CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con la biología, la biotecnología y la ciencia médica en lo general, en lo particular, se relaciona con proceso de producción de células mesenquimales y más específicamente se refiere a un novedoso método de producción a escala de células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton, con alto rendimiento celular en el mismo o menor tiempo, favoreciendo la relación costo-beneficio, debido a la presencia de una mayor superficie celular y optimización de los insumos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las células troncales mesenquimales (Mesenchymal stem cells MSC por sus siglas en inglés) constituyen una población heterogénea de células estromales m u I ti p ote n te s que tienen morfología semejante a la de los fibroblastos, con dos características fundamentales que las diferencian de otros tipos celulares: 1) su capacidad de autorrenovación (formar células troncales idénticas a ella misma) y 2) son células no diferenciadas (células que no tienen una función determinada en algún tejido u órgano); son capaces de generar células que pueden diferenciarse al menos a un linaje particular.

A diferencia de otro tipo de células no existe un marcador celular que las puede identificar por lo que la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT, por sus siglas en inglés) ha establecido 3 criterios fundamentales: 1) en cultivos in vitro tienen capacidad de adherencia al plástico, 2) que sean positivas para los marcadores celulares CD105, CD73 y CD90, además de expresar niveles bajos de HLA-I y ser negativas para HLA-II, CD11 b, CD14, CD34, CD45 y CD31; 3) deben tener capacidad de diferenciación a diferentes linajes mesenquimales como son hueso, cartílago y tejido adiposo.

Las células mesenquimales obtenidas in vitro, poseen propiedades biológicas importantes que pueden ser empleadas en la Medicina Regenerativa, como son: a) amplio potencial de diferenciación (plasticidad), b) secretan factores tróficos que favorecen la remodelación de tejidos, c) capacidad de soporte hematopoyético y d) tienen capacidad inmunosupresora. Debido a estas propiedades actualmente las células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) se aplican en algunos protocolos de terapia celular y en el futuro podrían emplearse en el tratamiento o prevención de otras patologías.

Las células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) han sido utilizadas inicialmente para la regeneración de tejidos destruidos o dañados, como ocurre en el caso de las enfermedades neurodegenerativas, la diabetes o la patología cardiaca; y finalmente también son usadas como vehículo terapéutico de genes, por ejemplo, en el caso de enfermedades monogénicas como la hemofilia o incluso como vehículo de terapias antitumorales o antiangiogénicas.

Las células mesenq uimales están involucradas en varios procesos fisiológicos y patológicos, incluido el mantenimiento de la homeostasis tisú lar, el envejecimiento, el daño de los tejidos y las enfermedades inflamatorias. La liberación de citocinas inflamatorias en los tejidos dañados conlleva la producción por parte de las células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) de una gran cantidad de factores de crecimiento, que orquestan a células endoteliales, fibroblastos y otras células madre a promover la regeneración y reparación de los tejidos a través de la angiogénesis, la secreción de metaloproteinasas, matriz extracelular y la diferenciación celular.

Existen diferentes fuentes de obtención, la primera de ellas fue a partir de muestras de médula ósea, el cual es un proceso invasivo que requiere que el donante ingrese a una sala quirúrgica, sea sometido a un proceso de anestesia total y se proceda a la punción de los huesos planos como las crestas iliacas para la recolección de las células, el número de punciones depende de la dosis celular que se esté deseando obtener. Otra fuente de obtención es la fracción estromal vascular en la cual el donante se somete a un proceso de anestesia para realizar la extracción de tejido adiposo y, por lo tanto, también es un método invasivo. Existen otras fuentes de obtención como la pulpa dental, la cual no es invasiva, sin embargo, la cantidad de células obtenidas es minima y el riesgo de contaminación es elevado por la misma naturaleza de las piezas dentales. Las células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés), también se pueden obtener de los tejidos placentarios, como lo es el cordón umbilical, éste es un proceso tiene la ventaja de no ser invasivo ya que estos tejidos por lo general se desechan y pueden ser aprovechados cuando se realiza un buen seguimiento de la evolución del embarazo y de la madre para obtener la mejor donación; este proceso no implica ningún riesgo ni para la madre ni para el bebé, además de que no implica cuestiones éticas.

