FUJIHARA TSUYOSHI (JP)
| WO2002020543A2 | 2002-03-14 | |||
| WO2003078623A1 | 2003-09-25 |
| JP2008162992A | 2008-07-17 |
ERITJA RAMON ET AL.: "A synthetic procedure for the preparation of oligonucleotides without using ammonia and its application for the synthesis of oligonucleotides containing O-4-alkyl thymidines", TETRAHEDRON, vol. 48, no. 20, 1992, pages 4171 - 4182
| 二のヌクレオシド化合物が連結してなる核酸合成用ダイマーアミダイドであって、前記二のヌクレオシド化合物が亜リン酸トリエステル結合を介して連結してなることを特徴とする核酸合成用ダイマーアミダイド。 |
| 核酸合成時に、亜リン酸トリエステル結合が酸化によりリン酸トリエステル結合とされた後、該リン酸トリエステル結合におけるリン酸基の保護基が、非プロトン性溶媒中で脱保護可能である請求項1に記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。 |
| 非プロトン性溶媒が、アセトニトリル、ジクロロメタン、DMF、及び、N-メチルピロリドンからなる群より選択される少なくともいずれかである請求項2に記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。 |
| 核酸合成時に、亜リン酸トリエステル結合が酸化によりリン酸トリエステル結合とされた後、該リン酸トリエステル結合におけるリン酸基の保護基が、嵩高い塩基により脱保護可能である請求項1から3のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。 |
| 嵩高い塩基が、DBU、DBN、及び、テトラメチルグアニジンからなる群より選択される少なくともいずれかである請求項4に記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。 |
| リン酸基の保護基が、シアノエチル基及びその誘導体、フルオレニルメチル基及びその誘導体、フェネチル基及びその誘導体、並びに、ニトロエチル基及びその誘導体からなる群より選択されるいずれかである請求項2から5のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。 |
| 二のヌクレオシド化合物のうち少なくともいずれか一方のヌクレオシド化合物が、塩基の環外アミノ基に結合された保護基を有し、かつ、該保護基が非プロトン性溶媒中で脱保護可能である請求項1から6のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。 |
| 保護基が、直接、塩基の環外アミノ基に結合してなる請求項7に記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。 |
| 保護基が、置換基を介して塩基の環外アミノ基に結合してなる請求項7に記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。 |
| 保護基が結合される塩基が、アデニン、グアニン、及び、シトシンのいずれかである請求項7から9のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。 |
| 下記構造式(1)~(11)のいずれかで表される請求項1から10のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。 |
| 請求項1から11のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイドを用いることを特徴とする核酸合成方法。 |
| 核酸合成用ダイマーアミダイドの縮合反応の後、前記核酸合成用ダイマーアミダイドの保護基の脱保護が行われる請求項12に記載の核酸合成方法。 |
| 非プロトン性溶媒中で脱保護が行われる請求項12から13のいずれかに記載の核酸合成方法。 |
| 嵩高い塩基により脱保護が行われる請求項12から14のいずれかに記載の核酸合成方法。 |
| 0.01M DBU濃度以下で脱保護が行われる請求項12から15のいずれかに記載の核酸合成方法。 |
| 15分以内に脱保護が行われる請求項12から16のいずれかに記載の核酸合成方法。 |
| 核酸自動合成装置を用いて行われる請求項12から17のいずれかに記載の核酸合成方法。 |
| 請求項12から18のいずれかに記載の核酸合成方法により得られることを特徴とする核酸。 |
| 置換基を有する修飾核酸である請求項19に記載の核酸。 |
本発明は、修飾核酸等の核酸の合成に好 な核酸合成用ダイマーアミダイド、及びそ を用いた核酸合成方法に関する。
人間の全遺伝子情報が既に明らかになった
その結果、研究者や科学者の興味の中心は
伝子産物である蛋白質の解析に移行してい
。蛋白質の解析においては、対象となる個
の蛋白質に対してアフィニティー(結合性)
有する分子を得ることによって、初めて実
的な解析が可能になるといっても過言では
い。しかしながら、細胞中には非常に多種
の蛋白質が存在し、そのアミノ酸配列や構
が未知であるものも多い。
ある特定の蛋白質に対してアフィニティー
有する分子を得る最も一般的な手法は、動
の免疫系を用い、アフィニティー抗体を作
する方法である。しかし、この方法では動
を用いるため、多量の蛋白質や多大な工程
費用が必要となり、しかもある特定の物質
対するアフィニティー抗体は生成されない
いう欠点があった。
このような問題を解決するために、生物 依存しないアプタマー法(別名:SELEX法)も提 されているが、この方法で得られる分子は 特定の蛋白質に対しては強い相互作用を示 ものの、必ずしも全ての蛋白質に応用可能 ものではなかった。そこで本発明者らは、 記アプタマー法を改良し、修飾核酸を用い 修飾アプタマー法を提案している(特許文献1 参照)。しかしながら、このような修飾アプ マー法では、複数種の置換基を有する修飾 酸を用いるため、蛋白質とアフィニティー 有する修飾核酸を増幅しようとした際には 個々の置換基の特性を考慮しなくてはなら 、良好なPCR増幅条件の選定が困難であった また、標的物質に強く結合する機能性分子 ど、PCRで増幅しにくいという欠点もあった
このような問題を解決するために、本発 者らは既に、蛋白質との結合に関与する置 基の種類とダイマーアミダイドの配列情報 が一対一に対応しており、かつ、アンモニ 処理により除去可能な結合で置換基を導入 ておくことで、蛋白質と結合させた後にこ らの置換基を除去し、PCR増幅を行うことが 能な修飾核酸の原料ダイマーアミダイドを 案している。しかしながら、これらのダイ ーアミダイドでは、ダイマーアミダイド内 、酸に非常に不安定な部位、及び、塩基に 常に不安定な部位が共存しているため、精 によりほとんど分解されてしまうという欠 がある。そのため未精製で使用せざるをえ 、特定のダイマーアミダイドでは、核酸自 合成装置による核酸合成収率が悪くなって まう場合もあり、更なる改良が望まれてい 。
一方で、核酸の固相合成は、20年以上も から行われており、自動合成装置もその時 で販売されている。核酸の固相合成は、例 ば、ヌクレオシドを結合させた固相担体(例 ば、CPG)に核酸原料(アミダイド)を縮合反応 せていくことにより行われるが、この縮合 応の際には、前記アミダイドのリン酸部分 他方の水酸基のみを縮合反応に関与させ、 れ以外の反応性基は縮合反応に関与させず 行う必要がある。したがって、使用するア ダイドの塩基が有する環外アミノ基や、縮 反応に関与させないリン酸部分の反応性基 には、保護基を導入して縮合反応への関与 防止し、全縮合反応が終了した後、保護基 脱離する(脱保護する)ことが必要となる。 来から、塩基の環外アミノ基に導入する保 基としては、ベンゾイル基、イソブチリル 等が用いられており、これらの保護基の脱 護には、濃アンモニア水を、55℃で8~15時間 作用させる方法が一般的であった。
しかしながら、前記したような、蛋白質に
してアフィニティー(結合性)を有する修飾
酸の製造においては、このような従来の脱
護条件では、保護基の脱保護とともに、修
核酸における修飾部分(蛋白質との結合性を
する置換基部分)までもが脱離してしまい、
安定して修飾核酸を製造することができない
という問題があった。したがって、このよう
な修飾核酸を製造するにあたっては、保護基
の脱保護とともに、蛋白質との結合性を有す
る置換基部分までもが外れてしまわないよう
、より緩やかな条件下で保護基の脱保護が可
能なアミダイドを用いることが求められてい
る。
例えば、従来の技術において、嵩高い塩基
シアザビシクロウンデセン(DBU)で脱保護可
な核酸アミダイドなどが報告されているが(
特許文献1~2)、これらの核酸合成用アミダイ
ドは、非プロトン性溶媒であるアセトニトリ
ル中で不安定であり(非特許文献5)、実用には
向かないものであった。また、ピリジン中、
0.5M DBUの条件下、16時間で脱保護可能である
酸合成用アミダイドも報告されている(非特
許文献3~4)が、高濃度のDBU、長時間による脱
護のため、核酸塩基へのアルキル化が起こ
という問題があった。また、メタノール中
K 2
CO 3
を用いた条件下で脱保護可能である核酸合成
用アミダイドも報告されている(非特許文献5~
6)が、プロトン性溶媒であるメタノール中で
基のK 2
CO 3
を使用するため、エステル等が分解するとい
う問題があった。
したがって、精製が可能であり、好まし は更に、緩やかな条件下で保護基の脱保護 可能な核酸合成用ダイマーアミダイド、及 前記核酸合成用ダイマーアミダイドを利用 た核酸合成方法の開発が、未だ望まれてい のが現状である。
本発明は、従来における前記問題を解決 、以下の目的を達成することを課題とする 即ち、本発明は、精製が可能であり、好ま くは更に、緩やかな条件下でリン酸基及び 基の保護基の脱保護が可能な核酸合成用ダ マーアミダイド、及び前記核酸合成用ダイ ーアミダイドを利用した核酸合成方法を提 することを目的とする。
前記課題を解決するための手段としては、
下の通りである。即ち、
本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドは
二のヌクレオシド化合物が亜リン酸トリエ
テル結合を介して連結してなることを特徴
する。前記核酸合成用ダイマーアミダイド
