発明の名称 ： 遺伝子増幅法及び遺伝子増幅用キット

技術分野

[0001 ] 本発明は、 遺伝子増幅法及び遺伝子増幅用キッ ト等に関する。

背景技術

[0002] 遺伝子を増幅する技術は、 医療分野において病原菌の検査、 がん診断など に、 ライフサイエンス分野においては、 食中毒菌の検査、 水質検査、 遺伝子 組換え作物検査などに広く産業利用されてい る。 遺伝子増幅は、 目的遺伝子 をテンプレートとし口 八ポリメラーゼと作用させ、 生成された目的遺伝子 を電気泳動と染色で検出する方法が知られて いる。 また、 簡便な遺伝子増幅 を確認する方法として、 反応副産物であるピロリン酸を測定すること で目的 遺伝子の増幅を判別する方法が使用されてい る。

[0003] 反応副産物であるピロリン酸の測定法として 蛍光試薬で検出する方法があ り、 リアルタイム 〇 などの検出系として実用化されている。 しかし、 該 方法は、 蛍光試薬を使用するため高価となること、 蛍光物質の影響を受けや すいことが知られている。 他のピロリン酸の測定方法として集積化トラ ンジ スタを用いた方法がある。 該方法は、 目的遺伝子増幅反応で副生したピロリ ン酸から生じるプロトンを 1 ^~ 1センサで捉え検出することで遺伝子増� �を評 価する方法であり、 口 八シーケンサの検出系としても実用化されて いる。 しかしながら、 該方法では、 遺伝子増幅反応のプロトンを捉える必要があ る ため、 反応液中の緩衝能を極力抑える必要があり、 その為、 酵素反応を繰り 返すと遺伝子増幅反応で産生したプロトンが 蓄積することで反応液が酸性に 傾き酵素の至適 1 ^~ 1から乖離し、 酵素活性が低下、 遺伝子増幅が低下するこ とが知られている （非特許文献 1） 。

[0004] そこでこれら課題を解決する方法として、 ピロリン酸を特異的に認識する ピリジルボロン酸を用いた方法がある。 該方法では、 蛍光試薬を使用する必 要がなく安価であり、 また、 酸性条件下でピロリン酸とピリジルポロン酸 が \¥0 2020/175406 2 卩（：170? 2020 /007232

作用するため、 遺伝子増幅反応で産生したプロトンが蓄積し ても問題なく検 出できる。 しかし、 ピリジルボロン酸がピロリン酸と結合できる 1 ^~ 1の範囲 が 5〜 7であり、 一般的な遺伝子増幅反応が、 アルカリ側で行われているこ と、 また、 酸性条件下では、 遺伝子の脱プリン化が起こりやすいことが知 ら れており （非特許文献 2） 、 脱プリン化が起こった遺伝子では、 口 八ポリ メラーゼが作用できず、 その為、 遺伝子増幅が起こらない。 このことから、 酸性条件下で遺伝子増幅を行える有効な方法 が未だないため、 本方法は活用 されていない状況である。

[0005] その他にも、 遺伝子増幅については多く検討されており、 これらの方法の 多くは、 アルカリ側での反応であるが、 その中で 1 ^~ 1が 7以下における遺伝 子増幅に関する記載のある公知文献がある （特許文献 1、 2、 3） 。 しかし 、 該公知文献では、 酸性条件下で遺伝子増幅を行うことが目的で はないため 、 酸性条件下で口 八ポリメラーゼを反応させる具体的な組成や 条件が示さ れてなく、 実際に酸性条件下で遺伝子増幅を行った例に ついては全く記載さ れていない。

