La présente invention concerne une nouvelle classe de canaux potassium mécanosensibles activés par les acides gras polyinsaturés. L'invention est basée sur la découverte d'un nouveau canal potassium humain, dénommé hTRAAK pour human TWICK-Related AA-Actived K+channel, mécanosensible activé par les acides gras polyinsaturés et également par le riluzole qui est un agent neuroprotecteur.

Les propriétés des canaux de la famille TRAAK ainsi que leur distribution tissulaire confèrent à ces canaux un rôle primordial dans le transport de potassium chez un grand nombre de types cellulaires.

Les canaux potassium sont des protéines ubiquitaires et leur exceptionnelle diversité fonctionnelle en fait des candidats idéaux pour un grand nombre de processus biologiques. Ils interviennent notamment dans la régulation de l'excitabilité neuronale et musculaire, sur le rythme cardiaque et sur la sécrétion d'hormone.

Jusqu'à présent, six membres de cette famille ont été clones : TWIK-1, TWIK-2, TASK-1, TASK-2, TREK-1 et TRAAK (Chavez et al., 1999 ; Duprat et al., 1997 ; Fink et al., 1996 ; Fink et al., 1998 ; Lesage et al., 1996 ; Reyes et al., 1998). Malgré une structure globalement similaire, l'identité de séquence entre ces canaux est faible (moins de 30%). TWIK-1 et TWIK-2 sont de faibles canaux K+ rectifiant intérieurs. TASK-1 et TASK-2 sont des canaux K+ rectifiant extérieurs sensibles à des variations de pH

extracellulaire dans une gamme physiologique étroite. TREK- 1, un autre canal K+ rectifiant extérieur, est activé par les étirements membranaires, les acides gras polyinsaturés, l'acidose intracellulaire et les anesthésiques inhalés (Maingret et al., 1999 (b) ; Patel et al., 1999 ; Patel et al., 1998). Tous ces canaux K à deux pores ont une distribution tissulaire étendue. TRAAK, le second canal K+ activé par les acides gras polyinsaturés et mécanosensible clone, est le seul exclusivement exprimé dans le système nerveux central (Fink et al., 1998 ; Maingret et al., 1999a).

Des applications utilisant les canaux potassium TRAAK de la souris sont divulguées dans la demande de brevet français FR 98/02725.

La présente invention est fondée sur la découverte et le clonage d'un nouveau canal désigné hTRAAK, membre de la famille des canaux TWIK. Le gène codant ce canal partage toutes les propriétés fonctionnelles de son équivalent murin (Fink et al., 1998 ; Maingret et al., 1999a) et aussi est principalement exprimé dans les tissus neuronaux.

La mise en évidence de cette nouvelle classe de canaux potassium et 1'expression hétérologue de ces canaux permet notamment de disposer de nouveaux moyens pour rechercher par criblage des drogues capables de moduler l'activité de ces canaux potassium et donc de prévenir ou de traiter des maladies impliquant ces canaux, comme l'épilepsie, les pathologies cardiaques (arythmies) et vasculaires, les neurodégénérescences, particulièrement celles qui sont associées aux ischémies et aux anoxies, les pathologies endocriniennes associées à des anomalies dans

la sécrétion d'hormones, les pathologies musculaires, les pathologies rétiniennes.

La présente invention a donc pour objet une protéine purifiée constituant un canal potassium humain mécanosensible activé par les acides gras polyinsaturés notamment l'acide arachidonique et par le riluzole. Plus particulièrement, l'invention concerne la protéine constituant le canal humain TRAAK dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2 ou un variant, dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine.

De tels variants sont ceux dont la séquence comprend une modification et/ou une suppression et/ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés, dès lors que cette modification et/ou suppression et/ou addition ne modifie pas les propriétés du canal hTRAAK. De tels variants peuvent tre analysés par l'homme du métier selon les techniques décrites dans les exemples donnés ci- après qui ont permis de mettre en évidence les propriétés biophysiques et pharmacologiques du canal hTRAAK.

Des anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre au moins une protéine constituant un canal ionique de l'invention peuvent tre préparés par les méthodes classiques décrites dans la littérature. Ces anticorps sont utiles pour rechercher la présence des canaux ioniques de l'invention dans différents tissus humains ou animaux, mais ils peuvent aussi trouver des applications dans le domaine thérapeutique pour inhiber ou activer in vivo, grâce à leur spécificité, un canal hTRAAK et/ou ses dérivés.

