La presente invención se refiere a un suplemento alimenticio para animales, a su procedimiento de obtención, así como a su uso en la alimentación animal, encontrando su aplicación en el campo de la nutrición animal, por ejemplo como suplemento líquido a administrar con el agua de bebida de los animales o mezclado con la comida, para promover la función del sistema circulatorio y prevenir lesiones vasculares en tejidos musculares.

Más concretamente, la invención proporciona un suplemento alimenticio para animales basado en un extracto crudo de ajo (Allium sativum) estabilizado en solución acética con un alto contenido en aliína y libre de alicina. Así, en el suplemento alimenticio de la invención no se producen las reacciones enzimáticas naturales del sistema aliína-aliínasa, que dan como resultado alicina, por lo que, una vez administrado el suplemento al animal, asegura la biodisponibilidad (concentraciones plasmáticas dosis-dependientes) de S-alilcisteína y aliína. Al mismo tiempo, modifica el metabolismo de los compuestos azufrados en el organismo, regulando los niveles de S-metil-L-cisteína y la conversión (biosíntesis) de la aliína a alicina en el plasma sanguíneo. Sus efectos a este nivel, se traducen en una reducción de alteraciones por petequias, hemorragias o sufusiones en las pechugas de las aves suplementadas.

La invención también tiene como objeto el procedimiento de obtención del suplemento alimenticio basado en un extracto crudo de Allium sativum estabilizado en solución acética con un alto contenido en aliína y libre de alicina, así como el uso de dicho suplemento para y en la nutrición animal.

La aliína (S-alilcisteína sulfóxido) es el compuesto azufrado más abundante en el ajo, que puede alcanzar concentraciones de 7 a 14 mg/g en fresco (de 18 a 42 mg/g del peso seco). Es inodora y estable en soluciones acuosas y a temperaturas elevadas (A. Stoll, E. Seebeck, Chemical investigation on alliin, the specie pinciple of garlic, Adv. Enzymol. 11 (1951 ) 377 ^A 400). Se encuentra en el citoplasma de las células, separada físicamente de la enzima aliinasa (C-S liasa) que se localiza en vacuolas (Kuettner EB, Hilgenfeld R, Weiss MS (2002). Purification, characterization, and crystallization of alliinase from garlic. Arch Biochem. Biophys. 402: 192-200) y que cataliza su transformación en ácido pirúvico, amoniaco y ácido alil-sulfénico cuando se rompe la estructura celular, al fracturar, cortar o machacar el bulbo.

La aliinasa constituye aproximadamente el 11 % del material proteico soluble del ajo. En contacto con el aire, puede catalizar la transformación de la aliína en menos de diez segundos (LD Lawson, ZJ Wang (2005) Allicin and Allicin-Derived Garlic Compounds Increase Breath Acetone through Allyl Methyl Sulfide: Use in Measuring Allicin Bioavailability J. Aghc. Food Chem. 53, 6, 1974-1983), aunque esta actividad enzimática suele demorarse entre 0,2 y 0,5 minutos, condicionada por las condiciones del medio: requiere temperaturas templadas (35°C a 47°C) y rangos de pH neutros o alcalinos (de 4,5 a 9). El calor (a partir de los 42°C) afecta negativamente a su función y a su estructura (a 60°C), y en medios muy ácidos (pH de 1 ,5 a 3) se inactiva rápidamente y de forma irreversible (Krest, I; Glodek, J; Keusgen, M (2000) Cysteine sulfoxides and alliinase activity of some Allium species Journal of Agricultural and Food Chemistry 48 (8), 3753-3760).

Tras la transformación enzimática de la aliína, el ácido alil-sulfénico resultante (que es inestable y muy reactivo a temperatura ambiente) se transforma, por condensación de dos moléculas, en agua y alicina (dialil-tiosulfinato) (Dusica P. Ilió , Vesna D. Nikolic, Ljubisa B. Nikolic, Mihajlo Z. Stankovió, Ljiljana P. Stanojevió, Milorad D. Cakió (2011) ALLICIN AND RELATED COMPOUNDS: BIOSYNTHESIS, SYNTHESIS AND PHARMACOLOGICAL ACTIVITY. FACTA UNIVERSITATIS. Series: Physics, Chemistry and Technology Vol. 9, No 1 , 2011 , pp. 9 - 20). Este alil-tiosulfinato es una especie de azufre reactiva, con propiedades oxidativas de grupos -tiol, como glutatión y cisteína (Rabinkov A, T Miron, L Konstantinovski, M Wilchek, D Mirelman, L Weiner (1998). The mode of action of allicin: trapping of radicals and interaction with thiol containing proteins. Biochim Biophys Acta; 1379(2):233-44), que pueden inducir cambios (por formación de enlaces disulfuro) en las estructuras de proteínas sensibles a estas reacciones REDOX (Gruhlke, M.C.H.; Slusarenko, A.J. The biology of reactive sulfur species (RSS). Plant Physiol. Biochem. 2012, 59, 98-107) en las que se produce una pérdida o ganancia de función (Buelna-Chontal, M.; Zazueta, C. Redox activation of Nrf2 & NF-KB: A double end sword? Cell Signal. 2013, 25, 2548-2557). A este mecanismo de acción se atribuyen las principales propiedades nutracéuticas de este compuesto, con efectos antitrombótico, hipotensor, antimicrobiano (antiviral, antibactehano y antifúngico), inmunomodulador y anticancerígeno (López Luengo M. T. (2007). El ajo. Propiedades farmacológicas e indicaciones terapéuticas. Ámbito Farmacéutico. Fitoterapia 26, 78-81 ). Sin embargo, su uso con tales objetivos se limita al ámbito de la investigación, por tratarse de un compuesto muy inestable.

