En general, la presente invención se refiere a una composición fertilizante que incluye iones metálicos complejados con aminoácidos para mejorar la solubilización del fósforo por parte de los microorganismos presentes en el suelo, facilitando con ello la absorción del fósforo por parte de las plantas. Más concretamente, la invención proporciona una composición fertilizante que incluye iones metálicos divalentes de cobre, hierro y manganeso complejados con aminoácidos (aminoatos de cobre, hierro y manganeso) para mejorar la capacidad de los microorganismos presentes en el suelo de solubilizar el fósforo, denominados habitualmente microrganismos solubilizadores de fósforo y, con ello, aumentar la cantidad de fósforo asimilable por las plantas en el suelo, mejorando con ello su crecimiento o desarrollo.

Esta composición fertilizante, por tanto, facilita no sólo el desarrollo y crecimiento de las plantas, sino también constituye un tratamiento para los suelos, más concretamente para los microorganismos presentes en ellos, permitiendo igualmente combatir el problema de la acumulación de fósforo en los suelos y disminuyendo la necesidad de fertilizarlos con fósforo.

El fósforo es uno de los elementos químicos esenciales para la vida, tanto para animales como para las plantas, ya que forma parte de los ácidos nucleicos, del ATP y de otras moléculas que incluyen el ion fosfato en su estructura y que almacenan energía, por ejemplo los fosfolípidos. Su reserva fundamental en la naturaleza es la corteza terrestre. En general, los suelos agrícolas contienen buenas reservas de fósforo como consecuencia de la aplicación regular de fertilizantes, pero su disponibilidad para la planta es escasa debido a los procesos químicos que "fijan" el fósforo soluble de los fertilizantes en formas insolubles no aptas para la nutrición vegetal, por ejemplo la formación de fosfatos de calcio en suelos alcalinos y de fosfatos de hierro y aluminio en suelos ácidos (Sanyal, S. K. y De Data, S. K. Chemistry of phosphorus transformation in soil. Adv Soil Sci 16: pp. 1 -120, 1991 ). El fósforo se encuentra en los suelos tanto en formas orgánicas como inorgánicas. Las plantas absorben el fósforo casi exclusivamente en la forma soluble, representadas por aniones fosfatos, generalmente HP0 ₄ ^"2 Y H ₂ P0 ₄ ^"1 . Las concentraciones de estos aniones en solución se encuentran alrededor de 1 y 10 μΜ en equilibrio con la fase sólida del suelo. De esta manera, el fósforo inorgánico disuelto satisface la demanda de los cultivos por unas pocas horas durante el período de crecimiento (Richardson, A. E., Soil microorganisms and phosphorous availability. En Soil biota: management in sustainable farming systems. Eds. C E Pankhurst, B M Doube, WSR Gupta; pp. 50-62. CSIRO, Victoria, Australia, 1994), considerando que estas cantidades son extremadamente pequeñas en comparación con las necesarias para los procesos biológicos asociados al crecimiento óptimo de las plantas.

Por ello, el fósforo es uno de los fertilizantes químicos más aplicados en los suelos, principalmente en forma de fósforo inorgánico. Sin embargo, este fósforo es transformado en fósforo insoluble, de forma que es imposible que sea absorbido por las plantas.

Existen ciertos microorganismos, denominados microorganismos solubilizadores de fosfato o MSP, involucrados en la transformación del fósforo del suelo y son componentes integrales del ciclo del fósforo. Estos microorganismos participan en la solubilización del fósforo inorgánico, la mineralización del fosfato orgánico, así como en su inmovilización.

Los microorganismos solubilizadores de fosfato constituyen hasta un 40% de la población de bacterias del suelo y una porción significativa de ellos son aislados de la rizosfera (Kucey, R. M. N. Phosphate-solubilizing bacteria and fungi in various cultivated and virgin Alberta soil. Canadian Journal of Soil Science 63: pp. 671 -678, 198314).