、二のヌクレオシド化合物が亜リン酸トリ
ステル結合を介して連結してなるため、リ
酸トリエステル結合を介して連結してなる
イマーアミダイドと比較して、塩基性条件
安定性が高く、精製が可能である。そのた
、精製が困難な、リン酸トリエステル結合
介して連結してなるダイマーアミダイドと
較して、高純度の核酸合成用ダイマーアミ
イドとして得ることができる。また、前記
酸合成用ダイマーアミダイドは、好ましく
更に、非プロトン性溶媒中で脱保護可能な
ン酸基及び塩基の保護基、即ち、緩やかな
件下で脱保護可能なリン酸基及び塩基の保
基を有するものであるため、例えば、塩基
保護基と塩基との間に、所望の置換基を安
に導入することも可能である。
本発明の核酸合成方法は、本発明の前記 酸合成用ダイマーアミダイドを用いること 特徴とする。前記したように、前記核酸合 用ダイマーアミダイドは精製が可能である め、前記核酸合成方法においては、精製さ た高純度の核酸合成用ダイマーアミダイド 用いることができ、そのため、未精製のダ マーアミダイドを用いた場合と比較して、 い核酸合成収率を得ることが可能となる。 た、前記核酸合成用ダイマーアミダイドは 好ましくは更に、緩やかな条件下でリン酸 及び塩基の保護基を脱保護可能であるため 例えば、塩基に導入された置換基を脱離さ ることなしに、塩基の保護基の脱保護を容 に行うことができ、即ち、所望の置換基を する核酸を安定に製造することができる。
本発明の核酸は、本発明の前記核酸合成 法により得られることを特徴とする。前記 酸は、好ましくは所望の置換基を有する修 核酸であり得、このような修飾核酸は、置 基を介して、蛋白質等の標的物質との結合 可能である。したがって、前記核酸は、例 ば蛋白質等の標的物質の解析に、好適に利 可能である。
本発明によると、従来における前記問題 解決することができ、精製が可能であり、 ましくは更に、緩やかな条件下でリン酸基 び塩基の保護基の脱保護が可能な核酸合成 ダイマーアミダイド、及び前記核酸合成用 イマーアミダイドを利用した核酸合成方法 提供することができる。
(核酸合成用ダイマーアミダイド)
本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドは
二のヌクレオシド化合物が亜リン酸トリエ
テル結合を介して連結してなることを特徴
し、好ましくは更に、リン酸基及び塩基の
護基が、非プロトン性溶媒中で脱保護可能
あることを特徴とする。
<ヌクレオシド化合物>
本発明において、前記「ヌクレオシド化合
」とは、核酸の合成に用いられるヌクレオ
ド又はヌクレオシド誘導体のモノマーをい
、前記ヌクレオシド誘導体には、末端がア
ダイド化された「核酸合成用アミダイド」
含まれる。以下、前記「核酸合成用アミダ
ド」を例に挙げ、前記「ヌクレオシド化合
」を説明するものとする。
-核酸合成用アミダイド-
前記「核酸合成用アミダイド」は、核酸の
成に用いられる、末端がアミダイド化され
ヌクレオシド誘導体のモノマーであり、そ
種類としては、特に制限はないが、例えば
下記式(I)~(III)に示す構造のものなどが挙げ
れる。
ただし、前記式(I)~(III)中、Xは塩基を表し 、Yは置換基を表し、Zは塩基に直接(式(I))又 置換基を介して(式(II))導入された保護基(本 細書中において、単に「塩基の保護基」と することがある)を表し、Qは水素原子又は 酸基を表す。
例えば、前記式(I)は、塩基Xの環外アミノ基
が、保護基Zに保護されてなる核酸合成用ア
ダイドを示す。塩基が、環外アミノ基を有
る塩基(例えば、アデニン、シトシン、グア
ン等)である場合には、核酸合成時の環外ア
ミノ基の不要な反応を防ぐため、前記環外ア
ミノ基に保護基を導入しておくことが好まし
い。したがって、このような場合には、前記
式(I)のような構造の核酸合成用アミダイドを
用いることができる。
また、前記式(II)は、塩基Xの環外アミノ基
置換基Yが導入されてなり、かつ、前記置換
が保護基Zに保護されてなる核酸合成用アミ
ダイドを示す。例えば、蛋白質等の標的物質
との結合性を有する修飾核酸を得ようとする
場合には、塩基の環外アミノ基に、蛋白質等
の標的物質との結合性を有する置換基を導入
しておくことができる。この場合、核酸合成
時の置換基の不要な反応を防ぐため、前記置
換基に保護基を導入しておくことが好ましい
。したがって、このような場合には、前記式
(II)のような構造の核酸合成用アミダイドを
いることができる。
また、前記式(III)は、保護基Z及び置換基Yの
いずれをも有さない、核酸合成用アミダイド
を示す。塩基が、環外アミノ基を有さない塩
基(例えば、チミジン等)である場合には、核
合成時の環外アミノ基の不要な反応を防ぐ
めの保護基を塩基に導入する必要はなく、
のため、前記式(III)のような構造の核酸合
用アミダイドを用いることができる。
--塩基--
前記式(I)~(III)中、Xで表される塩基としては
、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択す
ることができ、例えば、アデニン(A)、グアニ
ン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、ウラシル(U)な
どが挙げられる。また、前記塩基に保護基、
若しくは置換基が導入される位置としては、
特に制限はなく、目的に応じて適宜選択する
ことができるが、例えば、アデニン塩基の6
、シトシン塩基の6位、グアニン塩基の2位な
どが好ましい。
--塩基の保護基--
前記式(I)~(II)中、Zで表される塩基の保護基
しては、非プロトン性溶媒中で脱保護可能
保護基、即ち、緩やかな条件下で脱保護可
な保護基を用いることが好ましい。
ここで、前記「緩やかな条件下で脱保護可
」とは、例えば、前記保護基が、非プロト
性溶媒中で、嵩高い塩基により脱保護可能
あることをいう。前記非プロトン性溶媒と
ては、特に制限はなく、目的に応じて適宜
択することができ、例えば、アセトニトリ
、ジクロロメタン、DMF(N,N-ジメチルホルム
ミド)、N-メチルピロリドンなどが挙げられ
。また、前記嵩高い塩基としては、特に制
はなく、目的に応じて適宜選択することが
き、例えば、DBU(1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-
ンデセン)、DBN(1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]-5-ノ
ン)、テトラメチルグアニジンなどが挙げら
れる。これらの中でも、前記保護基は、前記
アセトニトリル中、前記DBUにより脱保護され
ることが好ましい。また、この場合、前記保
護基の脱保護に要するDBU濃度としては、0.5M
下が好ましく、0.1M以下がより好ましく、0.01
M以下が特に好ましい。また、前記保護基の
保護に要する時間としては、8時間以内が好
しく、1時間以内がより好ましく、15分間以
が特に好ましい。
中でも、前記塩基の保護基としては、3-ア
ノプロピオン酸誘導体、4-アミノ酪酸誘導体
、5-アミノ吉草酸誘導体、アミノメチル炭酸
導体、アミノエチル炭酸誘導体、アミノ安
香酸誘導体、アミノメチル安息香酸誘導体
アミノエチル安息香酸誘導体、アミノフェ
ル酢酸誘導体、アミノメチルフェニル酢酸
導体、アミノフェニルプロピオン酸誘導体
及び、アミノメチルフェニルプロピロン酸
導体のいずれかからなる保護基が好ましい
--置換基--
前記式(II)中、Yで表される置換基としては
その構造に特に制限はなく、目的に応じて
宜選択することができる。例えば、前記置
基は、天然又は非天然のアミノ酸、金属錯
、蛍光色素、酸化還元色素、スピンラベル
、水素原子、炭素数1~10のアルキル基、下記
(1)~(10)で表される基などの構造を含むこと
できる。ここで、前記置換基は、前記塩基
保護基が緩やかな条件下で脱保護される際
、併せて脱離されてしまわないよう、前記
基に導入されていることが好ましい。
前記天然又は非天然のアミノ酸としては、
に制限はなく、目的に応じて適宜選択する
とができ、例えば、バリン、ロイシン、イ
ロイシン、アラニン、アルギニン、グルタ
ン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン
、プロリン、システイン、スレオニン、メ
オニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、
ロシン、トリプトファン、アスパラギン、
リシン、セリンなどが挙げられる。
前記金属錯体としては、金属イオンに配位
が配位した化合物であれば特に制限はなく
目的に応じて適宜選択することができ、例
ば、Ruビピリジル錯体、フェロセン錯体、
ッケルイミダゾール錯体などが挙げられる
前記蛍光色素としては、特に制限はなく、
的に応じて適宜選択することができ、例え
、フルオレセイン系列、ローダミン系列、
オシン系列、NBD系列等の蛍光色素などが挙
られる。
前記酸化還元色素としては、特に制限はな
、目的に応じて適宜選択することができ、
えば、ロイコアニリン、ロイコアントシア
ン等のロイコ色素などが挙げられる。
前記スピンラベル体としては、特に制限は
く、目的に応じて適宜選択することができ
例えば、鉄N-(ジチオカルボキシ)サルコシン
(sarcosine)、TEMPO(テトラメチルピペリジン)誘導
体などが挙げられる。
前記炭素数1~10のアルキル基としては、特に
制限はなく、目的に応じて適宜選択すること
ができ、例えば、メチル基、エチル基、プロ
ピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブ
チル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ネオペ
チル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、
クチル基、ノニル基、デシル基などが挙げ
れる。
これらは、置換基で更に置換されていても
い。
--リン酸基の保護基--
前記核酸合成用アミダイドにおいて、核酸
成時の縮合反応に関与させないリン酸部分
反応性基には、核酸合成時の不要な反応を
ぐため、保護基(本明細書中において、単に
「リン酸基の保護基」と称することがある)
導入されていることが好ましい。前記リン
基の保護基は、非プロトン性溶媒中で脱保
可能な保護基、即ち、緩やかな条件下で脱
護可能な保護基であることが好ましく、こ
で、前記「緩やかな条件下で脱保護可能」
は、前記した塩基の保護基の項目に記載し
通りである。核酸合成時に、前記核酸合成
アミダイドの亜リン酸トリエステル結合が
化によりリン酸トリエステル結合とされた
