Unterscheidung von Enantiomeren mit Hilfe der breitbandigen Femtosekunden-Circulardichroismus-Massenspektrometrie

20 Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Unterscheidung von Enantiomeren mit Hilfe der breitbandigen Femtosekunden- Circulardichroismus-Laserionisations-Massenspektrometrie bereit. Es werden Laserpulse mit einer Zentralwellenlänge zwischen 200 nm und 1.100 nm eingesetzt, um die zu untersuchende Probe zu ionisieren. Die auf diese Weise erzeugten lo-

25 nen werden unmittelbar massenspektrometrisch analysiert. Da die Enantiomeren- spezifische Licht-Materie-Wechselwirkung direkt zur Ionisation genutzt wird, ist eine vorherige Trennung von Substanzgemischen nicht mehr erforderlich. Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren auch in zuvor unbekannten Substanzgemischen anwendbar. Beschreibung und Einleitung des allgemeinen Gebietes der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete Chemie, Biologie und Biochemie, Physik und instrumenteile Analytik.

Stand der Technik

Die Unterscheidung von Enantiomeren - besonders in unbekannten Substanzgemischen - gestaltet sich heute noch sehr aufwändig. Derzeit erfordert die Kombination von chemischer Analyse einerseits und Bestimmung der Enantiomeren- reinheit andererseits getrennte Arbeitsschritte: Zunächst muss das Substanzgemisch getrennt werden, beispielsweise mittels Gaschromatographie (GC) oder Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), dann wird die Enantiomerenrein- heit bestimmt und, falls nötig, anschließend eine chemische Analyse durchgeführt, beispielsweise mittels Massenspektrometrie.

Dem Fachmann ist bekannt, dass sich die Enantiomerenreinheit eines Gemisches beispielsweise mit Hilfe der CD-Spektroskopie (Circulardichroismus- Spektroskopie) bestimmen lässt. Die konventionelle CD-Spektroskopie beruht auf Einphotonen-Absorption, und eine Information über die Masse der untersuchten Probe ist intrinsisch nicht möglich. Mit dieser Methode können nur für zuvor identifizierte chemische Substanzen R- und S-Enantiomer unterschieden werden. E- benso wird keine spektral hochauflösende Information erhalten, die eine Unterscheidung chemisch ähnlicher Substanzen ermöglichte. Konventionelle CD- Spektrometer arbeiten üblicherweise im Wellenlängenbereich zwischen 200 nm und 1.100 nm. Während der Messung mit konventionellen CD-Spektrometem wird ständig zwischen RCPL und LCPL gewechselt, d.h. zwischen rechts- und links- zirkular polarisiertem Licht (right / left circularly polarized light).

Auch die Mehrphotonenionisation (MPI) in der CD-Spektroskopie ist bekannt. So wird beispielsweise in U Boesl von Grafenstein, A Bornschlegl: „Circular Dichroism Laser Mass SDectrometry: Differentiation of 3-Methylcyclopentanone Enantio- mers." ChemPhysChem 2006, 7, 2085-2087 die Verwendung der circulardichroi- schen Laser-Massenspektrometrie (CD-LAMS) zur Unterscheidung von Enantio- meren beschrieben. Die Anregung der Methylcyclopentanone erfolgt mit einem schmalbandigen Nanosekunden-Laser, wobei - wie üblich - die Laserwellenlänge genau passend zu dem anzuregenden Übergang eingestellt wird.

Bisher bekannte CD-Spektrometθr basieren auf einer Einphotonenanregung der zu untersuchenden Probe. Die spektrale Auflösung liegt im Wesentlichen in der Größenordnung von einem Nanometer. Da als Lichtquelle in der Regel zeitlich kontinuierliche UV-VIS-N I R-Lampen eingesetzt werden, ist eine Ionisation der Probenmoleküle auf Grund zu geringer Lichtintensität nicht möglich. Die chemische Identität der Probe muss in einem separaten Verfahren bestimmt werden. Bei Substanzgemischen ist hier eine vorherige Separation erforderlich.

Bekannt ist des Weiteren ein Verfahren zur Laserionisations- Massenspektrometrie, in dem zirkulär polarisierte Nanosekundenlaserpulse verwendet werden, deren Bandbreite im Bereich von Bruchteilen von Nanometern liegt; und zwar im Allgemeinen im Bereich von 0,01 nm. Sie werden üblicherweise zum Zweck hoher spektraler Auflösung eingesetzt. Die mit derartigen Lasern erreichbaren Spitzenintensitäten (peak intensities) liegen im Bereich von 10 ⁸ bis 10 ¹⁰ W/cm ² . Eine Ionisation der Probe ist unter diesen Bedingungen nur über eine Resonanzverstärkung möglich, d.h. wenn die eingestellte Wellenlänge exakt zum Molekül passt.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung sowie das damit durchführbare Verfahren ü- berwinden die Nachteile des Standes der Technik, indem erstmals spektral breit- bandige Circulardichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) und Massenspektrometrie dergestalt miteinander kombiniert werden, dass eine Trennung von Substanzgemischen nicht mehr erforderlich ist. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem zugehörigen Verfahren werden fs-Laserpulse eingesetzt, deren zeitliche Pulsdauer bezogen auf einen bandbreitenbegrenzten Puls kürzer als 200 fs ist und deren spektrale .Bandbreite dementsprechend groß ist. Die Pulsdauer ist beim Femtosekundenlaser etwa um einen Faktor 10 ⁶ kleiner als bei einem Nanosekundenlaser. Es ergeben sich erreichbare Spitzenintensitäten von 10 ¹² W/cm ² und größer. Dies ermöglicht eine sehr effiziente Ionisation der Probe. Die so erzeugten Ionen werden unmittelbar massenspektrometrisch analysiert. Die Enantiomeren-spezifische Licht-Materie-Wechselwirkung wird direkt zur Ionisation genutzt, so dass eine Trennung von Substanzgemischen nicht mehr erforderlich ist.