La présente invention a aussi pour objet une molécule d'acide nucléique purifiée comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une

protéine constituant un canal potassium humain mécanosensible activé par les acides gras polyinsaturés notamment l'acide arachidonique et par le riluzole. Plus particulièrement l'invention concerne une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour la protéine constituant le canal hTRAAK dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2 ou un variant, dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine. Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour la protéine hTRAAK est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1. L'invention concerne également sa séquence complémentaire.

L'invention concerne également un vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique précédente, avantageusement associée à des séquences de contrôle adaptées, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire d'une protéine constituant un canal ionique selon l'invention. La préparation de ces vecteurs ainsi que la production ou 1'expression dans un hôte des canaux de l'invention peuvent tre réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme du métier.

A titre d'exemple, un procédé de production d'une protéine constituant un canal cationique selon l'invention consiste : -à transférer une molécule d'acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire, -à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine constituant le canal potassium,

-à isoler, par tous moyens appropriés les protéines constituant les canaux potassium de l'invention.

A titre d'exemple, un procédé d'expression d'un canal ionique selon l'invention consiste : -à transférer une molécule d'acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire, -à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant 1'expression des canaux potassium de l'invention.

L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans les procédés précédents peut tre choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes.

Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré ; il peut s'agir de tout vecteur comme un plasmide.

L'invention concerne aussi les hôtes cellulaires et plus particulièrement les cellules transformées exprimant des canaux potassium présentant des propriétés et une structure du type de celles du canal hTRAAK obtenues conformément aux procédés précédents. Ces cellules sont utiles pour le criblage de substances capables de moduler les courants des canaux TRAAK. Ce criblage est effectué en mettant en contact des quantités variables d'une substance à tester avec des cellules exprimant les canaux de l'invention, puis en mesurant, par tous moyens appropriés, les effets éventuels de ladite substance sur les courants potassium desdits canaux. Des techniques électrophysiologiques permettent également ces études et font aussi l'objet de la présente invention dès lors qu'elles mettent en oeuvre les canaux hTRAAK ou leurs

variants. Ce procédé de criblage permet d'identifier des drogues capables de moduler l'activité des canaux potassium de l'invention et donc susceptibles de prévenir ou de traiter des maladies impliquant ces canaux. Ces substances et leur utilisation comme médicament, isolés et détectés grâce aux procédés ci-dessus, font également partie de l'invention.

Plus particulièrement, l'invention concerne donc une substance chimique ou biologique capable de modifier les courants d'un canal potassium selon l'invention pour la préparation d'un médicament utile pour prévenir ou traiter des maladies du coeur ou du système nerveux chez un sujet humain ou animal, comme les pathologies cardiaques (arythmies) et vasculaires, les neurodégénérescences, particulièrement celles qui sont associées aux ischémies et aux anoxies, les pathologies endocriniennes associées à des anomalies dans la sécrétion d'hormones, les pathologies musculaires Une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine constituant un canal hTRAAK ou un dérivé de celui- ci, ou un vecteur comprenant cette molécule d'acide nucléique ou encore une cellule exprimant des canaux TRAAK, sont aussi utiles pour la préparation d'animaux transgéniques. Il peut s'agir d'animaux sur-exprimant lesdits canaux, mais surtout d'animaux dit"knock out", c'est à dire présentant une déficience en ces canaux ; ces animaux transgéniques sont préparés par des méthodes connues de l'homme du métier, et permettent de disposer de modèles vivants pour l'étude de pathologies animales associées aux canaux TRAAK.

Ces animaux transgéniques de mme que les hôtes cellulaires décrits précédemment sont utiles en tant que modèles pour l'étude de pathologies associées à ces canaux potassium mécanosensibles activés par les acides gras polyinsaturés soient parce qu'ils sur-expriment les canaux potassium du type canal hTRAAK, soit parce qu'ils présentent une déficience en ces canaux potassium.

L'invention concerne également le diagnostic in vitro de pathologies chez 1'homme et/ou chez l'animal susceptibles d'impliquer ledit canal potassium mécanosensible activé par les acides gras polyinsaturés notamment l'acide arachidonique et par le riluzole. Ce diagnostic in vitro pourra tre accompli par tous moyens mettant en oeuvre un procédé de détection ou de localisation dans un échantillon biologique, dudit canal potassium ou du gène codant pour ledit canal potassium.