、該リン酸トリエステル結合におけるリン
基の保護基が、前記緩やかな条件下で脱保
されることが好ましい。
なお、前記式(I)~(III)で表される核酸合成用
ミダイドでは、前記リン酸基の保護基とし
、シアノエチル基が例示的に表記されてい
が、前記リン酸基の保護基としては、これ
限定されるものではなく、目的に応じて適
選択することができ、例えば、シアノエチ
基及びその誘導体、フルオレニルメチル基
びその誘導体、フェネチル基及びその誘導
、並びに、ニトロエチル基及びその誘導体
らなる群より選択されるいずれかであるこ
が好ましい。
前記したような核酸合成用アミダイドに 表されるヌクレオシド化合物は、例えば、 述する実施例に記載の方法等により、合成 ることができる。
<二のヌクレオシド化合物の連結>
前記したようなヌクレオシド化合物のうち
二のヌクレオシド化合物を亜リン酸トリエ
テル結合(P(OR) 3
)を介して連結させ、末端をアミダイド化す
ことにより、前記核酸合成用ダイマーアミ
イドを得ることができる。
前記二のヌクレオシド化合物を、亜リン酸
リエステル結合(P(OR) 3
)を介して連結させる方法としては、特に制
はなく、亜リン酸塩化物、亜リン酸ジ塩化
を用いても良いが、副反応を抑える意味で
後述する実施例に記載の方法が好適である
考えられる。
また、前記二のヌクレオシド化合物とし は、異なる種類のヌクレオシド化合物を使 してもよいし、同じ種類のヌクレオシド化 物を使用してもよい。ここで、前記二のヌ レオシド化合物のうち、少なくともいずれ 一方のヌクレオシド化合物は、その塩基の 外アミノ基に、前記したような非プロトン 溶媒中で脱保護可能な保護基を有している とが好ましい。また、前記二のヌクレオシ 化合物のうち、両方のヌクレオシド化合物 、その塩基の環外アミノ基に、前記したよ な非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護 を有していてもよい。前記塩基の保護基は 前記した式(I)のように、塩基に直接結合さ てなるものであってもよいし、また、前記 た式(II)のように、置換基を介して、塩基に 結合されてなるものであってもよい。なお、 前記非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護 基、即ち、緩やかな条件下で脱保護可能な保 護基の詳細としては、前記した通りである。
<具体例>
前記核酸合成用ダイマーアミダイドの具体
としては、例えば、下記構造式(1)~(11)に示
ものなどが挙げられるが、前記核酸合成用
イマーアミダイドとしては、これらに限定
れるものではない。
前記核酸合成用ダイマーアミダイドは、亜
ン酸トリエステル結合を介して連結してな
ため、精製が可能であり、そのため、高純
の核酸合成用ダイマーアミダイドとして得
ことができる。
図1に、リン酸トリエステル結合を介して連
結してなる比較対照のダイマーアミダイドと
、亜リン酸トリエステル結合を介して連結し
てなる本発明の核酸合成用ダイマーアミダイ
ドとの比較を示す。リン酸トリエステル結合
(P(=O)(OR) 3
)を介して連結してなる比較対照のダイマー
ミダイド(リン酸(リン5価)法;図1上段)では、
に非常に不安定な部位、及び塩基に非常に
安定な部位を共に有しており、このため精
によりほとんど分解されてしまうという欠
がある。一方で、亜リン酸トリエステル結
(P(OR) 3
)を介して連結してなる本発明の核酸合成用
イマーアミダイド(亜リン酸(リン3価)法;図1
段)では、塩基に非常に不安定な部位を有し
おらず、このため精製が可能であり、高純
の核酸合成用ダイマーアミダイドとして得
ことができる。
更に好ましくは、前記核酸合成用ダイマ アミダイドは、緩やかな条件下で脱保護が 能な、リン酸基及び塩基の保護基を有する で、例えば、塩基に導入された置換基を脱 させない条件下で、前記塩基の保護基を脱 護することができる。そのため、前記塩基 保護基と塩基との間に、所望の置換基を、 定に導入することも可能である。
(核酸合成方法)
本発明の核酸合成方法は、本発明の前記核
合成用ダイマーアミダイドを用いることを
徴とする。前記核酸合成方法は、例えば、
来の核酸自動合成装置を用いて行うことが
きる。
前記核酸合成方法においては、前記核酸 成用ダイマーアミダイドを、一種単独で使 してもよいし、二種以上を併用してもよい また、前記核酸合成方法に用いるダイマー ミダイドとしては、前記核酸合成用ダイマ アミダイドのみならず、他のダイマーアミ イドを組み合わせて用いてもよい。この場 、前記他のダイマーアミダイドとしては、 記したような緩やかな条件下で脱保護可能 ダイマーアミダイドを用いることが好まし 、このようなダイマーアミダイドとしては 例えば、特願2007-069378号明細書に記載のダ マーアミダイドなどを用いることができる
前記核酸合成方法においては、前記核酸 成用ダイマーアミダイド(及び、前記他のダ イマーアミダイド)の縮合反応の後、前記核 合成用ダイマーアミダイド(及び、前記他の イマーアミダイド)の、リン酸基及び塩基の 保護基の脱保護を行う。前記脱保護の条件と しては、特に制限はなく、目的に応じて適宜 選択することができるが、前記したような緩 やかな条件下で行われることが好ましく、例 えば、非プロトン性溶媒中で、嵩高い塩基に より脱保護を行うことが好ましい。前記非プ ロトン性溶媒、前記嵩高い塩基としては、前 記同様である。また、脱保護に要する濃度、 時間としても、前記同様である。
前記核酸合成方法では、本発明の前記核 合成用ダイマーアミダイドを用いるため、 製後の高純度の核酸合成用ダイマーアミダ ドを用いることができ、そのため、核酸の 成収率を高めることが可能である。また、 記核酸合成方法では、本発明の前記核酸合 用ダイマーアミダイドを用いるため、好ま くは、緩やかな条件下で脱保護を行うこと でき、そのため、前記核酸合成用ダイマー ミダイドが置換基を有する場合であっても 前記置換基を脱離することなしに、容易に 護基の脱保護のみを行うことができる。そ ため、前記核酸合成方法によれば、所望の 換基を有する核酸を、安定に製造すること 可能である。
(核酸)
本発明の核酸は、本発明の前記核酸合成方
により得られることを特徴とする。
前記核酸を構成するヌクレオチド単位の個
としては、特に制限はなく、目的に応じて
宜選択することができるが、例えば、10~200
が好ましく、20~100個がより好ましく、30~80
が特に好ましい。なお、前記核酸を構成す
ヌクレオチド単位のうち、前記核酸合成用
イマーアミダイドに由来するヌクレオチド
位の割合としては、特に制限はなく、目的
応じて適宜選択することができる。また、
記核酸は、DNA配列及びRNA配列のいずれであ
てもよく、また、前記DNA配列及びRNA配列は
一本鎖であってもよいし二本鎖であっても
い。
前記核酸は、本発明の前記核酸合成方法に
り得られるものであるため、所望の置換基
安定に有する修飾核酸であり得る。前記修
核酸は、置換基を介して、蛋白質等の標的
質との結合が可能であり、したがって、こ
ような修飾核酸は、例えば蛋白質等の標的
質の解析に、好適に利用可能である。
より具体的には、例えば、予め各核酸合成
ダイマーアミダイドに導入させた置換基の
類をダイマーコード対応表(核酸合成用ダイ
マーアミダイドの塩基配列と、置換基の種類
との対応表)等で定めておき、前記各核酸合
用ダイマーアミダイドを用いて合成した複
種の修飾核酸を、所望の標的物質と反応さ
る。次いで、複数種の修飾核酸の中から前
標的物質と高い結合性を有する修飾核酸を
別した後に、置換基を脱離し、PCR増幅、及
、シーケンシング(塩基配列決定)を行う。最
後に、前記修飾核酸に導入されていた置換基
の種類を前記ダイマーコード対応表を用いて
確認することにより、これらの情報に基づき
、前記標的物質と高い結合性を有する修飾核
酸と同様の修飾核酸を大量に複製等すること
ができ、このような修飾核酸を、標的物質の
解析に利用することが可能となる。
以下、本発明の実施例について説明する 、本発明はこれらの実施例に何ら限定され ものではない。
(実施例1:核酸合成用ダイマーアミダイドの合
成)
本発明の核酸合成用ダイマーアミダイド、I
X Ser
、IX Leu
、IX Phe
、IX Glu
、IX A-Lys
、IX G-Lys
、IX The
、IX Met
、IX Tyr
、IX’ Phe
、IX Dia
を以下のようにして合成した。なお、前記核
酸合成用ダイマーアミダイドIX Ser
、IX Leu
、IX Phe
、IX Glu
、IX A-Lys
、IX G-Lys
、IX The
、IX Met
、IX Tyr
、IX’ Phe
、IX Dia
は、それぞれ前記した構造式(1)~(11)に対応す
核酸合成用ダイマーアミダイドである。
なお、下記化合物I、III A
、VI G
、V Leu
、VI A
、V Phe
、VI C
、V Glu
、VI T
、VI A-Lys
、V T
、V G-Lys
、III G
、V G
は、それぞれ特願2007-069378号明細書に示され
合成方法に従い合成した。
<IIの合成>
I 13.58g(40mmol)を脱水アセトニトリルに溶解
、減圧濃縮を3回行った。残渣を200mLの脱水
セトニトリルに溶解し、ピリジン3.88mL(48mmol)
及び硝酸銀6.79g(40mmol)を加え、氷冷下、塩化
バロイル4.93mL(40mmol)を加え、0℃で15分間攪拌
した。続いて、グリコール酸4.56g(60mmol)を加
、室温で4時間攪拌した。反応溶液をジクロ
メタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロ
タン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマ
グラフィー(1%酢酸、ジクロロメタン-エタノ
ール100:0→19:1)にて精製し、目的物II 13.03g(82%
)を得た。
<IV Ser
の合成>
III A
10.58g(10mmol)を20mLの脱水ジクロロメタンに溶
し、トリエチルシラン2.40mL(15mmol)及びジア
ビシクロウンデセン2.24mL(15mmol)を加え、室温
にて10分間攪拌した、反応混合物にトリフロ
酢酸1.27mL(16.5mmol)、ピリジン1.45ml(18mmol)及び
クロロメタン10mLの混合溶液を加え、反応混
合物Aを得た。
II 4.97g(12.5mmol)を脱水トルエンに溶解し、減
圧濃縮を3回行った。残渣を30mLの脱水ジクロ
メタンに溶解し、N-ヒドロキシこはく酸イ
ド1.58g(13.8mmol)を加え、氷冷下、ジシクロヘ
シルカルボジイミド2.71g(13.1mmol)を加え、室