Aufgabe

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur Laserionisations- massenspektrometrie mittels zirkulär polarisierter Femtosekundenlaserstrahlung sowie ein Verfahren zur Unterscheidung von Enantiomeren mit Hilfe dieser Vorrichtung bereitzustellen, welches auch zur Anwendung in zuvor unbekannten Substanzgemischen geeignet ist und ohne vorgeschaltete Trennverfahren auskommt.

Lösung der Aufgabe

Die Aufgabe der Bereitstellung einer neuen Vorrichtung zur Laserionisationsmas- senspektrometrie mittels zirkulär polarisierter Femtosekundenlaserstrahlung wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Vorrichtung umfassend - eine fs-Laserstrahlungsquelle,

- einen Probeneinlass,

- eine lonenquelle,

- einen Massenanalysator

- einen lonendetektor, wobei sich Probeneinlass, lonenquelle, Massenanalysator und lonendetektor in der evakuierten Hauptkammer des Massenspektrometers befinden;

- einem elektronischen Messgerät zur Aufzeichnung der vom lonendetektor generierten Signale,

- einem Computer zur Auswertung und Speicherung der empfangenen Signale,

dadurch gekennzeichnet, dass

- es sich bei der fs-Laserstrahlungsquelle um ein Lasersystem zur Erzeugung von Laserpulsen im Femtosekundenbereich handelt, dessen Laserpulsdauer (τ) bezogen auf einen bandbreitenbegrenzten (Fourier-transform-limited) Puls kleiner oder gleich 200 fs und dessen Zentralwellenlänge (λ) 200 nm bis 1.100 nm beträgt, - die spektrale Bandbreite der zur Ionisation eingesetzten Femtosekundenla- serpulse ausgewählt wird aus Bandbreiten, die kleiner oder gleich 40 nm sind, und Bandbreiten, die größer 40 nm sind,

- die Laserpulse durch Mittel zur Erzeugung zirkularer Polarisation geleitet wer- den, die ein Wechseln zwischen rechts- und links-zirkular polarisiertem Licht gestatten,

- die so erhaltene zirkulär polarisierte Femtosekundenlaserstrahlung mit Hilfe einer Strahlführungsoptik über das Laserfenster in die Hauptkammer des Massenspektrometers gelenkt und mit Hilfe einer Fokussierungsoptik fokus- siert wird, und wobei

- unter lonenquelle derjenige Ort innerhalb der Hauptkammer des Massenspektrometers verstanden wird, an dem die Analyten durch Wechselwirkung mit der fokussierten Femtosekundenlaserstrahlung ionisiert werden.

Die vorliegende Erfindung stellt erstmals eine Kombination zirkulär polarisierter Femtosekundenlaserstrahlung mit der Laserionisationsmassenspektrometrie (LIMS) in einer circulardichroischen Anwendung bereit.

Bisher bekannte CD-Spektrometer betrachten Einphotonenanregungen der zu untersuchenden Probe und verwenden als Lichtquelle im Allgemeinen zeitlich kontinuierliche UV-VIS-NIR-Lampen. Wegen der zu geringen Lichtintensität ist eine Ionisation der Probenmoleküle nicht möglich. Daher ist hier ein separates Verfahren notwendig, um die chemische Identität der Probe zu bestimmen. Im Falle von Substanzgemischen ist zudem vorher eine Trennung des Gemisches in Einzelsubstanzen erforderlich.

Dagegen werden bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem zugehörigen Verfahren fs-Laserpulse eingesetzt. Dabei ist die Laserpulsdauer (τ), bezogen auf einen bandbreitenbegrenzten (Fourier-transform-limited) Puls kleiner oder gleich 200 fs. Bei Annahme eines zeitlich Gauss-förmigen Pulsprofils entspricht dies einer Frequenzunschärfe von 2,2 THz. Bei einer Zentralwellenlänge (λ) von 800 nm entspricht dies einer spektralen Bandbreite (BB, volle Breite bei der Hälfte des Maximums) in der Wellenlängendomäne von größer oder gleich 5 nm, bei 200 nm einer BB von größer oder gleich 0,3 nm und bei 1.100 nm einer BB von größer oder gleich 9 nm. Dem Fachmann ist bekannt, dass kürzest mögliche Pulsdauer (τ) und zugehörige spektrale Bandbreite eines Lasers einander umgekehrt proportional sind. Ihm ist auch bekannt, wie bei gegebener spektraler Bandbreite die zugehörige kürzest mögliche Pulsdauer ermittelt werden kann. Diese Pulse dienen als Grundlage zur Erzeugung von Laserstrahlung in dem für die eigentliche Messung benötigten Spektralbereich, der im Allgemeinen nicht dem Spektralbereich der Pulse entspricht.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Laserionisationsmassenspektrometrie mittels zirkulär polarisierter Femtosekundenlaserstrahlung sowie das erfindungsgemäße Verfahren zur Unterscheidung von Enantiomeren mit Hilfe dieser Vorrich- tung sind nachfolgend erläutert, wobei die Erfindung alle nachfolgend aufgeführten bevorzugten Ausführungsformen einzeln und in Kombination miteinander um- fasst.