Ces procédés de détection peuvent utiliser soit des anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre la protéine, contre un variant de celle-ci ou contre au moins un fragment de ceux-ci, constituant ledit canal ionique, soit une ou plusieurs sondes nucléotidiques capables de s'hybrider avec le gène codant pour ledit canal potassium, ou avec un variant de celui-ci ou avec au moins un fragment de ceux-ci.

Ainsi, l'invention concerne l'utilisation des anticorps poly ou monoclonaux décrits précédemment ou de leurs fragments pour la détection de pathologies chez l'homme et/ou chez l'animal caractérisée en ce qu'elle comprend la détection de la mutation, et/ou de la suppression et/ou de l'addition d'au moins un acide aminé dans la protéine constituant le canal potassium selon l'invention ou un variant de celle-ci. L'invention concerne également l'utilisation des séquences d'acides nucléiques selon l'invention ou des oligonucléotides issus de celles- ci pour la détection de pathologies chez 1'homme ou chez

l'animal caractérisée en ce qu'elle comprend la détection de la mutation, et/ou de la suppression et/ou de l'addition d'au moins un nucléotide dans lesdites séquences nucléotidiques.

Ces procédés de détection in vitro peuvent tre appliqués à la détection de toute pathologie impliquant les canaux potassium de l'invention, comme des pathologies cardiaques et vasculaires de pathologies du système nerveux associées aux ischémies et aux anoxies, des pathologies de la moelle épinière, des pathologies endocriniennes associées à des anomalies dans les sécrétions d'hormones, des pathologies musculaires, des pathologies de la rétine chez un sujet humain ou animal.

En outre, une protéine constituant un canal ionique neuronal hTRAAK peut tre aussi utile pour la fabrication de médicaments destinés à traiter ou prévenir des pathologies impliquant ces canaux. L'invention concerne donc aussi les compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif au moins une de ces protéines éventuellement associée à un véhicule physiologiquement acceptable.

De mme, les molécules d'acide nucléique de l'invention ou les cellules transformées par ladite molécule sont donc susceptibles d'tre utilisées dans des stratégies de thérapie génique afin de compenser une déficience des canaux hTRAAK au niveau de un ou plusieurs tissus d'un patient. L'invention concerne donc aussi un médicament comprenant des molécules d'acide nucléique de l'invention ou de cellules transformées par lesdites molécules pour le traitement de pathologie impliquant les canaux hTRAAK et leurs dérivés.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent rapportant le travail de recherche ayant mené à l'identification et à la caractérisation de ces canaux potassium mécanosensibles activés par les acides gras et où il sera fait référence aux séquences et dessins en annexe dans lesquels : -La figure 1A montre la topologie de hTRAAK.

La figure 1B et SEQ ID NO : 1 représentent la séquence nucléotidique de l'ADNc de hTRAAK, la figure 1B et SEQ ID NO : 2 représentent la séquence en acides aminés de la séquence codante.

-la figure 2 représente l'idiograme des bandes G du chromosome llq humain et la localisation du gène hTRAAK par rapport aux marqueurs localisés dans un panel Genebridge 4 RH.

-la figure 3 représente l'analyse par RT-PCR de la distribution de hTRAAK dans les tissus d'humain adulte.

-la figure 4 montre les propriétés biophysiques de hTRAAK enregistrées par la technique de voltage imposé sur des cellules COS transfectées avec un vecteur exprimant hTRAAK. La figure 4A montre que le courant hTRAAK n'a pas un seuil d'activation voltaique apparent, est indépendant du temps et non-activable. La figure 4B montre la courbe I-V, la pente de la courbe de restriction est 58,6 0,6 mV par changement d'un facteur 10 dans la concentration extérieure en K+ (n=6). La figure 4C montre le changement de sens du courant hTRAAK dans un gradient physiologique (5mM K+ ext. La figure 4D montre les propriétés d'un canal hTRAAK seul.

La figure 5 montre l'effet de l'acide arachidonique (AA) sur le canal hTRAAK exprimé dans des cellules COS transfectées. La figure 5A, montre l'activité du TRAAK humain potentialisée par 10 im d'acide arachidonique (AA) dans la configuration cellules entières (630 + 101 % à 0 mV, n=19). La figure 5B montre 1'effet l'effet de l'acide arachidonique (AA) sur le canal hTRAAK exprimé dans des cellules COS transfectées, lorsque le Na+ extérieur est substitué par du K+ La figure 5C montre le courant induit par AA observé dans une configuration outside-out. La figure 5D montre le courant enregistré pour un canal hTRAAK seul dans une configuration inside-out à- 50mV et 50mV.

