CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con la biotecnología y la ciencia médica en lo general, en lo particular, se relaciona con métodos para reparar lesiones tisulares y más específicamente se refiere a un método para la obtención de una membrana timpánica de colágeno humano tipo I entrecruzado de un solo uso, utilizada como andamio en la reparación de perforaciones del timpano, provocadas por la inserción de objetos extraños en el oido, cambios repentinos de presión (barotraumas), traumas acústicos, infecciones y/o lesiones del oido medio.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La membrana timpánica es una división delgada y semitransparente entre el canal auditivo externo y el oido medio. Cuando el sonido entra al oido externo, las ondas sonoras alcanzan la membrana timpánica haciendo que ésta vibre, las vibraciones son transferidas posteriormente a los huesecillos en el oido medio que transfieren las señales vibratorias al oido interno. Es aquí, donde la cóclea convierte las vibraciones acústicas en señales nerviosas que pueden ser interpretadas por el sistema nervioso. La membrana timpánica está compuesta de una membrana delgada de tejido conectivo cubierta por una capa epitelial en la parte del oido externo y por mucosa en la superficie interna.

Ante una perforación de membrana timpánica, el paciente puede presentar dolor, hemorragia, hipoacusia, acúfenos y vértigo. El diagnóstico se basa en la inspección visual, a través de la otoscopía. Por lo general, no se necesita de un tratamiento especifico para tratar las perforaciones de timpano, ya que, en la mayoría de los casos, el timpano tiende a sanar en un periodo comprendido desde unas cuantas semanas o hasta tres meses sin necesidad de aplicar un tratamiento. Opcionalmente, se pueden prescribir antibióticos orales o en forma de gotas óticas, para prevenir o tratar una infección.

No obstante, cuando se trata de lesiones más severas que sanan lentamente, que se complican, donde la perforación involucra los bordes del timpano o si representa > 30% de la membrana timpánica, o si se desarrolla un padecimiento crónico, los tratamientos para reparar la perforación incluyen desde colocar un parche timpánico, en un proceso conocido como miringoplastia, hasta el procedimiento quirúrgico (timpanoplastia). La cirugía puede ser necesaria para las perforaciones que persisten > 2 meses, cuando hay alteración de la cadena de huesecillos, o lesiones que afectan el oido interno.

Si la lesión en el timpano permanece, agentes patógenos pueden penetrar hasta el oido medio y causar infecciones (otitis media); en algunos casos, se puede desarrollar otitis media crónica, donde las infecciones son recurrentes y existe la posibilidad de que la infección pase al oido interno, resultando en un daño a los osículos auditivos (huesecillos del oido) y afectando la audición del paciente.

Una infección persistente en el oido, además, retarda el proceso de reparación del timpano, al mantenerse un estado de inflamación constante, en respuesta a dicha infección. Por otra parte, y aun cuando la perforación se haya resuelto, las infecciones causan una acumulación de fluidos en el oido medio, la presencia de estos fluidos aumenta la presión dentro del oido, lo que puede resultar en la ruptura del timpano por barotrauma.

Existen parches timpánicos elaborados a partir de distintos materiales. Entre los más empleados se encuentran los injertos autólogos de fascia temporal o cartílago, siendo el patrón de referencia en el tratamiento de perforaciones timpánicas; injertos alogénicos, y de materiales sintéticos y biológicos también son usados, dependiendo de la naturaleza de la perforación.

Existen parches de papel de cigarro, cintas adhesivas de látex (Steri-Strip) o parches de seda, que se usan principalmente para perforaciones o laceraciones traumáticas pequeñas o agudas. También existen en el mercado parches de ácido hialurónico, de submucosa del intestino delgado, quitosano, tejido adiposo, de colágeno, injertos de matriz dérmica acelular, de fibrinógeno, enriquecidos con factores de crecimiento.

Además de parches e injertos, existen suspensiones tópicas o en spray, suspensiones que gelifican o polimerizan por la adición de un estimulo químico, por ejemplo, luz UV, y forman un gel en el sitio de la lesión.

Se realizó una búsqueda para determinar el estado de la técnica más cercano, encontrándose los siguientes documentos:

Se ubicó el documento US2007162119A1 de Johnson Alan J. del 08 de enero de 2007, que revela una prótesis de membrana timpánica prefabricada, que incluye un trozo de lámina de colágeno procesada con una solución diluida de formalina. La pieza de hoja de colágeno se moldea sobre una superficie de una herramienta que tiene una forma que se asemeja a la membrana timpánica natural de un sujeto humano. El trozo de lámina de colágeno se procesa con una solución diluida de formalina para que la prótesis de membrana timpánica resultante conserve la forma. La prótesis de membrana timpánica es semirrígida, pero flexible, y está empaquetada en un recipiente sustancialmente rígido para proteger su forma durante el envio y almacenamiento.

Sin embargo, no es capaz de adherirse adecuadamente y mantenerse en el sitio de la lesión durante todo el tratamiento, no presenta un espesor y una porosidad adecuada para favorecer la transmisión del sonido ambiental hacia el oido interno. Se ubicó el documento JP2010259767A de Park Chan Hum et al. del 29 de junio de 2009, que revela una membrana timpánica artificial que utiliza proteina de seda que tiene una estructura en forma de película, obtenida desmineralizando y secando la proteina de seda (o fibroína de seda) o la solución del complejo de proteina de seda después de eliminar la sericina del capullo o fibra de seda. La membrana timpánica artificial promueve la reproducción de la membrana timpánica perforada por una enfermedad o accidente inesperado, proporciona un borde fino de la membrana timpánica reproducida y tiene una excelente biocompatibilidad y transparencia y una facilidad de uso eficaz. La membrana timpánica artificial se produce utilizando proteina de seda o solución de complejo de proteina de seda obtenida del capullo o mezclándola con colágeno, ácido algínico, PEG ( p o I i e t i I e n g I i c o I ) o Pluronic F-127, etc.

Como se puede observar, el proceso de obtención de la membrana timpánica artificial de dicho documento es muy diferente a nuestra invención y como materia prima emplea proteina de seda que, opcionalmente, puede mezclarse con colágeno, ácido algínico, PEG ( p o I i eti I e n g I i c o I ) o Pluronic F-127. A pesar de que se menciona que tiene una excelente biocompatibilidad, dicha membrana no aporta las bondades de la membrana timpánica de colágeno humano de la presente invención, no es capaz de adherirse adecuadamente y mantenerse en el sitio de la lesión durante todo el tratamiento, no presenta un espesor y una porosidad adecuada para favorecer la transmisión del sonido ambiental hacia el oido interno.