Überraschend wurde gefunden, dass die Licht-Materie-Wechselwirkung auch bei Verwendung von Femtosekundenlaserpulsen, die sich direkt zur Ionisation nutzen lassen, Enantiomeren-spezifisch ist. Dadurch ist es erstmalig möglich, Enantiomeren zu unterscheiden und zu identifizieren, ohne dass eine Trennung von Substanzgemischen erforderlich ist.

Hierbei werden zirkulär polarisierte ultrakurze Femtosekundenlaserpulse (fs- Laserpulse) eingesetzt, deren Zentralwellenlängen im Bereich zwischen 200 nm und 1.100 nm liegen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die zu untersuchende Probe mit ei- nem zirkulär polarisierten Femtosekundenlaserpuls ionisiert, dessen Bandbreite kleiner oder gleich 40 nm ist. In diesem Fall sind Wellenlängenabhängigkeiten zu beobachten. Zur Untersuchung dieser Wellenlängenabhängigkeit ist eine Variation der Wellenlänge zweckmäßig. Die zur Ionisierung eines bestimmten Analyten passende Wellenlänge muss jedoch nicht vorab bekannt sein. Bandbreiten kleiner oder gleich 40 nm werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung als „kleine Bandbreiten" bezeichnet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die zu untersuchende Probe mit zirkulär polarisierter Femtosekundenlaserstrahlung ionisiert, deren spektrale Bandbreite größer als 40 nm ist. Femtosekundenlaserstrahlung, deren spektrale Bandbreite größer als 40 nm ist, wird nachfolgend als „breitbandige Femtosekundenlaserstrahlung" oder „Laserstrahlung mit großer spektraler Bandbreite" bezeichnet. Diese breitbandige Strahlung wird verwendet, um die zu untersuchende Probe zu ionisieren. In dieser Ausführungsform ist es nicht erforderlich, dass die zur Ionisierung eines bestimmten Analyten passende Wellenlänge vorab bekannt ist, da auf Grund der großen spektralen Bandbreite die für das jeweilige zu untersuchende Molekül passenden Wellenlängen intrinsisch enthalten sind. Dies gilt insbesondere für spektrale Bandbreiten größer als 100 nm, die nachfolgend im Einklang mit der im Stand der Technik üblichen Bezeichnung als „Weißlichtkonti- nuum" bezeichnet werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die zu untersuchende Probe mit zirkulär polarisierter Femtosekundenlaserstrahlung ionisiert, bei deren spektraler Bandbreite es sich um ein Weißlichtkontinuum handelt, d.h. bei dem die Bandbreite größer als 100 nm ist.

Unabhängig davon, ob die zirkulär polarisierte Femtosekundenlaserstrahlung, die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem zugehörigen, nachfolgend erläuterten Verfahren verwendet wird, große oder kleine Bandbreiten aufweist, liegen die Zentralwellenlängen dieser Femtosekundenlaserpulse im Bereich zwischen 200 nm und 1.100 nm.

Weißlicht-Laserstrahlung in einem breiten Spektralbereich zwischen 200 nm und 1.100 nm kann beispielsweise - wie nachfolgend erläutert - durch die Wechsel- Wirkung der Strahlung mit Edelgas („Filamentbildung", „Selbst-Phasenmodulation") erzeugt werden.

Soll dagegen mit Laserpulsen einer Bandbreite kleiner oder gleich 40 nm gemessen werden, so lassen sich mit den Femtosekundenlaserpulsen weitere Lasersysteme optisch pumpen, wobei in den weiteren Lasersystemen durch optisch para- metrische Prozesse Licht anderer Wellenlänge entsteht und verstärkt wird (Optische parametrische Verstärker).

In der vorliegenden Erfindung bezeichnet „Analyt" eine einzelne zu untersuchende Substanz. Dabei kann jeder dieser Analyten unabhängig von den anderen chemischer, biologischer oder biochemischer Natur sein.

Bei der zu untersuchenden Probe kann es sich um einen einzigen Analyten oder um ein Gemisch mehrerer Analyten handeln, wobei jeder in der Probe enthaltene Analyt enantiomerenrein oder als Enantiomerengemisch vorliegen kann. Bei allen Ausführungsformen wird die Probe mit Hilfe von zirkulär polarisierter Femtosekundenlaserstrahlung ionisiert. Die so erhaltenen Ionen werden unmittelbar massenspektrometrisch analysiert

Bei der hier vorgestellten Vorrichtung und dem damit durchführbaren Verfahren garantiert der Femtosekundenlaserpuls die Intensität, die zur Ionisation und Fragmentierung der zu untersuchenden Substanzen notwendig ist. Während der Bestrahlung mit den Femtosekundenlaserpulsen wird zwischen RCPL und LCPL gewechselt, d.h. zwischen rechts- und links-zirkular polarisiertem Licht (right / left circuiarly polarized light), und die jeweilige lonenausbeute gemessen.