En relación a los métodos de obtención existen dos métodos principales, la obtención por digestión enzimática, donde el tejido obtenido se somete a un tratamiento con enzimas que lo destruyen y generan la liberación de las células; sin embargo, este proceso implica parte de las células son destruidas y se ve comprometida la viabilidad celular si no se cuidan factores como temperatura, tiempo y concentración de enzimas; posterior a este proceso, inicia el proceso del cultivo celular en frascos T de diferente dimensiones con el fin de proporcionar la superficie de adherencia donde comenzará el crecimiento celular hasta obtener la densidad celular deseada. El segundo método es el de explante en el cual se realiza la obtención de pequeños fragmentos de tejido que son colocados en frascos T y medio de cultivo para que de manera natural las células mesenquimales sean liberadas y comiencen a crecer la superficie de estos contenedores. Este proceso es menos agresivo y por lo tanto no se ve comprometida la viabilidad celular. Debido a que la viabilidad celular es critica para el buen funcionamiento de las células, se puede mejorar por este segundo método y de esta manera mejorar la calidad de las células obtenidas.

Los procesos en general se realizan por el método de digestión enzimática, de diferentes fuentes de obtención, y usan medios de cultivo que incluyen componentes de origen animal. La mayoría de los procesos no incluyen el uso de matraz con agitación (spinner flask, SF por sus siglas en inglés), ni microportadores para escalar la obtención de células mesenquimales.

El método de digestión enzimática, consiste en que el tejido obtenido se somete a un tratamiento con enzimas como tripsina y colagenasa, que lo destruyen y generan la liberación de las células, sin embargo, este proceso implica parte de las células son destruidas y se ve comprometida la viabilidad celular si no se cuidan factores como temperatura, tiempo y concentración de enzimas; posterior a ésta proceso, inicia el proceso del cultivo celular en frascos T de diferente dimensiones con el fin de proporcionar la superficie de adherencia donde comenzará el crecimiento celular hasta obtener la densidad celular deseada; este cultivo celular implica la adición de medio de cultivo suplementado con suero fetal de bovino (SBF) o suero humano para proporcionar los nutrientes necesarios para el crecimiento celular. Estos cultivos se mantienen en temperaturas que van de 36 a 38° C en una atmosfera entre 4 y 6% de CO2. Una vez alcanzada una confluencia entre el 80 y el 90% se realiza un proceso de tripsinización donde la intención es despegar las células de la superficie plástica, se recupera la densidad celular y se realiza un conteo al microscopio para conocer su concentración; una vez calculado este valor se siembra nuevamente en otro frasco T de mayor dimensión para continuar su crecimiento y este proceso se repite por 7 veces en total.

En relación con la obtención de estas células, existen diferentes fuentes de obtención, la primera de ellas fue a partir de muestras de médula ósea, el cual es un proceso invasivo que requiere que el donante ingrese a una sala quirúrgica, sea sometido a un proceso de anestesia total y se proceda a la punción de los huesos planos como las crestas iliacas para la recolección de las células, el número de punciones depende de la dosis celular que se esté deseando obtener. Otra fuente de obtención es la fracción estromal vascular en la cual el donante se somete a un proceso de anestesia para realizar la extracción de tejido adiposo y, por lo tanto, también es un método invasivo. Existen otras fuentes de obtención como la pulpa dental, la cual no es invasiva, sin embargo, la cantidad de células obtenidas es minima y el riesgo de contaminación es elevado por la misma naturaleza de las piezas dentales. Las células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) también se pueden obtener de los tejidos placentarios, como lo es el cordón umbilical. Este es un proceso que tiene la ventaja de no ser invasivo ya que estos tejidos por lo general se desechan y pueden ser aprovechados cuando se realiza un buen seguimiento de la evolución del embarazo y de la madre para obtener la mejor donación; este proceso no implica ningún riesgo ni para la madre, ni para el bebé; además de que no implica cuestiones éticas.

Los medios de cultivo ideales para obtener este tipo de células son los medios DMEM dulbecco modified Eagles minimal essential médium (medio de Eagle modificado por Dulbecco) o DMEM/Í12 (medio de Eagle modificado por Dulbecco), los cuales por lo general son suplementados con suero fetal bovino (SFB), lo cual conlleva a la posibilidad de una contaminación biológica proveniente de la linea de producción del suero fetal bovino (SFB), que representa un riesgo biológico importante en su utilización, además de los problemas éticos que implica el sacrificar animales para su producción.

El uso del suero fetal bovino (SFB) en los cultivos celulares es debatible dada la probable introducción de elementos que pueden inducir efectos inhibitorios en el desarrollo y diferenciación celular. La presente invención está orientada a un proceso de producción a escala de células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton, con alto rendimiento celular en el mismo o menor tiempo, favoreciendo la relación costo-beneficio, debido a la presencia de una mayor superficie celular y optimización de los insumos.