Algunos de los productos descritos comercialmente o en otras patentes no son capaces de adherirse y mantenerse en el sitio de la lesión durante todo el tratamiento. Un ejemplo son los parches de papel de cigarro o papel arroz que tienden a desplazarse por la superficie del timpano o despegarse del mismo, dejando descubierta la zona de la lesión y, por ende, fallando en cumplir la función de parche. Debido a lo anterior, es común que en estos casos se requiera de una segunda intervención médica para recolocar el parche en la zona adecuada, lo que puede generar inconvenientes al paciente.

Otros productos comerciales o patentes están elaborados a partir de materiales sintéticos, por lo que no pueden ser degradados por el cuerpo, y es necesario una segunda intervención médica para retirar el parche. Aunado a lo anterior, debido a su naturaleza sintética, este tipo de productos suele suscitar una respuesta inflamatoria más notoria, lo que ralentiza el proceso de curación y puede generar molestias en el paciente.

Algunos de los productos descritos comercialmente o en otras patentes, utilizan injertos de tejidos autólogos que, aunque representan el patrón de referencia en el tratamiento de perforaciones timpánicas, involucran un procedimiento quirúrgico sobre una zona donadora, y el procedimiento quirúrgico para implantar el injerto sobre el timpano, lo que prolonga los tiempos de recuperación del paciente, aumenta los costos del tratamiento e involucra un mayor riesgo por las complicaciones propias de la cirugía.

Algunos de los productos descritos comercialmente o en otras patentes, emplean materiales biológicos, derivados de la matriz extracelular, como el ácido hialurónico, que pueden promover la formación de tejido granular que, aunque necesario para el proceso de curación, si se genera de forma descontrolada, puede originar la formación de tejido fibrótico que afectaría la movilidad de la membrana timpánica y, por ende, su función en la transmisión del sonido ambiental hacia el oido interno. Además, la elaboración de la membrana con una porosidad controlada en este tipo de productos es un proceso sofisticado y complejo que requiere de equipo especializado, lo que representa un aumento en los costos de producción.

Algunos de los productos descritos comercialmente o en otras patentes, emplean materiales biológicos, derivados de la matriz extracelular, como el colágeno; sin embargo, se trata de colágeno xenogénico que presenta mayor riesgo de suscitar una respuesta inflamatoria, debido a que proviene de una especie distinta a la del receptor (paciente).

Otros productos descritos comercialmente o en otras patentes, utilizan altas concentraciones de colágeno, mientras que otros procesos describen métodos especializados y más complejos para la elaboración del parche.

Alguno de los productos descritos comercialmente o en otras patentes, contienen colágeno humano; sin embargo, el producto no ha sido tratado con proteasas, por lo que algunas regiones de la cadena de colágeno, responsables de provocar una respuesta antigénica, pueden estar aún presentes, y generar una respuesta inflamatoria en el paciente.

Ante la necesidad de contar con una membrana timpánica de colágeno humano tipo I entrecruzado de un solo uso, utilizada como andamio en la reparación de perforaciones del timpano, provocadas por la inserción de objetos extraños en el oido, cambios repentinos de presión (barotraumas), traumas acústicos, infecciones y/o lesiones del oido medio, o como parte de un procedimiento quirúrgico, fue que se desarrolló la presente invención.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN

La presente invención tiene como objetivo principal hacer disponible una membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano que presente propiedades físicas, químicas, mecánicas y biológicas apropiadas para su implementación en el tratamiento de lesiones y/o perforaciones de timpano.

Otro objetivo de la invención es proveer dicha membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano que, además, esté fabricado a partir de un material biológico, degradable, altamente biocompatible y cuya obtención no involucre realizar un procedimiento quirúrgico sobre el paciente, a diferencia de los injertos autólogos. Otro objetivo de la invención es proveer dicha membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano que, además, proporcione temporalmente un andamio y una barrera física que separe el oido medio del oido externo, mientras se lleva a cabo la reparación del tejido y se reestablece la continuidad del timpano.

Otro objetivo de la invención es proveer dicha membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano que, además, se pueda ofrecer a un menor costo que los productos actualmente disponibles y con mayor efectividad, debido a su naturaleza proteica alogénica.

Otro objetivo de la invención es proveer dicha membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano que, además, permita incorporase sobre el tejido de la membrana timpánica dañada y que ofrezca una mayor capacidad de retención permitiendo añadir sustancias, factores o aditamentos al producto que potencien su función reparadora, o que sirvan para ampliar la finalidad de uso de la membrana de colágeno.

Otro objetivo de la invención es proveer dicha membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano que, además, ofrezca mayores prestaciones mecánicas para que asemeje la resistencia y flexibilidad del timpano humano y pueda permanecer en el sitio de aplicación sin romperse, despegarse, desplazarse, degradarse prematuramente o generar un engrosamiento en el tejido o anomalía en el tímpano que perjudique al paciente.

Otro objetivo de la invención es proveer un proceso estandarizado y optimizado para la fabricación de una membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano, que permita prescindir de técnicas más sofisticadas y un costo de producción más bajo que el de productos similares en el mercado, sin comprometer la calidad.

Otro objetivo de la invención es proveer un proceso estandarizado y optimizado para la fabricación de una membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano, que además disminuya el riesgo de una infección por agentes patógenos externos y acelere el cierre de la perforación del timpano.

Y todas aquellas cualidades y objetivos que se harán aparentes al realizar una descripción general y detallada de la presente invención apoyados en las modalidades ¡lustradas.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL INVENTO

Durante el diseño y desarrollo de la membrana timpánica para la reparación de lesiones de timpano de la presente invención se presentaron diversos problemas a resolver para construir un prototipo funcional. El principal problema consistía en elaborar un producto altamente biocompatible, que no generara una respuesta inmune acentuada y que estuviera constituido por un material bioactivo que promoviera el proceso de curación. En relación con esto, se encontró sorprendentemente que el colágeno de origen humano cumplía con estos requerimientos, ya que la b i o co m p ati b i I i d a d intraespecifica representa una ventaja respecto a los materiales utilizados en otros productos ya existentes.

El segundo problema para resolver fue que las dimensiones del producto fueran semejantes a la membrana timpánica del ser humano, especialmente en el espesor ya que, un parche demasiado grueso podría entorpecer y ralentizar la curación de la lesión, además del riesgo de la disminución de la capacidad auditiva del paciente durante el tratamiento por el engrosamiento del tejido y consecuente pérdida de la movilidad de la membrana timpánica. Lo anterior se resolvió probando con distintas condiciones de I i o f i I i z a c i ó n y la incorporación de un proceso de prensado para producir estructuras de colágeno humano con características controladas.