Es ist bekannt, dass alle optisch aktiven Substanzen unterschiedliche Absorptionskoeffizienten für rechts- bzw. links-zirkular polarisiertes Licht besitzen. Der Ein- fluss des Circulardichroismus macht sich in der Intensität des lonensignals bemerkbar, da der CD-Effekt zu unterschiedlichen lonenausbeuten der Enantiome- ren führt und sich daher unterschiedliche CD-Werte bestimmen lassen. Zudem besitzt jedes Fragmention einer Substanz einen spezifischen CD-Wert.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren ergeben sich Massentrennung und CD-Effekt gleichzeitig, so dass eine Trennung von Substanzgemischen nicht notwendig ist. Erfindungsgemäß handelt es sich bei der Strahlungsquelle um ein Lasersystem zur Erzeugung von Laserpulsen im Femtosekundenbereich. Hierfür werden solche Lasersysteme ausgewählt, deren Pulsdauer kleiner oder gleich 200 Femtosekun- den bezogen auf einen bandbreitenbegrenzten (Fourier-transform-limited) Puls beträgt. Geeignet sind beispielsweise, aber nicht erschöpfend, Ti:Saphir-Laser.

Die Mittel zur Erzeugung von Femtosekundenlaserstrahlung im Bereich der Wellenlängen von 200 nm bis 1100 nm werden ausgewählt aus nichtlinearen optischen Wechselwirkungsprozessen, mit denen die spektrale Lage verschoben und die spektrale Breite der Ausgangspulse vergrößert werden kann, wie der Wechselwirkung innerhalb eines Plasma-Filaments, gasgefüllten Hohlfasern oder der Weißlichterzeugung durch Selbstphasenmodulation in Flüssigkeiten oder Festkörpern. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Mitteln zur Erzeu- gung breitbandiger Femtosekundenlaserstrahlung um ein oder mehrere Plasma- Filamente.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Mitteln zur Erzeugung breitbandiger Femtosekundenlaserstrahlung um gasgefüllte Hohlfasern. Bei den Hohlfasern handelt es sich um eine einzige Hohlfaser oder um zwei nacheinander durchlaufene Hohlfasern. Das Füllgas in diesen gasgefüllten Hohlfasern ist ein Edelgas.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Mitteln zur Erzeugung von Bandbreiten kleiner oder gleich 40 nm um eine Kombination aus der Erzeugung eines Weißlichtkontinuums mit einem nachgeschalteten spektralen For- mungsprozess, der durch Filter oder Pulsformer erzielt werden kann.

Erfindungsgemäß wird die zirkuläre Polarisation der Laserpulse beispielsweise mit Hilfe eines Fresnelrhombus, eines K-Prismas, einer Viertelwellenplatte, eines photoelastischen Modulators, zweier Pockelszellen oder einer Pockelszelle in Verbin- düng mit einer Viertelwellenplatte erzeugt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die zirkuläre Polarisation der Laserpulse mit Hilfe einer Pockelszelle in Verbindung mit einer Viertelwellenplatte erzeugt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die zirkuläre Polarisation der Laserpulse mit Hilfe eines Fresnelrhombus erzeugt. Die Verwendung eines Fres- nelrhombus führt zu einem Strahlversatz, der durch Umlenkoptik kompensiert werden muss. Diese Kompensation des Strahlversatzes bei Verwendung eines Fresnelrhombus ist dem Fachmann bekannt und kann ohne den Schutzbereich der Patentansprüche zu verlassen angewendet werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die zirkuläre Polarisation der Laserpulse mit Hilfe eines photoelastischen Modulators erzeugt. Dem Fachmann ist bekannt, dass photoelastische Modulatoren eine Synchronisation von Laser- pulszug und Modulatorfrequenz bzw. Phasenlage der Modulation erfordern. Dies geschieht dadurch das die Injektion des zu verstärkenden Pulses aus dem Oszillatorlaser des Lasersystems in den Verstärkerlaser nicht über die Teilerschaltung des Verstärkerlasers sondern über eine Tor-Schaltung gesteuert durch den photoelastischen Modulator erfolgt, und der Fachmann kann diese Methoden der Synchronisation anwenden, ohne den Schutzbereich der Patentansprüche zu verlassen.

Besonders bevorzugt wird die zirkuläre Polarisation des Femtosekundenla- serstrahls durch Transmission der Pulse durch ein Viertelwellenplättchen erreicht. Abhängig vom Winkel zwischen der eingehenden linearen Polarisationsrichtung und der schnellen Achse des Viertelwellenplättchens entsteht so rechts- oder links-zirkular polarisiertes Licht. Das Viertelwellenplättchen wird dabei so gelagert, dass es beispielsweise mit Hilfe einer computergesteuerten mechanischen Vorrichtung gedreht werden kann, um zwischen rechts- und links-polarisiertem Licht umschalten zu können. Der Polarisationszustand des transmittierten Lichts wird mit Hilfe eines Polarisators überprüft. Die so erzeugten zirkulär polarisierten Laserpulse werden innerhalb einer Vakuumapparatur fokussiert, beispielsweise mit Hilfe eines Hohlspiegels.

Probeneinlass, lonenquelle, Massenanalysator und lonendetektor befinden sich in der Hauptkammer des Massenspektrometers.

Beim Probeneinlass kann es sich beispielsweise, aber nicht erschöpfend, um eine Kapillare oder eine Molekularstrahldüse handeln. Dem Fachmann ist bekannt, durch welche Vorrichtung man die zu analysierende Probe in die Hauptkammer eines Massenspektrometers einführen kann. Er kann diese Vorrichtungen verwenden, ohne den Schutzbereich der Patentansprüche zu verlassen.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter lonenquelle derjenige Ort innerhalb der Hauptkammer des Massenspektrometers verstanden, an dem die Analy- ten durch Wechselwirkung mit der fokussierten Femtosekundenlaserstrahlung ionisiert werden.

