化合物である。

（〇） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 式 （3） で表される置換基であり、 が式 （1） で表される置換基である化 合物である。

（¢0 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 が 式 （1） で表される置換基であり、 が式 （7） で表される置換基である化 合物である。

（ø） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 が 式 （4） で表される置換基であり、 が式 （1） で表される置換基である化 合物である。

（干） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 式 （1） で表される置換基であり、 が式 （8） で表される置換基である化 合物である。

（9） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 が 式 （6） で表される置換基であり、 が式 （7） で表される置換基である化 20/175451 16 卩（：170? 2020 /007391

合物である。

（ ） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （ I） において、 式 （6） で表される置換基であり、 が式 （8） で表される置換基である化 合物である。

（ I） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 式 （6） で表される置換基であり、 が式 （1） で表される置換基である化 合物である。

） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 が 式 （5） で表される置換基であり、 が式 （8） で表される置換基である化 合物である。

（!＜） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 式 （1） で表される置換基であり、 が式 （6） で表される置換基である化 合物である。

（ I） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 式 （1） で表される置換基であり、 が式 （4） で表される置換基である化 合物である。

（〇〇 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 式 （5） で表される置換基であり、 が式 （1） で表される置換基である化 合物である。

（ ） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 式 （5） で表される置換基であり、 が式 （7） で表される置換基である化 合物である。

（〇） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 式 （2） で表される置換基であり、 が式 （7） で表される置換基である化 合物である。

（ ） 本発明の 1つの好ましい側面においては、 式 （丨） において、 式 （2） で表される置換基であり、 が式 （6） で表される置換基である化 合物である。 〇 2020/175451 17 卩（：170? 2020 /007391

（9） 本発明の 1つの好ましぃ側面におぃては、 式 （丨） におぃて、 が 式 （2） で表される置換基であり、 が式 （1） で表される置換基である化 合物である。

上記の （3） 〜 （9） の化合物は優れた抗菌活性を示す。

[0037] 本発明のより好ましぃ側面におぃては、 式 （丨） におぃて、 （丨） が炭 素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、 （8） で表される置換基であ る、 （丨 丨） が炭素数 1〜 3の直鎖状アルキル基であり、 が式 （1） で表される置換基である、 又は、 （丨 丨 丨） が式 （3） で表される置換基 であり、 （1） で表される置換基である、 化合物である。

の組み合わせが い） 〜 い 丨 丨） の組み合わせである場合は 、 より優れた抗菌活性を示す。

[0038] 本発明の更に好ましぃ態様におぃては、 の組み合わせが以下の 組み合わせから選択される。

1、 ） ： （八、 0） 、 （八、 V） 、 （ V） 、 （V、 〇） 、 （3、 V） 、 （V、 0） 、 （丫、 〇） 、 （丫、 0） 、 （丫、 V） （1\1、 0） 、 （V 、 丫） 、 （V、 3） （1\1、 V） 、 （1\1、 0） 、 ⑴、 0） 、 ⑴、 丫） 、 （

〇, V）

ここで、 V、 0、 、 3、 1\1、 丫、 八、 〇、 〇は、 上記で定義した通りであ る。

優れた抗菌活 性を示す。

[0039] また、 本発明の更に好ましぃ態様におぃては、 の組み合わせが 以下の組み合わせから選択される。

1、 ） ： （八、 0） 、 （八、 V） 、 （ V）

より優れた抗 菌活性を示す。

[0040] 本発明の化合物を製造する方法に限定はなく 、 如何なる方法で得られたも のでもよぃ。 例えば、 化学合成によって得られたものであってもよ く、 微生 〇 2020/175451 18 卩（：170? 2020 /007391

物を用いて発現させたものであってもよく 、 生物体から分離したものであっ てもよく、 それらを組み合わせて得られたものでもよい 。 本発明の化合物を 製造する方法の一例を実施例に示す。

[0041 ] 2 . 蘂学的組成物

本発明のもう 1つの実施態様は、 一般式 （丨） で表される化合物又はその 塩を含む感染症を治療するための薬学的組成 物である。

[0042] また、 本発明の 1つの実施態様は、 哺乳動物、 特にヒトにおける感染症の 治療方法であって、 そのような治療を必要とする哺乳動物に、 有効量の一般 式 （丨） の本発明の化合物又はそれらの薬学的に許容 される塩、 或いは、 一 般式 （丨） で表される化合物又はその塩を含む薬学的組 成物を投与する方法 である。

[0043] 感染症の例としては、 グラム陽性菌に起因する感染症が挙げられる 。 本発 明の薬学的組成物は、 特に、 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 （M R S A） を 含む黄色ブドウ球菌 （Staphy lococcus aureus） 、 Staphy lococcus s i mu Ians 、 btaphy lococcus haemo lyt i cus _% Staphy lococcus pseud i ntermed i us、 谷連 菌、 セレウス菌（Bac i Uus cereus）、 枯草菌（Bac i l lus subt i l i s）及びリステ リア菌（L i ster i a monocytogenes）等に起因する感染症の治療に好� �に使用で きる。

[0044] 本発明の薬学的組成物は、 一般式 （丨） で表される化合物又はその塩に加 えて、 その他の成分を含有することができる。

[0045] その他の成分としては、 特に制限はなく、 本発明の効果を損なわない範囲 内で、 目的に応じて適宜選択することができ、 例えば、 薬学的に許容され得 る担体や賦形剤等が挙げられる。

かかる担体としては、 特に制限はなく、 例えば、 後述する剤形等に応じて 適宜選択することができる。 また、 前記薬学的組成物中の前記 「その他の成 分」 の含有量としても、 特に制限はなく、 目的に応じて適宜選択することが できる。

[0046] 本発明の薬学的組成物の剤形としては、 特に制限はなく、 例えば、 後述す 〇 2020/175451 19 卩（：170? 2020 /007391

るような所望の投与方法に応じて適宜選択 することができる。

具体的には、 例えば、 経口固形剤 （錠剤、 被覆錠剤、 顆粒剤、 散剤、 カブ セル剤等） 、 経口液剤 （内服液剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等） 、 注射剤 （溶剤、 懸濁剤等） 、 軟膏剤、 貼付剤、 ゲル剤、 クリーム剤、 外用散剤、 ス プレー剤、 吸入散布剤等が挙げられる。

[0047] 前記経口固形剤としては、 例えば、 前記有効成分に、 賦形剤、 更には必要 に応じて結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 着色剤、 矯味 ·矯臭剤等の添加剤を加え 、 常法により製造することができる。

前記賦形剤としては、 例えば、 乳糖、 白糖、 塩化ナトリウム、 ブドウ糖、 デンプン、 炭酸カルシウム、 カオリン、 微結晶セルロース、 珪酸等が挙げら れる。

前記結合剤としては、 例えば、 水、 エタノール、 プロパノール、 単シロッ プ、 ブドウ糖液、 デンプン液、 ゼラチン液、 カルボキシメチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ヒドロキシプロピルスターチ、 メチルセル ロース、 エチルセルロース、 シエラック、 リン酉愛カルシウム、 ポリビニルピ ロリ ドン等が挙げられる。

前記崩壊剤としては、 例えば、 乾燥デンプン、 アルギン酸ナトリウム、 力 ンテン末、 炭酸水素ナトリウム、 炭酸カルシウム、 ラウリル硫酸ナトリウム 、 ステアリン酸モノグリセリ ド、 乳糖等が挙げられる。

前記滑沢剤としては、 例えば、 精製タルク、 ステアリン酸塩、 ホウ砂、 ポ リエチレングリコール等が挙げられる。

前記着色剤としては、 例えば、 酸化チタン、 酸化鉄等が挙げられる。 前記矯味 ·矯臭剤としては、 例えば、 白糖、 橙皮、 クエン酸、 酒石酸等が 挙げられる。

[0048] 前記経口液剤としては、 例えば、 前記有効成分に、 矯味 ·矯臭剤、 緩衝剤 、 安定化剤等の添加剤を加え、 常法により製造することができる。

前記矯味 ·矯臭剤としては、 例えば、 白糖、 橙皮、 クエン酸、 酒石酸等が 挙げられる。 〇 2020/175451 20 卩（：170? 2020 /007391

前記緩衝剤としては、 例えば、 クエン酸ナトリウム等が挙げられる。 前記 安定化剤としては、 例えば、 トラガント、 アラビアゴム、 ゼラチン等が挙げ られる。

[0049] 前記注射剤としては、 例えば、 前記有効成分に、 1 ^~ 1調節剤、 緩衝剤、 安 定化剤、 等張化剤、 局所麻酔剤等を添加し、 常法により皮下用、 筋肉内用、 静脈内用等の注射剤を製造することができる 。

前記 1 ^~ 1調節剤及び前記緩衝剤としては、 例えば、 クエン酸ナトリウム、 酢酸ナトリウム、 リン酸ナトリウム等が挙げられる。 前記安定化剤としては 、 例えば、 ピロ亜硫酸ナトリウム、 巳〇丁八、 チオグリコール酸、 チオ乳酸 等が挙げられる。 前記等張化剤としては、 例えば、 塩化ナトリウム、 ブドウ 糖等が挙げられる。 前記局所麻酔剤としては、 例えば、 塩酸プロカイン、 塩 酸リ ドカイン等が挙げられる。

[0050] 前記軟膏剤としては、 例えば、 前記有効成分に、 公知の基剤、 安定剤、 湿 潤剤、 保存剤等を配合し、 常法により混合し、 製造することができる。 前記基剤としては、 例えば、 流動パラフィン、 白色ワセリン、 サラシミツ ロウ、 オクチルドデシルアルコール、 パラフィン等が挙げられる。 前記保存 剤としては、 例えば、 パラオキシ安息香酸メチル、 パラオキシ安息香酸エチ ル、 パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる 。

[0051 ] 前記貼付剤としては、 例えば、 公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリー ム剤、 ゲル剤、 ペースト剤等を、 常法により塗布し、 製造することができる 。 前記支持体としては、 例えば、 綿、 スフ、 化学繊維からなる織布、 不織布 、 軟質塩化ビニル、 ポリエチレン、 ポリウレタン等のフィルム、 発泡体シー 卜等が挙げられる。

[0052] 本発明の薬学的組成物中の有効成分である、 _般式 （丨） で表される化合 物又はその薬学的に許容される塩の、 組成物全体に対する含有量は、 特に制 限がなく、 目的に応じて適宜選択することができるが、 組成物全体を 1 0 0 質量部としたときに、 一般式 （丨） で表される化合物又はその薬学的に許容 される塩の合計量として、 〇. 0 0 1〜 1 0 0質量部の含量で配合すること 〇 2020/175451 21 卩（：170? 2020 /007391

が好ましく、 より好ましくは 0. 01〜 99質量部、 特に好ましくは 0. 1 〜 95質量部、 更に好ましくは 1〜 90質量部の含量で配合することができ る。

[0053] 本発明の薬学的組成物の投与対象動物として は、 特に制限はないが、 例え ば、 ヒト ；マウス； ラッ ト ；サル； ウマ； ウシ、 ブタ、 ヤギ、 ニワトリ等の 家畜；ネコ、 イヌ等のペッ ト ；等が挙げられる。

[0054] また、 前記薬学的組成物の投与方法としては、 特に制限はなく、 例えば、 前記薬学的組成物の剤形等に応じ、 適宜選択することができ、 経口投与、 腹 腔内投与、 呼吸器への吸入、 血液中への注射、 腸内への注入等が挙げられる また、 前記薬学的組成物の投与量としては、 特に制限はなく、 投与対象で ある個体の年齢、 体重、 所望の効果の程度等に応じて適宜選択するこ とがで きるが、 例えば、 成人への 1 日の投与量は、 有効成分の量として、 1 m g〜 30 gが好ましく、 1 0 m g〜 1 O gがより好ましく、 1 00 m g〜 3 gが 特に好ましい。

また、 前記薬学的組成物の投与時期としても、 特に制限はなく、 目的に応 じて適宜選択することができ、 例えば、 予防的に投与されてもよいし、 治療 的に投与されてもよい。

本発明の薬学的組成物は、 他の公知の抗感染症剤と併用してもよい。 この ような公知の抗感染症剤としては、 グラム陽性菌に起因する感染症を治療又 は予防する公知の抗感染症剤等が挙げられる 。

[0055] 本発明のもう 1つの実施態様は、 一般式 (丨 ) で表される化合物又はその 塩を含む抗菌剤である。

[0056] 本発明の抗菌剤により、 グラム陽性菌： メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 ( MRSA) を含む黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) 、 Staphy lococc us simulans、 Staphylococcus haemo lyt i cus _% Staphylococcus pseud i nterme dius、 溶連菌、 セレウス菌 (Bac i Uus cereus)、 枯草菌 (Bacillus subtil is) 及びリステリア菌 (Lister ia monocytogenes)等を殺滅、 除去又はこれらの菌 〇 2020/175451 22 卩（：170? 2020 /007391

の増殖を抑制することができる。

[0057] 本発明の抗菌剤は、 一般式 （丨） で表される化合物又はその塩に加えて、 その他の成分を含有することができる。 「その他の成分」 、 抗菌剤の剤型に ついては、 本発明の薬学的組成物について記載したのと 同様のものを使用す ることができる。

[0058] 本発明の薬学的組成物は、 他の公知の抗菌剤を併用することができる。 こ のような公知の抗菌剤としては、 様々なものが挙げられるが、 例えば/ 3ラク タム系抗菌剤 （ペニシリン等） 、 テトラサイクリン系抗菌剤 （ドキシサイク リン等） 、 マクロライ ド系抗菌剤 （クラリスロマイシン等） 、 アミノグリコ シド系抗菌剤 （ゲンタマイシン等） 、 キノロン系抗菌剤 （レポフロキサシン 等） 、 グリコペプチド系抗菌剤 （バンコマイシン等） 、 リポペプチド系抗菌 剤 （コリスチン等） 等が挙げられる。

[0059] 3 . スクリーニング方法

本発明の 1つの実施態様は、 細菌膜に存在する物質 と相互作用して抗菌 活性を示すペプチド系の候補化合物のスクリ ーニング方法である （以下 「本 発明のスクリーニング方法」 とも言う） 。

本発明のスクリーニング方法は、 以下の工程を含む。

（ 1） 物質八と相互作用して抗菌活性を示すことが 知られているぺプチド系 化合物の類似化合物のライブラリーを提供す ること ；

（2） 前記ライブラリー中の類似化合物を物質 と接触させて、 各々の類似 化合物と物質 との錯体を形成させること ；

（3） （2） で得られた類似化合物と物質 との個々の錯体を分配し、 溶媒 を添加することにより当該錯体から物質 を溶離させること ；

（4） 各々の錯体から得られた各溶離液を採取して 、 各々の類似化合物につ いての物質 と錯体を形成した程度を分析すること ：

（5） 溶離液を採集した後に残った各々の類似化合 物を回収し、 各類似化合 物の抗菌活性を測定すること。

以下、 本発明のスクリーニング方法の各工程につい て詳細に説明する。 〇 2020/175451 23 卩（：170? 2020 /007391

[0060] 本発明のスクリーニング方法において用いる ことができる細菌膜に存在す る物質八としては、 メナキノン、 デメチルメナキノン、 メチルメナキノン、 ジメチルメナキノン、 メチオナキノン、 ユビキノン、 ロドキノン、 プラスト キノン、 クロロピウムキノン、 ジヒドロメナキノン、 テトラヒドロメナキノ ン、 ヘキサヒドロメナキノンが挙げられる。

[0061 ] ( 1 - 1 ) 物質 と相互作用して抗菌活性を示すことが知られ ているべプチ ド系化合物の類似化合物のライブラリーの構 築

本発明のスクリーニング方法は、 物質 と相互作用して抗菌活性を示すこ とが知られているべプチド系化合物を部分的 にミユーテーシヨンすることに より得られる類似化合物群をスクリーニング することにより行われる。 ここ で、 ミユーテーシヨンを行うぺプチド系化合物は 、 直鎖状のぺプチド化合物 、 環状ペプチド化合物のいずれでもよい。

また、 ペプチド系化合物には、 各アミノ酸残基がアミ ド結合で結合したぺ プチド化合物に加えて、 アミノ酸残基の一部がエステル結合等のアミ ド結合 以外の結合様式により結合した部位を含む化 合物も含まれる。