De igual forma, se tenia que garantizar que el producto, a pesar de ser una lámina, presentara una estructura porosa con el tamaño de poro adecuado para promover la adhesión y migración celular. Este punto se resolvió optimizando la concentración de la solución de colágeno y, por ende, la cantidad de colágeno contenido en cada membrana. El siguiente problema para resolver estaba relacionado con la funcionalidad del producto. Para que la membrana pueda desempeñar su función correctamente, es necesario que sea adaptable y resistente al entorno natural del sitio de aplicación. La membrana de colágeno tiene que ser capaz de adherirse al timpano y soportar los cambios de presiones entre el oido externo y el oido interno, sin desprenderse del timpano. Además, debe ser flexible para no interferir con las vibraciones del timpano y no afectar la capacidad auditiva del paciente. Esto se resolvió aumentando las propiedades mecánicas de la membrana de colágeno a través del sistema controlado de entrecruzamiento de colágeno. Una vez establecida una correlación entre el grado de entrecruzamiento y la caracterización de las prestaciones mecánicas, la membrana se testeó en un ambiente simulado donde se mimetizaron las condiciones del oido. En esta etapa, la membrana cumplió con los requerimientos de flexibilidad, adhesión, resistencia y migración celular, además de observarse una capacidad de retención de líquidos a pesar de su estructura colapsada.

La membrana timpánica de colágeno humano de la presente invención se elaboró con compuestos bioactivos alogénicos con el fin de aminorar la respuesta inflamatoria del paciente y contribuir a un proceso de curación más rápido y disminuir el riesgo de posibles complicaciones. Esto se resolvió al implementar previamente una linea de producción estandarizada y optimizada para la obtención de colágeno humano con altos rendimientos, y su acondicionado para cumplir requisitos dimensionales específicos, a través de un proceso sencillo y de bajo costo.

Primeramente, se buscó alcanzar las dimensiones a través de, únicamente, el proceso de liofilización. Modificando la cantidad de solución de colágeno a liofilizar y la concentración de ésta, se buscó que, al retirar la humedad, se generara una membrana de colágeno. No obstante, estos ajustes dieron como resultado membranas incompletas, muy frágiles, de superficie no uniforme, o que no eran manipuladles. En otros casos, solo se obtuvieron fibras dispersas de colágeno. En las concentraciones y volúmenes de solución más altos, se obtenía una estructura tridimensional, asemejando a una esponja.

Debido a lo anterior, se optó por encontrar la combinación de concentración minima de colágeno y volumen mínimo de la solución, con la cual se obtenía el andamio con el menor espesor posible, asegurando que se formara una estructura de superficie completa, que fuera uniforme y que fuera resistente a la manipulación. Simultáneamente, se experimentó fabricar una biopelícula, generando un hidrogel a partir de la solución de colágeno, y dejando secar hasta obtener una fina capa de colágeno que asemejaba una lámina de plástico. Esta última opción se descartó por la ausencia de poros y se continuó con la elaboración de una esponja de colágeno.

Una vez que se determinaron las relaciones entre la concentración de la solución de colágeno y el volumen a emplear de la misma, con la que se obtuvieron los andamios que más se ajustaban a los requerimientos, se discutió la posibilidad de colapsar la estructura mecánicamente, a través de un prensado. Se probaron distintos parámetros de prensado, incluyendo la fuerza aplicada y el tiempo de compresión. Algunos andamios no soportaron la presión y se rompieron, ya sea por su bajo contenido de colágeno o porque los parámetros de prensado fueron excesivos; por otra parte, algunos andamios si mostraron una reducción del espesor, pero recuperaban su forma original después de unos segundos, esto debido a su alto contenido de colágeno o a que los parámetros de prensado, contrario al caso anterior, no eran efectivos. De igual forma, se procedió a determinar la relación fuerza aplicada- tiempo en el que se obtuvieran membranas integras y que mantuvieran la reducción del espesor, incluso aunque fueran rehidratadas.

Finalmente, y como se ha mencionado anteriormente, para asegurar que el producto cumpla su finalidad de uso en el ambiente real de aplicación, se realizó una correlación entre el grado de entrecruzamiento del colágeno, abordado a través de un ensayo de digestibilidad in vitro, en conjunto con técnica colorimétrica de TNBS (2,4,6-ácido trinitrobencenosulfónico); y la caracterización de las propiedades mecánicas exhibidas, a través de una máquina universal especial para tejidos y materiales biológicos. La membrana fue hidratada con solución fisiológica y/o sangre, observándose preservación de la estructura y capacidad de retención con un incremento máximo de 20 veces su peso original, y sin que se perdiera la facilidad de manipulación del producto. Posteriormente, la membrana húmeda se colocó en un cuerpo esférico flexible, manteniéndose adherida a la superficie, y expandiéndose y contrayéndose conforme se inflaba el material. Durante este esfuerzo de elongación, la membrana no se rompió, ni rasgó y, durante la retracción, recuperó sus dimensiones originales, no se dobló ni se formaron surcos o arrugas excesivas.

De manera general la presente invención se refiere a una membrana timpánica de colágeno humano tipo I entrecruzado de un solo uso, utilizada como andamio en la reparación de perforaciones del timpano, provocadas por la inserción de objetos extraños en el oido, cambios repentinos de presión (barotraumas), traumas acústicos, infecciones y/o lesiones del oido medio.

La naturaleza alogénica de la membrana timpánica de colágeno humano tipo I garantiza un proceso de reparación más eficiente, debido a que la biocompatibilidad intraespecifica permite una respuesta inflamatoria más controlada, a diferencia de productos fabricados a partir de b i o m ate r i a I e s provenientes de otros animales.

Con relación a lo anterior, la membrana timpánica de colágeno humano representa una alternativa a los tratamientos actuales, contribuyendo a una reparación más dinámica y en menor tiempo que previene posibles complicaciones futuras como infecciones, perforaciones recurrentes o un daño extendido al oido medio y/o interno, y evitando, en algunos casos, el procedimiento quirúrgico. La membrana timpánica de colágeno humano de la presente invención consiste en una membrana de colágeno humano, con características físicas, químicas, mecánicas y biológicas que la establecen como una alternativa apropiada para la reparación de lesiones y/o perforaciones de timpano.