Es können dem Fachmann bekannte Massenanalysatoren verwendet werden, beispielsweise Flugzeit-Massenanalysatoren (Time-of-Flight Mass Spectrometer, TOF-MS) und Quadrupol-Massenanalysatoren.

Dabei ist der TOF-Massenanalysator bevorzugt, da dort im Wesentlichen mit einem Laserpuls das gesamte Flugzeitmassenspektrum gemessen werden kann. Dagegen ist beim Quadrupol-Massenanalysator für jede Masse mindestens ein Laserpuls notwendig, denn im Wechselfeld zwischen den Quadrupol-Stäben findet eine m/z-Selektierung statt, so dass intrinsisch jeweils nur Ionen mit einem definierten Verhältnis m/z von Masse (m) zu Ladung (z) das Feld durchlaufen können. In der vorliegenden Erfindung wird im Folgenden im Falle des Verhältnis- ses von Masse zu Ladung auch verkürzend von „Masse" gesprochen.

Der lonendetektor wird beispielsweise, aber nicht erschöpfend, ausgewählt aus Mikrokanalplatten (MCP, Micro-Channel Plate), Channeltron, Sekundärelektronenvervielfacher, Daly-type Detektoren, Szintillationszähler. Dabei sind im Falle eines TOF-MS Mikrokanalplatten bevorzugt.

Das elektronische Messgerät zur Messung und Aufzeichnung der vom lonendetektor generierten Signale wird beispielsweise, aber nicht erschöpfend, ausgewählt aus einem digitalen Oszilloskop, einem Transientenrekorder, einem Box- Car-Integrator oder einem Digitizer.

Dabei ist das digitale Oszilloskop bevorzugt.

Die empfangenen und gemessenen Signale werden mit Hilfe eines Computers gespeichert und ausgewertet. Dem Fachmann ist bekannt, dass die Intensität von Laserpulsen gegebenenfalls schwanken kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden daher die Flugzeitmassenspektren über mehrere Laserpulse gemittelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Weiterhin wird mit einem Strahlteiler ein Teil des Laserpulses auf einen Detektor geführt, der die Intensität des Pulses misst. Im Auswertungsprogramm des Computers werden die zugehörigen lonenzählraten mit der vorliegenden Pulsintensität korreliert.

Es ist ohne Weiteres ersichtlich, dass man die empfangenen und gemessenen Signale mit bekannten Signalen vergleichen kann. Die bekannten Signale lassen sich vorteilhaft in einer Datenbank abspeichern. Diese Datenbank enthält CD- Werte und Fragmentierungsmuster bekannter Substanzen. Besonders vorteilhaft ist es, wenn nicht nur zum jeweiligen Mutterion der bekannten Substanzen ein CD-Wert vorliegt, sondern auch zu den Fragmentionen. Gibt es zu den aktuell empfangenen und gemessenen Signalen unbekannter Substanzen bereits entsprechende Daten in der Datenbank, so lassen sich die unbekannten Substanzen auf diese Weise identifizieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Unterscheidung von Enantiomeren mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Femtosekunden-Circulardichroismus- Laserionisationsmassenspektrometrie umfasst folgende Schritte:

- Erzeugung zirkulär polarisierter Femtosekundenlaserstrahlung, wobei die La- serpulse eine Zentralwellenlänge (λ) zwischen 200 nm und 1.100 nm und eine

Laserpulsdauer (τ) kleiner oder gleich 200 fs, bezogen auf einen bandbreitenbegrenzten (Fourier-transform-limited) Puls, aufweisen, und wobei zwischen rechts- und links-zirkular polarisiertem Licht gewechselt wird,

- Einbringen der zu untersuchenden Probe und einer oder mehrerer achiraler Referenzsubstanzen in die Gasphase,

- Einführen der zu untersuchenden Probe und einer oder mehrerer achiraler Referenzsubstanzen in die Hauptkammer eines Massenspektrometers, Bestrahlung der zu untersuchenden Probe und einer oder mehrerer achiraler Referenzsubstanzen mit der zirkulär polarisierten Femtosekundenlaserstrah- lung,

Detektion der lonenausbeuten und der Massen pro Ladung der gebildeten Ionen und Berechnung ihrer CD-Werte,

Speicherung der Massenspektren und der zugehörigen CD-Werte, Auswertung der gemessenen Daten.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Flugzeitmassenspektren wie oben beschrieben über mehrere Laserpulse gemittelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.

Die Auswertung der gemessenen Daten umfasst die folgenden Schritte: a) Umrechnung der Flugzeitspektren in Masse-pro-Ladung-Spektren (m/z- Spektren), wobei die Zählrate des Mutterionensignals bei der bekann- ten Masse als Integral unter dem Flugzeitmassenspektrum und die Flächen unter dem Maximum jeweils für rechts- und links-zirkular polarisiertes Licht berechnet werden, b) Ermittlung der aufgezeichneten Massen und der Massenausbeuten der untersuchten Probe für jede untersuchte Wellenlänge sowie für links- und rechts-zirkular polarisiertes Licht, beginnend bei den größten und endend bei den kleinsten Massen, c) Identifizierung der zu diesen Massen gehörenden Substanzen durch Vergleich mit Werten aus einer Datenbank, d) Wiederholung der Schritte b) und c) für die gleichzeitig in der Apparatur gemessenen achiralen Referenzsubstanzen, e) Berechnung des CD-Wertes bezüglich der lonenausbeuten gemäß CD = 2 (YL-YR) / (YL ⁺ YR), worin Y _L und YR die lonenausbeuten für links- bzw. rechts-zirkular polarisiertes Licht sind, für den Analyten und die Referenzsubstanzen.