Se realizó una búsqueda para determinar el estado de la técnica más cercano, encontrándose los siguientes documentos. Se ubicó el documento CN103266081 A de Chen Hu et al. del 21 de enero de 2013, que divulga un método eficaz para aislar y cultivar células madre mesenquimales de cordones umbilicales, que comprende las siguientes etapas: (1) digerir un cordón umbilical in vitro usando una enzima digestiva de tejidos; (2) cultivar las células digeridas con un medio de cultivo de células madre mesenquimales para cultivar y obtener células madre mesenquimales; (3) cultivar el tejido que no está completamente digerido después de la digestión mediante un medio de cultivo de células madre mesenquimales para obtener las células madre mesenquimales.

Las células madre mesenquimales obtenidas por el método están en linea con las características de las células madre mesenquimales en marcadores de superficie, características de crecimiento, diferenciación inducida m u 11 i d i re c c i o n a I y otros aspectos.

El método menciona la eficiencia para el aislamiento y cultivo de células mesenquimales obtenidas del cordón umbilical combinando el método de digestión enzimática con el de Explante del tejido que no fue digerido.

Sin embargo, dicho documento no aporta el mismo o similar rendimiento celular, no permita disminuir los tiempos y aumentar el rendimiento celular; tampoco divulga o sugiere cultivo de escalamiento celular por lote con matraces con agitación y microportadores para obtener una mayor densidad celular por lote.

Se ubicó también el documento CN109251888A de Tan Rufu del 05 de septiembre de 2018, que revela un método que abarca desde la recogida del tejido, el transporte, pretratamiento del tejido de cordón umbilical y el cultivo del Explante de gelatina de Wharton. Es un método de separación continua de alta eficiencia.

Dicho documento no aporta el mismo o similar rendimiento celular, no permita disminuir los tiempos y aumentar el rendimiento celular; tampoco divulga o sugiere cultivo de escalamiento celular por lote con matraces con agitación y microportadores para obtener una mayor densidad celular por lote.

Se ubicó también el documento US2016024466A1 de Phan Toan- Thang y Lim Ivor Jiun del 18 de mayo de 2015, que revela un método de cultivo de células progenitoras a partir de un explante de tejido de la membrana amniótica del cordón umbilical en medios de cultivo y condiciones de cultivo adecuados durante un periodo adecuado de tiempo.

Dicho documento no aporta el mismo o similar rendimiento celular, no permita disminuir los tiempos y aumentar el rendimiento celular; tampoco divulga o sugiere cultivo de escalamiento celular por lote con matraces con agitación y microportadores para obtener una mayor densidad celular por lote.

Otro documento localizado fue el documento CA3031978A1 de Phan Toan Thang del 05 de octubre de 2017, que revela un método de aislamiento que comprende el cultivo de tejido del cordón umbilical en un medio de cultivo compuesto por DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco), F12 (de Ham F12 Medium), M171 (Medio 171) y FBS (Suero bovino fetal). La invención también se refiere a una población de células mesenquimales aislada de la membrana amniótica del cordón umbilical, en la que al menos aproximadamente el 90% o más células de la población de células madre expresan los siguientes marcadores: CD73, CD90 y CD105 y carecen de expresión de los siguientes marcadores: CD34, CD45 y HLA-DR. La invención también se refiere a una composición farmacéutica de esta población de células mesenquimales.

Sin embargo, dicho documento no revela ni sugiere un cultivo de escalamiento celular por lote con matraces con agitación y microportadores para obtener una mayor densidad celular por lote; además emplea medio de cultivo suplementado con componentes de origen animal.

También se ubicó el documento CN111918962A de Jo Hyun-Chul y Lee Ah-Young del 28 de marzo de 2019, que revela un método para el aislamiento de células madre derivadas del cordón umbilical y, más particularmente, a un método para el aislamiento de células madre derivadas del cordón umbilical, mediante el cual se puede aislar una cantidad notable de células madre de un cordón umbilical que tiene un cierto tamaño y sin tratamiento enzimático que suprime el estrés dado a las células; además, las células madre aisladas tienen un potencial de proliferación celular superior a las células madre aisladas mediante métodos de aislamiento convencionales. Sin embargo, dicho documento no revela ni sugiere un cultivo de escalamiento celular por lote con matraces con agitación y microportadores para obtener una mayor densidad celular por lote.

Ante la necesidad de contar con un método de producción a escala de células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton que busque obtener un mayor rendimiento celular, en el mismo o menor tiempo, favoreciendo costo-beneficio, debido a la presencia de una mayor superficie celular y optimización de los insumos, fue que se desarrolló la presente invención.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN

La presente invención tiene como objetivo principal hacer disponible un proceso de producción a escala de células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton, que permita disminuir los tiempos y aumentar el rendimiento celular, lo cual conllevará al ahorro en la producción de las células mesenquimales.