[0062] このような既知のぺプチド系化合物の類似化 合物のライブラリーは、 公知 の複合べプチドの固相全合成法を用いて得る ことができる。

本発明のスクリーニング方法においては、 類似化合物はビーズ結合型ぺプ チド系化合物であることが好ましい。 ビーズ結合型べプチド系化合物のライ ブラリー (化合物群) は、 〇巳〇〇 ( 0 11 6—匕 6 3〇1— 0 11 6—〇〇01 〇 u n d ) 法を用いて調製することが好ましい。 〇巳〇〇法を用いると、 個 々のビーズに構造的に特有の類似体をサブマ イクログラムの量で担持するこ とができる。 また、 1 0 0 0種類以上の類似化合物を同時に調製するこ� �が できる。

[0063] 〇巳〇〇法は1_ 3〇1 , [< . 3等により開発された方法であり «. .； V· (^6111· (^ · 1997, 97, 41 1 ) 、 小サイズのペプチド ライブラリーを構築する有効な手法ではある ものの、 これまで、 複雑な天然 ペプチドの合成には殆ど適用されなかった。 本発明者等は、 ライソシン巳の 〇 2020/175451 24 卩（：170? 2020 /007391

全固相合成で用いた手法を採用することに より高効率でビーズ結合型べプチ ド系化合物のライブラリーを構築できるので はないかと考えた。

即ち、 本発明者等が行ったライソシン巳の固相全合 成においては、 図 1 に 示す化合物 7を ₃ n 9樹脂に結合させて ₃ n ₉ 樹脂結合型 7を得て、 こ れを起点として化合物 4〜 6及び化合物 8〜 1 4を用いて段階的なペプチド 鎖の伸長を行い、 これに続くマクロラクタム化、 および保護基の酸による除 去によって、 総収率 8 . 0 %で達成された。

[0064] 〇巳〇〇法を用いたビーズ結合型べプチド系 化合物のライブラリーの調製 方法においては、 分割混合法 （3 丨 丨 1： _ 3 11 〇1 _ 111 丨 X法） が好適に用 いられる。 図 2は、 本発明のスクリーニング方法の基本的なスキ ームを示し ているが、 その上段部に本発明で用いるビーズ結合型べ プチド系化合物の〇 巳〇（3ライブラリーを構築する方法が示さ� �ている。

[0065] まず、 物質八と相互作用して抗菌活性を示すことが 知られているペプチド 系化合物のぺプチド残基のうち、 可変にするぺプチド残基部と変化させない ペプチド残基部を選定する。 図 2においては、 「八」 と 「巳」 が不変 （共通 ） ペプチド残基部であり、 「X」 と 「丫」 が可変ペプチド残基である。

図 2の上段に示すように、 ビーズを共通のペプチド成分である 「八」 と結 合させ、 次に可変残基である 「X」 の部位にペプチド成分 1〜 3を結合させ ると 3種類のビーズ結合型ジベプチドが得られる （図 2の上段部の左から 2 番目の図） 。 こうして得られた 3種類のビーズ結合型ジペプチドの全てに共 通のペプチド成分である 「巳」 を結合し、 次に、 可変の残基である 「丫」 の 部位にペプチド成分 4〜 6を結合させる。 その結果、 9 （= 3 ² ） 種類のビー ズ結合型テトラペプチドが得られる （図 2の上段部の右の図） 。 この操作を 繰り返すことにより、 〇巳 0（3ライブラリーとして、 所定の可変残基部位に 所望のぺプチド成分を導入したビーズ結合型 べプチド系化合物のライブラリ —を得ることができる。 図 2の下段部は、 〇巳〇〇法を用いてビーズ結合型 ライソシン類似体が得られる例を模式的に示 している。

[0066] 本発明のスクリーニング方法において、 〇巳〇〇法を用いてビーズ結合型 〇 2020/175451 25 卩（：170? 2020 /007391

ぺプチド系化合物のライブラリーを構築す るにあたり、 どのアミノ酸残基で 構造改変を行うかは、 物質 と相互作用して抗菌活性を示すことが知られ て いるべプチド系化合物の生物学的に重要な構 造への影響を最小化し、 全体的 な合成の効率も考慮して決定される。 一例として、 ライソシン巳において検 討した結果を以下に示す。

まず、 1 中心と レンは、 生物活性を示す三次元構造に潜在的に影響す ることから、 これらを保持した 。 次に、 （［¾） _ 3—ヒドロキシ _ 5—メチルヘキサンアミ ド、 〇 - A r 9 - 2 / 7、 及び口一丁 「 一 1 0については、 化学変異させると抗菌活性を低下させること から、 これらの残基は変更しな かった。 更に、 ！_ _◦ 丨 リ _ 8は固体支持体への結合部位として必須であ� � 、 また、 ！_ -丁 II 「一 1 / 1 2を変化させると固相エステル化の収率に影� � を与えると推定されたため、 これらの残基も変更しなかった。 そして、 これ らの点を考慮して、 I -— 3 6 「一3、 1 -—し㊀リー 6、 0— 0 I 1^— 9及び

1 1 をライブラリーの構築における可変部位と決 定した。

［0067］ 本発明のスクリーニング方法において、 〇巳〇〇法を用いてビーズ結合型 ぺプチド系化合物のライブラリーを構築する にあたり、 可変部位のペプチド の側鎖をどのように変更するかについては、 これらの物理化学的性質の観点 から多様化するのが望ましい。 可変部位のぺプチド側鎖に導入する基として 、 例えば、 疎水性基、 酸性基、 塩基性基、 水酸基又は水酸基含有基、 1級ア ミ ド基及び芳香族基からなる群から少なくとも 1以上を選択し、 これらの基 に属する適切な置換基を採用することができ る。

［0068］ また、 本発明のスクリ—ニング方法で得られるぺプ チド系の候補化合物の 構造を決定するために IV! 3 /IV! 3分析が用いられるが、 IV! 3 /IV! 3分析によ り、 一つのビーズ上の特有の構造を明確に決定す ることを可能にするために は、 ぺプチド系の候補化合物の配列中の各可変残 基は固有の分子量を有さな ければならない。 従って、 可変部位のペプチド側鎖に導入する基の分子 量は 、 通常異なることが好ましい。 〇 2020/175451 26 卩（：170? 2020 /007391

[0069] ビーズ結合型べプチド系化合物のライブラリ ーの調製方法において用いる ビーズとしては、 ペプチド固相合成で通常用いられる樹脂、 例えば、 W a n 9樹脂、 2—クロロトリチル (巳 8 「 I 〇 3 ) 樹脂、

、 I 6 n I 3 0 6 I等が使用できるが、 許容される溶媒種の多様性、 ビーズ サイズの均一性の点から、 I 6 n I 3 0 6 Iが好ましい。

[0070] また、 ペプチド系化合物とビーズを連結するリンカ ーとしては、 ペプチド 固相合成で通常用いられる種々のリンカーを 用いることができるが、 酸に安 定なリンカーを用いると側鎖を保護基で修飾 しなくてもビーズ結合型べプチ ド系化合物を調製することが可能であること から好ましい。 また、 光分解性 のリンカーを用いると、 試薬等を用いなくてもビーズ結合型べプチド 系化合 物に単に光を照射することで、 ビーズからぺプチド系化合物を遊離させるこ とができるため好ましい。

本発明のスクリーニング方法においては、 〇-二トロべラトリルリンカー 、 メチオニンリンカー等を好適に使用すること ができる。

[0071 ] ( 1 - 2 ) ライブラリー中の類似化合物を物質 と接触させて、 各々の類似 化合物と物質 との錯体を形成させる工程

( 1 ) の工程で得られた物質 と相互作用して抗菌活性を示すことが知ら れているぺプチド系化合物の類似化合物群を 、 物質 を接触させる手法とし ては、 例えば、 物質八の溶液を類似化合物に噴霧する方法、 物質八の溶液に 類似化合物群を溶解又は分散させる方法等が 挙げられる。

本発明のスクリーニング方法においては、 〇巳〇〇法を用いて調製したラ イブラリー中のビーズ結合型ペプチド系化合 物、 及び、 メナキノン等の物質 八をメタノール等のアルコール系溶媒に添加 することで、 各々のビーズ結合 型べプチド系化合物とメシチリン等の物質 を接触させることが好ましい。 両者を接触させると、 ビーズ結合型べプチド系化合物群の個々のビ ーズ結合 型べプチド系化合物とメナキノン等の物質 との錯体が形成される。

[0072] ( 1 - 3 ) 工程 ( 2 ) で得られた類似化合物と物質 との個々の錯体を分配 し、 溶媒を添加することにより当該錯体から物質 を溶離させる工程 〇 2020/175451 27 卩（：170? 2020 /007391

工程 ( 2 ) で得られた類似化合物と物質 との個々の錯体、 好適には、 ビ —ズ結合型べプチド系化合物とメナキノン等 の物質 との個々の錯体を分配 する方法としては、 各々の錯体をマイクロプレートに分配するこ とが好まし い。 ビーズ結合型べプチド系化合物では 1つのビーズに 1種類のペプチド系 化合物が担持されていることから、 マイクロプレートの 1つのウェルには 1 種類のビーズ結合型べプチド系化合物を分配 することができる。 マイクロプ レートのウェルの数は、 ビーズ結合型べプチド系化合物群中の化合物 の種類 に応じて適宜選択することができ、 例えば、 9 6—ウェルのマイクロプレー 卜等を使用することができる。

[0073] マイクロプレート等に分配した後、 前記類似化合物と錯体を形成していな い未結合の物質 を取り除くため、 有機溶媒で洗浄する。 この際に使用する 有機溶媒としては、 例えばメタノール等を用いることができる。

[0074] 次に、 前記類似化合物と物質 との錯体から物質 を溶離させるために溶 媒を添加する。 ここで用いる溶媒は、 類似化合物と物質 との錯体の種類に 応じて適宜選択されるが、 ビーズ結合型べプチド系化合物とメナキノン の錯 体の場合は、 長鎖アルカノールを使用することができ、 特に -ブタノール を好適に使用することができる。 また、 この際に、 门 _ブタノール等を添加 した分散液を 3 0〜 6 0 °〇に加温することが好ましく、 5 0 °〇に加温するこ とが特に好ましい。

上記の工程により、 各々の錯体から物質 が溶離して、 物質 の溶離液を 得ることができる。

[0075] ( 1 - 4 ) 各々の錯体から得られた各溶離液を採取して 、 各々の類似化合物 についての物質 と錯体を形成した程度を分析する工程

( 3 ) の工程で得られた各々の錯体から各溶離液を 採取して、 各々の類似 化合物について物質 との錯体を形成した程度を分析する。 これにより、 各 々の類似化合物が物質 を取り込むことができる程度、 即ち、 各々の類似化 合物が物質八と相互作用する程度を判定する ことができる (第 1スクリーニ ングエ程) 。 〇 2020/175451 28 卩（：170? 2020 /007391

各々の類似化合物について物質 との錯体を形成した程度を分析する手法 としては、 物質八の量を定量的又は定性的に検出するこ とができる分析方法 を適宜選択することができる。 物質 がメナキノンの場合は、 溶離液の蛍光 強度を測定することにより、 各々の類似化合物について物質 との錯体を形 成した程度を分析することができる。 更に、 メナキノンの溶離液に 3巳1 ^~ 1 ₄ 等の還元剤を添加することにより、 メナキノンを以下の下段の式に表される 還元型メナキノンにすると、 蛍光強度の測定感度が向上するため、 より定量 的な分析が可能になり好ましい。

[0076] 次に、 各々の類似化合物が物質 を取り込むことができる程度、 即ち、 各 々の類似化合物が物質 と相互作用する程度を判定するには、 物質 と相互 作用して抗菌活性を示すことが知られている べプチド系化合物についての分 析値を比較することにより、 当該既知のぺプチド系化合物よりも物質八と 相 互作用する程度が高いか否かを判定する。 物質 がメナキノンの場合は、 メ ナキノンと相互作用することが公知であるペ プチド系化合物、 例えばライソ シン巳を用いた場合の溶離液の蛍光強度と、 類似化合物について得られた溶 離液の蛍光強度を比較して、 類似化合物についての蛍光強度値が前者の蛍 光 強度より高ければ、 当該類似化合物をぺプチド系の候補化合物の 1つとして 選定することができる。

このようにしてぺプチド系の候補化合物とし て選定された化合物の集団 （ 化合物群） を、 「ペプチド系の候補化合物群 」 とも言う。 〇 2020/175451 29 卩（：170? 2020 /007391

[0077] （1 - 5） 溶離液を採集した後に残った各々の類似化合 物を回収し、 各類似 化合物の抗菌活性を測定する工程

次に、 溶離液を採集した後に残った各々の類似化合 物を回収し、 各類似化 合物の抗菌活性を測定する。

ここで、 類似化合物がビーズ結合型ペプチド系化合物 である場合は、 ビー ズを除去してペプチド系化合物を得て、 その抗菌活性を測定する （図 2の下 段の右側を参照） 。 ビーズ結合型ペプチド系化合物からビーズを 除去する手 法は、 用いるビーズの種類、 リンカーの種類等に応じて選択することがで き るが、 リンカーとして光分解性のリンカーを用いる と紫外線等の光を照射す ることによりビーズを除去することができる 。

[0078] 本工程においては、 （3） の工程の後に回収した全ての類似化合物につ い て抗菌活性を測定してもよいが、 （4） の工程で選定された 「ペプチド系の 候補化合物群 」 について抗菌活性を測定するのが好ましい。

[0079] 抗菌活性の測定としては、 種々の菌に対する耐性を調べることができる が 、 例えば、 グラム陽性菌： IV! 3 3八 1、 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 （IV! [¾ 3八 4） 、 11 3 6 111 0 I 〇 リ 3、 セレウス菌、 枯草菌及びリステリア菌等に対する活性を測 定することができ る。 また、 1\/1 3 3 1 に対する活性は、 活性を増強する血清である巳 0 3の 存在下 （例えば、 1 〇%添加） 又は非存在下で評価することができる。

[0080] ぺプチド系の候補化合物群 について抗菌活性を測定し、 それらの結果を 、 物質八と相互作用して抗菌活性を示すことが 知られているべプチド系化合 物の抗菌活性の測定結果と比較することによ り、 ぺプチド系の候補化合物と して選定することができる。

[0081 ] ペプチド系の候補化合物群 中の各化合物、 又は、 抗菌活性を測定した結 果選定されたべプチド系の候補化合物の配列 は、 これら化合物を シークェンス分析にかけることにより決定す ることができる。 ここで、 ぺプ チド系の化合物が環状べプチドである場合は 、 塩基性条件又は酸性条件下で 加水分解して直鎖べプチドを得て、 これを IV! 3 /IV! 3シークェンス分析に供 〇 2020/175451 30 卩（：170? 2020 /007391

する。

[0082] （1 - 6） ライソシン巳を用いたスクリーニング方法

本発明のスクリーニング方法の一例として、 メナキノンと相互作用して抗 菌活性を示すことが知られているべプチド系 化合物としてライソシン巳を用 いたスクリーニング方法について説明する。

[0083] ライソシン巳を基準化合物として〇巳〇（3� �により類似化合物を合成する 概略図を図 3 8及び図 3匕に示す。

図 3の上段左の図は、 ビーズ結合型ライソシン巳の構造を示してい る。 こ こで、 ビーズとして丁 6 n I 3◦ 6 丨 を用い、 リンカーとして光分解性リン 力一である〇 二トロべラトリノレリンカーを用いた。

可変部位としては、 上記で説明した理由から、 ！_— 3 6 「一 3、 ！_— 1_ 6 リー6、 0 -〇 1 门一9及び！- - 1 1 6 - 1 1 を選定した。 そして、 これら 可変部位の各ペプチド残基の側鎖を 、 及び と定めた （図 3 3 の上段の左図を参照） 。

[0084] 次に、 可変部位の 、 [¾ ² 、 ³ 及び ⁴ として導入する基として、 疎水性 基、 酸性基、 塩基性基、 水酸基含有基、 1級アミ ド基及び芳香族基を選択し た。 これらに加えて、 アラニンースキャニングの化学バージョンと して、 メ チル基での置換も採用した。 そして、 これらの基に属する具体的な置換基を 、 それぞれの置換基が異なる物理化学的特性を 持つように選定した。

上記で選定した置換基のリストを図 3 3の上段の右図に示す。 各基の右の 括弧内には、 各々の置換基を示す記号と、 分子量が記載されている。

[0085] 図 3匕は、 ライソシン巳ベースの〇巳〇〇ライブラリー を構築するために 用いる化合物 （アミノ酸成分） のリストを示す。 リストの上段の 4〜 1 0の 化合物は、 本〇巳 0（3法で共通して用いる化合物、 つまり、 不変ペプチド部 位を構成する。