Bei der Messung werden Flugzeitmassenspektren der zu untersuchenden Probe und einer achiralen Referenzsubstanz für die beiden zirkulären Polarisationen gemessen.

Im Falle einer chemisch reinen Substanz (zu untersuchende Probe) enthält das Massenspektrum einen Mutter-Ionen-Peak sowie in der Regel Fragment-Ionen- Peaks. Bei einem Substanzgemisch ergibt sich eine Überlagerung von Massenspektren. In den Flugzeitmassenspektren wird über die detektierten Massenpeaks (Mutter-Ionen-Peak plus Fragmentierungsmuster) eine Zuordnung zu einer Substanz möglich. Die Massenpeaks einer optisch aktiven Substanz zeigen unter- schiedliche lonenausbeuten für links- und rechts-zirkular polarisiertes Licht. Aus diesem Unterschied lässt sich ein CD-Wert berechnen. Bestandteil des erfindungsgemäßen Auswertungsverfahrens ist die Ermittlung des CD-Wertes für sämtliche beobachtete Ionen.

Der CD-Wert einer Substanz berechnet sich nach

CD=2(YL- YRX(YL ⁺ YR), wobei YL und Y _R die lonenausbeuten für links- bzw. rechts- zirkular polarisiertes Licht sind.

Die Auswertung, d.h. die Zuordnung von Substanzen zu bestimmten Massen- peaks, beginnt bei der größten beobachteten Masse. Die zu dieser Masse gehörende Substanz wird durch Vergleich mit entsprechenden Werten aus einer Datenbank identifiziert. Die Auswertung arbeitet sich iterativ zu kleineren Massen vor.

Flugzeit (t) und Masse pro Ladung (m/z) sind durch eine Beziehung miteinander verknüpft: t ~ (m/z) ^1/2 . Das Flugzeitenspektrum lässt sich damit in ein Masse-pro- Ladung-Spektrum umrechnen. Die Zählrate des Mutterionensignals wird bei der bekannten Masse als Integral unter dem Flugzeitmassenspektrum numerisch berechnet. Die Integrationsgrenzen werden dabei entweder automatisch oder auf Grund der bekannten untersuchten Probensubstanzen manuell gesetzt. Das Aus- Werteprogramm berechnet die Flächen unter dem Maximum des Mutterionensignals für links- und rechts-zirkular polarisiertes Licht und gibt den CD-Wert bezüglich der lonenausbeuten CD=2(Y _L -YR)/(YL+YR) aus.

Genauso wird für das Mutterionensignal einer gleichzeitig in der Apparatur befind- liehen achiralen Referenzsubstanz vorgegangen. Weist diese Substanz einen CD- Wert ungleich Null auf, muss dieser von Intensitäts- und Qualitätsunterschieden des links- und rechts-zirkular polarisierten Lichtes hervorgerufen sein. Dieser CD Wert wird deshalb von dem CD-Wert der chiralen Substanz als Korrektur subtrahiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Femtosekundenlaserstrahlung durchgeführt, deren Bandbreite kleiner oder gleich 40 nm ist. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn bereits bekannt ist, dass es sich bei der zu untersuchenden Probe um ein Enantiomerengemisch einer einzigen Sub- stanz handelt und die Enantiomerenreinheit gemessen werden soll.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Femtosekundenlaserstrahlung durchgeführt, deren Bandbreite größer als 40 nm ist. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn die Zusammensetzung der zu untersuchenden Probe vorab nicht bekannt ist. Im Falle von Proben unbekannter Zusammensetzung ist die Verwendung von Weißlicht-Laserstrahlung ganz besonders bevorzugt.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren können zur Identifizierung und Unterscheidung von Enantiomeren verwendet werden. Dabei können R- und S-Enantiomere auch in zuvor unbekannten Substanzgemischen identifiziert und der Anteil jedes Enantiomeren in diesem Gemisch ermittelt werden, ohne dass ein Trennverfahren notwendig wäre. Vorrichtung und Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gestatten es, die Aufnahme von Massen- spektren und die Bestimmung von CD-Werten simultan durchzuführen. Ausführungsbeispiele

Ausführungsbeispiel 1 :

Laserpulse mit einer Zentralwellenlänge von 800 nm und einer Dauer von 45 Femtosekunden wurden mit Hilfe eines kommerziellen Femtosekundenlaser- Verstärkersystems (ODIN, Fa. Quantronix) erzeugt. Diese Pulse dienten als Grundlage zur Erzeugung von Laserstrahlung in dem für die eigentliche Messung benötigten Spektralbereich. Mit den Verstärkerpulsen wurde ein weiteres Laser- system (Optischer parametrischer Verstärker, TOPAS, Fa. Light Conversion) optisch gepumpt. Durch zweimalige Frequenzverdoppelung der austretenden sogenannten Signal-Pulse wurden Femtosekundenpulse mit einer Zentralwellenlänge im nahen UV-Bereich von 311 nm und 324 nm sowie durch nur einmalige Frequenzverdopplung Femtosekundenpulse mit einer Zentralwellenlänge von 650 nm erzeugt und verstärkt. Diese Pulse waren für die Untersuchung der Beispielsubstanz Methylcyclopentanon geeignet.