Otro objetivo de la invención es hacer disponible dicho proceso de producción a escala de células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton que, además, favorezca el crecimiento de un mayor número de células, de hasta 3.7 veces en comparación con el método de digestión enzimática.

Otro objetivo de la invención es hacer disponible dicho proceso de producción a escala de células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton que, además, permita disminuir el tiempo de proceso hasta en 2 semanas menos que con el método de digestión enzimática.

Otro objetivo de la invención es hacer disponible dicho proceso de producción a escala de células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton, en donde además se use medio de cultivo libre de componentes de origen animal para disminuir la inmunogenicidad de las células obtenidas.

Y todas aquellas cualidades y objetivos que se harán aparentes al realizar una descripción general y detallada de la presente invención apoyados en las modalidades ¡lustradas.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL INVENTO

El procedimiento de cultivo celular en frascos flask (recipientes plásticos), es un procedimiento de cultivo celular en donde se adhieren las células a la superficie plástica y van creciendo hasta llegar a un estado de confluencia entre el 80 y 90%. El limite de crecimiento es el tamaño de la superficie del plástico. El medio de cultivo requerido para el crecimiento de las células está compuesto por medio DMEM/F12(dulbecco modified Eagles minimal essential medium (medio Eagle modificado de Dulbecco) suplementado con 10% de Suero Humano. Este medio es añadido a los frascos flask (frasco T) en conjunto con las células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) y son incubadas a una temperatura entre 36 y 38°C y en una atmosfera entre 4 y 6% de CO2. Permanecen en estas condiciones hasta que se observa al microscopio una confluencia entre el 80 y 90%, una vez alcanzado este valor, se añade una solución enzimática con el objetivo de despegar las células del plástico (donde están adheridas) y recuperarlas en suspensión para poder realizar el conteo celular y volver a sembrarlas en un frasco flask de mayor superficie y asi sucesivamente hasta obtener el número de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) deseadas.

El proceso tradicional con frascos flask (recipientes plásticos), conlleva tiempo para el crecimiento de las células, mayor volumen de estos insumos para llegar a un número considerable de células mesenquimales, asi como el volumen de medio de cultivo necesario, lo cual encarece el proceso; por este motivo se tuvo que encontrar una nueva metodología que ayudara a tener un mayor rendimiento celular y un menor consumo de insumos para de esta manera poder reducir el costo del proceso.

Para llegar al diseño y desarrollo del proceso de producción a escala de células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton de la presente invención, se evaluaron diversos aspectos relevantes como el medio de cultivo, para ello a través de varias pruebas, pudo encontrarse que empleando un medio de cultivo libre de componentes de origen animal ofrece mejores resultados y existe menos riesgo de contaminación, ya que los medios de cultivo que son suplementados con Suero Fetal Bovino (SFB), existe la posibilidad de una contaminación biológica proveniente de la linea de producción del Suero Fetal Bovino (SFB), que representa un riesgo biológico importante en su utilización, además de los problemas éticos que implica el sacrificar animales para su producción.

Se pensó en obtener células mesenquimales que fueran menos inmunogénicas, por lo que se optó por usar medios de cultivo con características libre de componentes de origen animal.

El método de explante sin escalamiento, solo en frascos flask podríamos obtener entre 1.500 y 2,000 millones de células mesenquimales.

Considerando lo anterior, se pensó en desarrollar un método de producción a escala de células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton que permitiera disminuir los tiempos y aumentar el rendimiento celular, lo cual conllevara al ahorro en la producción de las células mesenquimales.

Pudo determinarse sorprendentemente que empleando un método de escalamiento puede obtenerse un mayor rendimiento celular, en el mismo o menor tiempo, favoreciendo costo-beneficio, debido a la presencia de una mayor superficie celular y optimización de los insumos.

La ventaja es la adaptación de este método para el crecimiento de células mesenquimales, con insumos de origen alogénico (libre de xeno o libre de material de origen animal) y produciendo poblaciones de células viables en un pasaje bajo (7) y con las características celulares adecuadas, (marcadores positivos y negativos transmembranales).

Pudo determinarse que sorprendentemente combinando el método de explante con el escalamiento celular se podrían obtener entre 7,000 y 7,500 millones de células mesenquimales, aunado al beneficio de usar medios de cultivo libre de componentes de origen animal (libre de xeno o libre de material de origen animal) los cuales disminuyen la apoptosis celular, con una reducción de inmunogenicidad, y un aumento en la proliferación celular y secreción factores de crecimiento.