リストの下段の化合物 1 1〜 2 6は、 本〇巳〇〇ライブラリーの構築に用 いる分割混合法でランダム化させる化合物を 示す。 これらの化合物が可変部 位に導入される。 これらの内、 化合物 1 1〜 1 4は、 ライソシン巳に由来す 〇 2020/175451 31 卩（：170? 2020 /007391

る化合物であり、 化合物 1 5〜 2 6は人工化合物である。

[0086] 上記の化合物を用いて、 分割混合法によりビーズ結合型ライソシン巳 系化 合物の〇巳 0（3ライブラリーを構築する。 ここで、 4種類の可変部位におい て、 夫々 7種類のペプチド基を導入していることから� � 7 ⁴ = 2 4 0 1種類の 化合物を得ることができる。

このように、 本発明のスクリーニング方法では、 1つのビーズに 1種類の ぺプチド系化合物が固有的に結合した非常に 多くの種類のビーズ結合型ぺプ チド系化合物を合成することができるため、 有効なスクリーニングを行うこ とが可能である。

[0087] 図 4に、 ライソシン巳を用いたスクリーニング方法の 全体的模式図を示す 分割混合法により得られるビーズ結合型ライ ソシン巳系化合物をメタノー ルに分散し、 メナキノンを添加する。 これにより、 ビーズ結合型ライソシン 巳系化合物とメナキノンとの錯体が形成され る。 そして、 この分散液中の各 々のビーズ結合型ライソシン巳系化合物を 9 6ウェルのマイクロプレートに 分配する。 次に、 各ウェルにメタノールを加えて、 ビーズ結合型ライソシン 巳系化合物に結合していないメナキノンを洗 浄する。

[0088] 次に、 各ウェルに n _ブタノールを 5 0 °〇の条件下で添加して、 錯体から メナキノンンを溶離させる。 そして、 ビーズ結合型ライソシン巳系化合物と 溶離液を分離する。

上記の操作で得られた各溶離液を採取して、 各々のビーズ結合型ライソシ ン巳系化合物についてメナキノンとの錯体を 形成した程度を分析する。 これ により、 各々のライソシン巳の類似化合物がメナキノ ンを取り込むことがで きる程度、 即ち、 各々のライソシン巳類似化合物がメナキノン と相互作用す る程度を判定する （第 1スクリーニングエ程） 。 分析手法としては蛍光強度 の測定を用いるのが好ましい。 また、 3巳 1 ^~ 1 ₄ を添加することにより、 メナ キノンを還元型メナキノンに変換すると、 蛍光強度の測定感度が向上するた め、 より定量的な分析が可能になり好ましい （図 4の中段参照） 。 〇 2020/175451 32 卩（：170? 2020 /007391

そして、 各試料の蛍光強度の測定結果をビーズ結合型 ライソシン日を用い た場合の蛍光強度と比較して、 ライソシン巳よりもメナキノンと相互作用す る程度が高いか否かを判定する。 ライソシン巳を用いた場合よりも蛍光強度 が高ければ、 当該ライソシン日類似化合物を候補化合物の 1つとして選定す ることができる。 このようにして、 候補化合物を選定してライソシン巳類似 化合物の集団 （化合物群） を得る。 以下この化合物群を 「ライソシン巳系候 補化合物群 」 とも言う。

[0089] 上記の工程で、 メナキノンが遊離したビーズ結合型ライソシ ン系化合物を 回収する。 次に、 回収したビーズ結合型ライソシン日系化合物 について、 ビ —ズを除去してライソシン巳系化合物を得る 。 ビーズを除去する手法として は、 光を照射することによりビーズを除去するこ とができる （図 4の中段参 照） 。

こうして得られたライソシン日系化合物につ いて抗菌活性を測定するが、 全てのライソシン巳類似化合物について抗菌 活性を測定してもよいが、 上記 の第 1のスクリーニングエ程で選定された 「ライソシン巳系候補化合物群八 」 について抗菌活性を測定するのが好ましい。

[0090] 抗菌活性の測定としては、 種々の菌に対する耐性を調べることができる が 、 例えば、 グラム陽性菌： IV! 3 3八 1、 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 （IV! [¾ 3八 4） 、 11 3 6 111 0 I 〇 リ 3、 セレウス菌、 枯草菌及びリステリア菌等に対する活性を測 定することができ る。 また、 1 に対する活性は、 活性増強血清である巳 0 3の存在下 （例えば、 1 0 %添加） 又は非存在下で評価することができる。

[0091 ] ライソシン巳系候補化合物群 について抗菌活性を測定し、 それらの結果 を、 ライソシン巳の抗菌活性の測定結果と比較す ることにより、 ライソシン 巳系の候補化合物として選定することができ る。

[0092] ライソシン巳系候補化合物群 中の各化合物、 又は、 抗菌活性を測定した 結果選定されたライソシン巳系の候補化合物 の配列は、 これら化合物を IV! 3 /IV! 3シークエンス分析にかけることにより決定� �ることができる。 この際 〇 2020/175451 33 卩（：170? 2020 /007391

に、 塩基性条件又は酸性条件下で加水分解して直 鎖べプチドを得て、 これを MS /MSシークエンス分析に供する。

実施例

[0093] 以下に、 本発明の実施形態について実施例を用いて詳 述するが、 本発明は その要旨を越えない限り、 以下の実施例に限定されるものではない。

[0094] [参考実施例 1 ]

ビーズ結合ライソシン Eの合成と構诰決定、 アッセイの最谪化

本発明のスクリーニング方法を実施するに当 たり、 1 ビーズは 1 未満 のべプチドしか含まないため、 1つの系の〇 BOCライブラリーを構築する 前に小規模の手順を設計する必要がある。 そこで、 本発明者等は、 最初に、 本発明の〇 B OC戦略の実現可能性を検証するために、 T e n t a G e 丨 ビ —ズを使用してライソシン E （化合物 1） を合成することを目的とした。

[0095] （ 1） 合成の一般論

本明細書において、 特記しない限り、 空気および/または湿気に敏感なす ベての反応は、 乾燥溶媒中、 アルゴン （A r） 雰囲気下で行った。 CH ₂ C I 2、 DMF、 および E t ₂ 〇は、 G l a s s Co n t o u r溶媒分配システ ム （N i k k o H a n s e n） によって精製した。 特記しない限り、 他の 全ての試薬は供給されたままで使用した。 固相ペプチド合成 （S P PS） は 、 密閉反応容器を用いてマイクロ波支援ペプチ ド合成機 MWS— 1 000 （ EYE LA） にて行い、 当該密閉反応容器内の反応温度は、 内部温度プロー ブによってモニターした。

旋光度は、 P- 2200旋光計 （J ASC0） で記録した。 赤外線 （丨 R ） スぺクトルは、 C a F ₂ 上の薄膜として F T/丨 R-4 1 00分光計 （J A SCO） に記録した。 ¹ Hおよび ¹³ CN MRスペクトルは、 ECX500 V H NMRでは 500 MH z） 分光計、 ECZ 50 O R O H NMRでは 500 MH z） 分光計 （ J E〇 L） 、 または C r y〇 P r〇 b e （〗 Hでは 800M H z） を装備した Av a n c e I I I H D 800 MH z O Hでは 80 0MH z、 ¹³ CNMRでは 200 MH z） （B r u k e r） で記録した。 〇 2020/175451 34 卩（：170? 2020 /007391

化学シフトは、 内部標準 ^ 52. 50、 ¹³ 0539. 5） として残留溶媒のピークに関連して 5 （ ） で表記する。 スペクトルは、 |\/1 1 〇 「〇丁〇 1 1 03 I I 〇 11 I 〇 3

） エレクトロスプレーイオン化飛行時間型 （巳3 1 _丁〇 ） 質量分析計で 記録した。

リ V吸光度は□ V- 1 800 □ V- V I 3分光光度計 （ 3 丨 013

1·!） で測定した。 高速液体クロマトグラフィー 実験は、 11_ 2089 丨 リ 3インテリジェントポンプを備えた 1 ^~ 1 !_〇システムまたは 11-2086 ? I リ 3インテリジェントポンプを備えた 1 ^~ 1 !_〇システム で行った （」八3〇〇） 。 超高速液体クロマトグラフィー （II 1 ^~ 1 !_〇） 実 験は、 乂一1_〇システム （」八3〇〇） で行った。

[0096] （2） ビーズ結合型ペプチドの合成の一般的手順

化合物 29の調製

3） で洗浄した。 1_ 1 匕 「 3丁リ匕 6中のビーズに、 01\/1 （500 1_

） 中のヒドロキシエチルフォトリンカー （28. 3当量） 、 1\1、 1\1’ ージイ ソプロピルカルポジイミ ド （3当量） および 1 —ヒドロキシベンゾトリアゾ —ル （1 ^~ 1〇巳 1、 3当量） の溶液を室温で加えた。 室温で 2時間撹拌した後 、 混合物を濾過し、 口1\/1 （1. 00 !_ 3） で洗浄して光分解性リンカ —結合樹脂を得た。

!_ 丨 匕 「 ₃ 丁リ匕 6中の上記光分解性リンカー結合樹脂に、 口 IV! （ 1. 00〇11_） 中の 〇1〇〇-1_-〇 1 リー〇八 1 I ソ I （7 , 5当量） 、 1\1、 1\1’ ージイソプロピルカルボジイミ ド （5当量） および 4_ （1\1、 1\1_ジメ チルアミノ） ピリジン （〇. 5当量） の溶液を室温で添加した。 室温で 1 2 時間撹拌した後、 反応混合物を濾過し、 口1\/1 （1. 00 !_ 3） および 〇1 ^~ 1 ₂ 〇 丨 ₂ （1. 00〇!1_ 3） で洗浄して、 プレロードビーズを得た。 〇 2020/175451 35 卩（：170? 2020 /007391

上記の予め充填されたビーズに、 残りのヒドロキシ基をキヤッビングする ために室温で八 を加えた。 室温 で 30分間撹拌した後、 反応混合物を濾過し、 〇1 ^~ 1 ₂ 〇 丨 ₂ （1. 00 し 3） 、 （1. 00〇11_ 3） 、 および巳 1: ₂ 〇 （1. 00〇11_ 3） で洗浄し、 真空乾燥して化合物 29を得た。

[0097] （3） 積載率の決定

〇〇保護樹脂をピぺリジン/ 0 IV! （ 1 /4、 1 00 し） で室温に て 30分間処理した。 反応混合物を 01\/1 （2. 90 !_） で希釈した。 得 られた混合物の 301 V吸収を測定した。 ピペリジン/ 0 IV! （

1 /4） の溶液から得られた対照吸光度を差し引くこ とによってバックグラ ウンド吸光度を相殺した。 口ーディング速度 （X 01010 I /^） は以下の式 によって決定した。 ここで、 8は 01〇〇保護樹脂の重量 （019） であり、 そして 13は 301 01での吸光度である。

X = （ 1 0000X 6） / （7800X 3）

[0098] （4） ビーズ結合型ライソシン巳の合成

ビーズ結合型ライソシン巳の調製は、 光開裂可能なリンカー 28と丁 ₆ 门 I 306 I ビーズ 27のアミンとの結合体ら開始した （スキーム 1 （図 5）

） 〇 次に、 リンカーの第二級アルコールを I リー〇八 I I V I 7のカルボン酸と縮合させて、 化合物 29を 2ステップにわたって 90%の 収率で得た （3. 2 |^〇1〇 1 /ビーズ） 。 このようにして得られたビーズを 〇〇系固相ペプチド合成に供した。 アミ ドカップリングは、 合成を容易 にするためにマイクロ波支援条件下の 40°〇で行った。 更に、 ペプチドの鎖 間凝集および混入ジメチルアミンによる望ま しくない 01〇〇除去を回避す るために、 1\/1?を溶媒として使用した。

直鎖ドデカペプチドは、 6サイクルのピぺリジン促進 脱保護、 1 ^~ 1〇八 1 /1 ^~ 1八丁11媒介アミ ド化 （4〜 6、 9、 1 1、 1 2） 、 0 丨 〇/01\/1八？促 進エステル化 （1 0） 、 次いで、 脱保護およびアミ ド化 （8 、 1 3、 および 1 4） によって、 29より引き延ばされた。 次いで、 生成物 〇 2020/175451 36 卩（：170? 2020 /007391

の 1\1末端の 01〇〇基および（3末端のアリル基を、 ピぺリジン、 続いて 〇1 （ 1^ ₃ ） ₄ およびモルホリンで処理することにより 除去して、 マクロラク タム前駆体を得た。

次いで、 4 , 6—コリジンを使用してビーズ上環化を行 い、 3 7員環マクロラクタムを得た。 最後に、 マクロラクタムを水性丁 八 で処理すると、 側鎖保護基が脱離してビーズ結合型ライソシ ン巳 （化合物 3 0） が得られた。 酸性条件下でのその安定性にもかかわらず、 3 0のリンカ _は1\/| ₆ 〇1 ^~ 1に分散し紫外線 （3 6 5 nm） を照射することにより滑らかに 開裂し、 粗製物 1が得られた。 2 6ステップにわたる化合物 2 9から化合物 1 までの全体の収率は、 1\/1 3および高速液体クロマトグラフィー ） 分析によって 5 . 1 %と計算され、 この手順の効率が前の全合成 （8 . 0 %） に匹敵することを実証した。 その結果、 合成後の 1 ビーズは、 ライソシ ン巳を〇. 2 5 9含んでいた。

[0099] また、 図 6に示す蛍光強度の測定したビーズ結合型べ� �チド 3 0は以下の 手順で合成した。

ビーズ結合べプチド 3 0 :

ビーズ 2 9 （3 7 . 4〇1 9、 8. 3 0 〇1〇 1、 負荷率〇. 2 2 2〇1 111〇 丨 / 9） を、 上記のマイクロ波支援標準 3 3プロトコル、 ビーズ上エス テル化、 ビーズ上マクロラクタム化、 および脱保護に供して 3 0を得た （4

〇 〇 ₉ ）

[0100] （5） 合成したペプチドの構造決定

〇巳〇〇法においては、 1つのビーズを使用して 1つの構造を確立するこ とが不可欠である。 しかしながら、 環状ペプチドの配列決定は、 複数の位置 での開環によって引き起こされるそれらの複 雑な断片化パターンのために、 一般的に問題がある。 そこで、 分析を単純化するために、 化合物 1の大環状 化合物を、 1_ -丁 11 「一 1 と一 1 2との間の単ーエステル結合を利用するこ とによって直鎖状化した。 具体的には、 化合物 1 中の 1 % !\1 1 ^~ 1 ₃ で処理して直鎖状セコ酸 （化合物 3 1） を生成した。 化合物 3 1のマト 〇 2020/175451 37 卩（：170? 2020 /007391

リックス支援レーザー脱離/イオン化 〇\/1八1_ 0 I） 分光分析は

、 化合物 1のアミノ酸配列に一致する高品質フラグメ� �トイオンを与えた。 従って、 化合物 1の構造は、 エンコーディング技術を用いずに一義的に推 定 された。 その高い感度のために、 1\/13/1\/13シーケンス分析は1 ビーズ上の 化合物 1 （0. 04 9） の 1 5%しか必要としなかった。

[0101] （6） メナキノン錯体形成アッセイ

次に、 ビーズ上に結合したライソシン巳 （化合物 30） 及びメナキノン （ 化合物 2） を用いて、 ビーズ上複合体形成アッセイの実行可能性 を評価した。 化合物 2を化合物 30の IV! ₆ 〇1 ^~ 1溶液に添加すると、 化合物 3 0の色は黄色から赤色に変化し （図 7の 3） 、 これは、 ライソシン巳の構造 と化合物 2との間の選択的芳香族一芳香族相互作用を� �している。 ビーズが 溶液から切り出された後でさえも、 赤色が観察された （図 7の匕） 。 しかし ながら、 予備実験では、 赤色の大きさは捕獲された化合物 2の量に比例しな いことが示された。