Die Laserpulse wurden durch Transmission durch ein achromatisches Viertelwel- lenplättchen zirkulär polarisiert. Abhängig vom Winkel zwischen der eingehenden linearen Polarisationsrichtung und der schnellen Achse des Viertelwellenplätt- chens entsteht so rechts- oder links-zirkular polarisiertes Licht. Das Viertelwellen- plättchen wurde so gelagert, dass es mit Hilfe eines Schrittmotors gedreht werden konnte. Das erlaubte ein Umschalten zwischen links- und rechts-zirkular polarisiertem Licht. Die Ausrichtung des Viertelwellenplättchen und der Polarisationszu- Standes des transmittierten Lichtes wurde mit Hilfe eines Polarisators überprüft. Die so erzeugten zirkulär polarisierten Laserpulse wurden mittels einer Strahlführungsoptik durch ein Fenster in eine Vakuumapparatur geführt und innerhalb der Vakuumapparatur mit Hilfe eines Hohlspiegels der Brennweite von 75 mm fokus- siert. In der Vakuumapparatur befanden sich ein Flugzeitmassenspektrometer (TOF-Spektrometer) und die gasförmige Probe mit einem Druck von 4x10 ^"6 mbar. Während der eigentlichen Messung wechselwirkte die Laserstrahlung im Fokusbereich des Hohlspiegels mit den Molekülen der gasförmigen Probe, wobei entstehende Ionen mit dem Flugzeitmassenspektrometer detektiert wurden. Das Flugzeitmassenspektrum kann über eine quadratische Beziehung in ein Massenspektrum umgerechnet werden. Das bei einer Laserzentralwellenlänge von 650 nm gemessene Massenspektrum von Methylcyclopentanon ist in Abb. 3 gezeigt.

Ausführungsbeispiel 2:

Laserpulse mit einer Zentralwellenlänge von 800 nm und einer Dauer von 45 Femtosekunden wurden mit Hilfe eines kommerziellen Femtosekundenlaser- Verstärkersystems (ODIN, Fa. Quantronix) erzeugt. Diese Pulse dienten als Grundlage zur Erzeugung von Laserstrahlung in dem für die eigentliche Messung benötigten Spektralbereich. Mit den Verstärkerpulsen wurde ein weiteres Laser- System (Optischer parametrischer Verstärker, TOPAS, Fa. Light Conversion) optisch gepumpt. Durch zweimalige Frequenzverdoppelung der austretenden sogenannten Signal-Pulse wurden Femtosekundenpulse mit einer Zentralwellenlänge im nahen UV-Bereich von 311 nm und 324 nm sowie durch nur einmalige Frequenzverdopplung Femtosekundenpulse mit einer Zentralwellenlänge von 650 nm erzeugt und verstärkt. Diese Pulse waren für die Untersuchung der Beispielsubstanz Methylcyclopentanon geeignet.

Die Laserpulse wurden durch Transmission durch ein achromatisches Viertelwel- lenplättchen zirkulär polarisiert. Abhängig vom Winkel zwischen der eingehenden linearen Polarisationsrichtung und der schnellen Achse des Viertelwellenplätt- chens entsteht so rechts- oder links-zirkular polarisiertes Licht. Das Viertelwellen- plättchen wurde so gelagert, dass es mit Hilfe eines Schrittmotors gedreht werden konnte. Das erlaubte ein Umschalten zwischen links- und rechts-zirkular polarisierten Licht. Die Ausrichtung des Viertelwellenplättchen und der Polarisationszu- Standes des transmittierten Lichtes wurde mit Hilfe eines Polarisators überprüft. Die so erzeugten zirkulär polarisierten Laserpulse wurden mittels einer Strahlführungsoptik durch ein Fenster in eine Vakuumapparatur geführt und innerhalb der Vakuumapparatur mit Hilfe eines Hohlspiegels der Brennweite von 75 mm fokus- siert. In der Vakuumapparatur befanden sich ein Flugzeitmassenspektrometer (TOF-Spektrometer), die gasförmige Probe und als Referenzsubstanz XyIoI mit einem Gesamtdruck von 4x10 ^"δ mbar. Während der eigentlichen Messung wechselwirkte die Laserstrahlung im Fokusbereich des Hohlspiegels mit den Molekülen der Gasphase, wobei entstehende Ionen mit dem Flugzeitmassenspektrometer detektiert wurden.

Die lonenausbeuten der Mutterionen von Methylcyclopentanon und XyIoI wurden für links- und rechts-zirkular polarisierte Laserstrahlung gemessen. Zur Verbesserung der Genauigkeit der Methode und zur Minimierung von Messartefakten, die sich aus leicht unterschiedlichen linearen Anteilen in den links- und rechts-zirkular polarisierten Pulsen ergeben können wurde die optisch nicht aktive Substanz XyIoI simultan gemessen und als Referenz verwendet. Aufgrund der massenselektiven Messung ist die Aufnahme von lonensignalen mehrerer Substanzen unterschiedlicher Masse möglich. Der Wellenlängen abhängige resultierende oben definierte Circulardichroismus der lonenausbeuten der Enantiomere des Methylcyclopenta- nons wurde berechnet und ist in Abb. 4 dargestellt.