I-Identification, structure primaire et distribution tissulaire de hTRAAK.

Les recherches dans les bases ADN en utilisant le programme d'alignement de séquence BLAST (Altschul et al., 1990) ont permis l'identification de séquences humaines restreintes à un contig gnomique simple.

L'analyse de ces séquences a suggéré la présence d'introns et d'exons formant un gène codant un canal K+ à deux pores.

Les oligonucléotides ont été déduits des séquences exons potentielles et utilisés pour amplifier par PCR un fragment d'ADN contenant la phase ouverte de lecture (ORF) correspondante à partir d'ADNc de cerveau. Cette ORF est longue de 1182 nucléotides et code un polypeptide de 393 acides aminés (Fig 1B, SEQ ID NO : 2). Cette protéine est proche du canal TRAAK de la souris avec 82 % d'identité et 88 % d'homologie. Ce niveau d'homologie, ensemble avec la distribution tissulaire et les propriétés fonctionnelles conservées qui sont montrées après, indique que le nouveau canal est un homologue du TRAAK murin. La figure 1B montre

la séquence ADNc du TRAAK et l'organisation gnomique chez 1'homme. L'ORF est composée de six exons. Le segment transmembranaire Ml est codé par 1'exon 1, M2 par l'exon 3, M3 par l'exon 4 et M4 par 1'exon 5. Le second exon code la partie C-terminale de 1'interdomaine M1P1 et le sixième la grande partie C-terminale du canal (Fig 1A et 1B).

Les introns sont courts sauf le premier qui est long de plus de 3,8 Kb (Fig 1B). Un gène codant un autre canal K+ a deux pores de Mammifères, TWIK-1, a déjà été caractérisé (Arrighi et al., 1998). Les organisations de TRAAK et TWIK-1 sont plutôt différentes parce que TWIK-1 contient seulement trois exons séparés par deux larges introns. Cependant, une caractéristique commune entre ces deux gènes est la présence d'un intron dans le premier domaine pore Pl. Le site de 1'intron est entre le premier et le second nucléotides du codon pour le premier résidu glycine de la séquence GYG signature du pore (Arrighi et al., 1998). Un intron dans la mme position est trouvé dans 20 gènes parmi les 36 examinés qui code des canaux K+ à deux pores dans le nématode Caenorhabditis elegans (Wang et al., 1999). La signification de la position conservée de cet intron n'est pas connue, cependant cela vaut la peine de noter que cet intron a été conservé chez les Mammifères où il pourrait éventuellement avoir le mme rôle que chez les nématodes.

L'affectation chromosomique du TRAAK humain a été réalisée par une analyse des panels de radiation hybride. Comme montré sur la Fig. 2, le gène codant hTRAAK se trouve sur le chromosome llq et est télomérique à 5,34 cRays du marqueur WI-1409 (Logarithme du score > 21). Bien que les cartes de radiation hybride ne soient pas liées aux cartes cytogénétiques, la localisation la plus

vraisemblable du gène hTRAAK est llql3. KCNK7 qui contient un canal K+ à deux domaines P a été localisé sur le chromosome llql3 télomérique à 6,4 cRays de WI-1409. Cela suggère que hTRAAK et KCNK7 sont très proches l'un de l'autre (Salinas et al., 1999).

L'expression de hTRAAK dans différents tissus adultes humains a été étudiée par une analyse RT-PCR. Comme montré sur la figure 3, TRAAK est exprimé à des niveaux les plus élevés dans le cerveau et le placenta. Seulement de très faibles signaux ont été obtenus dans les testicules, le petit intestin, la prostate et le rein. hTRAAK n'a pas été détecté dans le placenta de souris (Fink et al., 1998).

La raison de cette contradiction n'est pas connue.

L'hybridation in situ (Fink et al., 1998) et l'immunologiquement (Reyes et al., 2000) ont démontré que le TRAAK de souris est spécifiquement exprimé dans les cellules neuronales. La distribution tissulaire montrée dans la figure 3 suggère que hTRAAK pourrait avoir le mme pattern restreint d'expression chez les humains.