そこで、 本発明者らは、 化合物 2を定量するための蛍光べースの方法を開 発した。 30のビーズ 1個を IV! 6〇1 ^~ 1中の化合物 2と共にインキユベートし 、 次いでマイクロプレートウエルに分注した。 IV!㊀〇 1 ^~ 1により得たビーズか らビーズに未結合の化合物 2を洗浄した後、 ビーズに結合した化合物 2をさ らに強制的かつ疎水性の条件 （50 ^° 〇で n -巳リ〇 1 ^~ 1） 下で溶出して、 化合 物 2を含有する溶出液を回収した。 次に、 化合物 2のナフトキノン部分を —巳 1_1〇1~1中の N 3巳 1~1 ₄ で還元して蛍光ヒドロキノン 21~1を生成した （ス ス % ₁₁₁₄ = 43〇 11111） 。 最後に、 化合物 30のビー ズ 1個からの 21 ^~ 1の蛍光強度を評価してビーズに結合し� �化合物 2の量を決 定した。

この方法はわずかな誤差範囲 （1 026±648. リ. ） を有し、 それは その高い精度を示した （図 5および図 6） 。 重要なことに、 複合体化アッセ イの間、 化合物 1の構造は無傷のままであった： ウルトラ 1 ^~ 1 !_〇 （11 ^ 9 !_〇） および質量分析は、 ビーズ上アッセイの前後で化合物 1の量が変化し 〇 2020/175451 38 卩（：170? 2020 /007391

ていないことを検証した。

[0102] （7） 抗菌アツセイ

最後に、 黄色ブドウ球菌に対する抗菌アツセイを小型 化して、 液相中の化 合物 1の活性を評価した。 シークエンシングは単ービーズに由 来する化合物 1の 1 5%を消費するため、 化合物 1の 0. 2 1 9に対応す る 85%をアツセイに適用した。 化合物 1の量が微量のため、 実験は単一濃 度で実施し、 増殖培地の容量は 1 ウエルあたり 40 しに縮小した。 それで も、 化合物 1の IV! I （3値 （2〜4 9/ !_） を考慮すると、 その抗菌効果 を検出するには、 化合物 1の約 0. 1 6〜〇. 32 9が必要となる。 有益 な収率でビーズから誘導された数千のペプチ ドの活性を並行して推定するた めには、 活性の検出限界を下げなければならない。 そのため、 本発明者らは 、 高感度アツセイを確立するための条件を探索 した。

[0103] 化合物 1は黄色ブドウ球菌感染マウス （巳 0 ₅₀ =〇. 5 ₉ /1< 9） にお いて強力な治療効果を有するので、 本発明者等はインビボ条件を模倣するこ とにより化合物 1のインビトロ活性を改善することを試みた� � 添加剤のスク リーニングは、 ウシの子牛血清 （巳〇 3） が化合物 1の抗菌活性を劇的に増 強することを明らかにした。 具体的には、 メチシリン感受性黄色ブドウ球菌 （1\/133八 1） に対する化合物 1の IV! I 〇値は、 1 0%巳〇3を増殖培地に 添加することによって 64分の 1 （0. 0625 9/ !_） となった。 図 7の〇に示されるように、 天然の化合物 1 （八/巳） の〇. 04 9および 単ービーズ由来の化合物 1 （〇/〇） の 85%の両方の添加は 1\/133八 1の 増殖を完全に阻害したが、 対照ウエル （日/ ） では増殖が観察された。

[0104] このようにして確立された実験プロトコルは 、 合成、 構造決定、 および単 —ビーズ由来の化合物 1のみを使用することによる性能評価を可能� �した。 したがって、 〇巳〇（3戦略全体はこれらのプロトコルに� �って設計した （図 5を参照） 。

[0105] 第一に、 2401種類のビーズ結合型ペプチドは、 分割一混合手法を用い た並行固相合成によって生成する。 第二に、 ビーズを IV! ₆ 〇! ^~ 1中で化合物 2 〇 2020/175451 39 卩（：170? 2020 /007391

と混合し、 マイクロプレートウエルに分配し、 1\/16〇1 ^~ 1および n—巳リ〇1 ^~ 1 で順次処理して、 化合物 2を含有する溶出液とビーズ結合型べプチド� �分離 した。 第三に、 溶出液への 3巳 1 ^~ 1 ₄ の添加によって生成される 21 ^~ 1の蛍光強 度を測定することによって、 ペプチドと化合物 2の錯化活性を評価した。 第 4に、 1 5%の単ービーズ由来のペプチドを直鎖状化し� ��、 その配列を 1\/13 分析によって決定した。 第 5に、 同じペプチドの 85%を用いてぺプ チドの抗微生物活性を評価した。 スクリーニングを容易にするために、 第三 段階の陽性化合物のみを第四および第五段階 に使用する。

[0106] [実施例 1 ]

ライソシン巳に甚づ <〇巳〇（3ライブラリーの構築

2401種類のペプチドを含む〇巳〇〇ライブラ� �ーは、 第 3残基、 第 6 残基、 第 9残基及び第 1 1残基の縮合時に分割混合法を適用すること� �よっ て構築した （スキーム 2 （図 8） ） 。 アミ ド化、 エステル化、 マクロ環化、 および脱保護のための試薬と条件は、 スキーム 1で開発したものと同じであ るが、 ランダム化には 1 2種類のアミノ酸 1 5-26を新たに使用した。 ここで、 実際には、 3倍のビーズ数 （約 75 1 〇ビーズ） を使用すること で、 合成上の効率を損なうことなくこのライブラ リーのカバー率を最大化す ることを計画した （ペプチドの予想カバー率 = 95%） 。 このようにして、

75 1 0個のビーズ （7 : 1 ビーズあたり 3. 2 n m〇 I） からなる 7—結 合型 29を 3段階でジペプチド 32 （化合物 32） に変換した。

第 6残基での最初のランダム化として、 化合物 32のビーズを 7つの反応 容器に分割し、 それらを天然物と同じ 〇〇アミノ酸 （1 2） および 6つ の 〇1〇〇アミノ酸 （1 1、 1 5、 1 7、 1 9、 22、 23、 および 25） と別々に縮合させ、 続いてピぺリジンで処理した。 次いで、 全てのビーズを 再度混合し、 化合物 5および化合物 4を用いて縮合を行い、 7つの構造を含 むへキサペプチド 33を得た。 7つの成分 （化合物 1 1、 1 5、 1 7, 1 9 、 22、 23及び 25） を使用する第 3残基での 2回目のランダム化に続い て、 化合物 6、 9及び 1 0の縮合/ 一脱保護を順次行い、 ノナペプチド 3 〇 2020/175451 40 卩（：170? 2020 /007391

4 （49構造） を得た。 さらに 3個のアミノ酸残基の導入、 第 1 1残基およ び第 9残基でのランダム化および第 1 0残基の縮合により、 直鎖ドデカぺプ チド 36 （2, 401構造） を合成した。

最後に、 ビーズ 36はパラジウムを用いたアリル基の除去、 マクロ環化、 およびビーズ上での脱保護により 2401種のビーズ結合型環状ペプチドに 変換した。

[0107] 以下にライソシン巳に基づく〇巳〇〇ライブ ラリーを構築した手法の詳細 を記載する。

[0108] （ 1） 分割混合法による合成の手順

2401種のビーズ結合型べプチドをぺプチド合� �機で調製した。 基本的 操作手順は以下の通りである。

工程 1 :固体支持 1\1„- 〇1〇〇ペプチド （3 〇 1、 3<50） を〇1 ^~ 1 ₂ 〇 I ₂ を含む 7つの 5 1_ 1_ 丨 匕 「 ₃ 丁リ匕 6に分割し、 真空乾燥した。 工程 2 :固相支持体 1\1„ _ 〇〇ペプチドをピぺリジン/ IV! （1 /4 、 室温、 1 〇分） で脱保護した。

工程 3 : 5〇11_の 1_ 1 匕 V a T u b _& 中の樹脂を IV! （2m L _s 30秒 X 5） で洗浄した。

工程 4 :バイアル中のアミノ酸 （4. 0当量） を、 1\/1?中の〇一 （7 -ア ザべンゾトリアゾールー 1 —イル） 一 1\1、 1\1、 1\1’、 1\!，ーテトラメチルウロ ニウムヘキサフルオロホスフエート （1 ^~ 1八丁11、 4. 0当量、 〇. 451\/1） /1 -ヒドロキシー7 -アザべンゾトリアゾール （1 ^~ 1〇八 1:、 4. 0当量、

〇. 45 IV!） の溶液によって活性化した。 活性化アミノ酸の溶液に、 1\/1? 中の丨 一 「 ₂ 巳 1: （8. 0当量、 2. 01\/〇 の溶液を加えた。 得られた 混合物を反応容器に移した。 バイアルを IV! （〇. 0072 1 1_） で 洗浄した。 溶液を反応容器に移した。

工程 5 :活性化アミノ酸を樹脂上のぺプチドとカッ� �リングさせ （ 40 ^° 〇、

1 00 ； 20分） 、 樹脂を含有する反応容器を IV! で洗浄した （2 !_

、 30秒 X 5） 〇 〇 2020/175451 41 卩（：170? 2020 /007391

ステップ 6 : 7バッチの樹脂を 1つの 1_ 1 匕 「 3丁リ匕 6で〇1 ^~ 1 ₂ 〇 I ₂ と混 合した。

[0109] 工程 1〜 6は、 残基一 3、 一6、 一 9及び一 1 1の縮合のために行われた。

工程 2〜 5は、 残基一 2、 一4、 一5、 一 7及び一 1 0の縮合のために行わ れた。

9のカップリングを室温で 40分間行った。

[0110] （2） ビーズ上エステル化

5〇11_の 1_ 丨 ビーズ結合へプタペプチド （ 8 01〇 I

、 ＜50） に、 1\/1?/〇1 ^~ 1 ₂ 〇 1 ₂ （1 /9、 500 !_） 中の 1\1、 1\1，一 ジイソプロピルカルポジイミ ド （8. 0当量） および 1 0 （8. 0当量） の 溶液を加えた。 混合物に、 1\1、 1\1—ジメチルー 4—アミノピリジン （1. 0 当量） を加えた。 室温で 3時間撹拌した後、 反応混合物を （1. で洗浄してビーズ結合デ プシぺプチドを得、 これをさらに精製することなく次の反応に使 用した。

[0111] （3） ビーズ上マクロラクタム化および脱保護

!_ I 匕 「 3丁リ匕 6中のビーズ結合デプシぺプチド 36または 35に、 〇 1 ^~ 1 ₂ 〇 1 ₂ （500 し） 中の （9 9 ^ ₃ ） ₄ （〇. 25当量） およびモル ホリン （24当量） の溶液を加えた。 室温で 30分間撹拌した後、 反応混合 物を〇1 ^~ 1 ₂ 〇 丨 ₂ （1. 00〇!1_ 5） で洗浄してビーズ結合べプチドを得た

（1 /9、 500 し） 中の ソ巳〇 （5. 0当量） および 2, 4, 6 - コリジン （1 0当量） の溶液を加えた。 室温で 1 2〜 1 4時間撹拌した後、 反応混合物を〇 1 ^~ 1 ₂ 〇 1 ₂ （1. 00〇11_ 3） 、 （1. 00〇11_ 3 ） 、 および〇 1 ^~ 1 ₂ 〇 I ₂ （ 1. 00 !_ X 3） で洗浄し、 1時間真空乾燥し、 ビーズ結合マクロラクタムを得た。

上記ビーズ結合マクロラクタムに、 丁 八/1 ^~ 1 ₂ 〇 （1 9/1、 2. 00 1-） を加えた。 室温で 1時間撹拌した後、 反応混合物を濾過し、 〇 2020/175451 42 卩（：170? 2020 /007391

び巳 1 ₂ 〇 （1. 00〇!1_ 3） で洗浄し、 真空下で乾燥させてビーズ結合型 ライソシン巳類似体を得た。

[0112] 図 5のスキーム 1 における化合物 1の収率および図 1 7の表の再合成され た化合物の収率によると、 ペプチドの全体的な収率は 2%_ 1 2% （ビーズ あたり約〇. 1 —0. 6 9のペプチド） であると推定された。

[0113] [実施例 2]

ビーズ結合 ライソシン巳類似体のメナキノンー複合体形 成アッセイ、 ！\/!3 による構造決定、 抗菌アッセイ

（1） ビーズ結合型ライソシン巳類似体の

実施例 1 において合成した 75 1 0のビーズ結合ペプチドを用いて、

-4 （メナキノン （化合物 2） ） —複合化アッセイを以下の一般的手順に従 つて行 ¹ つた。

[0114] メナキノン錯化アッセイの一般的丰順

のビーズ結合型ライソシン巳類似体に、 IV! 6〇 1 ^~ 1中の メナキノンー 4 （化合物 2） の溶液 1. 0〇11_/1 000ビー ズ） を加えた。 混合物を室温で 1 2時間インキユベートした。 M _e 〇H中の ビーズの懸濁液 （200ビーズ /20〇 し） を 2. 0 !_マイクロチユー ブに移した。

マイクロピぺッ トを使用して、 マイクロチユーブ内の各ビーズを 96ウエ ル濾過プレート （27801 1、 丁 1"16 「 111〇 3〇 I ø 1^

1: 丨 I ¹ 丨 〇、 1 ビーズ /ウエル） の各ウエルに化合物 2の溶液 （20 !-/ ビーズ） を移した。 各ウエルに （400 し） を加え、 ビーズを重 力流 （ 3） で濾過した。 プレート内のビーズを真空下で〇. 5〜 1時間乾 燥した。 乾燥したビーズを、 マイクロピペッ トを用いて、 Me〇H （20 !_/ウエル） を含む 96ウエル 〇[¾プレート （652270、 〇 6 1 门 13 丨 0— 0116、 1 ビーズ /ウエル） に移した。 溶液を 40 °0の八 「 気流下で除去して、 化合物 2とビーズ結合ペプチドとの複合体を得た。 〇 2020/175451 43 卩（：170? 2020 /007391

[0115] プレート中の化合物 2とビーズ結合型ペプチドとの複合体に、 室温で n _

B u OH (3〇M L/ウエル) を加えた。 懸濁液を 50°Cで 1時間インキユ ベートした。 プレート中に得られた混合物を 3500 X g、 室温で 1 0秒間 遠心した。 各ウエルの上清を黒色ポリスチレン平底 96ウエルプレート (6 55086、 G r e i n e r b i o— o n e) の対応するウエルに移した 。 溶液を 40 °Cの A r流下で濃縮して溶出物 2を得た。

プレート中の上記溶出物 2に、 室温で n _B u〇H (25 L/ウエル) を加えた。 プレートを室温で 1 0分間ボルテックスした。 得られた溶液に、 n - B u〇 H中の N a B H ₄ の溶液 ( 1. 0 mM、 25 L/ウエル) を加え た。 プレートを室温で 1 0分間ボルテックスした。 各ウエルのメナヒドロキ ノンの虽光 (2 H、 E x. 250 n m/Em. 430 n m) を、 G e m i n i EMマイクロプレートリーダー (Mo l e c u l a r D e v i c e s

) で 3分毎 (0、 3および 6分) に室温で測定した。 各ビーズの 3つのデー 夕点を平均し、 そしてビーズ数に対してプロッ トした。

上記の手順により 75 1 〇ウエルからの蛍光強度を定量した結果を図 9に 示す。

[0116] 図 9のドッ トプロッ トに示されるように、 蛍光強度は有意に変動しており 、 ペプチドの可変の MK錯形成活性を示している。 ライソシン E構造を有す る化合物 30が、 1 026 ±64 a. u. (スキーム 2) の強度を示したた め、 本発明者らは、 ＞1 000 a. u. の強度を示す 24 1個のビーズをヒ ッ トビーズとして定義した (図 9のチヤートの上部の囲み内) 。 こうして、 その後の実験のために、 ビーズ全体のおよそ上位 3 %が選択された。

[0117] (2) ライソシン E類似体の構造決定

次に、 24 1個のビーズ結合べプチドの構造を決定した� � 構造決定は以下 の手順に則り行った。

[0118] (a) ビーズ由来ペプチドの分離

(a- 1 ) 開裂反応用ビーズの調製

メナキノン錯化アッセイの後、 ビーズを次のように切断反応のために洗浄 〇 2020/175451 44 卩（：170? 2020 /007391

した。

マイクロピペッ トを用いて、 96ウエル 〇[¾プレート （1 ビーズ /ウエ ル） 中のビーズを、 Me OH （5〇 し/ビーズ） を含む濾過プレート （1 ビーズ /ウエル） に移した。 各ウエルに口1\/13〇 （400 し） を加え、 ビ —ズを重力流 （ 3） でろ過した。 各ウエルに M _e 〇H （400 し） を加 え、 ビーズを重力流 （ 2） で濾過した。 プレート中のビーズを真空下で 1 時間乾燥した。 乾燥したビーズを、 マイクロピペッ トを用いて、 IV! ₆ 〇 1 ^~ 1 （ 20 !-/ビーズ） を含む 96ウエル 〇[¾プレート （1 ビーズ /ウエル） に移した。 懸濁液を 40°〇の八 「流下で乾燥して乾燥ビーズを得、 これを切 断反応に使用した。