Aunque se han estudiado distintos métodos para estabilizar la alicina en soluciones hídricas, ácidas, con solventes (diclorometano, metanol, cloroformo, etanol, acetonitrilo) , por su incorporación en una matriz de gel hidrofóbico, o por formación de complejos con ciclodextrinas, este compuesto se degrada rápidamente en otros tiosulfinatos, como disulfuros (disulfuro de dialilo, alil-metil- disulfuro), polisulfuros (trisulfuro de dialilo, alil-metil-trisulfuro), vinil-ditiínas (2- vinil[4H]-1 ,3-ditiína, 3-vinil[4H]-1 ,2-ditiína) o ajoenos (E,Z), dependiendo de las condiciones ambientales.

En los productos obtenidos a partir de la transformación del ajo crudo, la cantidad y proporción relativa de estos azufrados volátiles es la base de su aroma y propiedades nutracéuticas. Este perfil define su valor fitoquímico y aplicaciones, que se ponen en valor con alegaciones de funcionalidad asociadas a los compuestos que concentran (Cañizares, P., Gracia, I., Gomez, L.A., Martin de Argila, C., de Rafael, L. and Garcia, A. (2002) Optimization of Allium sativum Solvent Extraction for the Inhibition of in Vitro Growth of Helicobacter pylori. Biotechnology Progress, 18, 1227-1232; Turos, E., Revell, K. D., Ramaraju, P., Gergeres, D. A., Greenhalgh, K., Young, A., Sathyanarayan, N., Dickey, S., Lim, D., Alhamadsheh, M. M., & Reynolds, K. (2008). Unsymmethc aryl-alkyl disulfide growth inhibitors of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Bacillus anthracis. Bioorganic & medicinal chemistry, 16(13), 6501-6508; Yamada N, Hatton A, Hayashi T, Nishikawa T, Fukuda H, Fujino T. 2004. Improvement of scopolamine-induced memory impairment by Z-ajoene in the water maze in mice. Pharmacol Biochem Behav.78(4):787-91 ). La composición de cada preparado depende de las condiciones bajo las que se procesa la materia prima vegetal.

Del estado de la técnica son conocidos diversos métodos definidos para incrementar la proporción de tiosulfinatos en el producto final, como son los aceites esenciales y extractos de ajo, que se obtienen por destilación con arrastre de vapor, con disolventes o dióxido de carbono supercrítico (véase por ejemplo los documentos CN1555728A, CN101117053A, CN 1124591 A o CN1818045A). También otros métodos de extracción con solventes orgánicos más complejos, que conllevan la aplicación de ultrasonidos o microondas en combinación (CN101243871 B, CN103436564A).

Frente al enfoque de los procesos tecnológicos dirigidos a obtener esencias líquidas, con un alto contenido en alicina, otros desarrollos se plantean para concentrar aliína y acondicionarla de la forma más estable posible, esto es en una forma sólida, habitualmente como polvo liofilizado. De la CN1203057C se conoce un procedimiento de extracción de aliína a partir de ajo fresco que proporciona un producto con un contenido en aliína superior al 90% en peso. Este procedimiento consiste esencialmente en la destrucción enzimática con microondas, extracción con etanol, concentración de la aliína mediante una resina de intercambio catiónico, desorción de la aliína de la resina con un agua amoniacal, concentración a baja presión con etanol y precipitación a pH entre 5,5 y 6,5 para obtener cristales de aliína.

La presente invención parte de un enfoque muy diferente que tiene como base la extracción de la fracción líquida del bulbo de A. sativum mediante un proceso de expresión en frío y su estabilización en una solución acética acondicionada para evitar la biosíntesis de la alicina, que concentra compuestos sulfurados y derivados de cisteína no volátiles, para su dosificación por vía oral a aves con la intención de asegurar la biodisponibilidad tanto de aliína, como de S-alilcisteína, modular la biosíntesis de alicina en el plasma sanguíneo, y de reducir el nivel oxidativo total a nivel circulatorio.

En un primer aspecto principal, la invención proporciona un suplemento alimenticio basado en un extracto crudo de ajo (Allium sativum) estabilizado en solución acética con un alto contenido en aliína y libre de alicina. Así, se proporciona un suplemento alimenticio en el que se interrumpen las reacciones enzimáticas naturales del sistema aliína-aliínasa, por lo que la biodisponibilidad de la alicina en el plasma sanguíneo se deduce de un mecanismo de síntesis alternativo al descrito en el ajo y que supone la posible capacidad de las aves para presentar una actividad metabólica con resultado similar, que podría deberse a la absorción (a nivel intestinal) y reactivación parcial de las aliinasas que pudiera contener el derivado de ajo ingerido, o utilizar otras enzimas para metabolizar compuestos S-alil (aliína, glutamil-S-alilcisteína, S-alilcisteína, etc.). Sobre estas hipótesis, que se han propuesto a partir de investigaciones científicas desarrolladas en personas y otros modelos animales (ratas), los ejemplos citados posteriormente demuestran que sólo se detectan metabolites de degradación de la alicina en el plasma sanguíneo, por lo que se sugiere una asociación con proteínas que intervienen como factores de la cascada de coagulación de la sangre.