En términos generales el proceso para producir membrana timpánica de colágeno humano de conformidad con la presente invención consta de las siguientes etapas, realizadas en un rango de temperatura de 2 - 25°C, alcanzando temperaturas de hasta - 80°C en las etapas de I i of i I i zac i ó n . a) Acondicionar el tejido obtenido de membrana amniótica, tendón y fascia humanos, removiendo tejidos o fluidos que no sean de interés para el proceso y reduciendo el tamaño de partícula de una manera uniforme a un tamaño de entre 0.5 mm a 2 mm con un molino de tambor o rotor, para lograr una mejor interacción entre las soluciones y el tejido en los pasos posteriores. b) Pre-tratar el tejido previamente acondicionado, exponiéndolo a una solución de hidróxido de sodio a 0.05 - 2 M, empleando 50 - 1000 mL por gramo de tejido seco, con agitación magnética eficiente de 100 - 500 RPM y por un periodo de 1 hora a 24 horas, con la finalidad de retirar proteínas superficiales y dejar las fibras de colágeno expuestas; b 1 ) Lavar con agua destilada para neutralizar el pH del tejido hasta tener un pH de entre 7 a 8, antes del siguiente paso; c) Extraer el colágeno mediante hidrólisis enzimática sometiendo el tejido a una solución ácida de ácido acético a una concentración de 0.02 - 0.5 M y usando 50 - 1000 L por kg de tejido seco, conjuntamente con 50 - 1000 g de pepsina por kg de tejido seco, para propiciar una solubilización más rápida del colágeno y propiciar una eliminación especifica y controlada de los grupos carboxilo y amino terminales de la molécula; en donde la extracción se realiza en un periodo de tres dias realizando adiciones de solución ácida intermedias (se inicia con 200 mL de ácido acético y 0.05 - 0.5 g de pepsina por g de tejido seco y después de 48 horas se adicionan 250 mL de ácido acético por g de tejido seco para propiciar el desarrollo de la reacción y en donde se eliminan los residuos de estructuras del tejido no colágenas por medio de una filtración con un tamiz de 50 - 900 m y se continúa con el proceso. d) Precipitar el colágeno llevando la solución resultante de colágeno (450 mL de solución por g de tejido seco) a una concentración alta de sal, agregando de 20 - 100 g de cloruro de sodio por 1 L de solución de colágeno, homogenizando la solución con agitación magnética y dejando que la interacción iónica de la sal con las moléculas de colágeno genere la precipitación de las mismas, durante un tiempo de entre 2 a 6 horas; posteriormente, tamizar la solución resultante a un tamaño de partícula de 50 a 900 m; en donde las fibras recuperadas del tamiz se solubilizan nuevamente en una solución de ácido acético, empleando 50 - 1000 mL de ácido acético por g de tejido seco; e) Dializar la solución de colágeno con la finalidad de purificar la solución del exceso de sal presente en la solución de colágeno, en un sistema de diálisis dinámica en el que el colágeno se coloca dentro de una membrana porosa de 12 a 14 kDa para expulsar las impurezas al introducirse a un buffer de diálisis que consiste en una solución con baja concentración de ácido acético de 0.02 - 0.5 M; en donde el intercambio de moléculas de sal entre ambas soluciones se origina por el diferencial de concentración de las mismas, de la solución de colágeno con una concentración de sales de 0.5 -2 M hacia la solución de ácido acético sin presencia de sales, y es acelerado por la superficie de contacto y el flujo del buffer; esta etapa dura de dos a cinco dias, durante los cuales el buffer se mantiene en recirculación y se cambia después de 6 a 48 horas; también se monitorea la conductividad de ambas soluciones y se detiene el proceso cuando el colágeno alcanza la misma conductividad que el buffer al inicio de la etapa (0.10 -0.5 mS/cm). f) Liofilizar la solución de colágeno purificada sometiéndola a un ciclo de liofilización para concentrar las fibras de colágeno, favoreciendo su preservación; para esto la solución se congela a una temperatura de entre -10°C y -80°C y posteriormente se somete a una presión de vacio de 0.02 - 0.2 mbar (2 - 20 Pa) por un periodo de tiempo de uno a cuatro dias, durante el cual se retira el agua y solventes en forma de vapor, secando el colágeno sin dañar las fibras; en donde el colágeno resultante se pesa y distribuye de acuerdo a lo requerido en el siguiente paso. g) Moldear y liofilizar por segunda ocasión, en donde, dependiendo de la aplicación y función esperada, se elige una concentración de 0.5 a 30 mg de colágeno por mL de ácido acético con molaridad de 0.02 a 0.5 M; una vez solubilizado, el colágeno se coloca en moldes que permitan generar la estructura con las dimensiones deseadas; nuevamente se realiza la liofilización de la solución a una temperatura de entre -10°C y -80°C y una presión de vacio de 0.02 - 0.2 mbar (2 -20 Pa), con la excepción de que se realiza una congelación controlada que consiste en retirar el calor al disminuir gradualmente la temperatura de la placa con la que se encuentra en contacto el molde y la solución de colágeno, permitiendo que los cristales de agua y ácido acético sean uniformes y variados, acomodando las fibras para generar un tamaño de poro promedio estimado; h) Prensar la estructura de colágeno que, considerando la aplicación y función que deba desempeñar el producto, es sometida a una fuerza mecánica determinada de entre 100 - 5000 N para compactar sus dimensiones a un valor deseado desde 0.001 - 10 mm y aumentar su densidad fibrilar. i) Entrecruzar las piezas de colágeno sometiéndolas a una atmósfera de vapor de formaldehido en un aparato de entrecruzamiento, a un tiempo de exposición de entre 1 a 90 minutos y concentración de la nube de vapor del reactivo de 0.1 a 100 ppm, resultando en un entrecruzamiento controlado que permita reforzar la unión entre fibras para brindar mejores propiedades físicas a la estructura.

De acuerdo con el proceso para producir membrana timpánica de colágeno humano de conformidad con la presente invención anteriormente descrito, se obtiene una membrana timpánica de colágeno humano tipo I, con una pureza de > 80% y concentración de < 30 mg/mL o < 15 mg/cm ² , de dimensiones controladas de 0.5 a 15 cm de diámetro o de lado, y 0.01 -10 mm de espesor y preferentemente de 1 cm de diámetro o de lado, y espesor de 0.03 - 0.3 mm), con una porosidad del 80 a 99% y tamaño de poro de entre 10 a 200 pm.

La membrana es flexible, reabsorbible, adherible, resistente a las presiones internas del oido y biocompatible.

La membrana se recorta, de acuerdo con las dimensiones de la lesión observada, y posteriormente, se hidrata con solución fisiológica, solución de antibióticos o alguna otra que el médico considere apropiado. La membrana húmeda se coloca sobre el timpano, accediendo por el canal auditivo y cubriendo totalmente el sitio de la lesión. La membrana se adhiere al timpano por su carácter hidrofílico. De esta forma, la membrana de colágeno provee un soporte provisional que subsana la discontinuidad del timpano, permitiendo cierta transmisibilidad de las ondas de sonido, y sobre el cual las células del timpano pueden migrar desde el borde de la herida hacia el centro, y generarán las capas epitelial y fibrosa que cerrarán la herida.

La porosidad promedio de las membranas elaboradas fue de 83.81 ± 7.09.