La solubilización de fósforo mineral es un proceso relacionado fundamentalmente con la producción y liberación de ácidos orgánicos de bajo peso molecular por parte de estos microorganismos solubilizadores de fosfato del suelo, dentro de este grupo se encuentran las bacterias solubilizadoras de fosfato, que son de vida libre en el suelo y son capaces de adaptarse, colonizar y persistir en la rizosfera de la planta y favorecer su crecimiento o desarrollo. Estos microorganismos, son capaces de solubilizar el fosfato inorgánico de diferentes compuestos, como son el fosfato bicálcico, fosfato tricálcico y rocas fosfóricas (lllmer, P. and F. Schinner. 1995. Solubilization of inorganic calcium phosphates solubilization mechanisms. Soil Biol. Biochem. 27: 257-263).

Existen 13 géneros de bacterias con la capacidad de solubilizar fosfato: Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium, Micrococcus, Aerobacter, Flavobacterium, Mesorhizobium, Azotobacter, Azospirillum y Erwinia (Sperber, 1958b; Goldstein, 1986; Rodríguez y Fraga, 1999).

En diferentes estudios (véase por ejemplo Banik S, Dey BK, Available phosphate contení of an alluvial soil is influenced by inoculation of some isolated phosphate- solubilizing microorganisms, Plant Soil 1982;69:353-64) se atribuye la capacidad de solubilización de fósforo de estos microorganismos a la producción de ácidos orgánicos, siendo el más significativo, el ácido glucónico, seguido del ácido 2- cetoglucónico, ácido láctico, ácido acético, ácido isovalérico o el ácido isobutílico entre otros. El ácido glucónico es producido principalmente por Pseudomonas sp. (lllmer y Shinner, 1992), Erwinia herbicola (Liu et al., 1992), Pseudomonas cepacia (Goldstein et al., 1993) y Burkholderia cepacia (Rodríguez y Fraga 1999; Lin, et al., 2006; Song et al., 2008).

El ácido glucónico, principal ácido orgánico producido por los microorganismos solubilizadores de fosfato y que es capaz de solubilizar el fosforo, se produce a partir de la siguiente reacción, catalizada por la enzima glucosa oxidasa:

Glucosa + O2 + H ₂ 0 Glucosa ^ Ácido glucónico + H2O2

La enzima glucosa-oxidasa (Gox) es una oxido-reductasa que cataliza la oxidación de la glucosa, reduciendo el oxígeno a peróxido de hidrógeno. La glucosa-oxidasa cataliza la oxidación de β-D-glucosa en D-glucono-1 ,5-lactona, que es hidrolizada a ácido glucónico. Para actuar como catalizador, la GOx requiere un cofactor, el flavín adenín dinucleótido (FAD), un componente común en las reacciones de oxidorreducción biológicas. En la reacción redox catalizada por la GOx, el FAD actúa como el aceptor inicial de electrones y es reducido a FADH ₂ . Después el FADH ₂ es oxidado por oxígeno molecular (O2) que desempeña el papel de aceptor final de electrones. El oxígeno es capaz de ello debido a que tiene un potencial de reducción mayor. Como consecuencia el O2 es reducido a peróxido de hidrógeno (H2O2). Se trata de una flavoproteína que contiene FAD, y es altamente específica para D-glucosa.

Con el fin de mejorar la actividad catalítica de estas enzimas, y con ello de mejorar la producción de ácido glucónico, algunas enzimas necesitan de la presencia de componentes adicionales, conocidos como cofactores, que en general pueden ser iones inorgánicos, coenzimas y/o grupos prostéticos. En el caso de los iones metálicos inorgánicos, éstos pueden ser parte integral de la estructura de la enzima o pueden asociarse con el sustrato, ayudando a la unión con la enzima y aumentando la actividad catalítica.

Así, en la composición fertilizante objeto de invención se adicionan iones metálicos con el fin de mejorar la actividad catalítica de estas enzimas que catalizan la formación de los ácidos orgánicos secretados por los microorganismos solubilizadores de fosfato anteriormente mencionados, principalmente del ácido glucónico.