[0119] （3 _ 2） ビーズからのペプチドの開裂

96ウエル 〇[¾プレート （1 ビーズ/ウエル） 中の上記洗浄ビーズ結合 ペプチドに、 （2〇 し/ウエル） を加えた。 マイクロプレートに 、 簡易リ ランプ （八3 〇 巳、 31_ 11 ー6、 6\^/） を用いて、 1 5分 毎にランプ位置を 2本ずつずらして室温で合計 1時間 II V光 （ス = 365 n を照射した （図 1 0） 。 得られた溶液を 40°〇の八 「流下で濃縮して、 粗ライソシン巳類似体 （1ペプチド/ウエル） を得た。

[0120] （3-3） 抗菌活性アッセイおよび シーケンス分析のためのぺプ チドの分離

96ウエル 〇 プレートの粗ペプチドに IV! 6〇 1 ^~ 1 （ 1 00 !_/ウエル ） を加えた。 プレートに 8連キャップを装着し、 室温で 1分間音波処理した 。 プレート中の得られた混合物を 3500 ₉ 、 室温で 1 0秒間遠心した。

8連キャップをプレートから注意深く取り� �いた。 溶液を穏やかにピぺッテ ィングした後 （ 3） 、 IV! 6〇 1 ^~ 1中の粗ペプチドの溶液 （85 し/ウエル ） を 96ウエル丸底プレート （3367、 〇〇 「！·！ 1 1^ 9） に移した。 丸底 プレート中の溶液 （85 1-/ウエル） を 40°〇の八 「流中で乾燥させて粗 ペプチドを得、 これを抗菌活性アッセイに使用した。 〇[¾プレートに残つ た溶液 （25 し/ウエル） を 40°〇の八 「気流下で乾燥し、 粗ペプチドを 〇 2020/175451 45 卩（：170? 2020 /007391

得て、 これを IV! 3シークエンシング分析に使用した。

[0121] （匕） シーケンス解析

96ウエル 〇 プレートの粗ぺプチドに、 1 % 1 ^~ 1 ₃ を含む IV! 60 H/H 2〇 （1 /9、 20 !-/ウエル） を加えた。 混合物を室温で 1 2〜 1 4時間 インキユベートした。 反応混合物を 40°〇の八 「流下で濃縮して、 加水分解 した直鎖状べプチドを得た。

粗製直鎖状ペプチドを、 〇. 1 %丁 八 （2. 5 1-/ウエル、 4. 〇

9 / m L） を含有する 1\/16〇1\1/1 ^~ 1 ₂ 〇 （7/3） 中の シアノー4 -ヒド ロキシケイ皮酸の溶液およびクエン酸水素ニ アンモニウム溶液に溶解した。 1 ^~ 1 ₂ 〇中 （〇. 0025 !-/ウエル、 得られたぺプチ ド溶液を丁〇 /丁〇 5800 （八巳 3〇 I 6 X） 上で IV! 3 /IV! 3配列 決定分析にかけた。

[0122] 24 1個のペプチドのうち、 237個が明確な断片化バターン （図 1 1） を与え、 それらの構造を明確に確立することを可能に した （図 1 2〜 1 4の 各表を参照） 。 その結果、 それらは 1 66の異なる構造を持つことが分かっ た。 重要なことに、 1 66の化合物のうちの 1つが化合物 1 （ライソシン巳 ） であることが判明し、 何千ものペプチドの混合物から活性分子を選 択する ための 2—錯形成アッセイの信頼性が実証された。

[0123] （3） ライソシン巳類似体の抗菌アッセイ

最後に、 メナキノン錯化アッセイにおいて 1 66個の陽性化合物を用いて 溶液中抗菌アッセイを行った。 そして、 単ービーズ由来のペプチドの残り 8 5%を 1 0%巳〇3添加培地 と別々にインキユベー 卜した。 抗菌アッセイは以下の手順により行った。

[0124] （ ₃ ） 抗菌活性測定用ビーズの調製

96ウエル 〇[¾プレート （1 ビーズ/ウエル） 中のビーズを、 マイクロ ピペッ トを用いて （50 ^Ji L） を含むろ過プレート （1 ビーズ /ウ エル） に移した。 ウエルに口1\/13〇 （400 !-/ウエル） を加え、 ビーズ を重力流 （ 3） で濾過した。 ウエルに （400 !_/ウエル） を 〇 2020/175451 46 卩（：170? 2020 /007391

加え、 ビーズを重力流 （ 2） で濾過した。 プレート中のビーズを真空下で 1時間乾燥した。 乾燥したビーズを、 マイクロピペッ トを用いて、 IV! ₆ 〇 1 ^~ 1 （20 !-/ビーズ） を含む 96ウェル 〇[¾プレート （1 ビーズ /ウェル ） に移した。 懸濁液を 40°〇の八 「流下で乾燥して乾燥ビーズを得、 これを 切断反応に使用した。

[0125] b） 抗菌活性測定のためのサンプル分離

96ウェル 〇 プレートの粗ペプチドに IV! 6〇 1 ^~ 1 （ 1 00 !_/ウェル ） を加えた。 プレートに 8連キャップを装着し、 そして室温で 1分間音波処 理した。 プレート中の得られた混合物を 3500 X 9、 室温で 1 0秒間遠心 した。 8連キャップをプレートから注意深く取り除� �た。 溶液を穏やかにピ ペッティングした後 （ 3） 、 IV! 6〇 1 ^~ 1中の粗ペプチドの溶液 （85 !-/ ウェル） を 96ウェル丸底プレートに移した。 丸底プレート中の溶液を 40 °〇の八 「流下で乾燥させて粗ペプチドを得た。 プレート中の粗ペプチドに 0 1\/13〇 （1 1-/ウェル） を加えた。 プレートを抗微生物活性アッセイにか けた。

[0126] （〇） 抗菌活性アッセイ

（1 し /ウェル） 中のペプチドの溶液に、 陽イオン調整ミュラ —ヒントンブロスを含有する 1 0%ウシ血清中の黄色ブドウ球菌 丁〇〇 1 3709株の懸濁液 [4〇 !-/ウェル、 2 1 0 ⁵ コロニー形成単位 （ 40 !_ /ウェル） を添加した。 〇 11） 、 2 1 ₉ /1_ミュラーヒントンブロ ス （0 1 干〇〇） 、 50〇1 ₉ /1_ 03 ² + （0 aC ₂ 21 ^~ 1 ₂ 〇で調整） 、 および 25〇1 ₉ /1_ （1\/1 ₉ 〇 丨 ₂ · 61 ^~ 1 ₂ 〇で調整） ] 。 プレートを

37 ^° 〇で1 8時間インキュベートし、 ブロスの濁度を調べた。

[0127] その結果、 化合物 1 を含む 26の化合物は IV! 33八 1の増殖を完全に抑制 した （図 1 2〜図 1 4） 。 2つのアッセイで同定された 25個の人エペプチ ドを八 1 ~八25 （八群） と命名した。

[0128] 本発明のスクリーニング方法の〇巳〇（3戦� �を検証し、 詳細な生物学的活 性を評価するために、 八 1〜八 25を大規模に再合成することにした。 さら 〇 2020/175451 47 卩（：170? 2020 /007391

に、 第一のアツセイで陽性でありそして第二のア ツセイで陰性であった、 巳 1 5および〇 1 ~〇 5の 1 0個のぺプチドを大規模合成のために選択し た。 具体的には、 巳 1 ~巳 5 （グループ巳） は 2 -錯形成アツセイにおける 上位 5つの化合物に対応し、 〇 1 ~〇5 （グループ〇） は残りの 1 35の化 合物から無作為に抽出した。

[0129] [実施例 3]

35種の人工類似体の合成

化合物 1の 35種の人工類似体 巳 1 ~巳 5、 および〇 1 〜〇5） は、 化合物 1の合成経路に従って数ミリグラム規模で、 別々に合成 した。 原材料は、 24段階で全体的収率の 1. 8〜 1 2%で八 1 ~八 25、 巳 1 ~巳 5、 および〇 1 ~〇 5を生成するために、 により精製した （表 1および図 32〜34） 。 一貫した全体的収率 （5. 6 ±2. 9%） で の 35個の構造的に複雑な類似体の全合成は、 全固相合成経路の頑健性およ び一般性を裏付けた。 各化合物の合成手順について以下に記載する 。

[0130] ペプチド八 1 ~八25、 及び〇 1 ~〇 5をペプチド合成機で調 製した。 基本的操作手順は以下の通りである。

工程 1 :固体支持体 （1 /4、 室温、 1 〇分） で脱保護した。

1_ 13〇 L \ b V a 7 u b _& （50 〇 1未満の 31用） ] 内の樹脂を IV!

[5〇11_ （50 〇 丨以上の 31用） または 2〇11_ （50 〇 丨未満の 31用） 、 40秒 6] にて洗浄した。

工程 3 :バイアル中のアミノ酸 （4. 0当量） を、 1\/1?中の〇一 （7 -ア ザべンゾトリアゾールー 1 —イル） 一 1\1、 1\1、 1\1， 、 1\1， ーテトラメチルウ ロニウムヘキサフルオロホスフエート （1 ^~ 1八丁11、 4. 0当量、 〇. 451\/1 ） /1 -ヒドロキシー7 -アザべンゾトリアゾール （1 ^~ 1〇八 1:、 4. 0当量 、 〇. 45 IV!） の溶液によって活性化した。 〇 2020/175451 48 卩（：170? 2020 /007391

活性化アミノ酸の溶液に、 1\/1?中の丨 一? 「 ₂ 巳 1: （8. 0当量、 2. 〇1\/〇 の溶液を加えた。 得られた混合物を反応容器に移した。 このバイアル を 31の 3 〇 1用に 1\/1? （0. 0072 で洗浄した。 当該 溶液を反応容器に移した。

工程 4 :活性化アミノ酸を樹脂上のぺプチドとカッ� �リングさせ （ 40 °〇、

200 ； 20分） 、 樹脂を含有する反応容器を IV! ［5 1_ （50 〇 I以上の 31用） または （50 〇 丨未満の 31用） 、 40秒 X

6］ にて洗浄した。

工程 1〜 4を繰り返し、 アミノ酸を固体支持体上に縮合させた。

［0131］ ペプチド八 1〜八25、 巳 1〜巳 5及び〇 1〜〇 5の合成

プレロード樹脂 〇 -〇 1 リ （Wa n ₉ 樹脂） 一〇アリル （31

、 3 01〇 1） は、 1\1〇 313 1 〇〇 11601から購入した。 反応容器中の樹 月旨 31 ［20〇11_の （50以上の 3） または

\ b V a T u b _& （50未満の 3） ］ を、 〇1 ^~ 1 ₂ 〇 1 ₂ ［5 1_ （50以上の a） または （50未満の 3） 、 40秒 3］ および 1\/1? ［5 1_ （

50以上の 3） または （50未満の 3） 、 40秒 6］ で洗浄した。 樹脂を 6サイクル （6、 乂2、 5、 4、 X I、 および 6） のマイクロ波支援 3 3プロトコルに供してペプチド 32を得た。 ここで、 乂2は化合物 1 1、 1 2、 1 7、 22、 23、 および 25のうちの 1つであり、 X 1は化合 物 1 1、 1 5、 1 7、 1 9、 22、 23、 および 25のうちの 1つである。 樹脂結合ペプチド 32をマイクロ波支援 3 3プロトコルで処理した （ 9のカップリングは室温で 40分間行った） 。 反応混合物を 1\/1?/〇1 ^~ 1 ₂ 〇 I ₂ ［1 /9、 5〇11_ （50以上の 3） または （50未満の 3） 、 40 秒 6］ で洗浄してペプチド 33を得た。

［0132］ バイアル中の 1 0 （8. 0当量） に、 1\/1?/〇1 ^~ 1 ₂ 〇 I ₂ （1 /9） 中の

1\1、 1\1’ ージイソプロピルカルボジイミ ド （8. 0当量、 〇. 571\/〇 の溶 液を加えた。 得られた混合物を反応容器 ［20 !_

50以上の 8） または 5〇11_ 1_ 1 13 「 3丁リ 66 （50未満の 8） ］ 内の 〇 2020/175451 49 卩（：170? 2020 /007391 樹脂結合ペプチド 33に移した。 バイアルを 1\/1?/〇1 ^~ 1 ₂ 〇 丨 ₂ （1 /9、

〇. 0047 1 1_） で洗浄した。 得られた溶液を反応容器に移した。 反 応混合物を室温で 5分間撹拌し、 次いで （1 /9） 中の 4 - （1\1、 1\1 -ジメチルアミノ） ピリジン （1. 0当量、 〇. 821\/〇 の溶 液を加えた。 室温で 2時間撹拌した後、 得られた混合物を 1\/1?/〇1 ^~ 1 ₂ 〇 I 2 ［1 /9、 5 !_ （50以上の 3） または （50未満の 3） 、 40秒 6］ で洗浄した。 このカップリング反応を繰り返した （2度） 。 反応混合

［0133］ 樹脂結合ペプチド 34をマイクロ波支援 トコル （乂3は化合 物 1 1、 1 4、 1 7、 1 9、 23及び 25のうちの 1つ、 乂4は化合物 1 3 、 1 6、 1 8、 20、 2 1、 24、 および 26のうちの 1つ） の 3サイクル （乂4、 8、 および乂3） にかけた。 上記のマイクロ波支援 3 3プロト コルのステップ 1および 2によって、 〇〇基を除去した。 反応混合 物を〇 1 ^~ 1 ₂ 〇 丨 ₂ （50の以上の 3） または （50未満の 3）

、 40秒 6］ で洗浄してペプチド 35を得た。

以上の 3） または 結合べプチド 35に、 〇 1 ^~ 1 ₂ 〇 1 ₂ 中の （9 9 ^ ₃ ） ₄ （〇. 25当量、 〇. 01 31\/〇 およびモル ホリン （24当量、 2. 6 IV!） の溶液を添加した。

室温で 30分間撹拌した後、 反応混合物を ［5 1_ （50以上 の 3） または （50未満の 3） 、 40秒 6］ 、 1\/1? ［5〇11_ （5

0以上の 3） または （50未満の 3） 、 40秒 6） および 1\/1?/

〇1 ^~ 1 ₂ 〇 丨 ₂ ［1 /9、 5 1_ （50以上の 3） または 2 1_ （50未満の 3 ） 、 40秒 6］ で洗浄し、 ペプチド 36を得た。

反応容器中の樹脂結合べプチド 36 ［20 1_

0以上の 3） または 5011_ 1_ 1 13 「 3丁リ 66 （50未満の 3） ］ に、 〇 2020/175451 50 卩（：170? 2020 /007391

1\/1 ?/〇 1 ^~ 1 ₂ 〇 1 ₂ （ 1 /9） および 2, 4, 6 -コリジン （ 1 0当量） 中の ? ₇ 巳〇 溶液を加えた。 室温で 1 1 時間撹拌した後、 反応混合物を I ₂ （50以上の 3） または （50未満の 3） 、 40秒 X 6］

、 1\/1 ? ［5 1_ （5以上の 3） または （50未満の 3、 40秒 6

） （50以上の 3） または （50未満の 真空乾燥して、 ペプチド 37を得た。 20〇!