En la membrana fabricada de acuerdo con la presente invención, los poros más pequeños tienen un tamaño que van desde 10 a 13.81 ± 4.94 pm, mientras que los más grandes oscilan entre 100-200 pm, especialmente en la sección transversal de la membrana, lo que contribuye a la adhesión y la migración celular en la membrana, como se describe posteriormente.

El espesor de la membrana es de 234.79 ± 47.44 m.

La membrana presenta un porcentaje de retención promedio de humedad de 1304.07 ± 166.81 %, y el incremento de masa fue de 14.04 ± 1.67 veces el peso original (Ps). Resaltando que, a pesar de que la membrana absorbía líquidos, no hubo una turgencia de la misma, y no se vieron afectadas las dimensiones de la membrana.

A la membrana se le pueden adicionar diversas sustancias, tales como: Pegamento tisular para mejorar la adherencia de la membrana al sitio de implante; una solución de antibiótico para tratar o prevenir una infección del oido mientras se repara el timpano; factores de crecimiento y/o células mesenquimales autólogas o alogénicas que, por su capacidad de señalización puedan promover o potenciar las rutas bioquímicas relacionadas a la curación de heridas y reparación de tejidos; nanoparticulas para la liberación dosificada de fármacos o alguna otra sustancia que pueda servir para el tratamiento de algún síntoma o padecimiento de la herida; en general, cualquier sustancia, compuesto o molécula, sintética o biológica que, por su naturaleza bioactiva o terapéutica pueda emplearse para el mejoramiento o aceleramiento de los procesos de reparación tisular, o como tratamiento a cualquier deterioro, alteración o daño a la salud. Para comprender mejor las características de la invención se acompaña a la presente descripción, como parte integrante de la misma, los dibujos con carácter ilustrativo más no limitativo, que se describen a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra un diagrama de bloques del proceso para la obtención de la membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano, de conformidad con la presente invención.

La figura 2 muestra una gráfica de gel de e I e ctrofo re si s con los colágenos extraídos de membrana amniótica, tendón y fascia humanos, de conformidad con el proceso de la presente invención.

La figura 3 muestra una imagen de un prototipo de la membrana timpánica de colágeno humano, en una de sus presentaciones, de conformidad con la presente invención.

Las figuras 4A y 4B muestran una imagen que corresponden al análisis superficial y transversal, respectivamente, de la membrana de colágeno, presentando una porosidad jerárquica.

Las figuras 5A y 5B muestran dos imágenes obtenidas por tinción citoquímica con 4 ' , 6 - d i a m i d i n o - 2 - f e n i I i n d o I (DAPI) que muestra la migración celular en una membrana timpánica de colágeno humano de conformidad con la presente invención, después de 15 dias de cultivo, con objetivos 4X y 20X, respectivamente.

La figura 6A muestra una imagen de una membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano, de conformidad con la presente invención, que se ha sometido en contacto con sangre y se somete a manipulación con pinzas que muestran sus resistencia a la manipulación para su colocación en la membrana timpánica dañada.

La figura 6B muestra una imagen de una membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano, de conformidad con la presente invención, que se ha adherido sobre la superficie de un globo para demostrar su capacidad de adherencia a las superficies.

La figura 6C muestra una imagen de una membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano, de conformidad con la presente invención, que se ha adherido sobre la superficie de un globo y se ha sometido a estiramiento para demostrar su resistencia a la expansión.

La figura 6D muestra una imagen de una membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano, de conformidad con la presente invención, que se ha adherido sobre la superficie de un globo y se ha sometido a estiramiento mostrando su capacidad de preservar la forma y propiedades al regresar a la forma original.

La figura 7 muestra una imagen de una membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano, de conformidad con la presente invención, sometida a pruebas de absorción para determinar el porcentaje de retención de humedad que permitía la estructura.

Para una mejor comprensión del invento, se procederá a hacer la descripción detallada de alguna de las modalidades de este, mostrada en los dibujos que, con fines ilustrativos mas no limitativos, se anexan a la presente descripción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO

Los detalles característicos de la membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano se muestran claramente en la siguiente descripción y en los dibujos ilustrativos que se anexan, sirviendo los mismos signos de referencia para señalar las mismas partes.

El proceso de fabricación de la membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano ha sido estandarizado y optimizado, prescindiendo de técnicas más sofisticadas que permiten, sin comprometer la calidad, un costo de producción más bajo que el de productos similares en el mercado. De esta forma, se presenta una membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano, que se puede ofrecer a un menor costo que los productos actualmente disponibles y con mayor efectividad, debido a su naturaleza proteica.

El proceso para producir la membrana timpánica de colágeno humano para la reparación de lesiones de timpano abarca desde el aislamiento del tejido hasta la obtención del colágeno, asi como su posterior transformación en estructuras b¡ o tridimensionales. Consta de un total de nueve etapas principales: acondicionado de tejido, pre-tratamiento, extracción, precipitación, diálisis, liofilización, moldeado, prensado, y entrecruzamiento, asi como una etapa opcional de compresión.

Este proceso permite extraer colágeno tipo I alogénico, y con ello, ajustarlo a las dimensiones adecuadas y acondicionarlo químicamente (entrecruzarlo) para conseguir características funcionales in vivo, en la aplicación destinada. Finalmente, este último proceso permite adecuarse para poderse poner al punto y con ello alcanzar las condiciones de degradación in vitro e in vivo deseables.