Des expériences électrophysiologiques ont été réalisées dans des cellules COS transfectées de façon transitoire. Le courant hTRAAK n'a pas un seuil d'activation voltaïque apparent, est indépendant du temps et non-activable (fig. 4A). La courbe I-V est rectifiant vers l'extérieur et tumultueuse aux potentiels positive (fig. 4A, B). Dans un gradient physiologique (5mM K+ ext.), Le courant hTRAAK change de sens à la valeur prédite d'équilibre pour le K+ (-87,1 1,2 mV, n=6). Quand le Na+ extérieur est substitué par du K+, le potentiel de changement de sens suit de près la valeur d'équilibre du K+ (fig. 4C). La pente de la courbe de restriction est 58,6 + 0,6 mV par changement d'un facteur 10 dans la concentration

extérieure en K+ (n=6) ce qui est en accord avec l'équation de Nernst pour un canal sélectif pour le K+. Dans un gradient symétrique (155 mM K+ extérieur), la courbe I-V est presque linéaire (fig. 4A, B) et change de sens à 0,8 1,1 mV (n=6). Les propriétés pharmacologiques of hTRAAK ont été étudiées dans la configuration cellules entières. hTRAAK est insensible aux agents bloquants classiques des canaux K+ quinidine (100 Fm), 4AP (3mM), TEA (10 mM), barium (1 mM) et glibenclamide (10 Fm). Il a été montré que certains membres de la famille des canaux K+ à deux domaines P (TREK-1 et TASK-1) étaient ouverts par les anesthésiques généraux volatiles (Patel et al., 1999).

Aussi nous avons recherché 1'effet du chloroforme sur le hTRAAK. L'application de chloroforme (0,8 mM, n=8) n'a pas d'effet sur l'activité du canal. Les propriétés d'un canal seul hTRAAK sont illustrées dans la figure 1D. Au niveau microscopique, le courant du hTRAAK reste rectifiant vers l'extérieur et est caractérisé par un comportement oscillant.

La figure 5A, B montre que l'activité du TRAAK humain, à l'instar du TRAAK de souris (Fink et al., 1998), est potentialisée par 10 Rm d'acide arachidonique (AA) dans la configuration cellules entières (630 101 % à 0 mV, n=19). Cette activation est complètement réversible grâce à un lavage (fig 5A, cartouche). Dans des conditions physiologiques, le courant induit par AA est rectifiant vers l'extérieur et change de sens à 80,6 0,9 mV, n=7 (fig 5A). Lorsque le Na+ extérieur est substitué par du K+, le courant devient linéaire et le potentiel de changement de sens est de-0,6 0,8 mV, n=7 (fig 5B). hTRAAK est également activé par l'acide gras polyinsaturé docosahexaenoate (10 J, M, n=3) mais est insensible aux acides gras saturés myristate, palmitate, stearate, arachinate (10 AM, n=6 à 8). De plus, les dérivés d'AA avec

un alcool ou un méthyl ester substitué sur la fonction carboxylique sont inactifs (n=5). La stimulation par AA de hTRAAK reste alors que le patch est excisé (fig 5C). Le courant induit par AA observé dans une configuration outside out est rectifiant vers l'extérieur et change de sens au potentiel reverse de K+ (fig 5C, cartouche). Nous avons démontré que les canaux K+ à deux domaines P activés par les acides gras polyinsaturés (mTREK-1 et MTRAAK) sont des canaux K+ mécanosensibles. En effet, l'ouverture du canal est médiée par une déformation de la membrane (Maingret et al., 1999a ; Patel et al., 1998). La figure 5D illustre la sensibilité mécanique de hTRAAK. Dans la configuration patch à 1'envers, l'activité du canal est presque absent à la pression atmosphérique. L'application de pression négative ouvre les canaux de façon dose- dépendante. Pris ensemble, ces résultats démontrent que le TRAAK humain partage les mmes propriétés biophysiques et pharmacologiques que son homologue de souris (Fink et ;, 1998 ; Maingret et al., 1999a ; Patel et al., 1999).

II-Clonage de l'ADNc hTRAAK.