Con base en la información investigada, haciendo cálculos matemáticos de la superficie de crecimiento que tendrían las células, los insumos que se requieren y el rendimiento celular que se obtendría pudo encontrarse el método de escalamiento con matraz con agitación (spinner flask, SF por sus siglas en inglés), podría aportar todos los beneficios indicados en el apartado de los objetivos. Asi mismo, se detectaron los rangos de operati vid ad para cada lote, con resultados en la maximización de la cantidad de células viables y el uso mínimo de insumos y reactivos. Los matraces con agitación, es una técnica que se usa para cosechar subproductos de células para ser aprovechados en ámbitos clínicos y/o industriales. En la presente invención se ha adaptado con base al conocimiento previo adquirido del crecimiento de célula mesenquimales en superficies planas (cell-stacks) el uso de matraces con agitación (SF) y microportadores, para aumentar la población celular por lote. El método de escalamiento celular por medio de matraz con agitación (spinner flask, SF por sus siglas en inglés) y microportadores para obtener una mayor densidad celular, usando medios de cultivo libre de componentes de origen animal (Xeno- free), no han sido localizados en el estado de la técnica. Este proceso implica realizar pequeños cortes de 1 a 2 mm del tejido y colocarlo en la superficie de los frascos T, añadir medio de cultivo y mantener en incubación a una temperatura entre 36 y 38°C y entre 4 y 6% de CO2, hasta observar el desplazamiento de las células al medio de cultivo y su adherencia a la superficie del frasco. Una vez alcanza una confluencia entre 75 y 85% se re aliza un desprendimiento de las células, se cuentan al microscopio y se realiza una resiembra en otro frasco T de mayor superficie y la adición de medio de cultivo, para que las células se adhieran y continúen su crecimiento. Estos frascos se mantienen a una temperatura entre 36 y 38°C y entre 4 y 6% de CO2. Este proceso se repite 5 veces y una vez realizado el conteo celular, se siembra en los matraces con agitación (spinner flask, SF por sus siglas en inglés) que contienen los microportadores los cuales proporcionan una mayor superficie celular para que las células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés), se adhieran a ellos y continúen creciendo una vez añadido el medio de cultivo y se mantenga en agitación constante a una temperatura entre 36 y 38°C y entre 4 y 6% de CO2. De esta manera se obtiene una mayor superficie de crecimiento a diferencia de la que se tendría en los frascos T, y, por lo tanto, una mayor cantidad de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés), a diferencia de lo que se obtendría en los frascos T. En un frasco T se podría tener una superficie de crecimiento de 1272 cm ² y en un matraz con agitación (spinner flask, SF por sus siglas en inglés) con microportadores, la superficie puede aumentar hasta a 18,000 cm ² , por lo que se obtiene un mayor rendimiento celular.

El medio de cultivo libre de componentes de origen animal es para disminuir la inmunogenicidad de las células obtenidas. Este medio de cultivo está compuesto por altas concentraciones de glucosa, L- glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio, el cual es suplementado con suero humano, el cual proporciona los factores de crecimiento y aminoácidos necesarios para el crecimiento de las células y como no contiene componentes de origen animal, las células bajo estas condiciones, no contienen restos de origen animal y por lo tanto no causan rechazo o problemas de inmunogenicidad.

Para comprender mejor las características de la invención se acompaña a la presente descripción, como parte integrante de la misma, los dibujos con carácter ilustrativo más no limitativo, que se describen a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra una diagrama de bloques del proceso de producción a escala de células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton. Para una mejor comprensión del invento, se procederá a hacer la descripción detallada de alguna de las modalidades de este, mostrada en los dibujos que, con fines ilustrativos mas no limitativos, se anexan a la presente descripción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO

Los detalles característicos del método de producción a escala de células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton se muestran claramente en la siguiente descripción y en los dibujos ilustrativos que se anexan, sirviendo los mismos signos de referencia para señalar las mismas partes.

El método de escalamiento en matraz con agitación (spinner flask, SF por sus siglas en inglés) y microportadores para la producción a escala de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) a partir de gelatina de Wharton, de conformidad con la presente invención, consiste en incubar pequeños cortes de 1 a 2 mm del tejido en la superficie de frascos T, añadir medio de cultivo y manteniendo a una temperatura entre 36 y 38°C y entre 4 y 6% de CO2, hasta observar el desplazamiento de las células al medio de cultivo y su adherencia a la superficie de los frascos T. Una vez que se alcanza una confluencia entre 75 y 85%, se realiza un desprendimiento de las células, se cuentan al microscopio y se realiza una resiembra en otro frasco T de mayor superficie, con la adición de medio de cultivo, para que las células se adhieran y continúen su crecimiento (este proceso correspondería a un pase celular). Estos frascos se mantienen a una temperatura entre 36 y 38°C y una concentración de CO2 entre 4 y 6%. Este proceso se repite 5 veces (pase 5) y una vez realizado el conteo celular, se siembran entre 600 y 800 millones de células mesenquimales en matraz con agitación (spinner flask, SF por sus siglas en inglés) que contienen microportadores (pase 6), los cuales proporcionan una mayor superficie celular para que las MSC se adhieran a ellos y continúen creciendo una vez añadido el medio de cultivo y se mantenga en agitación constante a una temperatura entre 36 y 38°C y entre 4 y 6% de CO2. Se realiza un conteo celular y se criop reservan entre 3,000 y 4,000 millones de células mesenquimales y el resto que corresponden a 1000 millones aproximadamente se resiembran en los matraces con agitación