El suplemento alimenticio de la invención tiene un contenido en compuestos azufrados y derivados de la cisteína no volátiles en un rango del 1 al 10% en peso con respecto a la masa total del suplemento de la invención, consistentes en y- glutamil-S-alilcisteína, N-Y-glutamil-S-(1-propen¡l)c¡steína, v-gl ^utam il-S- aliltiocisteína, N-acetil-S-(N-metilcarbamoil) cisteína, y-L-glutamil-S- (2-carbox¡-1- propil)cisteinilglicina, aliína, S-metilcisteína, ácido propano-1-sulfonotioico u sulfóxido de N-acetilmetionina y está libre de alicina, según el siguiente perfil bioquímico:

Preferentemente el contenido en compuestos azufrados y derivados de la cisteína no volátiles es el 5, 1 % de la masa total del suplemento de la invención y según el siguiente perfil bioquímico:

El suplemento de la invención también contiene compuestos azufrados volátiles, que caracterizan su perfil aromático con una composición relativa definida sobre los volátiles totales (100%):

Como se deriva de las tablas anteriores, la concentración de compuestos azufrados derivados de la cisteína es alto, y la composición de azufrados volátiles presentes en el suplemento de la invención similar al del aceite esencial de ajo obtenido por arrastre de vapor, aunque con diferencias significativas como son la ausencia de actividad aliinasa, el predominio del thsulfuro de alilo en el perfil aromático y una mayor proporción de vinil-ditiínas.

Es también objeto de la invención el procedimiento de obtención del suplemento antes descrito, obteniéndose dicho suplemento a partir de bulbos de ajo pelados que i. se someten en primer lugar a un proceso de expresión en frío para obtener la fracción líquida en forma de zumo de ajo, el cual se filtra para eliminar residuos sólidos,

¡i. el zumo de ajo filtrado obtenido en i) se mezcla al 50% con una disolución de los aditivos ácido cítrico (1 a 5%), cisteína (1 % a 2%) y/o ácido glutámico (1% a 2%) en una solución acética diluida, preferentemente vinagre de manzana (c.s.p.), con pH final inferior a 4, iii. la mezcla obtenida en ¡i) se homogeneiza hasta citólisis completa a presiones diferenciales de 100 a 600 bar.

Opcionalmente, a la mezcla de la etapa ¡i) se le pueden añadir aromatizantes.

El procedimiento de la invención permite que se liberen completamente componentes azufrados (derivados de la cisteína) intracelulares del ajo y evita que reaccionen de forma natural por interrupción del sistema enzimático aliína- aliínasa, de forma que la reacción de transformación de la aliína en alicina no se produzca en el producto ni en el alimento suministrado (agua o pienso). En una forma de realización preferente del procedimiento de la invención, el suplemento de la invención presenta la siguiente composición: 50% en peso de zumo de ajo, 50% en peso de solución acética de cisteína, ácido glutámico, ácido cítrico y opcionalmente aromatizantes.

También en una realización preferente, la solución acética de cisteína, ácido glutámico, ácido cítrico y opcionalmente aromatizantes se obtiene utilizando vinagre de manzana como disolvente.

Otro objeto de la invención es el uso del suplemento antes descrito en la alimentación animal, por ejemplo mezclado con el agua de bebida en concentraciones del 0,2 al 2%.

Por otra parte, los inventores han encontrado que la administración del suplemento alimenticio de la invención a pollos en el agua de bebida produce un significativo descenso del pH, que inicialmente no afecta a su consumo de agua, pero que lo estimula significativamente a partir de los 3 días de aplicación, teniendo también efecto sobre la calidad de pechugas, biodisponibilidad y parámetros de coagulación, así como un efecto aditivo o complementario al de los flavonoides aportados en pienso.

También se ha encontrado que la administración del suplemento alimenticio de la invención a pollos en el agua de bebida a altas concentraciones (2%) durante los últimos tres días de vida de los pollos no altera su aroma ni sabor (no modifica el perfil de componentes azufrados de sus músculos ni grasas), pero incrementa (con una relación dosis-dependiente) las concentraciones de S-alil-cisteína en sus sueros, plasmas, hígados y riñones, junto con crecientes niveles de aliína en suero y de alicina en los respectivos plasmas. Este hallazgo (detección de alicina en plasma) permite demostrar que existe una actividad enzimática similar a la de la aliínasa en este fluido sanguíneo; posiblemente basada en la acción del complejo protrombinasa.

Los análisis de la actividad hemostática de sueros de pollos a los que se administra el suplemento de la invención no indican una asociación significativa con la modificación de resultados de parámetros asociados a factores de la cascada de la coagulación. En este sentido, el importante esfuerzo desarrollado para encontrar un método adecuado (Tiempo de Protrombina Parcial Activado) que se adaptó exprofeso con un tejido aviar homólogo (cerebro liofilizado de pollo) para reducir la elevada variabilidad individual (comprobada en los procedimientos descritos con reactivos comerciales de otras especies), no se tradujo en resultados significativos. Sin embargo, las tendencias en otros parámetros medidos (tiempo de sangrado) que pueden estar sujetos a discusión metodológica (falta de estándar), sugieren un posible efecto antiagregante de trombocitos o fibrinolítico. Otras evaluaciones adicionales, realizadas para contrastar otros posibles efectos descritos de los componentes detectados en sangre sólo han destacado un efecto significativo en el suero: reducción del estado oxidativo total (TOS), cuyo mecanismo de acción es distinto del de otros compuestos antioxidantes (flavonoides).