で1時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を
応混合物Aに加えた。反応混合物を室温にて
1時間攪拌した。続いてメタノール5mLを加え
30分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタン
で希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶
液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフ
ィー(ジクロロメタン-エタノール97:3→47:3)に
精製し、目的物IV Ser
10.11g(95%)を得た。
<V Ser
の合成>
IV Ser
10.11g(9.48mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
クロロメタンに溶解し、減圧濃縮を3回行っ
。残渣を38mLの脱水ジクロロメタンに溶解し
氷冷下ジメチルアミノピリジン57.9mg(0.47mmol)
、ジイソプロピルエチルアミン1.87mL(11.4mmol)
加え、2-シアノエチルジイソプロピルクロロ
ホスホロアミジト2.33mL(10.4mmol)の9.5mLジクロロ
メタン溶液を5分以上かけ滴下した。混合溶
を0℃で1時間攪拌した。続いてメタノール9.5
mLを加え、30分間攪拌した。反応溶液をジク
ロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロ
メタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロ
トグラフィー(2%ピリジンin酢酸エチル;ヘキ
ン=2:1-2%ピリジン、3%エタノールin酢酸エチル
1:0→0:1)にて精製し、目的物V Ser
10.31g(86%)を得た。
<VIII Ser
の合成>
V Ser
10.31g(8.14mmol)及びVI G
5.87g(8.55mmol)を脱水アセトニトリルに溶解し
減圧濃縮を3回行った。残渣を41mLの脱水ア
トニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール2.
85g(40.7mmol)を加え、室温で30分間攪拌した。続
いてメタノール3.3mLを加え、30分間攪拌した
溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄
た。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。
渣を43mLのピリジンに溶解し、氷冷下、1Mヒ
ラジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液12.8mL
加え、0℃で1時間攪拌し、VII Ser
の消失が確認できるまで、30分毎に、1Mヒド
ジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液4.3mLを加
えた。氷冷下、アセトン30mLを加え、0℃で10
間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、
で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃
した。得られた残渣を中圧クロマトグラフ
ー(ジクロロメタン-エタノール97:3→9:1)にて
製し、目的物VIII Ser
11.07g(78%)を得た。
<IX Ser
の合成>
VIII Ser
10.03g(6.29mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
クロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を
3回行った。残渣を25mLの脱水ジクロロメタン
溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン38mg
(0.3mmol)、ジイソプロピルエチルアミン1.25mL(7.
55mmol)を加え、2-シアノエチルジイソプロピル
クロロホスホロアミジト1.54mL(6.92mmol)のジク
ロメタン6.3mL希釈溶液を加えた。混合溶液を
0℃で12時間攪拌した後、室温で2時間攪拌し
。続いてメタノール2.5mLを加え、30分間攪拌
た。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、
で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃
し、残渣を(2%ピリジンinジクロロメタン;ヘ
サン=2:1-2%ピリジンinジクロロメタン0→100%
続けて2%ピリジン、20%エタノール2%ピリジンi
nジクロロメタン1:0→3:1)にて精製し、目的物I
X Ser
8.83g(71%)を得た。
<VII’ Ser
の合成>
V Ser
4.14g(3.27mmol)及びVI G
2.25g(3.27mmol)を脱水アセトニトリルに溶解し
減圧濃縮を3回行った。残渣を32mLの脱水ア
トニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール1.
16g(16.34mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。続
いて水1.0mLを加え、15分間攪拌した。溶液を
クロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジ
ロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を0.1M
ウ素inTHF:水:ピリジン=7:2:1溶液114mLに溶解し
室温で30分間攪拌した。反応混合物に290mLの
ジクロロメタンを加え、亜硫酸ナトリウム7.2
gを加え、室温で15分間攪拌した。反応混合物
に約25gの硫酸ナトリウムを加え、よく攪拌し
た後、不溶物を濾過した。濾液を減圧濃縮し
、得られた残渣を中圧クロマトグラフィー(
クロロメタン-エタノール49:1→8:1)にて精製
、目的物VII’ Ser
4.86g(80%)を得た。
<VIII’ Ser
の合成>
VII’ Ser
4.74g(2.60mmol)を26mLのピリジンに溶解し、ヒド
ラジン1水和物1.26mL(26.0mmol)の希釈溶液26mL(ピ
ジン:酢酸=3:2)を加え、室温で5分間攪拌した
氷冷下、アセトン26mLを加え、0℃で10分間攪
拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗
浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した
。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー(
クロロメタン-エタノール49:1→17:3)にて精製
、目的物VIII’ Ser
3.59g(78%)を得た。
<IX’ Ser
の合成>
VIII’ Ser
3.14g(1.77mmol)を脱水アセトニトリルに溶解し
減圧濃縮を3回行った。残渣を18mLの脱水ジ
ロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミ
ピリジン12.7mg(0.089mmol)、ジイソプロピルエチ
ルアミン401μL(2.30mmol)を加え、2-シアノエチル
ジイソプロピルクロロホスホロアミジト471μL
(2.12mmol)を加えた。混合溶液を0℃で1時間攪拌
した後、室温で2時間攪拌した。続いてメタ
ール1.8mLを加え、30分間攪拌した。反応溶液
ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。
クロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を25mL
の酢酸エチル及び10mLのジクロロメタンに溶
し、-60℃で177mLのヘキサンに滴下した。不溶
物をろ過し、冷ヘキサンで洗浄し、濾物から
減圧下溶媒を除くことにより目的物IX’ Ser
2.98g(86%)を得た。
<VIII Leu
の合成>
V Leu
7.39g(7.51mmol)及びVI A
5.79g(8.63mmol)を脱水アセトニトリルに溶解し
減圧濃縮を3回行った。残渣を38mLの脱水ア
トニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール2.
65g(37.5mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。続
てメタノール1.7mLを加え、30分間攪拌した。
溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄し
た。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残
渣を43mLのピリジンに溶解し、氷冷下、1Mヒド
ラジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液12.9mLを
加え、0℃で1時間攪拌し、VII Leu
の消失が確認できるまで、30分毎に、1Mヒド
ジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液4.3mLを加
えた。氷冷下、アセトン30mLを加え、0℃で10
間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、
で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃
した。得られた残渣を中圧クロマトグラフ
ー(ジクロロメタン-エタノール97:3→9:1)にて
製し、目的物VIII Leu
8.22g(75%)を得た。
<IX Leu
の合成>
VIII Leu
7.08g(4.86mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
ロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を3
回行った。残渣を19mLの脱水ジクロロメタン
溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン30mg(
0.24mmol)、ジイソプロピルエチルアミン964μL(7.