(spinner flask, SF por sus siglas en inglés) que contienen los microportadores (pase 7), se mantienen en agitación constante a una temperatura entre 36 y 38°C y entre 4 y 6% de CO2; hasta que se observa una confluencia entre 75 y 85% se realiza un conteo celular y se criop reservan las células obtenidas que serian entre 4,000 y 5,000 millones.

Con esta metodología se obtiene una mayor superficie de crecimiento a diferencia de la se obtiene en los frascos T, y, por lo tanto, una mayor cantidad de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés), a diferencia de lo que se obtendría en los frascos T. En un frasco T se podría tener una superficie de crecimiento de 1272 cm ² y en un matraz con agitación (spinner flask, SF por sus siglas en inglés) con microportadores, la superficie puede aumentar hasta a 18,000 cm ² , por lo que se obtiene un mayor rendimiento celular. En la siguiente tabla 1 se muestra un comparativo entre el método Flask de producción a escala de células mesenquimales vs el método de escalamiento de la presente invención.

Tabla 1.- método Flask de producción a escala de células mesenquimales vs el método de escalamiento de la presente invención. acuerdo con la figura 1, el método de producción a escala de células mesenquimales a partir de gelatina de Wharton comprende las siguientes etapas: a) Obtener el tejido de cordón umbilical, limpiarlo con solución salina, la cual es una solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% (p/v) en agua; posteriormente realizar un corte transversal del cordón para retirar los componentes del sistema circulatorio para que no contaminen el cultivo celular con células de origen hematopoyético por lo que son desechados y obtener la gelatina de Wharton la cual tienen una consistencia gelatinosa; con la ayuda de unas pinzas de disección se va obteniendo y se cortar en fragmentos pequeños con el bisturí; b) Cultivar pequeños fragmentos de 1 a 2 mm de gelatina de Wharton y colocar en cajas de cultivo preferentemente de 6 pozos, en cada pocilio añadir 1 - 2 mL de medio de cultivo el cual contiene 10% de suero humano (medio de cultivo A), compuesto por altas concentraciones de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio, el cual es suplementado con suero humano, que proporcionan en conjunto los nutrientes y factores de crecimiento necesarios para el crecimiento de las células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés). El volumen de medio de cultivo añadido debe ser el suficiente para cubrir los fragmentos de gelatina de Wharton. Posteriormente las cajas son colocadas en una incubadora que mantendrá la temperatura entre 36 y 38°C y condiciones controladas de CO2 que varían de 4 a 6%. Los medios de cultivo se revisan a diario hasta que se observe un crecimiento celular entre 75 y 85% que cubra la superficie de cada pozo de cultivo. c) Primera recolección de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) una vez que se alcanza el 75 a 85% de confluencia, mediante un proceso de tripsinización con una tripsina recombinante (TrypLE® Select, enzima recombinante libre de origen animal para disociar una amplia gama de células de mamíferos adherentes), que permite liberar las células. La tripsina se añade en un volumen que cubra a penas la capa de células mesenquimales, que por lo general es de 0.5 a 1 mL. Esta tripsina es una enzima recombinante con capacidad p roteol ¡tica que degrada las proteínas de adhesión que generan las células para permanecer unidas a la superficie de crecimiento y de esta manera liberar las células para que puedan ser recolectadas y contadas.