En cuanto a la calidad de la carne, la administración del suplemento alimenticio de la invención a pollos en el agua de bebida a altas concentraciones (2%) durante los últimos tres días de vida de los pollos se traduce en una reducción muy significativa del porcentaje de pechugas afectadas por lesiones vasculares (petequias, hemorragias, o sufusiones) y, por tanto, aumenta su valor comercial final. Además, no afecta a las propiedades visuales de estos músculos y puede optimizar los resultados conseguidos con otros antioxidantes (flavonoides) en términos ópticos que se mantienen a largo plazo en bandeja gracias a una menor oxidación de la carne.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ¡lustran la presente invención.

1. Valor nutricional del suplemento alimenticio de la invención

Desde el punto de vista nutricional, el suplemento de la invención tiene los siguientes componentes mostrados en la Tabla 1 y los valores nutricionales indicados en la Tabla 2:

Tabla 1

Tabla 2

Cuando se suministra el suplemento de la invención con el agua de bebida del animal, en concentraciones del 0,2 al 2%, el suplemento alimenticio de la invención destaca por incluir una diversidad relevante de aminoácidos, especialmente de cisteína, en rangos de composición variables (del 3 al 10%), acompañada de arginina en un 2,78% que, a dosis de uso, supone un 0,08% de las necesidades de este componente en la alimentación de pollos en la fase de crecimiento, por ejemplo. Además, presenta porcentajes interesantes de ácido glutámico (2,36%) y ácido aspártico (1 ,34%). Por otro lado son relevantes las aportaciones de hierro (13 mg), que suponen un aporte del 3% de las necesidades de pollos en crecimiento y del 1 ,5% en pollos de cebo y gallinas en puesta; de Selenio (26 pg), que son un 2,4% de las necesidades de pollos en crecimiento, cebo y gallinas de puesta. Los aportes de sodio (136 mg) suponen el 0,84% de las necesidades de cebo y crecimiento. Por último, también se deben considerar los aportes vitamínicos más relevantes: Tiamina '-Vit. B1- (0,23 mg), que suponen el 1 ,6% de las necesidades de este microelemento para pollos en crecimiento, el 1 ,18% para pollos en la fase de cebo y el 2,62% para gallinas en el periodo de puesta. Los aportes de Niacina -Vit. B2- (1 ,5 mg) son también relevantes, al aportar el 1 ,26% de las necesidades de pollos en crecimiento, el 0,5% de pollos en fase de cebo. Por último, los aportes de Tocoferol -Vit. E- (0,5 mg) representan el 0,84% de las necesidades de los pollos en crecimiento, cebo y para las gallinas en periodo de puesta.

Administrado el suplemento de la invención en rumiantes con el agua de bebida al 1 %, son relevantes las aportaciones de cobalto (13 pg), que suponen un aporte del 12,03% de las necesidades de corderos en la fase de cebo y del 100% de las necesidades de ovejas en mantenimiento. También de sodio (136 mg), que pueden llegar a cubrir (a dosis máximas recomendadas) hasta el 7% de las necesidades de corderos en fase de crecimiento y cebo. Este elemento puede cubrir el 1 ,79% de las necesidades de las ovejas en mantenimiento, y el selenio (26 pg) supone un 2,4% de las necesidades de corderos en crecimiento - cebo, y el 0,41 % de las de ovejas en mantenimiento. Por último, los aportes de hierro (13 mg) pueden llegar a satisfacer el 2,4% de las necesidades de los corderos de crecimiento - cebo, y el 0,3% de las de ovejas en fase de mantenimiento.

2. Estudio bioquímico del suplemento alimenticio de la invención (presente en el agua de bebida)

En este estudio se realizan análisis bioquímicos para comprobar la estabilidad de metabolites azufrados del suplemento de la invención aplicado en agua de bebida destinada a todo tipo de animales.

Para el desarrollo de estos estudios se definieron técnicas específicas para definir y comparar el perfil químico de compuestos azufrados (volátiles y no volátiles) derivados de la cisteína en en agua suplementada el suplemento de la invención añadido al 0,5%, 1% y 2%.

En base a esta metodología fue posible descartar la biosíntesis de alicina antes de la administración del suplemento de la invención a los animales, corroborando la hipótesis planteada en relación a la inactivación del sistema aliínia-aliinasa de este compuesto.

Resultados Como resultado de los análisis indicados se obtuvo el siguiente perfil de componentes para el suplemento de la invención diluido en agua (0,5 - 2%):

Concentración media (mg/l) de compuestos derivados de aliáceas identificados en el agua de bebida conteniendo el suplemento

3. Efecto sobre el pH del agua de bebida, rendimientos productivos y consumo de agua En este estudio se reúnen los pH del agua de bebida consumida por pollos de engorde en instalaciones experimentales en las que se han realizado tres ensayos dirigidos a evaluar el efecto del suplemento de la invención durante los días previos al sacrificio de las aves. - Ensayo 1 : Sobre el agua de bebida, con un pH de 6,77, se dosificó el suplemento de la invención al 0,75% y 1 ,5, y se administró en bebederos de campana durante 7 días.