1_の 1_ 丨 匕 r a T u b㊀中の樹脂結合べプチド 37について、 樹脂結合ぺプ

（ 1 9/ 1、 2. 0 !_） を加えた。 室温で 1 時間撹拌した後、 反応混合物 を濾過し、 そして丁 八/1 ^~ 1 ₂ 〇 （ 1 9/ 1、 1 0 !_、 40^X 6） で洗 浄した。 合わせた濾液を 2時間撹拌した。 得られた混合物を濃縮して粗ぺプ チドを得た。 粗ペプチドに巳 1 ₂ 〇 （ 1 〇〇 !_） を加えた。 得られた混合物を 室温で 1分間超音波処理し、 そして有機層を除去した。 同じ手順を繰り返し た （2度） 。 残渣を真空乾燥して粗ペプチドを得た。

粗ペプチドを、 〇. 05 %丁 八を含有し、 〇. 05%丁 八/1 ^~ 1 ₂ 〇を含 有する に溶解した ［25/7 5、 8. 0 !_ （50以上の 3の各バ ッチに対して） または 5. O m L （50未満の 3に対して） ］ 。 溶液を I 6 「 36 3 I I 111 （3 1 8—巳 ［840〇19 （50以上の の各バッ チについて） または （50未満の 3について） ］ に充填した。 力 ラムは、 〇. 05%丁 八 ［25/7 5、 8. O m L （50以上の 3の各バ ッチに対して） または 5. O m L （50未満の 3に対して） ］ を含有し、 0 . 05%丁 /1 ^~ 1 ₂ 〇を含有する で洗浄し、 不純物を除去した。 粗 ペプチドは、 〇 05%丁 八 ［60/40、 1 6〇11_ （50以上の 3の各 バッチについて） または 1 0〇11_ （50未満の 3について） ］ を含有し、 0 . 05%丁 /1 ^~ 1 ₂ 〇を含有する で溶出し、 そして凍結乾燥した。 残渣を逆相 1 ^~ 1 1_（3により精製して、 化合物 1 （ライソシン巳） 類似体を 得た。 〇 2020/175451 51 卩（：170? 2020 /007391

[0135] （合成実施例 1）

ペプチド八 1の合成

リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 充填速度： 0 . 45 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 25、 乂2として化合物 1 2、 乂3として化合物 1 3、 および X 4として化合物 1 4を用いて上記の一般的 手順に供した。

粗製八 1 を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 20X2500101 、 溶離液 ： IV! 6〇 1 ^~ 1 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05%丁 八、 直線勾配 /巳= 50分間かけて 60/40から 85/1 5、 流速： 5. 0mL /分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラ ム：不活性〇 8-3 20X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%丁 八、 直線勾配八/巳 = 30分間かけ て 37. 5/62. 5から 45/55、 次いで 1 0分かけて 45/55、 流 速： 5. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 により精製し、 八 1 （I ^ 29. 6〜 3 1. 4分、 1 8. 7〇1 ₉ 、 1 0. 9 〇 1、 25工程で 1 0 %） : 白色の固体； [«] 0 = + 22. 2° （〇 =〇. 800、 1\/16〇1 ^~ 1）

得た。

[0136] （合成実施例 2）

ぺプチド八 2の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 25、 乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 1 6、 および X 4として化合物 1 4を使用して、 上記の一般 手順に供した。 〇 2020/175451 52 卩（：170? 2020 /007391

粗製八 2を第 1逆相 1 ^~ 1 1_〇 （カラム：不活性〇 8-3 20X25001 、 溶離液 ： IV! 6〇 1 ^~ 1 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 50分間かけて 60/40から 85/1 5、 流速 : 5. 0rr\L /分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 !_〇 （力 ラム：不活性〇 8-3 20X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇 + 0. 05

%丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%丁 八、 直線勾配八/巳 = 30分間 かけて 37. 5/62. 5から 45/55、 次いで 1 0分かけて 45/55 、 流速 = 5. 0 !_/分、 検出： II V 280 n ） により精製し、 八 2 （ 1 ^ = 35. 7〜 37. 1分、 1 2. 4〇1 ₉ 、 7. 37 〇 1、 25工程で 6 . 9%） : 白色の固体； [«] ₀ ²³ 二 +26. 2° （〇 = 0. 427、 1\/16〇 1 ^~ 1） ; （フイルム） V I 1 39、 1 203、 1 454、 1 540、 1 6 27、 1 678、 2338、 2360、 2959、 3276、 3625、 3

〇 ₁₈ [1\/1+1 ^~ 1] ⁺ 1 572. 8897の計算値 1 ^~ 1 IV! 3 （巳 3 I） 、 実測値 1 572. 8927を得た。

[0137] （合成実施例 3）

ぺプチド八 3の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 9、 乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 1 6、 および X 4として化合物 1 4を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製八 3を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 20X25001 、 溶離液 ： IV! 6〇 1 ^~ 1 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 50分間かけて 60/40から 85/1 5、 流速 : 5. Orr\L /分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 !_〇 （力 ラム：不活性〇 8-3 20X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇 + 0. 05

%丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇 + 0. 05%丁 八、 八/巳 = 50分間かけ 〇 2020/175451 53 卩（：170? 2020 /007391

て 37. 5/62. 5、 流速 = 5. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 に より精製し、 八3 （1^=27. 6〜 29. 9分、 1 3. 8019、 7. 43 〇1〇 1、 25工程で 6. 9%） : 白色の固体； [«] ⁴ = + 25. 0°

= 0. 447、 1\/16〇1 ^~ 1） ; （フイルム） V I 1 4 1、 1 200、 1 4

65、 1 5 1 5、 1 629、 1 677、 1 740、 2305、 3274、 3

〇 ₁₈ [1\/1+1 ^~ 1] ⁺ 1 629. 9475計算値 1 ^~ 1 IV! 3 （巳 3 I） 、 実測値 1

629. 9477を得た。

[0138] （合成実施例 4）

ぺプチド八 4の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 746 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 5、 乂2として化合物 1 2、 乂3として化合物 20、 および X 4として化合物 1 4を使用して、 上記の一 般手順に供した。

粗製八 4を、 第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 03-4 1 0X25

0〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 0 5%丁 八、 直線勾配八/巳= 25分間かけて 35/65から 50/50次 いで 5分かけて 50 / 50まで、 流速： 3. OmL /分、 検出： II V 280 门〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （カラム： 003-4 1 0 X 2500101、 溶出液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 0 + 0. 05%丁 八、 直線勾配八/巳= 40分間かけて 70/30から 9 0/1 0、 流速： 2. 0 !_/分、 検出： UV220 n m） により精製し、 八4 （1 ^ 1 4. 1 - 1 6. 0分、 1. 22m g _^ 〇. 705 〇 1、 2 5工程で 4. 1 %） : 白色の固体； 〇 ₇₇ 1 ^~ 1 ₁₂₃ !^ ₂₀ 〇 ₁₈ + 1 6 1 5

. 93 1 9の計算値 !! [¾ IV! 3 （巳 3 I） 、 実測値 1 6 1 5. 9277を得た

[0139] （合成実施例 5） 〇 2020/175451 54 卩（：170? 2020 /007391

ペプチド八 5の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 1、 乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 1 6、 および X 4として化合物 1 4を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製八 5を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、 溶離液 ： IV! 60 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分間かけて 25/75から 50/50まで、 流速 = 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （ カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： IV! 6〇 1 ^~ 1 + 0. 0

5%7 F A _s 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 60分 間かけて 45/55から 75/25、 流速 = 3. 0 !_/分、 検出： II V 2 80门〇〇 により精製し、 八5 （1^=55. 5〜 56. 8分、 〇. 684 9、 〇. 402 〇 丨、 25工程で 1. 8%） : 白色の固体； 〇 ₇₅ 1 ^~ 1 _{] ] 8 19} 〇 ₁₉ [1\/1+1 ^~ 1] + 1 588. 8846の計算値 1 ^~ 1 IV! 3 （巳 3 I） 、 実測値 1 588. 8895を得た。

[0140] （合成実施例 6）

ぺプチド八 6の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 5を、 乂2として化合物 1 2、 乂3として化合物 1 3、 および X 4として化合物 1 4を用いて上記の一般的 手順に供した。

粗製八 6を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、 溶離液 ： IV! 60 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 50分間かけて 25/75から 50/50、 流速 : 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラ ム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05% 丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 60分間か 〇 2020/175451 55 卩（：170? 2020 /007391

けて 45/55から 75/25、 流速 = 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 门〇〇 により精製し、 八6 （1 ^54. 3〜 55. 8分、 3. 7 1 ₉ 、 2 . 1 3 〇 丨、 25工程で 9. 8%） : 白色の固体； 〇 ₇₇ 1 ^~ 1 ₁₂₁ 1\1 ₂₀ 〇 ₁₉ [1\/1+1 ^~ 1] + 1 629. 9 1 1 1の計算値 1 ^~ 1 IV! 3 （巳 3 I） 、 実測値 1 62 9. 9 1 1 1 を得た。

[0141] （合成実施例 7）

ぺプチド八 7の合成

リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 23、 乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 20、 および乂4として化合物 1 4を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製八 7を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、 溶離液 ： IV! 60 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 50分間かけて 25/75から 50/50、 流速 : 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラ ム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05% 丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 60分間か けて 45/55から 75/25、 流速 = 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 门〇〇 により精製し、 八 7 （1^=5 1. 〇〜 52. 8分、 3. 53 ₉ 、 1 . 85 〇 丨、 25工程で 8. 8%） : 白色の固体； 〇 ₈₁ 1 ^~ 1 ₁₂₃ 1\1 ₂₀ 〇 ₁₉ [1\/1+1 ^~ 1] + 1 679. 9268の計算値 1 ^~ 1 IV! 3 （巳 3 I） 、 実測値 1 67 9. 9276を得た。

[0142] （合成実施例 8）

ぺプチド八 8の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 23、 乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 1 3、 および X 4として化合物 1 4を使用して上記の一般手 川頁に供した。 〇 2020/175451 56 卩（：170? 2020 /007391

粗製八 8を第一逆相 l·\ P LC （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、 溶離液 ： IV! 60 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 48分間かけて 25/75から 49/5 1、 流速 : 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラ ム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05% 丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05%丁 八、 60分かけて直線勾配八/巳 = 60分間かけて 45/55から 75/25、 流速： 3. 0 1_/分、 検出 : 11 280门〇〇 により精製し、 八8 （1^=55. 7〜 57. 1分、 2. 27〇19、 1. 26 111〇 1、 25工程で 5. 6 %） : 白色の固体； 〇 ₈ 〗 1 ^~ 1 _{! 21} 1\1 ₂₀ 0 ₂₀ + 1 693. 906 1の計算値 （巳 3 I） 、 実測値 1 693. 9086を得た。

[0143] （合成実施例 9）

ぺプチド八 9の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 746 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 23、 乂2として化合物 1 2、 乂3として化合物 1 6、 および X 4として化合物 1 4を使用して、 上記の一 般手順に供した。

粗製八9を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性 003-4 4. 6X25

0〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 0 5%丁 八、 直線勾配八/巳= 20分間かけて 35/65から 50/50、 次いで 1 5分間かけて 50/50、 流速： 1. 0 !_/分、 検出： II V 28

0门〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （カラム： 003-4 1 0 X 2500101、 溶出液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳= 40分間かけて 70/30から 90/1 0、 流速： 2. 0 !_/分、 検出： □ V220 n〇!） により精製し 、 八9 （t _R = 1 7. 4〜 2〇. 1分、 1. 25 019、 〇. 703 〇 1

、 25工程で 3. 8%） : 白色の固体； 〇 ₈₁ 1 ^~ 1 ₁₂₂ 1\1 ₁₉ 〇 ₁₉ [1\/1+1 ^~ 1] + 1 6 64. 9 1 59の計算値 !! [¾ IV! 3 （巳 3 I） 、 実測値 1 664. 9207を 〇 2020/175451 57 卩（：170? 2020 /007391

得た。

[0144] （合成実施例 1 0）

ペプチド八 1 0の合成

リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （3 1、 負荷率： 〇. 746 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 22、 乂 2として化合物 1 2、 乂3として化合物 1 3、 および乂4として化合物 1 4を使用して、 上記の一 般手順に供した。

粗製八 1 0を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム ：不活性 003-4 4. 6 X 2 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇 + 0.

05%丁 八、 直線勾配八/巳= 20分間かけて 35/65から 50/50 、 次いで 1 5分かけて 50/50まで、 流速 = 1 . 0 !_/分、 検出 ： II V

280门〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （カラム ： 003 -4 1 0 X 250〇1〇1、 溶出液八 ： 1\/16〇 1 ^~ 1 + 0. 05%丁 八、 溶離液 巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 40分間かけて 70/30 から 90/ 1 0、 流速： 2. 0〇! !_/分、 により精 製し、 八 1 0 （t _R = 1 5. 6〜 1 8. 3分、 1 . 1 8〇1 ₉ 、 〇. 67 1 〇1 〇 1、 25工程で 3. 7%） : 白色の固体； 〇 ₇₆ 1 ^~ 1 _{] 18} 1\1 ₂₁ 〇 ₂ 〇 +

1 644. 885 7の計算値 1 ^~ 1 IV! 3 （巳 3 丨 ） 、 実測値 1 644. 887 1 を得た。

[0145] （合成実施例 1 1 ）

ぺプチド八 1 1 の合成

〇1〇〇 - 1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （3 1、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 5、 乂 2として化合物 1 2、 X 3として化合物 24、 および乂4として化合物 1 4を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製八 1 1 を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム ：不活性〇 8-3 1 0 X 250 〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 1 ^~ 1 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05 %丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分間かけて 55/45から 80/20、 流 〇 2020/175451 58 卩（：170? 2020 /007391

速： 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （力 ラム：不活性〇 8-3 1 0X25001〇1、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1/1\/16〇

（2/1） +0. 05%丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%丁 八、 直線 勾配八/巳 = 50分間かけて 40/60〜 75/25、 流速： 3. OmLX 分、 検出： 11 280门〇〇 により精製し、 八 1 1 （1 ^27. 3〜 28.

0分、 3. 35019、 1. 88 111〇 1、 25工程で 8. 3 %） : 白色の固 体； 〇 ₈₁ 1 ^~ 1 ₁₂₂ 1\1 ₁₉ 〇 ₁₉ + 1 664. 9 1 59の計算値 （ 巳 3 I） 、 実測値 1 664. 9 1 45を得た。

[0146] （合成実施例 1 2）

ペプチド八 1 2の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 746 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 5、 乂2として化合物 1 2、 乂3として化合物 2 1および X 4として化合物 1 4を用いて上記の一般手順 に供した。

粗製八 1 2を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 03-4 1 0X25

0〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 0 5%丁 八、 直線勾配八/巳= 25分間かけて 35/65から 50/50、 次いで 30分かけて 50/50、 流速： 3. 0〇!!_/分、 検出： □ V 280 门〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （カラム： 003-4 1 0 X 2500101、 溶離液 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 0 + 0. 05%丁 八、 直線勾配八/巳= 30分間かけて 70/30から 8 5/1 5、 流速： 2. 0 !_/分、 検出： UV220 n m） により精製し、 八 1 2 （1 ^ 1 7. 4〜 1 8. 9分、 〇. 944〇1 ₉ 、 〇. 554 〇 1 、 25工程で 3. 4%） : 白色の固体； 〇 ₇₅ 1 ^~ 1 _{1 18} 1\1 ₁₉ 〇 ₁₉ [1^+（·!] + 1 5 88. 8846の計算値 （巳 3 丨） 、 実測値 1 588. 8873を 得た。

[0147] （合成実施例 1 3）

ペプチド八 1 3の合成 〇 2020/175451 59 卩（：170? 2020 /007391

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 22、 乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 1 6および X 4として化合物 1 4を用いて上記の一般的手順 に供した。

粗製八 1 3を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X250 〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05 %丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分間かけて 55/45から 80/20、 流 速： 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （力 ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇 + 0. 05 %丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%丁 八、 直線勾配八/巳 = 40分間 かけて 30/70から 50/50、 流速： 3. 0 1_/分、 検出： □ V 28 0门〇〇 により精製し、 八 1 3 （1^=32. 9〜 33. 9分、 2. 55 9、 1. 47 〇1〇 1、 25工程で 6. 1 %） : 白色の固体；

₀ 〇 ₁₉ [1\/1+1 ^~ 1] + 1 6 1 5. 8955の計算値 （巳 3 I） 、 実測値 1 6 1 5. 8967を得た。

[0148] （合成実施例 1 4）

ペプチド八 1 4の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 746 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 22、 乂2として化合物 1 2、 乂3として化合物 20、 および X 4として化合物 1 4を使用して、 上記の一 般手順に供した。

粗製八 1 4を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇カラム （不活性〇 03-4 1 0X250

〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05 %丁 八、 直線勾配八/巳 = 25分間かけて 35/65から 50/50、 次 いで 30分かけて 50/50、 流速 = 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n

003-4 1 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇 + 0. 05%丁 八、 直線勾配八/巳= 1 8分間かけて 70/30から 79 〇 2020/175451 60 卩（：170? 2020 /007391