Entre el 75 y el 85% del promedio de crecimiento es el ideal ya que bajo estas condiciones las células aun tienen superficie de crecimiento, no está saturado, si se sobre pasa este valor, las células entran en una fase de apoptosis, o si no alcanzan a llegar a este valor de crecimiento, significa que las células no tienen las condiciones ideales de crecimiento y el cultivo se desecha. d) Realizar el conteo celular en una cámara de Neubauer para determinar la cantidad y la viabilidad celular. Este es un dispositivo de precisión hecho de vidrio óptico especial que se utiliza para contar células u otras partículas en suspensiones bajo el microscopio. Al observar al microscopio la sección central, se puede identificar un cuadrado de tres por tres mm, que en conjunto mide 9 mm ² . En esta cuadricula se pueden localizar los cuatro cuadrantes que están en los extremos, cada uno de ellos divididos a su vez en un conjunto de 4 x 4, donde se realiza el conteo de las células. La fórmula para realizar el conteo celular es la siguiente:

C = N «1 O ⁴ • dil Donde:

C = cel/mL

N = promedio de células presentes en 1 mm ²

10 ⁴ = factor de conversión de 0.1 L a 1 mL di I = factor de dilución si es que se diluye la muestra

La viabilidad se determina mediante la relación de las células vivas y las células muertas, bajo la siguiente fórmula:

% viabilidad = (células muertas) (100) / células totales e) Sembrar entre 800 mil y 1 millón de células mesenquimales (volumen de células que nos de este valor) y colocarlas en cajas T- 75 de cultivo con una mayor superficie, añadir de 8 - 12 mL de medio de cultivo A, e incubar a una temperatura entre 36 - 38°C con un % de CO2 entre 4 y 6. f) Segunda recolección de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) una vez que se alcanza entre 75% a 85% de confluencia, mediante un proceso de tripsinización con una tripsina recombinante (TrypLE® Select, enzima recombinante libre de origen animal para disociar una amplia gama de células de mamíferos adherentes), que permite liberar las células. La cantidad de enzima (TrypLE® Select, enzima recombinante libre de origen animal para disociar una amplia gama de células de mamíferos adherentes) que se añade es la suficiente para cubrir la capa de células mesenquimales, lo cual es un volumen aproximado entre 7 y 9 mL, se incuba a una temperatura entre 36 y 38° C durante 12 a 16 minutos hasta observar al microscopio que las células se han despegado. En este momento se coloca un volumen de medio de cultivo igual al añadido de enzima (TrypLE® Select, enzima recombinante libre de origen animal para disociar una amplia gama de células de mamíferos adherentes) para neutralizar la reacción y detener la función de la enzima y de esta manera se realiza la recuperación de las células pasándolas a un tubo de 50 mL por medio de una pipeta para posteriormente realizar el conteo celular en la cámara de Neubauer como se explicó anteriormente. g) Sembrar entre 2.5 y 3.5 millones de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) en una caja de mayor superficie (caja T-175), añadir entre 25 - 30 mL de medio de cultivo A, e incubar entre 36 y 38° C con una atmósfera de CO2 que esté entre 4 -6 %; h) Tercera recolección de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) una vez que se alcanza entre 75% a 85% de confluencia, mediante un proceso de tripsinización con una tripsina recombinante (TrypLE® Select, enzima recombinante libre de origen animal para disociar una amplia gama de células de mamíferos adherentes), que permite liberar las células. La cantidad de enzima usada es de 18 - 22 mL, se incuba a una temperatura entre 36 y 38° C durante 18 a 22 minutos hasta observar al microscopio que las células se han despegado. En este momento se coloca un volumen de medio de cultivo igual al añadido de enzima (TrypLE® Select, enzima recombinante libre de origen animal para disociar una amplia gama de células de mamíferos adherentes). para neutralizar la reacción y detener la función de la enzima y de esta manera se realiza la recuperación de las células pasándolas a un tubo de 50 mL por medio de una pipeta para posteriormente realizar el conteo celular en la cámara de Neubauer como se explicó anteriormente. Sembrar de 8 -10 millones de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) en una caja de mayor superficie (Tryple Flask), añadir 80 - 100 mL de medio de cultivo A, incubar entre 36 y 38° C con una atmósfera de CO2 que este entre 4 -6 %; i) Cuarta recolección de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) una vez que se alcanza entre 75% a 85% de confluencia, mediante un proceso de tripsinización con una tripsina recombinante (TrypLE® Select, enzima recombinante libre de origen animal para disociar una amplia gama de células de mamíferos adherentes), que permite liberar las células. La cantidad de enzima usada es de 60 - 80 mL, se incuba a una temperatura entre 36 y 38° C durante 30 a 35 minutos hasta observar al microscopio que las células se han despegado. En este momento se coloca un volumen de medio de cultivo igual al añadido de enzima (TrypLE® Select, enzima recombinante libre de origen animal para disociar una amplia gama de células de mamíferos adherentes, para neutralizar la reacción y detener la función de la enzima y de esta manera se realiza la recuperación de las células pasándolas a un tubo de 50 mL por medio de una pipeta para posteriormente realizar el conteo celular en la cámara de Neubauer como se explicó anteriormente. j) Sembrar de 30 a 50 millones de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) en cajas Cell Stak para tener una mayor superficie de crecimiento ( 1272 cm ² ), añadir 160 - 180 ml_ de medio de cultivo A combinado con medio de diferenciación mesenquimal (1:1). k) Realizar el conteo celular en una cámara de Neubauer para determinar la cantidad y la viabilidad celular, al observar una confluencia entre 75 - 85%; en esta fase se espera que el rendimiento celular esté en el rango de entre 500 y 600 millones de células mesenquimales l) Sembrar entre 5,000 y 8,000 células/cm ² en cada matraz con agitación (spinner flask, SF por sus siglas en inglés) de 1 litro y añadir 50 - 60 g de microportadores, asi como 500 - 600 mL de medio de cultivo A y medio de diferenciación mesenquimal. Mantener en incubación entre 36 y 38° C con una atmósfera de CO2 que esté entre 4 -6 %, se mantiene en agitación constante por medio de un agitador orbital para incubadora.