Resultados En la tabla siguiente se muestra el pH medio medido. Los tratamientos con adición del suplemento de la invención presentaron valores medios de pH inferiores al control negativo (P<0,001 ).

- Ensayo 2: Sobre el agua de bebida, con un pH de 6,62, se dosificó ácido acetil salicílico (0,5 g/l de FEBRICEN; 650 mg de ácido acetilsalicílico /g) o el suplemento de la invención al 0,5%, 1 % y 2% que se administraron en bebederos de jaula durante 3 días.

Resultados

En la tabla siguiente se muestra el pH medio medido. La adición del suplemento disminuyó el pH del agua respecto a los tratamientos que no lo incluían (P<0,001).

Se observó una relación lineal entre la dosis de suplemento y el pH del agua, produciéndose una reducción del pH del agua de 1 ,2 puntos de pH por cada 1% de producto añadido al agua. - Ensayo 3: Sobre el agua de bebida, con un pH de 6,74, se dosificó el suplemento de la invención al 2% y se administró en bebederos de campana durante 3 días.

Resultados

La siguiente tabla muestra el pH medio del agua de bebida, medido para cada uno de los tratamientos testados en el ensayo 3.

La adición del suplemento de la invención disminuyó el pH del agua respecto a los tratamientos que no lo incluían (P<0,0001 ); siendo el promedio del pH del agua de bebida del control negativo de 6,74±0,07 vs. 4,29±0,11 en el agua de bebida con el suplemento al 2%.

4. Efecto sobre el consumo voluntario (agua de bebida con suplemento de la invención)

En este estudio se recopilan los resultados de tres ensayos dirigidos a evaluar el efecto del suplemento de la invención durante los días previos al sacrificio de las aves en instalaciones experimentales, como ya se ha apuntado en el apartado anterior.

Ensayo 1 : Se realizó para evaluar cuatro tratamientos experimentales (control, suplemento de la invención al 0,75%, suplemento de la invención al 1 %, fórmula alternativa 0,75%) en 3 corrales de 5 animales hembra Ross 5 (60 pollitas con peso medio de 2,9 kg), cada uno, durante 7 días

Resultados

El consumo medio diario de agua por animal no difirió significativamente (P>0,05) entre tratamientos durante los 7 días de administración de los productos diluidos en agua de bebida (a dos dosis) en esta prueba. No se observó rechazo de ninguno de los tratamientos por parte de los pollos.

Respecto al consumo diario de agua, la administración del suplemento de la invención en el agua de bebida no generó ningún tipo de rechazo en el consumo de agua por parte de los animales. Los consumos de agua fueron similares comparados con el control negativo durante los primeros cinco días. A partir del día 6, el control negativo mostró consumos de agua inferiores respecto al tratamiento con 1 ,50% (P=0,028 el día 6; P=0,029 el día 7) y también respecto al tratamiento con 0,75% el día 7 (P<0,001 ).

Ensayo 2: Se realizó para evaluar cinco tratamientos experimentales (control, ácido acetil salicílico, suplemento de la invención al 0,5%, suplemento de la invención al 1 % y suplemento de la invención al 2%) en jaulas de 2 animales macho Ross 308 (80 pollos con peso medio de 2,8 kg), cada uno, durante 3 días

Resultados

No se observaron diferencias significativas entre tratamientos en el promedio del consumo de agua durante la fase de administración del suplemento de la invención

Ensayo 3: Se realizó para evaluar dos tratamientos experimentales en agua de bebida (control y suplemento de la invención al 2%) sobre grupos de aves con cuatro tratamientos con distintos aportes de flavonoides en pienso, repartidos en 8 corrales de 12 animales macho Ross 308 (384 pollos con peso medio de 2,12 kg), cada uno, durante 3 días

Resultados

En cuanto al consumo de agua, la administración del suplemento de la invención disminuyó significativamente (P=0,007) el consumo de agua el primer día de aplicación del mismo, aunque aumentó posteriormente, alcanzando el tercer día el mismo consumo de agua del grupo control negativo. Estos resultados indican que los animales se adaptan progresivamente al agua con el suplemento en un periodo corto (<3 días).

5. Efecto sobre los rendimientos productivos de pollos de engorde

En este estudio se agrupan las conclusiones de los resultados del análisis de los índices productivos estimados en los ensayos 2 y 3, que ya se han presentado en los apartados anteriores, dirigidos a evaluar el efecto del suplemento de la invención durante los días previos al sacrificio de las aves en instalaciones experimentales,

Ensayo 2: Se realizó para evaluar cinco tratamientos experimentales (control, ácido acetil salicílico, suplemento de la invención al 0,5%, suplemento de la invención al 1 % y suplemento de la invención al 2%) en jaulas de 2 animales macho Ross 308 (80 pollos con peso medio de 2,8 kg), cada uno, durante 3 días

Resultados

Respecto al grupo control negativo, la adición del suplemento de la invención al agua de bebida no modificó los parámetros productivos (consumo de agua y pienso ganancia media diaria, peso, e índice de conversión).