55mmol)を加え、2-シアノエチルジイソプロピル
クロロホスホロアミジト1.19mL(5.35mmol)のジク
ロメタン4.9mL希釈溶液を加えた。混合溶液を
4℃で一晩攪拌した。続いてメタノール1.9mLを
加え、30分間攪拌した。反応溶液をジクロロ
タンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメ
ン溶液を減圧濃縮し、残渣を(2%ピリジンin
クロロメタン;ヘキサン=2:1-2%ピリジンinジク
ロメタン0→100%、続けて2%ピリジンinジクロ
メタン-2%ピリジン、20%エタノール2%ピリジ
inジクロロメタン1:0→3:1)にて精製し、目的
IX Leu
3.86g(48%)を得た。
<VIII Phe
の合成>
V Phe
7.09g(7.05mmol)及びVI C
4.79g(7.41mmol)を脱水アセトニトリルに溶解し
減圧濃縮を3回行った。残渣を35mLの脱水ア
トニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール2.
47g(35.3mmol)を加え、氷冷下で45分間攪拌した。
続いてメタノール1.4mLを加え、15分間攪拌し
。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗
した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した
残渣を38mLのピリジンに溶解し、氷冷下、1M
ドラジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液11.1m
Lを加え、0℃で1時間攪拌し、VII Phe
の消失が確認できるまで、30分毎に、1Mヒド
ジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液3.7mLを加
えた。氷冷下、アセトン30mLを加え、0℃で10
間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、
で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃
した。得られた残渣を中圧クロマトグラフ
ー(ジクロロメタン-エタノール97:3→92:8)にて
精製し、目的物VIII Phe
7.07g(69%)を得た。
<IX Phe
の合成>
VIII Phe
5.17g(3.56mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
ロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を3
回行った。残渣を14mLの脱水ジクロロメタン
溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン22mg(
0.18mmol)、ジイソプロピルエチルアミン706μL(5.
34mmol)を加え、2-シアノエチルジイソプロピル
クロロホスホロアミジト873μL(3.92mmol)のジク
ロメタン3.6mL希釈溶液を加え、0℃で5時間攪
した。続いてメタノール1.4mLを加え、30分間
攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈
し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減
圧濃縮し、残渣を(2%ピリジンinジクロロメタ
;ヘキサン=2:1-2%ピリジンinジクロロメタン0
100%、続けて2%ピリジンinジクロロメタン-2%ピ
リジン,20%エタノール2%ピリジンinジクロロメ
ン1:0→3:1)にて精製し、目的物IX Phe
4.01g(68%)を得た。
<VIII Glu
の合成>
V Glu
6.52g(5.53mmol)及びVI T
1.98g(5.81mmol)を脱水アセトニトリルに溶解し
減圧濃縮を3回行った。残渣を28mLの脱水ア
トニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール1.
94g(27.7mmol)を加え、氷冷下で1時間攪拌した。
いてメタノール2.2mLを加え、5分間攪拌した
溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄
た。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。
渣を29mLのピリジンに溶解し、氷冷下、1Mヒ
ラジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液8.7mL
加え、0℃で1時間攪拌し、VII Glu
の消失が確認できるまで、30分毎に、1Mヒド
ジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液2.9mLを加
えた。氷冷下、アセトン23mLを加え、0℃で10
間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、
で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃
した。得られた残渣を中圧クロマトグラフ
ー(ジクロロメタン-エタノール97:3→91:9)にて
精製し、目的物VIII Glu
6.17g(85%)を得た。
<IX Glu
の合成>
VIII Glu
6.17g(4.67mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
ロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を3
回行った。残渣を19mLの脱水ジクロロメタン
溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン29mg(
0.23mmol)、ジイソプロピルエチルアミン0.93mL(5.
33mmol)を加え、2-シアノエチルジイソプロピル
クロロホスホロアミジト1.15mL(5.14mmol)のジク
ロメタン4.8mL希釈溶液を加え、0℃で2時間攪
した。続いてメタノール1.9mLを加え、30分間
攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈
し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減
圧濃縮し、残渣を(2%ピリジンinジクロロメタ
;ヘキサン=2:1-2%ピリジンinジクロロメタン0
100%、続けて2%ピリジンinジクロロメタン-2%ピ
リジン、20%エタノール2%ピリジンinジクロロ
タン1:0→3:1)にて精製し、目的物IX Glu
4.79g(67%)を得た。
<VIII A-Lys
の合成>
VI A-Lys
6.89g(9.77mmol)及びV T
8.0g(10.7mmol)を脱水アセトニトリルに溶解し
減圧濃縮を3回行った。残渣を50mLの脱水アセ
トニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール3.4
2g(48.9mmol)を加え、氷冷下で1時間攪拌した。
いてメタノール3.9mLを加え、5分間攪拌した
溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄
た。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。
渣を49mLのピリジンに溶解し、氷冷下、1Mヒ
ラジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液14.6mL
加え、0℃で1時間攪拌し、VII A-Lys
の消失が確認できるまで、30分毎に、1Mヒド
ジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液4.9mLを加
えた。氷冷下、アセトン15mLを加え、0℃で10
間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、
で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃
した。得られた残渣を中圧クロマトグラフ
ー(ジクロロメタン-エタノール97:3→9:1)にて
製し、目的物VIII A-Lys
9.09g(74%)を得た。
<IX A-Lys
の合成>
VIII A-Lys
9.09g(7.27mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
ロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を3
回行った。残渣を29mLの脱水ジクロロメタン
溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン44mg(
0.36mmol)、ジイソプロピルエチルアミン1.44mL(8.
27mmol)を加え、2-シアノエチルジイソプロピル
クロロホスホロアミジト1.78mL(7.99mmol)のジク
ロメタン7.3mL希釈溶液を加え、0℃で4時間攪
した。続いてメタノール2.9mLを加え、30分間
攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈
し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減
圧濃縮し、残渣を(2%ピリジンinジクロロメタ
;ヘキサン=2:1-2%ピリジンinジクロロメタン0
100%、続けて2%ピリジンinジクロロメタン-2%ピ
リジン,20%エタノール2%ピリジンinジクロロメ
ン1:0→3:1)にて精製し、目的物IX A-Lys
6.64g(63%)を得た。
<VIII G-Lys
の合成>
V G-Lys
9.47g(7.92mmol)及びVI C
5.37g(8.31mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
ロロメタンに溶解し、減圧濃縮を3回行った
。残渣を50mLの脱水アセトニトリル:脱水ジク
ロメタン=4:1に溶解し、氷冷下テトラゾール
2.77g(39.6mmol)を加え、氷冷下で2時間攪拌した
続いてメタノール3.2mLを加え、5分間攪拌し
。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗
した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した
残渣を41.6mLのピリジンに溶解し、氷冷下、1M
ヒドラジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液12.
4mLを加え、0℃で1時間攪拌し、VII G-Lys
の消失が確認できるまで、30分毎に、1Mヒド
ジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液2.9mLを加
えた。氷冷下、アセトン25mLを加え、0℃で10
間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、
で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃
した。得られた残渣を中圧クロマトグラフ
ー(ジクロロメタン-エタノール96:4→92:8)にて
精製し、目的物VIII G-Lys
10.3g(79%)を得た。
<IX G-Lys
の合成>
VIII G-Lys
9.93g(6.04mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
ロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を3
回行った。残渣を24mLの脱水ジクロロメタン
溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン37mg(
0.30mmol)、ジイソプロピルエチルアミン1.12mL(6.
88mmol)を加え、2-シアノエチルジイソプロピル
クロロホスホロアミジト1.48mL(6.65mmol)のジク
ロメタン6mL希釈溶液を加え、0℃で5時間攪拌
した。続いてメタノール2.4mLを加え、30分間
拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈
、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減
濃縮し、残渣を(2%ピリジンinジクロロメタン
;ヘキサン=2:1-2%ピリジンinジクロロメタン0→1
00%、続けて2%ピリジンinジクロロメタン-2%ピ
ジン,20%エタノール2%ピリジンinジクロロメタ
ン1:0→3:1)にて精製し、目的物IX G-Lys
6.58g (59%)を得た。
<IV The
の合成>
III G
10.35g(12mmol)を24mLの脱水ジクロロメタンに溶
し、トリエチルシラン2.88mL(18mmol)及びジア
ビシクロウンデセン2.69mL(18mmol)を加え、室温
にて30分間攪拌した。反応混合物にトリエチ
アンモニウム塩酸塩3.30g(24mmol)を加え、反応
混合物Aを得た。
3-テノイルクロリド2.20g(15mmol)を36mLの脱水ジ
クロロメタンに溶解し、N-ヒドロキシベンゾ
リアゾール2.23g(16.5mmol)を加え、氷冷下、ピ
ジン1.82g(22.5mmol)を加え、室温で30分間攪拌
、反応混合物Aに加えた。反応混合物を室温
て30分間攪拌した。反応溶液をジクロロメ
ンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタ
溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグ
フィー(ジクロロメタン-エタノール92:8→88:12
)にて精製し、目的物IV The
7.23g(80%)を得た。
<V The
の合成>
IV The
7.26g(9.66mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
ロロメタンに溶解し、減圧濃縮を3回行った
。残渣を40mLの脱水ジクロロメタンに溶解し
氷冷下ジメチルアミノピリジン59mg(0.48mmol)、
ジイソプロピルエチルアミン1.92mL(11.0mmol)を
え、2-シアノエチルジイソプロピルクロロホ
スホロアミジト2.37mL(10.6mmol)の9.7mLジクロロメ
タン溶液を、5分以上かけ滴下した。混合溶
を0℃で1晩攪拌した。続いてメタノール1.9mL
加え、30分間攪拌した。反応溶液をジクロ
メタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロ
タン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマ
グラフィー(2%ピリジンin酢酸エチル;ヘキサ
=2:1-2%ピリジン、5%エタノールin酢酸エチル1:0
→0:1)にて精製し、目的物V The
7.69g(84%)を得た。
<VIII The
の合成>
V The
7.48g(7.87mmol)及びVI T
2.81g(8.26mmol)を脱水アセトニトリルに溶解し
減圧濃縮を3回行った。残渣を39mLの脱水ア
トニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール2.