/2 1、 流速： 2. 0 !_/分、 検出： UV220 n m） により精製し、 八 1 4 （1：［^= 1 3· 2〜 1 4. 9分、 0 939〇19、 〇. 538 111〇 1、

25工程で 3. 6%） : 白色の固体； 〇 ₇₆ ! ^~ 1 ₁₂ 〇 ₂₁ 〇 ₁₉ + 1 63

〇. 9064の計算値 （巳 3 I） 、 実測値 1 63〇. 9 1 1 2を得 た。

［0149］ （合成実施例 1 5）

ペプチド八 1 5の合成

リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 746 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 25、 乂2として化合物 1 2、 乂3として化合物 24、 および X 4として化合物 23を使用して、 上記の一 般手順に供した。

粗製八 1 5を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 03-4 1 0X25 0〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 0 5%丁 八、 直線勾配八/巳= 20分間かけて 35/65から 50/50、 次いで 1 0分かけて 50 / 50まで、 流速： 3. OmL /分、 検出： II V 2 80门〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （カラム： 003- 4 溶出液八） ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%丁 八、 溶離液 巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 30分間かけて 70/30 から 85/1 5、 流速： 2. 0〇!!_/分、 検出： により精 製し、 八 1 5 （1 ^ 1 1. 〇〜 1 2. 8分、 1. 54〇1 ₉ 、 〇. 855 〇1 〇 1、 25工程で 5. 8%） : 白色の固体； 〇 ₈₂ 1 ^~ 1 _{1 16} 1\1 ₁₉ 〇 ₂ 〇 +

1 686. 8639の計算値 1 ^~ 1 IV! 3 （巳 3 I） 、 実測値 1 686. 866 2を得た。

［0150］ （合成実施例 1 6）

ペプチド八 1 6の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 746 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 7、 乂2として化合物 1 2、 乂3として化合物 20、 および X 4として化合物 1 4を使用して、 上記の一 〇 2020/175451 61 卩（：170? 2020 /007391

般手順に供した。

粗製八 1 6を第 1逆相 1 ^~ 1 1_〇 （カラム：不活性〇 03-4 1 0X25 0〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 0 5%丁 八、 直線勾配八/巳= 25分間かけて 35/65から 50/50、 次いで 5分かけて 50 / 50まで、 流速： 3. 0mL /分、 検出： II V 28 0门〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （カラム： 003-4 1 0 X 2500101、 溶出液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳= 30分間かけて 70/30から 85/1 5、 流速： 2. 0 !_/分、 検出： □ V220 n〇!） により精製し 、 八 1 6 （1： _[ ^= 1 3· 2〜 1 5. 5分、 1. 58〇19、 〇. 905 111〇 1 、 25工程で 5. 9%） : 白色の固体； 〇 ₇₆ 1 ^~ 1 _{1 19} 1\1 ₂₀ 〇 ₂ 〇 + 1 6

3 1. 8904の計算値 （巳 3 丨） 、 実測値 1 63 1. 8889を 得た。

[0151] （合成実施例 1 7）

ペプチド八 1 7の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 7、 乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 24、 および乂4として化合物 1 4を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製八 1 7を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X250 〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05 %丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分間かけて 55/45から 80/20、 流 速： 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （力 ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇 + 0. 05

%丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分間 かけて 30/70から 55/45、 流速： 3. 0 1_/分、 検出： □ V 28 0门〇〇 により精製し、 八 1 7 （1 ^34. 1〜 35. 2分、 3.

、 1. 86 〇 丨、 25工程で 9. 3%） : 白色の固体； 〇 2020/175451 62 卩（：170? 2020 /007391

〇 ₂₁ [1\/1+1 ^~ 1] + 1 680. 8744の計算値 （巳 3 I） 、 実測値 1 680. 8766を得た。

[0152] （合成実施例 1 8）

ペプチド八 1 8の合成

リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 746 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 7、 乂2として化合物 1 2、 乂3として化合物 1 6、 および X 4として化合物 1 4を使用して、 上記の一 般手順に供した。

粗製八 1 8を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性 003-4 4. 6X2 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇 + 0.

05%丁 八、 直線勾配八/巳= 20分間かけて 35/65から 50/50 、 次いで 1 5分かけて 50/50まで、 流速 = 1. 0 !_/分、 検出： II V

280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラム：不活性 003 -4 1 0 X 溶離液 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇 + 0 . 05%丁 八、 直線勾配八/巳= 35分間かけて 70/30から 87. 5 /1 2. 5、 流速： 2. 0 !_/分、 検出： II 220 n ） により精製し

、 八 1 8 （t _R =23. 2〜 25. 3分、 〇. 82 1 〇1 ₉ 、 〇. 474 〇 I、 25工程で 2. 6%） : 白色の固体； 〇 ₇₆ 1 ^~ 1 _{1 18} 1\1 ₁₉ 〇 ₂ 〇 + 1

6 1 6. 8795の計算値 1 ^~ 1 IV! 3 （巳 3 I） 、 実測値 1 6 1 6. 881 1 を得た。

[0153] （合成実施例 1 9）

ペプチド八 1 9の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 7、 乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 2 1、 および X 4として化合物 1 4を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製八 1 9を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X250 〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05 〇 2020/175451 63 卩（：170? 2020 /007391

%丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分間かけて 30/70から 55/45、 流 速： 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （力 ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05 %丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%丁 八、 直線勾配八/巳 = 35分間 かけて 60/40から 80/20、 流速： 3. 0 1_/分、 検出： □ V 28 0门〇〇 により精製し、 八 1 9 （1^=20. 3〜 2 1. 6分、 2. 04 ₉ 、 1. 27 〇 丨、 25工程で 5. 1 %） : 白色の固体； 〇 ₇₄ 1 ^~ 1 _{] 14} 1\1 ₁₉ 〇 ₂₁ [1\/1+1 ^~ 1] ⁺ 1 604. 843 1の計算値 （巳 3 I） 、 実測値 1 604. 8409を得た。

[0154] （合成実施例 20）

ぺプチド八 20の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 1 を、 乂2として化合物 25、 乂3として化合物 2 1、 および X 4として化合物 1 4を用いて上記の一般手 川頁に供した。

粗製八 20を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X250

〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05 %丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分間かけて 30/70から 55/45、 流 速： 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （力 ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05 %丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%丁 八、 直線勾配八/巳 = 25分間 かけて 60/40から 74. 3/25. 7、 流速： 3. 0 1_/分、 検出： 11 280门〇〇 により精製し、 八20 （1 ^ 1 4. 〇〜 1 6. 2分、 1.

26〇19、 〇. 767 111〇 1、 25工程で 3. 2 %） : 白色の固体； 〇 ₇ 〇 1 ^~ 1 ₁₀₈ 1\1 ₁₉ 〇 ₂₀ + 1 534. 801 3の計算値 （巳 3 I

） 、 実測値 1 534. 7999を得た。

[0155] （合成実施例 2 1）

ぺプチド八 2 1の合成 〇 2020/175451 64 卩（：170? 2020 /007391

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 5を、 乂2として化合物 23、 乂3として化合物 20、 および X 4として化合物 1 4を使用して、 上記の一 般手順に供した。

粗製八 2 1 を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X250 〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05 %丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分間かけて 25/75から 50/50、 流 速： 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （力 ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05

%丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分間 かけて 45/55から 75/25、 流速 = 3. 0 !_/分、 検出： II V 28 〇门〇〇 により精製し、 八2 1 （1^=35. 9〜 37. 7分、 3. 86 ₉ 、 2. 04 〇 丨、 25工程で 1 0%） : 白色の固体； 〇 ₈₀ 1 ^~ 1 ₁₂₁ 1\1 ₂₀ 〇 _{1 9} [1\/1+1 ^~ 1] + 1 665. 9 1 1 1の計算値 1 ^~ 1 IV! 3 （巳 3 I） 、 実測値 1 6 65. 907 1 を得た。

[0156] （合成実施例 22）

ぺプチド八 22の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 746 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 7、 乂2として化合物 1 2、 乂3として化合物 1 6、 および X 4として化合物 23を使用して、 上記の一 般手順に供した。

粗製八 22を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 03-4 1 0X25

0〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 0 5%7 F A _s 八/巳 = 5分間かけて 35/65、 次いで直線勾配八/巳 = 2 5分間かけて 35/65から 60/40、 流速： 3. 0 1_/分、 検出： II 280门〇〇 、 第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （カラム：不活性 003-4 1 0 X 溶離液 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇 + 0 . 05%丁 八、 直線勾配八/巳= 25分間かけて 65/35から 70/3 〇 2020/175451 65 卩（：170? 2020 /007391

〇、 次いで 5分かけて 70/30、 流速： 3. 0 1_/分、 検出： フォトダ イオードアレイ検出器 1 99〜 65 1 n〇〇 、 および第 3逆相 1 ^~ 1 !_〇 （力 ラム：不活性〇 03-4 1 0X2500101、 溶離液八 ： IV! 6〇 1 ^~ 1 + 0. 0

5%7 F A _s 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 35分 間かけて 70/30から 87. 5/1 2. 5、 流速： 2. 0 !_/分、 検出 : II V 220门〇〇 により精製し、 八 22 （1 ^ 1 7. 8〜 1 9. 4分、 0 . 969〇19、 〇. 544 111〇 1、 25工程で 3. 2 %） : 白色の固体； 〇 ₇₉ 1 ^~ 1 _{1 16} 1\1 ₁₉ 〇 ₂₁ + 1 666. 8588の計算値1 ^~ 1 [¾1\/13 （巳 3 I） 、 実測値 1 666. 8624を得た。

[0157] （合成実施例 23）

ぺプチド八 23の合成

リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45〇1〇1〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 23、 X 2として化合物 25、 X 3として化合物 1 8、 および乂4として化合物 1 1 を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製八 23を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X250

〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05 %丁 八、 直線勾配八/巳= 50分間かけて 30/70から 37. 5/62 . 5、 流速： 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101） 、 溶離液八 ： IV! 6〇 1 ^~ 1

+ 0. 05%丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分間かけて 45/55から 70/30、 流速： 3. 0 1_/分、 検出 : II V 280门〇〇 により精製し、 八 23 （1 ^29. 7〜 3 1. 5分、 2 . 33〇19、 1. 44 111〇 1、 25工程で 6. 4 %） : 白色の固体； 〇 ₇₄ 1 ^~ 1 ₁₀₆ 1\1 ₁₉ 〇 ₂₂ [1\/1+1 ^~ 1] + 1 6 1 2· 7754の計算値1 ^~ | [¾1\/13 （巳3 I）

、 実測値 1 6 1 2. 7746を得た。

[0158] （合成実施例 24）

ぺプチド八 24の合成 〇 2020/175451 66 卩（：170? 2020 /007391

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 25、 乂2として化合物 22、 X 3として化合物 1 6、 および X 4として化合物 1 9を用いて上記の一般手順 に供した。

粗製八 24を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X250

〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05 %丁 八、 直線勾配八/巳= 56分間かけて 24/76から 73/27、 流 速： 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （力 ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇 + 0. 05

%丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%丁 八、 直線勾配八/巳 = 40分間 かけて 20/80から 35/65、 流速： 3. 0 1_/分、 検出： □ V 28 O n m） により精製し、 八24 （1 ^24. 2〜 26. 0分、 3. 1 7 ₉ 、 1. 74 111〇 丨、 25工程で 8. 4%） : 白色の固体； 〇 ₇₃ ^ _{1 15} N ₂₁ 〇 _{1 g} [M+2 H] ² +794. 9334の計算値 （巳 3 I） 、 実測値 794. 9346を得た。

[0159] （合成実施例 25）

ぺプチド八 25の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 25、 乂2として化合物 1 7、 X 3として化合物 1 8、 および X 4として化合物 1 4を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製八 25を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X250 〇1〇1、 溶離液 ： 1\/16〇 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05 %丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分間かけて 25/75から 50/50、 流 速： 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 1_〇 （力 ラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05

%丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分間 かけて 45/55から 70/30、 流速 = 3. 0 !_/分、 検出： II V 28 〇 2020/175451 67 卩（：170? 2020 /007391

〇门〇〇 により精製し、 八25 （1^=38. 2〜 39. 8分、 3.

、 2. 00 〇 丨、 25工程で 9. 1 %） : 白色の固体； 〇 ₇₂ 1 ^~ 1 ₁ 〇 ₈ 1\1 ₁₉ 〇 ₂₂ [1\/1+1 ^~ 1] + 1 59〇. 79 1 1の計算値 （巳 3 I） 、 実測値 1 590. 7903を得た。

[0160] （合成実施例 26）

ペプチド巳 1の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 5を、 乂2として化合物 25、 乂3として化合物 2 1、 および X 4として化合物 1 4を使用して、 上記の一 般手順に供した。

粗製巳 1 を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、 溶離液 ： IV! 60 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 50分間かけて 30/70から 55/45、 流速 : 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラ ム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05% 丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 50分間か けて 45/55から 70/30、 流速： 3. 0 1_/分、 検出： 11 28

〇门〇〇 により精製し、 巳 1 （1^ = 40. 〇〜 42. 6分、 2. 24 ₉ 、 1. 35 〇 丨、 25工程で 6. 1 %） : 白色の固体； 〇 ₇₂ 1 ^~ 1 _{1 13} 1\1 〇】 9 [1\/1+21 ^~ 1] ² +773. 9225の計算値 （巳 3 I） 、 実測値 77 3. 9234を得た。

[0161] （合成実施例 27）

ぺプチド巳 2の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 7、 乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 1 6、 および X 4として化合物 25を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製巳 2を第 1逆相 !! !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 〇 2020/175451 68 卩（：170? 2020 /007391

、 溶離液 ： IV! 6〇 1 ^~ 1 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 60分かけて 40/60から 70/30、 流速： 3. 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラム :不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇 + 0. 05%7 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 50分間かけ て 25/75から 50/50、 流速： 3. 0rr\L /分、 検出： II V 280 门〇〇 により精製し、 巳 2 （1^=25. 4〜 26. 5分、 3. 35 ₉ 、 2 . 1 3 〇 1、 25工程で 9. 9%） : 白色の固体； 〇 ₇₃ 1 ^~ 1 _{] 12} 1\1 ₁₉ 0 ₂₀ [1\/1+1 ^~ 1] + 1 574. 8326の計算値 1 ^~ 1 IV! 3 （巳 3 I） 、 実測値 1 57 4. 8357を得た。

[0162] （合成実施例 28）

ペプチド巳 3の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 7、 乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 20、 および X 4として化合物 23を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗巳 3を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101

、 溶離液 ： IV! 6〇 1 ^~ 1 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05%丁 八、 直線勾配 /巳= 60分間かけて 40/60から 70/30、 流速： 3. 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラム :不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇 + 0. 05%7 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 50分かけて 25/75から 50/50、 流速： 3. OmL /分、

） により精製し、 巳 5 （1^=30. 8〜 32. 2分、 4. 34 ₉ 、 2. 4 2 〇 I、 25工程で 1 1 %） : 白色の固体； 〇 ₇₉ 1 ^~ 1 _{1 17} 1^ ₂₀ 〇 ₂₁ [IV! + 1 ^~ 1] + 1 681. 8697の計算値 （巳 3 I） 、 実測値 1 681. 8 727を得た。

[0163] （合成実施例 29） 〇 2020/175451 69 卩（：170? 2020 /007391

ぺプチド巳 4の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 23、 乂2として化合物 1 1、 X 3として化合物 26、 および X 4として化合物 1 9を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製巳 4を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、 溶離液 ： IV! 60 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 40分間かけて 25/75から 35/65、 流速 : 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラ ム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05% 丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 50分間か けて 45/55から 62. 5/57. 5、 流速： 3. 0 1_/分、 検出： II V 280门〇〇 により精製し、 巳4 （1 ^ 1 8. 4〜 1 9. 8分、 0. 74 3〇19、 〇. 401 〇 丨、 25工程で 2. 0 %） : 白色の固体； 〇 ₇₆ 1 ^~ 1 _{! 14} 1\1 ₂₀ 0 ₂₀ [IV! +21 ^~ 1] ² + 81 3. 4254の計算値 （巳 3 I） 、 実測値 81 3. 4276を得た。

[0164] （合成実施例 30）

ぺプチド巳 5の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 7、 乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 24、 および X 4として化合物 1 7を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製巳 5を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、 溶離液 ： IV! 60 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 38分かけて 25/75から 44/56、 流速： 3. 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラム

:不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%7 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05%丁 八、 直線勾配八/巳 = 40分間かけ 〇 2020/175451 70 卩（：170? 2020 /007391

て 50/50から 70/30、 流速： 3. 0mL /分、 検出： II V 280门

81 75を得た。

[0165] （合成実施例 3 1）

ペプチド〇 1の合成

リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 5、 乂2として化合物 1 2、 X 3として化合物 24、 および X 4として化合物 1 1 を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製〇 1 を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、 溶離液 ： IV! 60 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 50分かけて 25/75から 50/50、 流速： 3. 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラム

:不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%7 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05%丁 八、 直線勾配八/巳 = 50分かけて 45/55から 70/30、 流速： 3. OmL /分、

） により精製し、 〇 1 （1^=38. 2〜 39. 6分、 3. 44 ₉ 、 1. 9 6 〇 丨、 25工程で 8. 8%） : 白色の固体； 〇 ₇₈ 1 ^~ 1 _{] 16} 1\1 ₁₉ 〇 ₂₀ [IV! + 1 ^~ 1] + 1 638. 8639の計算値 （巳 3 I） 、 実測値 1 638.