Ensayo 3: Se realizó para evaluar dos tratamientos experimentales en agua de bebida (control y suplemento de la invención al 2%) sobre grupos de aves con cuatro tratamientos con distintos aportes de flavonoides en pienso, repartidos en 8 corrales de 12 animales macho Ross 308 (384 pollos con peso medio de 2,12 kg), cada uno, durante 3 días

Resultados

Respecto al grupo control negativo, la adición del suplemento de la invención al agua de bebida alteró los parámetros productivos al comienzo de la aplicación, que repercutió ligeramente (-6%) a la ganancia media diaria estimada para los tres días de aplicación, que repercutió levemente (- 1 %) en el valor global estimado para este índice.

6. Estudio del metabolismo del suplemento alimenticio de la invención en pollos de engorde

En este estudio se resumen los análisis bioquímicos para comprobar la composición, estabilidad y biodisponibilidad de metabolites azufrados del suplemento de la invención en el organismo de los animales empleados en el ensayo 2. A partir de las muestras biológicas de estos pollos se han puesto a punto métodos de identificación de metabolites exógenos relacionados con los principios bioactivos suministrados, con la finalidad de caracterizar la composición de las muestras.

Para ello, se han empleado técnicas cromatográficas, de líquidos y gases, acopladas a espectrometría de masas de alta resolución (LC-MS/MS y GC-MS) con las que se han identificado compuestos azufrados (volátiles y no volátiles) y caracterizado el perfil químico derivado de la cisteína en diferentes tejidos, que han permitido confirmar la biodisponibilidad de S-alilcisteína, ahina, y alicina en muestras obtenidas de sangre de pollos, así como de otros metabolites en diversas matrices biológicas (hígado, riñón, grasa, músculo y heces).

Resultados

Se obtuvo el perfil plasmático de pollos alimentados con el suplemento de la invención, obteniéndose los siguientes resultados:

Se obtuvo también el perfil sérico de pollos alimentados con el suplemento de la invención, obteniéndose los siguientes resultados:

Se obtuvo también la concentración media (mg/kg) de compuestos derivados de aliáceas identificados en hígado, riñón, músculo, grasa y heces de los pollos, con el siguiente resultado:

Como se deriva de los resultados mostrados, las dosis más altas del suplemento de la invención permiten alcanzar mayores concentraciones de compuestos derivados de la cisteína en los tejidos animales. En riñón, hígado y, en menor medida, también en músculo, la S-alilcisteína es el metabolite que mejor refleja el consumo de producto. Por el contrario, las muestras de grasa y heces no proporcionan datos que puedan considerase indicativos del consumo del suplemento de la invención. Para para evaluar su biodisponibilidad y posibles efectos de tipo aliinasa a nivel sanguíneo, resultan clave los compuestos aliína y alicina identificados en las muestras de suero y plasma.

7. Efecto sobre los parámetros bioquímicos y propiedades de coagulación de la sangre de pollos de engorde

En este estudio se sintetizan los análisis bioquímicos para comprobar los efectos derivados de la biodisponibilidad de metabolites azufrados del suplemento de la invención en la bioquímica sanguínea y parámetros de coagulación de los animales empleados en los ensayos 1 y 2, presentados previamente. A partir de las muestras biológicas de estos pollos se han puesto a punto métodos de evaluación de la función hemostática y el estrés oxidativo de pollos de engorde en el momento de su sacrificio:

Ensayo 1 : Se realizaron análisis para evaluar el tiempo de coagulación activado, el tiempo de protrombina (con reactivos comerciales y tejido homólogo de especie) y el tiempo de tromboplastina parcial activado en aves hembra Ross 5 sometidas a cuatro tratamientos experimentales (control, suplemento de la invención al 0,75%, suplemento de la invención al al 1 %, fórmula alternativa 0,75%) a los 3 y 7 días de aplicación

Resultados

Se obtuvo el Tiempo de coagulación activado (s) para cada tratamiento tras 3 y 7 días de administración de pienso complementario en agua de bebida perfil plasmático de pollos alimentados con el suplemento de la invención, obteniéndose los siguientes resultados:

Se obtuvo el Tiempo de protrombina mediante método de cerebro de pollo (s) para cada tratamiento tras 3 y 7 días de administración de suplemento de la invención en agua de bebida, obteniéndose los siguientes resultados:

Tratamiento ¹ Día ²

T1 T2 T3 T4 EEM ³ P-valor 3 7 EEM ³ P-valor

Tiempo 7, 6 7,6 10,0 7,9 1 ,73 0,714 7,5 9,0 1 ,52 0,381 protrombina

¹ N° de réplicas: 15 réplicas/tratamiento

² N° de réplicas: 3 y 12 réplicas/día para los días 3 y 7, respectivamente

³ EEM: Error estándar de la media

T1 : Control negativo (CN); T2: CN + 0,75% suplemento de la invención; T3: CN + 1 ,5% suplemento de la invención; T4: CN + 0,75% Fórmula alternativa

Se obtuvo el Tiempo de protrombina mediante método comercial (s) para cada tratamiento tras 3 y 7 días de administración de pienso complementario en agua de bebida, obteniéndose los siguientes resultados:

Tratamiento ¹ Día ²

T1 T2 T3 T4 EEM ³ P-valor 3 7 EEM ³ P-valor

Tiempo _{1 Q Q 8} protrombina

¹ N° de réplicas: 15 réplicas/tratamiento

² N° de réplicas: 3 y 12 réplicas/día para los días 3 y 7, respectivamente

³ EEM: Error estándar de la media

T1 : Control negativo (CN); T2: CN + 0,75% suplemento de la invención; T3: CN + 1 ,5% suplemento de la invención; T4: CN + 0,75% Fórmula Alternativa Se obtuvo el Tiempo de tromboplastina parcial activado (s) para cada tratamiento tras 3 y 7 días de administración de pienso complementario en agua de bebida, obteniéndose los siguientes resultados:

Tratamiento ¹ Día ²

T1 T2 T3 T4 EEM ³ P-valor 3 7 EEM ³ P-valor

Tiempo tromboplastin 61 ,9 68,5 69,5 46,9 11 ,37 0,478 51 ,1 72,3 10,08 0,067 a

¹ N° de réplicas: 15 réplicas/tratamiento

² N° de réplicas: 3 y 12 réplicas/día para los días 3 y 7, respectivamente

³ EEM: Error estándar de la media

T1 : Control negativo (CN); T2: CN + 0,75% suplemento de la invención; T3: CN + 1 ,5% suplemento de la invención; T4: CN + 0,75% Fórmula alternativa Ensayo 2: Se realizaron análisis para evaluar el tiempo de sangrado, el tiempo de protrombina (con tejido homólogo de especie) y el estado oxidativo total en aves macho Ross 308 sometidas a cinco tratamientos experimentales (control, ácido acetil salicílico, suplemento de la invención al 0,5%, suplemento de la invención al 1 % y suplemento de la invención al 2%) a los 3 días de aplicación

Resultados

Se midió el estado oxidativo total (TOS), y se comprobaron diferencias entre grupos resultaron significativas en un nivel P<0,001. En cuanto a las comparaciones por pares, se apreciaron diferencias entre T5 (suplemento de la invención 2,0%) con respecto a los grupos T1 (control negativo), T2 (control positivo) y T3 (suplemento de la invención 0,5%), todos con un nivel de significación P=0,001.

Igualmente, se midió el nitrato (u óxido nítrico) y se comprobaron diferencias entre grupos significativas en un nivel P<0,001. En cuanto a las comparaciones por pares, se apreció diferencia entre T3 (suplemento de la invención, 0,5%) con T1 (control negativo) y T5 (suplemento de la invención, 2,0%) con un nivel de significación P<0,001 en ambos casos, y con T2 (control positivo) con un nivel de significación P=0,001.

Los resultados se muestran en las figuras 1 y 2 respectivamente.

Los resultados obtenidos con las moléculas antioxidantes (CUPRAC, FRAP, TEAC, Tiol, ácido úrico) y oxidantes (AOPP y FOX) no resaltaron diferencias significativas en los análisis comparativos, como tampoco los análisis de los parámetros de coagulación medidos (tiempo de protrombina (TP), fibhnógeno, dímero-D y tiempo de sangrado). No obstante, se aprecia una tendencia decreciente del tiempo de protrombina con dosis crecientes de suplemento de la invención y, curiosamente el tiempo de sangrado tiende a aumentar en el grupo que recibe la dosis más baja de suplemento de la invención (0,5%).

Por otro lado, no se encontraron diferencias entre grupos en los resultados de los análisis de interleucinas IL-6 e IL-8, aunque sí, cercana a la significación estadística, se aprecia una tendencia al incremento de IL-6 en T2 (control positivo) y T3 (suplemento de la invención 0,5%).

No se aprecian diferencias estadísticamente significativas entre los distintos grupos con respecto a los valores séricos de albúmina, fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa, bilirrubina o proteínas totales, como tampoco de los de urea ni ácido úrico.

8. Efecto sobre sobre la calidad de las pechugas tras el sacrificio de pollos y durante su vida útil en refrigeración

En este estudio se resumen los análisis bromatológicos realizados para comprobar los efectos derivados del suplemento de la invención en la calidad de las pechugas de los pollos empleados en los ensayos presentados previamente. A partir de las muestras biológicas de estos animales se han puesto a punto métodos de evaluación de la frecuencia de lesiones vasculares y de medición de parámetros indicativos de la alteración del tejido muscular:

Ensayo 1 : Se realizaron exámenes de pechugas para evaluar la frecuencia de lesiones vasculares y su color en aves hembra Ross 5 sometidas a cuatro tratamientos experimentales (control, suplemento de la invención al 0,75%, suplemento de la invención al al 1 %, fórmula alternativa 0,75%) a los 7 días de aplicación

Resultados

En la tabla siguiente se muestra el número de pechugas afectadas por lesiones vasculares, y la frecuencia relativa de este valor. Los valores medios obtenidos de los parámetros de color L* a* y b* de las pechugas de los pollos sacrificados el día 7 del estudio se muestran en la tabla siguiente.