De acuerdo con la figura 1, en términos generales el proceso para producir membrana timpánica de colágeno humano de conformidad con la presente invención consta de las siguientes etapas, realizadas en un rango de temperatura de 2 - 25°C, alcanzando temperaturas de hasta -80°C en las etapas de I i of i I i zac i ó n . a) Acondicionar el tejido obtenido de membrana amniótica, tendón y fascia humanos, removiendo tejidos o fluidos que no sean de interés para el proceso y reduciendo el tamaño de partícula de una manera uniforme a un tamaño de entre 0.5 mm a 2 mm con un molino de tambor o rotor, para lograr una mejor interacción entre las soluciones y el tejido en los pasos posteriores. b) Pre-tratar el tejido previamente acondicionado, exponiéndolo a una solución de hidróxido de sodio a 0.05 - 2 M, empleando 50 - 1000 mL por gramo de tejido seco, con agitación magnética eficiente de 100 - 500 RPM y por un periodo de 1 hora a 24 horas, con la finalidad de retirar proteínas superficiales y dejar las fibras de colágeno expuestas; b 1 ) Lavar con agua destilada para neutralizar el pH del tejido hasta tener un pH de entre 7 a 8, antes del siguiente paso; c) Extraer el colágeno mediante hidrólisis enzimática sometiendo el tejido a una solución ácida de ácido acético a una concentración de 0.02 - 0.5 M y usando 50 - 1000 L por kg de tejido seco, conjuntamente con 50 - 1000 g de pepsina por kg de tejido seco, para propiciar una s o I u b i I i z a c i ó n más rápida del colágeno y propiciar una eliminación especifica y controlada de los grupos carboxilo y amino terminales de la molécula; en donde la extracción se realiza en un periodo de tres dias realizando adiciones de solución ácida intermedias (se inicia con 200 mL de ácido acético y 0.05 - 0.5 g de pepsina por g de tejido seco y después de 48 horas se adicionan 250 mL de ácido acético por g de tejido seco para propiciar el desarrollo de la reacción y en donde se eliminan los residuos de estructuras del tejido no colágenas por medio de una filtración con un tamiz de 50 - 900 m y se continúa con el proceso. d) Precipitar el colágeno llevando la solución resultante de colágeno (450 mL de solución por g de tejido seco) a una concentración alta de sal, agregando de 20 - 100 g de cloruro de sodio por 1 L de solución de colágeno, homogenizando la solución con agitación magnética y dejando que la interacción iónica de la sal con las moléculas de colágeno genere la precipitación de las mismas, durante un tiempo de entre 2 a 6 horas; posteriormente, tamizar la solución resultante a un tamaño de partícula de 50 a 900 m; en donde las fibras recuperadas del tamiz se solubilizan nuevamente en una solución de ácido acético, empleando 50 - 1000 mL de ácido acético por g de tejido seco); e) Dializar la solución de colágeno con la finalidad de purificar la solución del exceso de sal presente en la solución de colágeno, en un sistema de diálisis dinámica en el que el colágeno se coloca dentro de una membrana porosa de 12 a 14 kDa para expulsar las impurezas al introducirse a un buffer de diálisis que consiste en una solución con baja concentración de ácido acético de 0.02 - 0.5 M; en donde el intercambio de moléculas de sal entre ambas soluciones se origina por el diferencial de concentración de las mismas, de la solución de colágeno con una concentración de sales de 0.5 -2 M hacia la solución de ácido acético sin presencia de sales, y es acelerado por la superficie de contacto y el flujo del buffer; esta etapa dura de dos a cinco dias, durante los cuales el buffer se mantiene en recirculación y se cambia después de 6 a 48 horas; también se monitorea la conductividad de ambas soluciones y se detiene el proceso cuando el colágeno alcanza la misma conductividad que el buffer al inicio de la etapa (0.10 -0.5 mS/cm). f) Liofilizar la solución de colágeno purificada sometiéndola a un ciclo de liofilización para concentrar las fibras de colágeno, favoreciendo su preservación; para esto la solución se congela a una temperatura de entre -10°C y -80°C y posteriormente se somete a una presión de vacio de 0.02 - 0.2 mbar (2 - 20 Pa) por un periodo de tiempo de uno a cuatro dias, durante el cual se retira el agua y solventes en forma de vapor, secando el colágeno sin dañar las fibras; en donde el colágeno resultante se pesa y distribuye de acuerdo a lo requerido en el siguiente paso. g) Moldear y liofilizar por segunda ocasión, en donde, dependiendo de la aplicación y función esperada, se elige una concentración de 0.5 a 30 mg de colágeno por mL de ácido acético con molaridad de 0.02 a 0.5 M; una vez solubilizado, el colágeno se coloca en moldes que permitan generar la estructura con las dimensiones deseadas; nuevamente se realiza la liofilización de la solución a una temperatura de entre -10°C y -80°C y una presión de vacio de 0.02 - 0.2 mbar (2 -20 Pa), con la excepción de que se realiza una congelación controlada que consiste en retirar el calor al disminuir gradualmente la temperatura de la placa con la que se encuentra en contacto el molde y la solución de colágeno, permitiendo que los cristales de agua y ácido acético sean uniformes y variados, acomodando las fibras para generar un tamaño de poro promedio estimado; h) Prensar la estructura de colágeno que, considerando la aplicación y función que deba desempeñar el producto, es sometida a una fuerza mecánica determinada de entre 100 - 5000 N para compactar sus dimensiones a un valor deseado desde 0.001 - 10 mm y aumentar su densidad fibrilar. i) Entrecruzar las piezas de colágeno sometiéndolas a una atmósfera de vapor de formaldehido en un aparato de entrecruzamiento, a un tiempo de exposición de entre 1 a 90 minutos y concentración de la nube de vapor del reactivo de 0.1 a 100 ppm, resultando en un entrecruzamiento controlado que permita reforzar la unión entre fibras para brindar mejores propiedades físicas a la estructura.

Al final del proceso la membrana se somete a evaluación.

Por medio de electroforesis SDS-PAGE, se determinó la identidad los tipos de colágeno obtenidos con el proceso de extracción de colágeno antes descrito. La figura 2 muestra el gel de electroforesis con los colágenos extraídos de membrana amniótica, tendón y fascia humanos. Gel de SDS-PAGE para muestras de colágeno. M: Marcador de peso molecular. Carril 1: Estándar de colágeno tipo I (0.5 mg/mL). Carril 2: Colágeno de tendón (1 mg/mL). Carril 2: Colágeno de membrana amniótica (1 mg/mL). Carril 4: Colágeno de fascia (1 mg/mL).

Para todas las muestras, se observaron dos bandas de mayor intensidad con un tamaño aproximado de 116 y 130 kDa.

Lo anterior demuestra que con el proceso de obtención y purificación de colágeno se aisló colágeno tipo I, puesto que las bandas visualizadas tienen un tamaño cercano a los 112 y a los 95 kDa, correspondientes a las dos cadenas a1 y a la cadena a2, respectivamente (Santos, et al., 2013); además de coincidir con el patrón de bandas que exhibió el estándar comercial de colágeno tipo I (ver figura 2).

Una vez identificado el tipo de colágeno, se determinó la pureza del mismo al cuantificar, colorimétricamente, el contenido de hidroxiprolina. En la tabla 1 se muestra la concentración de hidroxiprolina y el porcentaje de colágeno.

Tabla 1.- Concentración de hidroxiprolina y el porcentaje de colágeno obtenido por el proceso de la presente invención.