75g(39.3mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。続
てメタノール3.1mLを加え、5分間攪拌した。
液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄し
。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残
を41mLのピリジンに溶解し、氷冷下、1Mヒド
ジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液12.4mLを
え、0℃で1時間攪拌し、VII The
の消失が確認できるまで、30分毎に、1Mヒド
ジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液4.1mLを加
えた。氷冷下、アセトン28mLを加え、0℃で10
間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、
で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃
した。得られた残渣を中圧クロマトグラフ
ー(ジクロロメタン-エタノール95:5→9:1)にて
製し、目的物VIII The
5.44g(64%)を得た。
<IX The
の合成>
VIII The
5.49g(5.03mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
ロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を3
回行った。残渣を20mLの脱水ジクロロメタン
溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン31mg(
0.25mmol)、ジイソプロピルエチルアミン1.00mL(5.
72mmol)を加え、2-シアノエチルジイソプロピル
クロロホスホロアミジト1.23mL(5.53mmol)のジク
ロメタン5.0mL希釈溶液を加えた。混合溶液を
0℃で1日攪拌した。続いてメタノール1.0mLを
え、30分間攪拌した。反応溶液をジクロロメ
タンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタ
ン溶液を減圧濃縮し、残渣を(2%ピリジンinジ
ロロメタン;ヘキサン=2:1-2%ピリジンinジクロ
ロメタン0→100%、続けて2%ピリジン、20%エタ
ール2%ピリジンinジクロロメタン1:0→4:1)にて
精製し、目的物IX The
4.30g(66%)を得た。
<IV Met
の合成>
III A
15.78g(15mmol)を30mLの脱水ジクロロメタンに溶
し、トリエチルシラン3.59mL(22.5mmol)及びジア
ザビシクロウンデセン3.37mL(22.5mmol)を加え、
温にて10分間攪拌した。反応混合物にトリフ
ロロ酢酸1.27mL(16.5mmol)、ピリジン1.45ml(18mmol)及
びジクロロメタン10mLの混合溶液を加え、反
混合物Aを得た。
トリフォスゲン2.23g(7.5mmol)を33mLの脱水ジク
ロメタンに溶解し、氷冷下、ピリジン2.0mL(2
4.8mmol)及び2-(メチルチオ)エタノール1.96mL(22.5m
mol)の15mLジクロロメタン溶液を滴下した。反
混合物を室温にて15分間攪拌した。N-ヒドロ
キシこはく酸イミド3.11g(27.0mmol)及びピリジン
2.0mL(24.8mmol)を加え、室温で15分間攪拌し、反
混合物Aに加えた。反応混合物を室温にて8
間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで
釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液
減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィ
(ジクロロメタン-エタノール98:2→93:7)にて精
製し、目的物IV Met
8.37g(69%)を得た。
<V Met
の合成>
IV Met
8.25g(10.25mmol)を脱水アセトニトリルに溶解し
、減圧濃縮を3回行った。残渣を41mLの脱水ジ
ロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミ
ピリジン63mg(0.51mmol)、ジイソプロピルエチ
アミン2.03mL(11.7mmol)を加え、2-シアノエチル
イソプロピルクロロホスホロアミジト2.51mL(1
1.3mmol)の10mLジクロロメタン溶液を5分以上か
滴下した。混合溶液を0℃で45分間攪拌した
続いてメタノール2.0mLを加え、30分間攪拌し
。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水
洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮
、残渣を中圧クロマトグラフィー(2%ピリジ
in酢酸エチル;ヘキサン=2:1-2%ピリジンin酢酸
チル1:0→0:1)にて精製し、目的物V Met
8.10g(79%)を得た。
<VI Met
の合成>
IV Met
15.3g(19.3mmol)を脱水ジオキサンに溶解し、減
濃縮を3回行った。残渣を96mLの脱水ジクロ
メタンに溶解し、ジメチルアミノピリジン18
9mg(1.55mmol)、シシクロヘキシルカルボジイミ
7.96g(35.6mmol)及びレブリン酸3.96mL(35.6mmol)を加
た。混合溶液を室温で1時間攪拌した。続い
てメタノール3.9mLを加え、15分間攪拌した。
要物をろ過し、濾液を減圧濃縮した。残渣
酢酸エチルに溶解し、水で洗浄した。酢酸
チル溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメ
ン180mLに溶解し、氷冷下でトリフロロ酢酸9.6
5mLを加え、0℃で30分間攪拌した。続いて、メ
タノール77mL及びピリジン21mLを加え、室温で
晩攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジク
ロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧ク
マトグラフィー(ジクロロメタン-エタノー
98:2→95:5)にて精製し、目的物VI Met
10.0g(86.3%)を得た。
<VIII Met
の合成>
VI Met
6.01g(10mmol)及びV G
11.46g(10.5mmol)を脱水アセトニトリルに溶解し
、減圧濃縮を3回行った。残渣を50mLの脱水ア
トニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール3
.50g(50mmol)を加え、室温で4時間攪拌した。続
てメタノール2.0mLを加え、15分間攪拌した。
液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄し
。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残
を50mLのピリジンに溶解し、氷冷下、1Mヒド
ジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液15mLを加
え、0℃で1時間攪拌し、VII Met
の消失が確認できるまで、30分毎に、1Mヒド
ジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液5.0mLを加
えた。氷冷下、アセトン30mLを加え、0℃で10
間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、
で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃
した。得られた残渣を中圧クロマトグラフ
ー(ジクロロメタン-エタノール97:3→9:1)にて
製し、目的物VIII Met
8.09g(54%)を得た。
<IX Met
の合成>
VIII Met
7.94g(5.32mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
ロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を3
回行った。残渣を21mLの脱水ジクロロメタン
溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン32mg(
0.27mmol)、ジイソプロピルエチルアミン1.06mL(6.
06mmol)を加え、2-シアノエチルジイソプロピル
クロロホスホロアミジト1.31mL(5.85mmol)のジク
ロメタン5.3mL希釈溶液を加えた。混合溶液を
0℃で2日間攪拌した。続いてメタノール1.1mL
加え、30分間攪拌した。反応溶液をジクロロ
メタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメ
タン溶液を減圧濃縮し、残渣を(2%ピリジンin
クロロメタン;ヘキサン=2:1-2%ピリジンinジク
ロロメタン0→100%、続けて2%ピリジン、20%エ
ノール2%ピリジンinジクロロメタン1:0→85:15)
て精製し、目的物IX Met
5.64g(63%)を得た。
<Xの合成>
4-(FMOC-アミノメチル)安息香酸37.3g(100mmol)を40
0mLの脱水ジクロロメタンに懸濁し、アルゴン
雰囲気下、オキサリルクロリド12.9mL(150mmol)及
びジメチルホルムアミド0.15mL(1.9mmol)を加え、
室温で7時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮
、残渣に脱水トルエンを加えた後、減圧濃
し、400mLの脱水ジクロロメタンに溶解し、溶
液Aを得た。
デオキシシチジン塩酸塩29.0g(110mmol)を脱水
リジンで懸濁し、減圧濃縮する操作を3回行
た。残渣を375mLの脱水ピリジンで懸濁し、0
でトリメチルクロロシラン46.4mL(396mmol)を加
、室温で1時間攪拌した後、再び0℃に冷却
、本溶液を氷冷下、溶液Aに導入した。反応
合物を室温で1時間攪拌した。氷冷下100mLの
を加え、室温で8時間攪拌した。本溶液を減
圧濃縮した。残渣に酢酸エチル500mL及び水500m
Lを加え、よく攪拌し、ろ過することにより
製の目的物X 61.6gを得た。
<III C
の合成>
粗製のX 61.6gを脱水ピリジンに溶解し、減
濃縮を3回行った。残渣を500mLの脱水ピリジ
に溶解し、氷冷下4,4’-ジメトキシトリチル
ロリド33.92g(100mmol)を加え、0℃にて8時間攪
した。続いてメタノール20mLを加え、30分間
拌した。溶液を減圧濃縮し、酢酸エチルで
釈し、水で洗浄した。酢酸エチル溶液を減
濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー(酢
エチル-エタノール1:0→19:1)にて精製し、目
物III C
76.2g(90% 2step)を得た。
<XIの合成>
III C
23.11g(26.1mmol)を脱水ジオキサンに溶解し、減
圧濃縮を3回行った。残渣を130mLの脱水ジオキ
サンに溶解し、ジメチルアミノピリジン226mg(
0.21mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド10.