Ausführungsbeispiel 3:

Laserpulse mit einer Zentralwellenlänge von 800 nm und einer Dauer von 45 Femtosekunden wurden mit Hilfe eines kommerziellen Femtosekundenlaser- Verstärkersystems (ODIN, Fa. Quantronix) erzeugt. Diese Pulse dienten als Grundlage zur Erzeugung von Laserstrahlung mittels Filamentbildung. Zur Filamentbildung wurden die ursprünglichen Laserpulse der Zentralwellenlänge von 800 nm mit einer Linse der Brennweite von 1 m in eine mit Argon gefüllte Kammer fokussiert. In der 150 cm langen Kammer verbreiterte sich das Spektrum der Pulse aufgrund von Selbstphasenmodulation in einem Filament. Die mit einem Spektrometer gemessene Verbreiterung des Pulsspektrums in Abhängigkeit des Druckes des Argons in der Kammer ist in Abb. 5 dargestellt. Ebenfalls dargestellt ist das Spektrum der ursprünglichen Laserpulse mit einer Zentralwellenlänge von 800 nm. Bezugszeichenliste

1. Femtosekundenlaser

2. Mittel zur Erzeugung breitbandiger Femtosekunden-Laserstrahlung 3. Mittel zur Erzeugung der zirkularen Polarisation

4. Strahlführungsoptik

5. Fokussierungsoptik

6. Laserstrahl (fokussierter breitbandiger zirkulär polarisierter Femtosekundenla- serstrahl) 7. Laserfenster

8. Hauptkammer des Massenspektrometers

9. Probeneinlass 10. lonenquelle

11. Beschleunigungssystem 12. Ionen auf dem Weg zum lonendetektor 13. lonendetektor

14. elektronisches Messgerät zur Messung der vom lonendetektor generierten Signale

15. Computer 16. zur Vakuumpumpe

17. Flugrohr des Flugzeit-Massenspektrometers (TOF)

18. Beschieunigungsstrecke

19. Zugstrecke

20. Linsensystem 21. Driftstrecke Abbildungslegenden

Abb. 1 :

Abb. 1 zeigt schematisch den Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei es sich beim Massenspektrometer um ein FIugzeit-Massenspektrometer (Time of Flight-Mass Spectrometer, TOF-MS) handelt.

Mit Hilfe des Lasersystems (1 ) werden Laserpulse im Femtosekundenbereich erzeugt. Die Laserpulse werden durch Mittel zur Erzeugung breitbandiger Femtose- kunden-Laserstrahlung (2) und durch Mittel zur zirkulären Polarisation (3) geleitet. Die so erhaltene breitbandige zirkulär polarisierte Femtosekunden-Laserstrahlung wird mit Hilfe einer Strahlführungsoptik (4) in Richtung des Laserfensters (7) gelenkt und mit Hilfe einer Fokussierungsoptik (5) fokussiert. Der fokussierte breitbandige zirkulär polarisierte Laserstrahl (6) tritt über das Laserfenster (7) in die Hauptkammer (8) des Massenspektrometers ein. Die Probe gelangt über den Probeneinlass (9) in die Hauptkammer (8) und wird durch den Laserstrahl (6) ionisiert. Mit Hilfe des Beschleunigungssystems (11) werden die Ionen (12) zum lo- nendetektor (13) hin beschleunigt. Die vom lonendetektor (13) erzeugten Signale werden über ein elektronisches Messgerät (14) registriert und mit Hilfe eines Computers (15) ausgewertet.

Abb. 2

Abb. 2 zeigt schematisch einen Ausschnitt aus einem FIugzeit- Massenspektrometer, wie es in den Ausführungsbeispielen 1 bis 2 verwendet wurde. Das Linsensystem (20) bestand aus drei Linsen L1 , L2 und L3. Die Zugstrecke (19) zwischen L1 und L2 hatte eine Länge von 1 ,5 cm, die Spannungsdifferenz ΔU zwischen L1 und L2 betrug 500 V. Die Beschleunigungsstrecke (18) zwischen L2 und L3 hatte ebenfalls eine Länge von 1 ,5 cm; die Spannungsdifferenz ΔU zwischen L2 und L3 betrug 2 kV. Die lonenquelle (10) befand sich zwischen L1 und L2. Das Flugrohr (Driftstrecke) (17) hatte eine Länge von 57 cm. Beim lonendetektor (13) handelt es sich um Mikrokanalplatten-Detektoren (MCPs).

Abb. 3

Abb. 3 zeigt ein mit 650 nm Zentralwellenlänge aufgenommenes Massenspektrum von Methylcyclopentanon. Dabei wurde die lonenausbeute jedes Fragmentions gegen m/z aufgetragen. Es sind sowohl das Mutterion als auch die Fragmentionen sichtbar.

Abb. 4

Abb. 4 zeigt den wellenlängig abhängigen resultierenden Circulardichroismus der lonenausbeuten von Methylcyclopentanon in Abhängigkeit von der Wellenlänge.

Es ist

▼ ^: (R)-(+)-3-Methylcyclopentanon

■: racemisches 3-Methylcyclopentanon A : (S)-(+)-3-Methylcyclopentanon a: Δε: linearer Circulardichroismus

Abb. 5

Abb. 5 zeigt die mit einem Spektrometer gemessene Verbreiterung des Pulsspektrums in Abhängigkeit des Druckes des Argons in der Filamentkammer. Ebenfalls dargestellt ist das Spektrum der ursprünglichen Laserpulse mit einer Zentralwellenlänge von 800 nm. Es ist a: Spektrum des Ausgangspulses b: Verbreitertes Spektrum des Pulses für einen Argondruck von 1 bar c: Verbreitertes Spektrum des Pulses für einen Argondruck von 2 bar