Concentración de Concentración de

Porcentaje de

Muestra Hidroxiprolina colágeno colágeno (%)

(mg/mg) (mg/mL)

Tendón 0.112 0.8371 83.7

Membrana

0.145 1.0732 107.3

Amniótica

Lo anterior coincide con el contenido de hidroxiprolina de 0.135 mg/mg en colágeno tipo I proveniente de mamíferos (Capella- Monsonis, et al., 2018). Además, se demuestra que, el colágeno obtenido de tendón humano y de membrana amniótica, corresponde a un colágeno de gran pureza y que más del 80% del contenido proteico de las muestras se traduce en proteínas colágenas. Finalmente, debido a que el proceso de entrecruzamiento se realiza con formaldehido, se determinó el contenido de formaldehido residual en las membranas de colágeno, de acuerdo con la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM), en el Suplemento para Dispositivos Médicos. En la tabla 2 se condensan los resultados obtenidos. El valor de absorbancia obtenido para la solución de referencia de formaldehido 0.001% (m/v) fue de 0.15.

Tabla 2.- Absorbancia de las estructuras de colágeno entrecruzadas, obtenido por el proceso de la presente invención.

Peso de Agua (mL) Ácido Cromotrópico Absorbancia

Estructuras (mg) (mL)

0.8 0.16 3.2 O.1O

0.8 0.16 3.2 0.08

0.8 0.16 3.2 0.12

De acuerdo con los resultados anteriores, se obtiene que, en promedio, la absorbancia de las muestras fue de 0.1 ± 0.02, siendo por debajo del valor de referencia de 0.15. Lo anterior indica que la concentración de formaldehído en las estructuras de colágeno es menor al 0.001% y cumple con los requisitos estipulados por la FEUM.

De acuerdo con el proceso para producir membrana timpánica de colágeno humano de conformidad con la presente invención anteriormente descrito, se obtiene una membrana timpánica de colágeno humano tipo I, con una pureza de > 80% y concentración de < 30 mg/mL o < 15 mg/cm ² , de dimensiones controladas (1 cm de diámetro o de lado, y espesor de 0.03 - 0.3 mm), con una porosidad del 80 a 99% y tamaño de poro de entre 10 a 200 m.

La membrana es flexible, reabsorbible, adherible, resistente a las presiones internas del oido y biocompatible.

La membrana se recorta, de acuerdo con las dimensiones de la lesión observada, y posteriormente, se hidrata con solución fisiológica, solución de antibióticos o alguna otra que el médico considere apropiado. La membrana húmeda se coloca sobre el timpano, accediendo por el canal auditivo y cubriendo totalmente el sitio de la lesión. La membrana se adhiere al timpano por su carácter hidrofílico. De esta forma, la membrana de colágeno provee un soporte provisional que subsana la discontinuidad del timpano, permitiendo cierta transmisibilidad de las ondas de sonido, y sobre el cual las células del timpano pueden migrar desde el borde de la herida hacia el centro, y generarán las capas epitelial y fibrosa que cerrarán la herida.

En la elaboración de andamios para ingeniería de tejidos, tanto la porosidad como la permeabilidad son aspectos importantes ya que, la porosidad provee el espacio necesario para la migración celular a través del andamio y para la formación de la matriz extracelular; mientras que la permeabilidad permite la afluencia de los nutrientes y la elución de los desechos metabólicos, por lo que se busca que los dispositivos tengan alta porosidad y alta permeabilidad.

Para determinar la porosidad de la membrana de colágeno, se midieron las dimensiones de las estructuras y se determinó el volumen de las estructuras (Vm). Las membranas se pesaron individualmente, previo a la experimentación (Wo). Posteriormente, se sumergieron en 5 mL de etanol absoluto y se dejaron por 24 h a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo, se retiraron las estructuras de colágeno y se quitó el exceso superficial de liquido, con un papel filtro. Las membranas se pesaron inmediatamente (W2 ) y se determinó el porcentaje de porosidad, de acuerdo con la siguiente fórmula, donde p es la densidad del etanol absoluto:

(3.30 mg — 1.20 mg)/(789.7 mg/cm ³

Pl% x 100 = 91.91%

0.00289 cm ³

(3.50 mg — 0.8 mg)/(789.7 mg/cm ³ )

P2 _% x 100 = 80.76% 0.00423 cm ³

(3.10 mg — 1.10 mg)/(789.7 mg/cm ³ ')

P3 _% x 100 = 78.75%

0.00322 cm ³ La porosidad promedio de las membranas elaboradas fue de 83.81 ± 7.09.

En relación con lo anterior, se realizó un análisis por microscopía SEM para determinar el tamaño de poro. En la figura 4A se puede observar la estructura colapsada del andamio, creando superficies lisas, pero manteniendo una estructura porosa con heterogeneidad en el tamaño de poro, asi como en la morfología de los mismos. Una microestructu ra heterogénea es deseable en la ingeniería de tejidos, ya que asemeja la compleja estructura jerárquica, que se encuentran en los sistemas biológicos; diferentes tamaños de poro tienen influencia en distintos procesos celulares. Los nanoporos (< 100 nm) son importantes para la formación de fibras de colágeno y matriz extracelular, mientras que los macroporos (100 m - mm) influyen en la siembra celular, distribución, migración y neovascularización in vivo.

Los andamios deben permitir la formación de las uniones gap funcionales, y la interacción apropiada con otras células y/o con la matriz extracelular. Para contacto indirecto célula-célula, el tamaño de poro debe ser lo suficientemente grande para asegurar la nutrición celular pero no muy largo para evitar la migración celular. La migración celular a través de la membrana requiere de un balance entre tamaño celular, adhesión, tamaño de poro y la topografía de la superficie. Andamios con tamaños de poro de 50 nm a 12 m regulan la adhesión celular, la interacción célula-célula y la migración a través de la membrana. Los andamios con tamaño de poro > 100 pm tienen un mayor número de unidades funcionales necesarias para la regeneración de varios tejidos.

Para regeneración de piel se había establecido un rango de tamaño de poro de 20 -120 pm, óptimo para viabilidad y actividad celular. Se demostró que la adhesión celular disminuyó al incrementar el tamaño de poro, atribuyéndose a que, poros más pequeños (120 pm) ofrecen mayor área superficial a la cual se pueden adherir las células, después de la inoculación. No obstante, después de 7 dias de cultivo, se observó un mayor conteo celular en andamios con tamaños de poro mayores (150-200 pm y 300-350 pm). Por otra parte, tamaños de poro de 325 pm facilitaban una mayor infiltración celular a través del andamio, exhibiendo una distribución celular uniforme, migrando completamente del borde hasta el centro del andamio.

En la membrana fabricada de acuerdo con la presente invención, los poros más pequeños tienen un tamaño de 13.81 ± 4.94 pm, mientras que los más grandes oscilan entre 100-200 pm, especialmente, en la sección transversal de la membrana (ver Figura 4B), lo que contribuye a la adhesión y la migración celular en la membrana, como se describe posteriormente.