Parámetros de color L*, a* y b* de las pechugas, tras retirar la piel a los 30 minutos desde el sacrificio

Tratamiento L*

T1 45,70 2,92 2,01

T2 45,85 2,74 2,33

T3 46,87 3,05 2,29

T4 46,26 2,91 2,02

EEM ¹ 0,609 0,303 0,387

P-valor 0,542 0,909 0,900

¹ EEM: Error estándar de la media (n=6)

T1 : Control negativo (CN); T2: CN + 0,75% suplemento de la invención; T3: CN + 1 ,5% suplemento de la invención; T4: CN + 0,75% Fórmula alternativa

Ensayo 2: Se realizaron exámenes de 80 pechugas para evaluar la frecuencia de lesiones vasculares y su color en aves macho Ross 308 sometidos a cinco tratamientos experimentales (control, ácido acetil salicílico, suplemento de la invención al 0,5%, suplemento de la invención al 1 % y suplemento de la invención al 2%) a los 3 días de aplicación

Resultados

La frecuencia de defectos vasculares (porcentaje de pechugas con lesiones en forma de petequias o hematomas) en los tratamientos se evaluó de forma sensorial, de modo que la presencia de defectos se asignó con carácter binomial (sí/no) y el número de muestras afectadas se expresó en valores porcentuales absolutos y relativos (respecto al control negativo) en la siguiente tabla:

Frecuencia de defectos vasculares superficiales en pechugas de pollos sometidos a distintos tratamientos y porcentaje de reducción de lesiones respecto al tratamiento control negativo (sin adición de compuestos)

A partir de los datos presentados, se puede comprobar que la capacidad para reducir la frecuencia de pechugas con lesiones vasculares del suplemento de la invención a distintas concentraciones (0,5, 1 y 2 %) resultó superior a la del ácido acetilsalicílico (a dosis de uso).

El análisis de las medidas instrumentales de color realizadas a las pechugas recién extraídas de los animales sometidos a los distintos tratamientos evaluados puso de manifiesto que no se encontraron diferencias significativas ni entre las muestras dentro del mismo tratamiento (variabilidad intraespecífica), ni entre las muestras sometidas a distintos tratamientos (variabilidad interespecífica). Las pechugas analizadas presentaron una tonalidad intermedia (ni claras ni oscuras) y tendiendo a una coloración rojiza y ligeramente amarillenta típica. Por otro lado, en cuanto a la diferencia total de color (AE*) de las muestras obtenidas de pollos sometidos a los tratamientos con el suplemento de la invención inmediatamente tras el sacrificio respecto a las muestras control estas no fueron detectadles (AE*= 0-0,5). Sin embargo, la diferencia total de color fue ligeramente perceptible (AE*= 0,5-1 , 5) en las muestras sometidas al tratamiento con el suplemento de la invención al 2% respecto al control, indicando que este cambio de color podría llegar a ser detectado ligeramente por el ojo humano.

Ensayo 3: Se realizaron exámenes de pechugas de 192 pollos para evaluar la frecuencia de lesiones vasculares y su color en aves macho Ross 308 sometidas a dos tratamientos experimentales en agua de bebida (control y suplemento de la invención al 2%) sobre grupos de aves con cuatro tratamientos con distintos aportes de flavonoides en pienso, repartidos en 8 corrales de 12 animales, durante 3 días

Resultados

Se realizó una evaluación sensorial llevada a cabo por un panel de catadores de las muestras de pechugas de los distintos tratamientos con el objetivo de detectar la presencia de defectos y lesiones en la superficie. El porcentaje de incidencia de lesiones, así como la reducción de la presencia de defectos respecto al tratamiento 1 (control negativo sin compuestos) se muestra en la tabla siguiente.

Presencia de defectos de los tratamientos 2 a 4 y, porcentaje de reducción de lesiones respecto al tratamiento 1 (control negativo sin adición de compuestos)

Los resultados obtenidos en las medidas instrumentales de color en esta fase mostraron que no existían diferencias significativas dentro del mismo tratamiento (variabilidad interespecífica) ni entre tratamientos (variabilidad intraespecífica) de las muestras de pechugas analizadas. Los valores medios de los atributos de color indicaron nuevamente que las pechugas analizadas presentaron una tonalidad intermedia y, una coloración rojiza y ligeramente amarillenta (típicos).

Respecto a la diferencia total de color (AE*), estas fueron calculadas entre las muestras de los tratamientos 2 a 4 frente al tratamiento 1 (solo con suplemento de la invención 2 %). No se observaron diferencias detectadles (AE*= 0-0,5) en las muestras evaluadas inmediatamente tras el sacrificio respecto a las muestras control, preservando la coloración típica de la pechuga de pollo. Del mismo modo, se evaluó también el color y la diferencia total de color de muestras de los tratamientos 1 y 3 durante su vida útil en refrigeración (vida útil esperada 8 días) envasadas en atmósfera modificada. Durante este periodo se realizó la medida instrumental de color en un punto intermedio (4 días) y, al final del periodo de almacenamiento (8 días) y, se calcularon las diferencias respecto al día 0. En el caso del Tratamiento 1 las diferencias fueron intensas (AE*= 6,0-12,0) desde el punto intermedio de análisis (11 ,14) hasta el fin de vida útil (11 ,59). Además, se observó un cierto colapso de los envases y la aparición de algo de limo superficial que se intensificó al final del periodo de estudio. Sin embargo, estas diferencias de color, aunque visibles visualmente (AE*= 3, 0-6,0) fueron significativamente menores en el caso del tratamiento 3 y, no se observó la presencia de limo ni colapso en los envases. Estos resultados parecen indicar que la adición de

Biomasa cítrica (500 g/T) conjuntamente con el suplemento de la invención al 2% previene la degradación del color en las muestras de pechuga de pollo y, evita la aparición de pérdidas de calidad de la misma.