Los microportadores promueven una excelente unión y crecimiento de lineas celulares dependientes del anclaje y se han utilizado para la producción de productos para la salud humana. Éstos son esferas de poliestireno preparados de manera comercial para aumentar la adherencia celular, éstos proporcionan una superficie de adherencia de 30 a 35 cm ² /mL.

El medio de cultivo mesenquimal está diseñado para proliferar células mesenquimales y está elaborado de tal manera que garantiza que no promueve la diferenciación espontánea de las células ni inhibe la diferenciación celular a linajes osteogénicos, condrogénicos o adipogénico; está compuesto por: medio de cultivo DMEM-F12, L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 2 pg/mL de anfotericina B y factores de crecimiento, cuya función es proporcionar todos los nutrientes para que las células se diferencien a la linea mesenquimal. m) Quinta recolección de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) una vez que se alcanza entre 75% a 85% de confluencia, mediante un proceso de tripsinización con una tripsina recombinante (TrypLE® Select, enzima recombinante libre de origen animal para disociar una amplia gama de células de mamíferos adherentes), que permite liberar y recuperar las células. Añadiendo entre 180 y 220 mL de (TrypLE® Select, enzima recombinante libre de origen animal para disociar una amplia gama de células de mamíferos adherentes), se incuba a una temperatura entre 36 y 38° C durante 18 a 22 minutos hasta observar al microscopio que las células se han despegado. Se realiza la recuperación de las células pasándolas a un tubo de 500 mL y se realiza el conteo celular en la cámara de Neubauer como se explicó anteriormente, se espera un rendimiento celular entre 3,500 y 4,500 millones de células n) Sembrar en cuatro matraces con agitación (spinner flask, SF por sus siglas en inglés) entre 150,000 o 250,000 células mesenquimales en cada uno y 50 - 60 g de microportadores y 500 - 600 mL de medio de cultivo A y medio de diferenciación mesenquimal en una proporción (1:1); mantener en incubación a una temperatura entre 36 y 38° C con una atmósfera de CO2 que está entre 4 - 6%, mantener en agitación constante por medio de un agitador orbital para incubadora.

0) Dosificar el resto de las células mesenquimales en las diferentes presentaciones y criopreservar. En este caso se realiza el cálculo para criopreservar 5 millones de células /mL de medio cell freezing DMSO serum free (Sigma Aldrich), las dosis celulares pueden ser de 1, 3, 5, 10, 20, 50, 70 u 80 millones de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés); una vez dosificadas, se colocan en un congelador de rampas para disminuir la temperatura de manera gradual y programada hasta llegar a -90° C. Una vez que llega a esta temperatura, se colocan en los criotanques suministrados por nitrógeno liquido y donde permanecerán almacenados a temperaturas criogénicas que están entre -130 y -180° C. p) Sexta recolección de células troncales mesenquimales (MSC por sus siglas en inglés) añadiendo entre 180 y 220 mL de (TrypLE® Select, enzima recombinante libre de origen animal para disociar una amplia gama de células de mamíferos adherentes), se incuba a una temperatura entre 36 y 38° C durante 18 a 22 minutos hasta observar al microscopio que las células se han despegado. Se realiza la recuperación de las células pasándolas a un tubo de 500 mL y se realiza el conteo celular en la cámara de Neubauer como se explicó anteriormente, se espera un rendimiento celular entre 3,500 y 4,500 millones de células mesenquimales. Dosificar en las diferentes presentaciones como se explicó anteriormente y se criopreservan.

El invento ha sido descrito suficientemente como para que una persona con conocimientos medios en la materia pueda reproducir y obtener los resultados que mencionamos en la presente invención.