Igualmente, se puede observar en la figura 4B, que el espesor de la membrana tiene valores de 168.92 pm, 201.25 pm y 268.34 pm, pudiendo establecerse el espesor promedio de 234.79 ± 47.44 pm. El espesor de la membrana timpánica varia en función de las diferentes zonas que la componen, pero en general, la mayoría de los autores han convenido en un espesor de entre 30-150 m (Van der Jeught, 2013). Se ha observado que, durante la reparación de la membrana timpánica, existe la posibilidad de una hiperproliferación de la capa epitelial, lo que genera un engrosamiento de la membrana timpánica y, por ende, se extiende el proceso de sanación, además de que puede afectar temporalmente la capacidad auditiva del paciente (Kim et al., 2017). Por tal motivo, la reducción del espesor de las estructuras de colágeno es importante, para no sumar volumen a la zona lesionada y contribuir a una proliferación más controlada.

La migración celular es una propiedad crucial que debe cumplir el injerto, ya que éste es el principio para la reparación de tejidos. En particular, el mecanismo de curación de una herida de timpano es diferente al de otras partes del cuerpo, por ejemplo, la piel. Normalmente, ante una lesión, la respuesta de los tejidos es comenzar una serie de fases de hemostasia, inflamación, proliferación celular y, finalmente, migración celular; en el caso de la membrana timpánica la migración celular precede a la proliferación. Además, por lo general el tejido de granulación se desarrolla y sirve como base para la reepitelización; en el caso del timpano, el epitelio escamoso se desarrolla primero, seguido por el resto de la capa epitelial y concluye con la capa fibrosa. Asi mismo, se ha observado que los puntos de mayor proliferación en la membrana timpánica son el anillo y el mango del martillo. Por otra parte, la particularidad con el timpano es que el borde de la herida está suspendido, no existe una matriz de tejido subyacente que pueda soportar el epitelio en regeneración y los vasos migratorios que, por necesidad, deben derivarse de la lámina propia circundante (Teh et al., 2013).

En relación con lo anterior, en un estudio se comparó la interacción de fibroblastos humanos con la matriz extracelular de dermis descelularizada de porcino y humano, encontrándose que, la dermis descelularizada de origen humano presentaba una mayor infiltración de fibroblastos y una mayor distancia recorrida desde la superficie de inoculación (Armour et al., 2006).

Se realizaron estudios de migración celular al cultivar fibroblastos humanos sobre la membrana timpánica de colágeno. En dichos estudios se observó que los fibroblastos proliferaban y se infiltraban en la estructura porosa de la membrana (ver figuras 5A a 5B) lo que demuestra que la membrana permitiría la migración de las células desde los bordes de la lesión, hasta el centro de la misma, donde las células comiencen la deposición de componentes proteicos que reparen la continuidad de las capas de la membrana timpánica.

Para evaluar la capacidad de la membrana de colágeno para promover la migración celular, se cultivaron fibroblastos sobre la superficie de la misma y se mantuvo el cultivo en incubación por 15 dias (37°C, 5% CO2). Por tinción citoquímica con 4 ' , 6 - d i a m i d i n o - 2-feni l¡ ndol (DAPI), se visualizaron los núcleos de los fibroblastos, de acuerdo con las figuras 5A y 5B se pudo observar que la membrana de colágeno soportó el crecimiento de fibroblastos y las células pudieron migrar a través de toda la estructura, a pesar de su compactación. Las células se pueden distinguir individualmente por la tinción de los núcleos (ver flechas), en la parte superior de la estructura de colágeno; o como zonas de luminosidad (ver circuios) debido a la alta densidad celular presente, en los planos inferiores de la membrana, evidenciando una excelente infiltración celular. Adicionalmente, las membranas de colágeno se mantuvieron integras y fueron fácilmente manipuladles, aún después de haber estado en cultivo.

Para evaluar la resistencia mecánica de la membrana, se realizaron pruebas de comportamiento en húmedo. Primeramente, la membrana de colágeno se sumergió en sangre recién extraída, y se colocó sobre un globo inflado, para evaluar adhesión y resistencia a la expansión, ya que los cambios de presión en el oido son cercanos a la presión atmosférica.

Las membranas de colágeno mostraron resistencia a la manipulación, después de estar en contacto con sangre. Mantenían la forma definida de membrana, se adherían a las superficies y soportaron la fuerza de extensión al inflar el globo. Las figuras 6A, 6B, 6C y 6D muestran evidencia de lo anterior.

Como parte de la caracterización física de la membrana, se realizaron pruebas de absorción para determinar el porcentaje de retención que permitía la estructura. Para ello, se siguió el método descrito por la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, en el Suplemento para Dispositivos Médicos.

Se registra el peso inicial en seco (Ps) de una membrana. Posteriormente, la membrana se sumerge completamente en 20 mide agua MiliQ y se deja reposar por 72 h a temperatura ambiente Terminado el periodo, se remueve la membrana del agua y se deja escurrir el exceso de agua por 1 minuto. Seguidamente, se pesa, anotando el peso final en húmedo (Ph). Se determina el porcentaje de retención de humedad (R%), de acuerdo con la siguiente fórmula:

(11 — 0.9) mg

/?lo/ _o — - - - — -X 100 = 1122.22% 0.9 mg

(21.7 - 1.4) mg

/?2o _/o — - - — - - — - x 100 = 1450%

1.4 mg

(21.6 - 1.5) mg

/?3o _/o — - - - - - — - x 100 = 1340%

1.5 mg

De acuerdo con lo anterior, se determinó que la membrana presenta un porcentaje de retención promedio de humedad de 1304.07 ± 166.81 %, y el incremento de masa fue de 14.04 ± 1.67 veces el peso original (Ps). Resaltando que, a pesar de que la membrana absorbía líquidos, no hubo una turgencia de la misma, y no se vieron afectadas las dimensiones de la membrana (ver figura 7). A la membrana se le pueden adicionar diversas sustancias, tales como: Pegamento tisular para mejorar la adherencia de la membrana al sitio de implante; una solución de antibiótico para tratar o prevenir una infección del oido mientras se repara el timpano; factores de crecimiento y/o células mesenquimales autólogas o alogénicas que, por su capacidad de señalización puedan promover o potenciar las rutas bioquímicas relacionadas a la curación de heridas y reparación de tejidos; nanoparticulas para la liberación dosificada de fármacos o alguna otra sustancia que pueda servir para el tratamiento de algún síntoma o padecimiento de la herida; en general, cualquier sustancia, compuesto o molécula, sintética o biológica que, por su naturaleza bioactiva o terapéutica pueda emplearse para el mejoramiento o aceleramiento de los procesos de reparación tisular, o como tratamiento a cualquier deterioro, alteración o daño a la salud.

El invento ha sido descrito suficientemente como para que una persona con conocimientos medios en la materia pueda reproducir y obtener los resultados que mencionamos en la presente invención.