De la técnica anterior son conocidas composiciones fertilizantes que favorecen la asimilación de iones metálicos por parte de las plantas. Por ejemplo en la EP2171 105B1 , "Metal component absorption enhancer for plant" se describe el uso de ácido 5-aminolevulínico para mejorar la absorción por parte de las plantas de un elemento metálico seleccionado de entre los grupos 2 a 12 del tercer o cuarto periodo de la Tabla Periódica de los Elementos. Igualmente, la US5504055A describe un método para preparar quelatos metálicos de aminoácidos de fácil asimilación por parte de las plantas.

El objeto de la presente invención es proporcionar una composición fertilizante que incluye iones metálicos complejados con aminoácidos para mejorar la solubilización del fósforo por parte de los microorganismos presentes en el suelo, basándose este aumento de la presencia de fósforo, en particular de fósforo inorgánico soluble, en promover o mejorar la actividad catalítica de estas enzimas que catalizan la formación de los ácidos orgánicos secretados por los microorganismos solubilizadores de fosfato presentes en los suelos anteriormente mencionados, principalmente de ácido glucónico.

En la fig. 1 se muestra un gráfico de amplificación PCR obtenido con un sistema de detección con SYBR Green, así como las curvas de emisión de fluorescencia que correlaciona a cada uno de los ciclos con la evolución de microorganismos en el tiempo, se muestran las curvas de ensayo a tiempo final (control (2) y muestra de la invención (1 )) y las curvas a tiempo inicial (control (4) y muestra con fertilizante (3)). Para evitar falsos positivos se incluyen dos muestras control negativo (5) y (6). Cada uno de los ensayos fue realizado por duplicado.

En la fig. 2 se muestra la evolución del fósforo soluble disponible para las plantas aumenta considerablemente en el tiempo de la composición fertilizante de la invención en comparación con un control de fertilizante fosfatado y con una composición que contiene los iones sin complejar con aminoácidos.

En la presente invención, el término "composición fertilizante" se refiere a cualquier composición orgánica o inorgánica, natural o sintética, que aporte a las plantas uno o varios de los elementos nutritivos indispensables para su desarrollo vegetativo normal, habitualmente macroelementos primarios (N, P, K), macroelementos secundarios (Ca, Mg, S) así como microelementos (B, Cl, Co, CU, Fe, Mn, Mo y Zn). Así el término "composición fertilizante" abarca en particular fertilizantes minerales simples (contenido en uno solo de los macroelementos siguientes: nitrógeno, fósforo o potasio) y complejos (contenido en más de uno de los macroelementos siguientes: nitrógeno, fósforo o potasio), fertilizantes orgánicos, órgano-minerales, etc., tales como, fertilizantes P, fertilizantes K, fertilizantes N, fertilizantes NP, fertilizantes PK, fertilizantes NK o fertilizantes NPK.

La composición fertilizante incluye iones metálicos divalentes de cobre, hierro y manganeso (Cu ²⁺ , Fe ²⁺ y Mn ²⁺ ) complejados con aminoácidos para mejorar la solubilización del fósforo por parte de los microorganismos presentes en el suelo, basándose este aumento de la presencia de fósforo soluble en los suelos, en particular de fósforo inorgánico, en promover o mejorar la actividad catalítica de estas enzimas que catalizan la formación de los ácidos orgánicos secretados por los microorganismos solubilizadores de fosfato, tales como aquellos de los géneros Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium, Micrococcus, Aerobacter, Flavobacterium, Mesorhizobium, Azotobacter, Azospinllum y Erwinia anteriormente mencionados, principalmente de ácido glucónico. El uso de aminoácidos como agente complejante se debe no sólo a que se trata de sustancias con elevada capacidad complejante, sino a que se trata de sustancias naturales que no afectan al desarrollo de los microorganismos, siendo además considerados abonos especiales por su acción sobre la fisiología de la planta. Así, los aminoácidos constituyen un agente complejante de origen natural y, por tanto, totalmente biodegradable.

El procedimiento para la preparación de la composición fertilizante de la invención no es crítico. En un ejemplo de realización, dicha composición se prepara añadiendo en primer lugar diferentes cantidades de los cationes Cu ²⁺ , Fe ²⁺ y Mn ²⁺ , tales como las indicadas posteriormente, a una disolución de aminoácidos. Tras comprobar que se ha producido la complejación de estos elementos, la solución obtenida se añade sobre una composición fertilizante del tipo citado anteriormente, esto es de tipo N, P, K, NP, NK, PK o NPK, sea esta última sólida o líquida.