78g(52.2mmol)及びレブリン酸5.36mL(52.2mmol)を加え
室温で2時間攪拌した。反応溶液に5mLのメタ
ノールを加え、30分間攪拌した。不溶物をろ
し、濾液を減圧濃縮し、ジクロロメタンで
釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液
減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィ
(酢酸エチル-エタノール1:0→19:1)にて精製し
、目的物XI 25.2g(98%)を得た。
<XII Tyr
の合成>
XI 17.86g(15mmol)を38mLの脱水ジクロロメタンに
溶解し、トリエチルシラン4.53mL(28.3mmol)及び
アザビシクロウンデセン4.23mL(28.3mmol)を加え
室温にて10分間攪拌した。反応混合物にト
フロロ酢酸2.39mL(31.1mmol)、ピリジン2.74ml(34.0mm
ol)及びジクロロメタン19mLの混合溶液を加え
反応混合物Aを得た。
p-ヒドロキシフェニル酢酸5.74g(37.7mmol)及びN-
ヒドロキシこはく酸イミド5.21g(45.3mmol)をアセ
トニトリルに溶解し、氷冷下、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド8.17g(39.6mmol)を加え、0℃
1時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を反
混合物Aに加えた。反応混合物を室温にて1
間攪拌した。続いてピペリジン3.7mLを加え、
30分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタン
希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶
を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフ
ー(酢酸エチル-エタノール19:1→9:1)にて精製
し、目的物XII Tyr
5.03g(64%)を得た。
<XIIIの合成>
FMOC-Suc 33.74g(100mmol)を100mLのジクロロメタン
溶解し、氷冷下、2-(メチルアミノ)エタノー
ル8.25mL(105mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した
。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶
液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフ
ィー(酢酸エチル-ヘキサン1:1→1:0)にて精製し
、目的物XIII 28.72g(97%)を得た。
<XIV Tyr
の合成>
XII Tyr
10.38g(11.6mmol)を脱水アセトニトリルに溶解し
、減圧濃縮を3回行った。残渣を26mLの脱水ア
トニトリルに溶解し、ピリジン2.36mL(29.2mmol)
を加え、反応混合物Aを得た。
トリフォスゲン1.38g(4.64mmol)を16mLの脱水ジク
ロロメタンに溶解し、氷冷下、ピリジン1.2mL(
14.6mmol)及びXIII 4.14g(13.92mmol)の16mLジクロロメ
ン溶液を滴下した。反応混合物を室温にて1
5分間攪拌した。本反応混合物を反応混合物A
0℃で加えた。反応混合物を室温にて15分間
拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈
水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧
縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー(酢酸
エチル-エタノール94:6→91:9)にて精製し、目
物XIV Tyr
12.0g(85%)を得た。
<IV Tyr
の合成>
XIV Tyr
9.14g(7.5mmol)を75mLのピリジンに溶解し、ヒド
ジン1水和物3.11mL(64.3mmol)の希釈溶液90mL(ピリ
ジン:酢酸=2:1)を加え、室温で5分間攪拌した
氷冷下、アセトン53mLを加え、0℃で10分間攪
した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗
した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した
得られた残渣を中圧クロマトグラフィー(ジ
クロロメタン-エタノール1:0→19:1)にて精製し
、目的物IV Tyr
6.26g(75%)を得た。
<V Tyr
の合成>
IV Tyr
5.72g(5.10mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
ロロメタンに溶解し、減圧濃縮を3回行った
。残渣を20mLの脱水ジクロロメタンに溶解し
氷冷下ジメチルアミノピリジン31mg(0.26mmol)、
ジイソプロピルエチルアミン1.01mL(5.81mmol)を
え、2-シアノエチルジイソプロピルクロロホ
スホロアミジト1.25mL(5.61mmol)の5.1mLジクロロメ
タン溶液を、5分以上かけ滴下した。混合溶
を0℃で90分間攪拌した。続いてメタノール1.
0mLを加え、15分間攪拌した。反応溶液をジク
ロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロ
メタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロ
トグラフィー(2%ピリジンin酢酸エチル;ヘキ
ン=2:1-2%ピリジンin酢酸エチル0→100%、続け
2%ピリジン、20%エタノール2%ピリジンinジク
ロメタン1:0→17:3)にて精製し、目的物V Tyr
5.72g(85%)を得た。
<VI Tyr
の合成>
XIV Tyr
12.0g(9.82mmol)をジクロロメタン98mLに溶解し、
氷冷下でトリフロロ酢酸4.91mLを加え、0℃で45
分間攪拌した。続いて、メタノール49mL及び
リジン11mLを加え、室温で一晩攪拌した。反
溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を
圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー(
酢酸エチル-エタノール93:7→86:14)にて精製し
目的物VI Tyr
8.24g(92%)を得た。
<VIII Tyr
の合成>
VI Tyr
8.24g(9.00mmol)及びV T
6.75g(9.06mmol)を脱水アセトニトリルに溶解し
減圧濃縮を3回行った。残渣を45mLの脱水ア
トニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール3.
15g(45mmol)を加え、室温で30分間攪拌した。続
てメタノール1.8mLを加え、15分間攪拌した。
液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄し
。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残
を45mLのピリジンに溶解し、氷冷下、1Mヒド
ジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液13.5mLを
え、0℃で1時間攪拌し、VII Tyr
の消失が確認できるまで、30分毎に、1Mヒド
ジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液4.5mLを加
えた。氷冷下、アセトン23mLを加え、0℃で10
間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、
で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃
した。得られた残渣を中圧クロマトグラフ
ー(ジクロロメタン-エタノール97:3→9:1)にて
製し、目的物VIII Tyr
11.25g(85%)を得た。
<IX Tyr
の合成>
VIII Tyr
10.72g(7.34mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
クロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を
3回行った。残渣を29mLの脱水ジクロロメタン
溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン45mg
(0.40mmol)、ジイソプロピルエチルアミン1.46mL(8
.35mmol)を加え、2-シアノエチルジイソプロピ
クロロホスホロアミジト1.80mL(8.07mmol)のジク
ロメタン7.3mL希釈溶液を加えた。混合溶液
0℃で2時間攪拌した。続いてメタノール1.5mL
加え、30分間攪拌した。反応溶液をジクロ
メタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロ
タン溶液を減圧濃縮し、残渣を(2%ピリジンin
ジクロロメタン;ヘキサン=2:1-2%ピリジンinジ
ロロメタン0→100%、続けて2%ピリジン,20%エタ
ノール2%ピリジンinジクロロメタン1:0→80:20)
て精製し、目的物IX Tyr
7.36g(60%)を得た。
<IV Phe
の合成>
III C
35.4g(40mmol)を80mLの脱水ジクロロメタンに溶
し、トリエチルシラン9.58mL(60.0mmol)及びジア
ビシクロウンデセン8.97mL(60.0mmol)を加え、室
温にて10分間攪拌した。反応混合物にトリエ
ルアミン塩酸塩4.13g(30.0mmol)、を加え、反応
合物Aを得た。
N-ヒドロキシこはく酸イミド6.33g(55.0mmol)及
ジイソプロピルエチルアミン9.09mL(55.0mL)をア
セトニトリルに溶解し、氷冷下、フェニルア
セチルクロリド6.61mL(50.0mmol)を加え、室温で15
分間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を反応
混合物Aに加えた。反応混合物を室温にて20分
間攪拌した。続いてピペリジン1.19mLを加え、
10分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタン
希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶
を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフ
ー(ジロロメタン-エタノール49:1→9:1)にて精
製し、目的物IV Phe
29.44g(94%)を得た。
<VI Phe
の合成>
IV Phe
13.73g(17.58mmol)を脱水ジオキサンに溶解し、
圧濃縮を3回行った。残渣を90mLの脱水ジオキ
サンに溶解し、ジメチルアミノピリジン172mg
ジシクロヘキシルカルボジイミド7.26g(35.2mmo
l)及びレブリン酸3.61mL(35.2mmol)を加え、室温で
1時間攪拌した。反応溶液に3.5mLのメタノール
を加え、1時間攪拌した。不溶物をろ過し、
液を減圧濃縮し、得られた残渣をジクロロ
タン170mLに溶解し、氷冷下、トリフロロ酢酸
8.79mLを加え0℃で45分間攪拌した。反応混合物
にメタノール70mL、ピリジン38.7mLを加え室温
4時間攪拌した。得られた反応混合物を、水
洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し
。残渣を酢酸エチル150で懸濁し、不溶物で
るVI Phe
を濾別により得た。目的物VI Phe
8.92g(85%、約5%(mol/mol)ジシクロヘキシルカル
ジウレア(DCU)含有)を得た。
<VIII’ Phe
の合成>
VI Phe
6.24g(10mmol(DCU込み))及びV A
10.75g(10mmol)を脱水アセトニトリル/脱水ジク
ロメタンに溶解し、減圧濃縮を3回行った。
残渣を40mLの脱水アセトニトリル及び10mLのジ
ロロメタンに溶解し、氷冷下、テトラゾー
3.50g(50.0mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。
続いてメタノール2.0mLを加え、15分間攪拌し
。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗
した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した
残渣を50mLのピリジンに溶解し、氷冷下、1M
ドラジン1水和物、ピリジン:酢酸=5:2溶液51mL
加え、0℃で2時間攪拌した。氷冷下、アセ
ン10mLを加え、0℃で10分間攪拌した後、ジク
ロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロ
メタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣
中圧クロマトグラフィー(ジクロロメタン-
タノール95:5→9:1)にて精製し、目的物VIII’ phe
8.99g(62%)を得た。
<IX’ Phe
の合成>
VIII’ phe
8.61g(5.93mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
ロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を3
回行った。残渣を24mLの脱水ジクロロメタン
溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン36mg(
0.30mmol)、ジイソプロピルエチルアミン1.24mL(7.