8627を得た。

[0166] （合成実施例 32）

ぺプチド〇 2の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45〇1〇1〇 1 / ₉ ） を、 X I として化合物 25、 X 2として化合物 25、 X 3として化合物 24、 および X 4として化合物 23を使用して、 上記の一般 手順に供した。 〇 2020/175451 71 卩（：170? 2020 /007391

粗製〇 2を第 1逆相 1 ^~ 1 1_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、 溶離液 ： IV! 60 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 50分間かけて 30/70から 55/45、 流速 : 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラ ム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05% 丁 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 35分間か けて 60/40から 80/20、 流速： 3. 0 1_/分、 検出： □ V 280 门〇〇 により精製し、 〇2 （t _R =7. 69〜 9. 1 9分、 1. 48 ₉ 、 0 . 843 〇 丨、 25工程で 4. 0%） : 白色の固体； 〇 ₇₉ 1 ^~ 1 _{] ]} 〇 1\1 _{] 9} 〇 _{2 0} [1\/1+1 ^~ 1] + 1 644. 81 69の計算値 1 ^~ 1 IV! 3 （巳 3 I） 、 実測値 1 6 44. 81 39を得た。

[0167] （合成実施例 33）

ぺプチド〇 3の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 1、 乂2として化合物 25、 X 3として化合物 24、 および X 4として化合物 25を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製〇 3を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、 溶離液 ： IV! 60 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 50分かけて 30/70から 55/45、 流速： 3. 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラム :不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇1 ^~ 1 + 0. 05%7 八、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 30分かけて 60/40から 73. 3/26. 7、 流速： 3. 0 1_/分、 検出： 11 2 80门〇〇 により精製し、 〇3 （1^=7. 5 1〜 8. 82分、 〇. 870 9、 〇. 5 1 7 〇1〇 1、 25工程で 2. 5 %） : 白色の固体； 〇 ₇₃ 1 ^~ 1 _{! 07 ! 9} 〇 ₂₀ [1\/1+21 ^~ 1] ² +784. 8964の計算値 （巳 3 I） 、 実測 値 784. 8957を得た。 〇 2020/175451 72 卩（：170? 2020 /007391

[0168] （合成実施例 34）

ぺプチド〇 4の合成

リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 7、 乂2として化合物 23、 X 3として化合物 1 3、 および X 4として化合物 1 4を使用して上記の一般手 川頁に供した。

粗製〇 4を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、 溶離液 ： IV! 60 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 八、 直線勾配八/巳= 45分かけて 25/75〜 47. 5/52. 5、 流速 = 3. 0 !_/分、 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （ カラム：不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： IV! 6〇 1 ^~ 1 + 0. 0

5%7 F A _s 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+〇. 05%7 F A _s 直線勾配八/巳 = 50分 かけて 45/55〜 70/30、 流速： 3. 0 1_/分、 検出： 11 28

〇门〇〇 により精製し、 04 （1^ = 40. 4〜 4 1. 9分、 1. 62 ₉ 、

0. 955 〇1〇 1、 25工程で 4 1 %） : 白色の固体； 〇 ₇₉ 1 ^~ 1 _{1 15} 1\1 ₂ 〇 〇 ₂₂ [1\/1+1 ^~ 1] + 1 695. 8489の計算値 （巳 3 I） 、 実測値 1 695. 8484を得た。

[0169] （合成実施例 35）

ペプチド〇 5の合成

〇1〇〇-1_ -〇 1 リ （Wa n g樹脂） 一〇アリル （31、 負荷率： 〇. 45 〇 丨 / ₉ ） を、 X I として化合物 1 7、 乂2として化合物 23、 X 3として化合物 24、 および X 4として化合物 25を使用して、 上記の一般 手順に供した。

粗製〇 5を第 1逆相 1 ^~ 1 !_〇 （カラム：不活性〇 8-3 1 0X25001 、 溶離液 ： IV! 60 + 0. 05%丁 、 溶離液巳 ： 1 ^~ 1 ₂ 〇+ 0. 05% 丁 、 直線勾配 /巳= 50分かけて 25/75から 50/50、 流速： 3. 検出： II V 280 n〇〇 および第 2逆相 1 ^~ 1 P LC （カラム :不活性〇 8-3 1 0X2500101、 溶離液八 ： 1\/16〇 !! + 0. 05%7 〇 2020/175451 73 卩（：170? 2020 /007391

FA、 溶離液 B : H ₂ 〇 +〇. 05%T FA、 直線勾配 A/ B = 50分かけて 45/55から 70/30、 流速： 3. 0 m L /分、 検出： U V 280 n m ） により精製し、 C5 （t _R =32. 2〜 34. 6分、 1. 54m g、 0. 9 1 3 M m〇 u 25工程で 4. 3%） : 白色の固体； C ₈₀ H _{1 10} N _{i g} 〇 ₂₂ [ M+ H] + 1 688. 8067の計算値 H RMS （ES I） 、 実測値 1 688 . 8095を得た。

[0170] [実施例 4]

35種の人工類似体の杭微生物スぺクトルと MK_ 4依存的膜破壊活忡

全合成した 35種類のライソシン E類似体の抗菌活性を評価し、 ライソシ ン E （化合物 1） の抗菌活性と比較した （図 1 7） 。 M 丨 Cアツセイは、 C l i n i c a l a n d L a b o r a t o r y S t a n d a r d s I n s t i t u t eのプロトコルに従って行った。 ぺプチドの抗微生物活性は 微量希釈法を用いて測定した。

[0171] M l C値は、 6株のグラム陽性細菌： M S S A 1、 メチシリン耐性黄色ブ ドウ球菌 （MRSA4） 、 スタフイロコツカスへモリテイカス、 セレウス菌 、 枯草菌、 およびリステリアモノサイ トゲネスに対する 2倍段階希釈手順に よって決定された。 さらに、 MSS A 1 に対するペプチドの効果は BCS、 つまり活性増強血清の有無にかかわらず評価 した。 各 A群、 B群、 または C 群の化合物は、 1 0%BCSの存在下での MSS A 1 に対する活性の降順で 記載した。 化合物が BCS存在下での MSS A 1 に対して同じ M 丨 C値を示 したとき、 BCS非存在下での MSS A 1の値をそれらの順序付けに使用し た。 活性の強さは、 カラーグラデーションヒートマツプ形式で表 示した。

[0172] 最も重要なことには、 MS S A 1 に対する A 1〜 A 1 1の 1 1個の新規類 似体の M 丨 C値は、 増殖培地に 1 0 % B C Sを添加すると 0. 01 5 M 9 / mL~0. 0625 g /m Lであることが分かった。 従って、 化合物 1 （ 0. 0625 M g/m L） の活性に比べ、 より効力がある、 または同じ効力 がある。 これらのうち、 3つの人エペプチド A 1、 A 2、 および A 3は、 天 然の化合物 1 よりも 4倍高い抗菌活性を示した。 化合物 1 （ 0. 25 M 9 / 〇 2020/175451 74 卩（：170? 2020 /007391 1_） と同様に、 八 1 ~八3も巳3〇添加 （それぞれ 0. 25、 〇. 25、 および〇. 1 25 9/ 1_） に対して高い活性を示し、 1\/^3 八感染症の治療におけるそれらの潜在的な有 用性を示唆している。 さらに、

7つの化合物八 1 2~八 1 8は化合物 1 よりやや弱かったが、 それでも強い 抗菌効果を保持していた。

—方、 八群の残りの 7つのペプチド八 1 9~八 25は、 IV! 丨 〇値が 4. 0 9/ 1_よりも高いため、 偽陽性化合物として分類される。 単一点抗菌ァ ッセイ （図 5） の結果によると、 巳群 （巳 1 ~巳 5） および（3群 （<31 ~〇 5） の化合物はいずれも低い IV! 丨 <3値を持っていなかった。 その結果、 八群 の 26個のぺプチドの 69%ならびに巳群および〇群の 1 0個のぺプチドの 0%が活性であった。 このように、 本発明のスクリーニング方法により複数 の活性類似体を発見することができ、 本発明の方法の妥当性が確認された。

[0173] 次に、 巳〇 3を使用せずに、 6つのグラム陽性菌に対する八群〜〇群の 3

6化合物の抗菌活性を評価した。 天然の化合物 1および 1 8個の類似体八 1 〜八 1 8は1\/1[¾3八 1 を含む全ての株に対して活性であったが、 八 1 9〜八 25、 巳 1 ~巳 5、 および〇 1 ~〇 5は細菌に対して弱いまたは無視できる ほどの影響しか及ぼさなかった。 興味深いことに、 巳〇3は、 1\/133八 1 に 対する八 1 1 4の活性を 1 6〜 533倍増強したが、 添加剤は八 1 5〜 八 1 8の活性を 2〜 4倍しか増大させなかった。 血清の増強効果の構造依存 性は、 この現象に対する分子物質の存在を示した。

八 1 1 8の株選択性は類似していることが分かった� � これらは 3. へ モリチカスおよび巳. セレウスに対してより活性があり、 ！-. モノサイ トゲ ネスに対しては活性が低い。 八 1 5と八 1 7は他のペプチドとわずかに異な っていたが、 ！-. モノサイ トゲネス （1\/1 丨 〇= 64 9/ !_） 、 巳. セレ ウスと枯草菌 （IV! 丨 0= 1 6 9/ !_） には各々弱い影響しかなかった。 これらの結果は、 化合物 1の構造変化が株選択性を減弱させるのに有� �であ ることを実証した。

[0174] 合成されたライソシン巳類似体がライソシン 巳と同様の作用機序を有する 〇 2020/175451 75 卩（：170? 2020 /007391

ことを確認するために、 細菌細胞膜のモデルとしてリポソームを用い ること によって 36の合成ペプチ （化合物 2） 依存的膜破壊活性を推 定した。 卵黄ホスファチジルコリン （ 〇） /卵黄ホスファチジルグリセロ _ル （ 〇） （50 : 50の比） を含む大きな単層小胞 （1_ 11 3） を調製 して、 細菌膜の負に帯電した表面を模倣した。 〇/ 〇からなる 1_ II Vに （2） の 1. 25モル％、 または II〇一 1 0 （ユビキノン （ 化合物 3） ） の 1. 25モル％で添加して、 化合物 3に対する化合物 2への 選択性を評価した。 PCXPGX2 _S PCXPGX3 _S および 〇/ 〇を 含む 3つの！- II V 3の中に、 カルボキシフルオレセイン （〇 ） を蛍光指示 薬としてカプセル化した。 3種類の !_ II Vに対するべプチドの膜破壊活性は 、 様々な濃度の蛍光変化 （％） を測定することによって最大半減応答 （巳〇; 〇） 値として定量した。

[0175] 90/90/2 _% 90/90/3. および 〇/ 〇 1_ 11 についての 化合物 1の巳（3 ₅ 。値は、 それぞれ 1 9. 5 nM、 92. 0 n M _% および 55 9 _n IV!であると決定され （図 1 6） 、 化合物 1 による化合物 2依存的な膜破 壊が確認された。 化合物 1の、 化合物 2に対する選択性指数は、 4. 7 （= 92. 0/1 9. 5） であると計算された。 注目すべきことに、 35の類似 体のうち 27 （八 1 ~八22、 巳 1、 巳 2、 および〇 1 ~〇3） が、 9〇/ 90/2 !_ II Vについて検出可能な巳（3 ₅ 。値および 2. 9を超える選択性 指数を有していた。

これらのデータは、 リポソーム膜の化合物 2依存的破壊が抗菌活性にとっ て十分な条件ではないことを示した。 高い割合の膜破壊性類似体は、 2—錯 化アツセイにおける八群〜〇群のすべてのぺ プチドの強力な活性を反映して いたと考えられる （図 8） 。 重要なことに、 八 1 ~八 1 1の 1 1個の最も強 力な抗菌化合物は、 90/90/2 1_ 11 （巳〇 ₅ 。= 1 〇. 7〜 38. 8 门 IV!） に対して化合物 1 （1 9. 5 n IV!） に匹敵する膜破壊活性を示した。 したがって、 化合物 1 と 1〜 1 1は同じ化合物 2依存的な作用機序を有 することが示唆される。 また、 八 7 （1 9. 7） 、 八 1 4 （＞1 9. 7） 、 〇 2020/175451 76 卩（：170? 2020 /007391

および八 1 6 （2 0 . 6） の選択性指数が八 1 （4 . 7） のそれよりも高い ことは注目に値し、 キノン選択性は化合物 1の構造変化によって減衰できる ことを示唆している。

[0176] 以上の結果から、 抗菌および 2選択的膜破壊活性の構造的要件に関する貴 重な情報を集めることができた （図 1 8 3）。 最も注目すべきことに、 化合 物 1および 1 1個すベての強力な類似体 1 ~ 1 1は残基一 6でロイシン （!_） を、 そして残基一 1 1でイソロイシン （丨） を共有する。 八 1 5以外 の活性の低い八 1 2 ~八 1 8でさえ、 同じ 2つの残基を持っている。 したが って、 これらの残基は強力な抗菌機能に不可欠であ る可能性が最も高い。

!_および丨 は疎水性があり、 嵩高いため、 2つの側鎖は細菌膜または化合 物 2の疎水性脂質尾部と相互作用し、 および/または生物活性立体配座を形 成するであろう。 保存された残基一 6および一 1 1 とは対照的に、 残基一 3 および一 9は有意に変化しており、 これらの部分構造の活性に対する相対的 な無関係を示している。

化合物 1の残基一 3および一 9、 八 1 ~八 1 4、 および八 1 6 ~八 1 8は 、 それぞれ 7および 5アミノ酸残基に対応する。 それらの中で、 最も高い抗 菌活性を有する八 1 ~八 3は、 残基一 3にアラニン （八） またはリジン （ ） および残基一 9にパリン （V） またはグルタミン （〇） を有する。 一方、 最も高い化合物 2—選択性を有する八 7、 八 1 4および八 1 6の全てにおい て、 残基一 9にオルニチン （〇） を含み、 このことはこれら部分構造の特異 的効果を意味する。 注目すべきことに、 化合物 1および最も強力な八 1は、 残基一 3におけるヒドロキシ基の存在または非存在� �おいてのみ異なる。

[0177] 類似体八 1 5は、 残基一 3、 _ 9、 および一 1 1 において、 化合物 1 と異 なる （図 1 8匕） 。 すなわち、 八 1 5では、 化合物 1のセリン （3） 、 グル タミン （〇） 、 およびイソロイシン （丨） が、 それぞれアラニン （八） およ び 2つのチロシン （丫） に置き換えられている。 抗微生物類似体の中の八 1 5のこの独特の突然変異パターンは、 添加に対する非感受性と異なる 細菌株選択性、 といった異なる生物学的行動の原因となる。 巳 0 3添加と異 〇 2020/175451 77 卩（：170? 2020 /007391

なる細菌株選択性に対する非感受性。 興味深いことに、 1 5の残基一 6の ロイシン （!_） をアラニン （八） に変えると、 非抗菌性 0 2が得られ、 これ もまた、 残基一 6の側鎖の活性に対する意義を裏付けるもの� �ある。 全体と して、 本戦略は、 化合物 1の機能を増強および調節するための極めて� �要な 構造因子を抽出するのに有効であることが証 明された。