La composición fertilizante incluye los iones metálicos divalentes de cobre, hierro y manganeso complejados con aminoácidos en una concentración del 0,01 al 9,00% m/m (porcentaje en masa) con respecto al total de la composición fertilizante. En una realización preferente, las concentraciones finales de cada uno de los iones metálicos en forma complejada con respecto al fertilizante se muestran en la siguiente tabla:

Iones metálicos Concentración

(en m/m con respecto al total de la

composición fertilizante)

0,01 % - 3%

Se realizó un ensayo para estudiar de evolución de los microorganismos capaces de solubilizar fósforo mediante cuantificacion por PCR en tiempo real. Para ello se emplearon los cebadores correspondientes para detectar microorganismos capaces de producir la enzima glucosa-oxidasa (de los géneros Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium, Micrococcus, Aerobacter, Flavobacterium, Mesorhizobium, Azotobacter, Azospirillum y Erwinia), enzima que cataliza la reacción de producción de ácido glucónico.

Así, se preparó un medio de cultivo incluyendo dichos microorganismos con exceso en azúcar con el fin de eliminar la fuente de carbono como factor limitante del desarrollo de los microorganismos. A continuación, se prepararon dos muestras de cultivo, uno al que se adicionaron los iones metálicos divalentes de hierro, manganeso y cobre complejados con aminoácidos y otra de control conteniendo sólo los microorganismos. Ambas muestras de cultivo de cultivaron separadamente en una cámara de cultivo a temperatura y agitación regulada. Finalmente se realizó un ensayo PCRq para detectar cualitativamente los microorganismos capaces de generar ácido glucónico. Los ensayos se realizaron por duplicado para evitar falsos resultados. En la Fig. 1 se muestran las curvas de emisión de fluorescencia que correlaciona a cada uno de los ciclos, donde dicha emisión es proporcional a la cantidad de ADN específico de la enzima en cada una de las muestras ensayadas (con la composición fertilizante y sin ella). Se muestra la evolución del número de microorganismos en estudio en función del tiempo.

Como se observa en esta figura 1 , se alcanza una mayor fluorescencia a un número menor de ciclos para la fracción del ADN diana de la enzima glucosa- oxidasa, lo cual indica que la composición fertilizante objeto de la invención favorece el crecimiento de los microorganismos capaces de producir dicha enzima. En la tabla siguiente se indican los resultados en tiempo de ciclos de cada una de las curvas de amplificación de las muestras (sistema de detección con SYBR Green).

Tabla 1

Ct a lo largo del tiempo

Tiempo inicial (Oh) Tiempo final (144h)

Control 37,91 37,28 34,71 34,47

Muestra con Cu ²⁺ , Fe ²⁺ y Mn ²⁺ 38,28 38,67 21 ,95 22,41 complejados con aminoácidos

Ambas muestras de cultivo se añadieron a un fertilizante fosfatado con el fin de medir la variación del contenido de fósforo soluble con el tiempo. Con fines comparativos, también se evaluó la acción de los iones divalentes sin complejar con aminoácidos, esto solo con el fertilizante fosfatado. Los rangos de concentraciones (% en masa con respecto a la masa de la composición fertilizante total) empleados se muestran en la siguiente tabla 2.

Tabla 2

Control Fertl izante fosfatado

Fertl izante fosfatado

Cu ²⁺

0,2% m/m

M1

Mn ²⁺

0,8% m/m

Fe ²⁺

0,2% m/m

Fertl izante fosfatado

Cu ²⁺ complejado con aminoácidos

M2 0,2% m/m

Mn ²⁺ complejado con aminoácidos

0,8% m/m Fe^ complejado con aminoácidos

0,2% m/m

En la fig. 2 se muestran los resultados obtenidos. Como puede observarse en esta figura, el porcentaje de fósforo soluble disponible para las plantas aumenta considerablemente con respecto al control de fertilizante fosfatado, ascendiendo a casi el doble, y a una composición que contiene los iones sin complejar con aminoácidos en aproximadamente un 60%.