12mmol)を加え、2-シアノエチルジイソプロピル
クロロホスホロアミジト1.46mL(6.52mmol)のジク
ロメタン6.0mL希釈溶液を加えた。混合溶液を
0℃で2時間攪拌した。続いてメタノール1.2mL
加え、30分間攪拌した。反応溶液をジクロロ
メタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメ
タン溶液を減圧濃縮し、残渣を(2%ピリジンin
クロロメタン;ヘキサン=1:1-2%ピリジンinジク
ロロメタン0→100%、続けて2%ピリジン,20%エタ
ール2%ピリジンinジクロロメタン1:0→80:20)に
て精製し、目的物IX’ phe
7.45g(76%)を得た。
<XIVの合成>
L-α,βジアミノプロピオン酸塩化物7.03g(50mmol
)を150mLの蒸留水に溶解し、炭酸水素ナトリウ
ム4.22g(52.5mmol)を加え、5分間攪拌した後、ジ
トキシエタン300mL及びN-(9-フルオレニルメト
シカルボニル)スクシンイニド35.4g(110mmol)を
え、室温で1週間攪拌した。反応混合物を減
圧濃縮した後、蒸留水250mL、36%塩酸及びジク
ロメタン250mLに懸濁し、ろ過により目的物XI
V 24.57g(90%)を得た。
<IV Dia
の合成>
III C
22.12g(25mmol)を50mLの脱水ジクロロメタンに溶
し、トリエチルシラン4.39mL(27.5mmol)及びジア
ザビシクロウンデセン5.61mL(37.5mmol)を加え、
温にて10分間攪拌した、反応混合物にトリエ
チルアミン塩酸塩6.20g(45mmol)を加え、反応混
物Aを得た。
XIV 16.46g(30.0mmol)を50mLの脱水ジメチルホルム
アミドに溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリア
ール3.81g(33.0mmol)を加え、氷冷下、ジシクロ
キシルカルボジイミド6.50g(31.5mmol)を加え、
温で1時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液
を反応混合物Aに加えた。反応混合物を室温
て1時間攪拌した。続いてピペリジン0.6mLを
え、5分間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し
後、酢酸エチル150mL、蒸留水150mLに懸濁し、
ろ過により目的物IV Dia
を含む固体(粗IV Dia
)27.51gを得た。
<V Dia
の合成>
粗IV Dia
27.51gを脱水ピリジンに懸濁し、減圧濃縮を3
回行った。残渣を90mLの脱水ジクロロメタン
懸濁し、氷冷下ジメチルアミノピリジン131mg
(1.2mmol)、ジイソプロピルエチルアミン4.57mL(27
.7mmol)を加え、2-シアノエチルジイソプロピル
クロロホスホロアミジト5.89mL(25.3mmol)の23mLジ
ロロメタン溶液を5分以上かけ滴下した。混
合溶液を0℃で1時間攪拌した。続いてメタノ
ル4.7mLを加え、15分間攪拌した。反応溶液を
ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジ
クロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧
クロマトグラフィー(2%ピリジンin酢酸エチル;
ヘキサン=1:1-2%ピリジン、2%エタノールin酢酸
チル1:0→0:1)にて精製し、目的物V Dia
16.11g(46% 2step)を得た。
<VIII Dia
の合成>
V Dia
16.06g(11.5mmol)及びVI G
8.71g(12.7mmol)を脱水ジクロロメタン、脱水ア
トニトリル混合溶液に溶解し、減圧濃縮を3
回行った。残渣を35mLの脱水アセトニトリル
び35mL脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下
トラゾール4.04g(57.6mmol)を加え、室温で一晩
拌した。続いてメタノール2.3mLを加え、30分
間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し
、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧
濃縮した。残渣を58mLのピリジンに溶解し、
冷下、1Mヒドラジン1水和物、ピリジン:酢酸=
3:2溶液34.6mLを加え、0℃で1.5時間攪拌した。
冷下、アセトン6mLを加え、0℃で10分間攪拌
た後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄
た。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。
られた残渣を中圧クロマトグラフィー(ジク
ロメタン-エタノール97:3→9:1)にて精製し、
的物VIII Dia
13.46g(62%)を得た。
<IX Dia
の合成>
VIII Dia
12.98g(6.90mmol)を脱水アセトニトリル、脱水ジ
クロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を
3回行った。残渣を44mLの脱水ジクロロメタン
溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン42mg
(0.34mmol)、ジイソプロピルエチルアミン2.18mL(1
3.2mmol)を加え、2-シアノエチルジイソプロピ
クロロホスホロアミジト2.70mL(12.1mmol)のジク
ロメタン11mL希釈溶液を加えた。混合溶液を
0℃で12時間攪拌した後、室温で2時間攪拌し
。続いてメタノール2.2mLを加え、30分間攪拌
た。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、
で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃
し、残渣を(2%ピリジンin酢酸エチル;ヘキサ
=2:1-2%ピリジンin酢酸エチル0→100%、続けて2%
ピリジン、20%エタノール2%ピリジンin酢酸エ
ル1:0→1:1)にて精製し、目的物IX Dia
10.52g(73%)を得た。
<各化合物の構造確認>
前記スキーム1~スキーム11の各化合物(本発
の核酸合成用ダイマーアミダイドであるIX Ser
、IX Leu
、IX Phe
、IX Glu
、IX A-Lys
、IX G-Lys
、IX The
、IX Met
、IX Tyr
、IX’ Phe
、IX Dia
を含む)の構造確認を以下のようにして行っ
。結果を図2-1~図12-11に示す。
[ 1
H-NMR]
各サンプル約5mgを重溶媒に溶解し、測定し
。内部標準は重溶媒ピークを基準とした。
[ 31
P-NMR]
外部標準としてPPh 3
を用い、-6.2ppmを基準として測定した。BCMに
測定を行った。
(実施例2:純度の確認)
実施例1で得られた本発明の核酸合成用ダイ
マーアミダイドIX Ser
に対して精製を行い、精製後のIX Ser
と、未精製の比較対照のダイマーアミダイド
IX’ Ser
との純度比較を行った。
結果、図13A及び図13Bに示す通り、未精製の
較対照のダイマーアミダイドIX’ Ser
(HPLC Chart a、図13A)に比べ、精製後の本発明
核酸合成用ダイマーアミダイドIX Ser
(HPLC Chart b、図13B)は純度が高く、核酸合成
好適であることが確認できた。
なお、比較対照のダイマーアミダイドIX’ Ser
では、IX Ser
と同様の条件(ピリジン含有)でシリカゲルク
マト精製を行ったところ、ほとんどが分解
れ、回収率は3%以下であった。なお、逆相HP
LCでは40%程度が回収できたが、核酸自動合成
率の改善はほとんどみられなかった。
(実施例3:核酸合成収率の確認)
本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドIX Ser
(精製後)を用いてDNAを合成した場合のDNA合成
率と、比較対照のダイマーアミダイドIX’ Ser
(未精製)を用いてDNAを合成した場合のDNA合成
率を比較した。DNA合成はジーンワールド社
H-8DNA合成機を用い、カップリング、脱トリ
ル(合成収率確認)プログラムをそのまま利
した(図14)。
結果、図15A及び図15Bに示す通り、比較対照
ダイマーアミダイドIX’ Ser
(未精製)を用いてDNAを合成した場合の総収率
約40%であり、一段階収率は約83.3%であった(
15A)。これに対し、本発明の核酸合成用ダイ
マーアミダイドIX Ser
(精製後)を用いてDNAを合成した場合の総収率
約96%であり、一段階収率は約99.6%であった(
15B)。
したがって、亜リン酸トリエステル結合を
して連結してなる本発明の核酸合成用ダイ
ーアミダイド(精製可能)を用いることによ
、リン酸トリエステル結合を介して連結し
なる本発明の核酸合成用ダイマーアミダイ
(精製不可能)を用いるよりも、結果的に高い
核酸合成収率が得られることが確認できた。
本発明の核酸合成用ダイマーアミダイド 及び本発明の核酸合成方法によれば、例え 、置換基を有する修飾核酸(本発明の核酸の 一態様)を、安定に、かつ効率的に得ること できる。得られた修飾核酸は、置換基を介 て蛋白質等の標的物質との結合が可能であ 、したがって、前記修飾核酸は、例えば、 白質等の標的物質の解析に、好適に利用可 である。