Les séquences de canaux K+ à deux domaines P ont été utilisées pour rechercher des homologues dans les bases de données publiques d'ADN en utilisant le programme BLAST (Altschul et al., 1990). Cela a permis l'identification d'une séquence gnomique (numéro d'accession Genbank AC005848) qui présente des similarités significatives avec le TRAAK de souris. Deux oligonucléotides ont été choisis à partir de cette séquence gnomique correspondant aux séquences équivalentes flanquant le premier codon d'initiation et le codon stop du mTRAAK : brin sens : 5'-AGAATTCGCGCCATGCGCAGCACCACG-3' (SEQ ID NO : 3) et brin anti-sens : 5'- TTTCTCGAGGCCCGGCCAGGGATCCTG-3' (SEQ ID NO : 4) introduisant

les sites de restriction EcoRI et XhoI respectivement. La séquence codant entière a été amplifiée à partir d'ADNc de cerveau humain par PCR en utilisant ces amorces et une ADN polymérase à faible taux d'erreur puis sousclonée dans un vecteur pIRES-CD8 pour donner pIRES-CD8. hTRAAK. Des inserts à partir d'expériences de PCR-ligation indépendantes ont été séquences sur les deux brins et trouvés identiques.

III-Cartographie chromosomique Le panel d'ADN 4 RH de Genebridge (Research Genetics) a été trié par PCR en utilisant des amorces déduits à partir de l'intro 5 (amorce sens : 5'- ACCCAGTGGAGGAGCCCTTC-3') (SEQ ID NO : 5) et de 1'exon 6 (amorce antisens : 5'-GAGGCCCGGCCAGGGATCCTG-3') (SEQ ID NO : 6). Les conditions de PCR sont 39 cycles de 30s à 94°C, 30s à 55°C et 30s à 72°C. Les produits de PCR ont été séparés par une électrophorèse sur agarose puis transférés sur des membranes de nylon chargées. Les blots ont été analysés avec un oligonucléotide marqué au P32 5'- CCAGGCTGCCAGCTGGACTG-3' (SEQ ID NO : 7). Les résultats ont été analysés en utilisant le programme RH-MAPPER à l'Institut Whitehead.

IV-Expériences de RT-PCR.

De l'ADNc de plusieurs types tissulaires (Clontech) ont été utilisés comme patron selon le protocole du fournisseur. Les séquences des amorces étaient pour l'amorce sens : 5'-CTCAGTGCTCACCACCATCG-3' (SEQ ID NO : 8).

(exon 5) et pour l'amorce antisens : 5'- GAGGCCCGGCCAGGGATCCTG-3' (SEQ ID NO : 9). (exon 6). Les conditions de PCR sont 34 cycles de 30s à 94°C, 30s à 55°C et 1 min à 72°C. Les produits de PCR ont été séparés, transférés et analysés comme décrit pour la cartographie chromosomique.

V-Culture cellulaire et transfection.

Les cellules COS-7 ont été maintenues dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco complété avec 10 % de sérum foetal bovin. Le plasmide pIRES-cD8-hTRAAK a été transfecté en utilisant le procédé classique DEAE dextrane.

Les cellules positives ont été visualisées 48 h après transfection en utilisant la méthode des billes recouvertes par l'anticorps anti-CD8 (Maingret et al., 1999a ; Maingret et al., 1999b).

VI-Electrophysiologie Pour les expériences sur cellules entières et outside-out, la solution de la pipette (INT) contenait 150 mM KC1, 3 mM MgCl2,5 mM EGTA et 10 mM HEPES, pH 7,2 ajusté avec KOH. La solution de bain (EXT) contenait 150 mM NaCl, 5 mM KC1, 3 mM MgCl2,1 mM CaCl2 et 10 mM HEPES, pH 7,4 ajusté avec NaOH. Pour les expériences inside-out, la solution dans la pipette était EXT et la solution de bain était INT. La solution EXT riche en K+ contenait 150 mM KC1 au lieu de 150 mM NaCl. Pour étudier la sélectivité des ions, les relations entre le courant et le voltage ont été obtenues à différentes concentrations K+ ext. Pour chaque concentration, NaCl a été substitué dans la solution EXT par du KC1 équimolaire.

Tous les produits ont été obtenus de Sigma. Les acides gras ont été dissous dans de l'éthanol à la concentration de 100 mM, mis sous argon et conservés à -20°C pendant une semaine. La stimulation mécanique a été appliquée par un système générant la pression en boucle ouverte et contrôlée au niveau de la pipette durant l'expérience par un senseur de pression calibré.

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