[0006] また、 酸性条件に至適 1 ^~ 1が 6である 0 八ポリメラーゼを用いて遺伝子 増幅の検討が行なわれている （非特許文献 3） 。 しかしながら、 該方法では 、 遺伝子増幅の最適 1 ^~ 1は 8 . 2であり、 1 ^~ 1 7 . 4では遺伝子増幅が認めら れなかった。 酵素の至適 1 ^~ 1と遺伝子増幅の至適 1 ^~ 1は異なっており、 酸性 条件に至適 ! !を有する 0 八ポリメラーゼであれば、 酸性条件で遺伝子増 幅ができるわけではない。 以上のように、 酸性条件下でピロリン酸を検出す るのに有用なピリジルポロン酸を用いた方法 等を活用できるような、 実際に 酸性条件下での口 八ポリメラーゼを用いた遺伝子増幅法は未だ ない状況で ある。

先行技術文献

特許文献

[0007] 特許文献 1 :特許 4 6 9 9 4 1 5号明細書

特許文献 2 :特許 5 0 0 7 4 4 0号明細書 特許文献 3 :特開 201 6 _ 52 1 1 20号公報

非特許文献

［0008］ 非特許文献 1 : 日本学術振興会 科学研究費助成事業 研究成果報告書 課題 番号 2670201 3 2版 平成 29年 6月 26日

非特許文献 2 :ベーシックマスター 分子生物学 P 1 5— 1 6 出版年 20 〇 6年 1 2月 オーム社

非特許文献 3 : E n z yme a n d M i c r o b i a l t e c h n o I o g y, 5 1 , 334-34 1 , 201 2

発明の概要

発明が解決しようとする課題

［0009］ 本発明は、 上記の遺伝子増幅に関する従来技術に於ける 様々な問題点を解 決し、 酸性条件下で D N Aポリメラーゼを用いて、 測定対象の遺伝子を選択 的且つ簡便に増幅する方法等を提供すること を目的とする。

課題を解決するための手段

［0010］ 発明者らは、 DN Aポリメラーゼを用いて、 測定対象の遺伝子を増幅する 方法を詳細に検討した結果、 予想外にも、 酸性条件下での遺伝子増幅反応を 有意に行うことを可能とする、 緩衝液の種類及び各種塩濃度等の遺伝子増幅 反応条件が存在することを見出し、 本発明を完成させた。

［0011］ 本発明は、 以下の ［1］ 〜 ［8］ の態様に関する。

［1］ p H4.2~6.9の酸性反応液中での D N Aポリメラーゼ反応で対象 遺伝子を増幅させる工程 （丨） を含む、 遺伝子増幅法。

［2］ 工程 （ I） で用いる酸性反応液を p H 4.0〜 6. 9の緩衝液を用いて 調製することを特徴とする、 態様 ［1］ に記載の遺伝子増幅法。

［3］ 工程 （丨） で用いる酸性反応液が、 5 mM〜 1 25 mMの塩化カリウ ムを含むことを特徴とする、 態様 ［2］ に記載の遺伝子増幅法。

［4］ 工程 （丨） で用いる DN Aポリメラーゼが、 T h e r m u s属、 T h e r mo c o c c u s属、 又は、 B a c i I I u s属バクテリオファージ由 \¥0 2020/175406 4 卩（：170? 2020 /007232

来の〇 ポリメラーゼであることを特徴とする、 態様 ［1］ に記載の遺伝 子増幅法。

［5］ 工程 （ I） で用いる酸性反応液が糖類を含むことを特徴 とする、 態様

［ 1］ に記載の遺伝子増幅法。

［6］ 態様 ［1］ 〜 ［5］ のいずれか一項に記載の工程 （丨） 、 及び、 該エ 程 （丨） で得られた増幅産物又は反応副産物に基づき 前記対象遺伝子を検出 する工程 （ I I） を含む、 遺伝子検出法。

［7］ 工程 （ I I） に於いて、 該工程 （丨） で生じた反応副産物の量を測定 し、 該反応副産物の測定量に基づき前記対象遺伝 子の量を決定することを特 徴とする、 遺伝子検出法。

［8］ 反応副産物がピロリン酸である、 態様 ［7］ に記載の遺伝子検出法。

［9］ 工程 （丨 丨） に於いて、 ピリジルボロン酸との反応による電位変化を 測定することによって工程 （丨） で生じた反応ピロリン酸の量を測定する、 態様 ［8］ に記載の遺伝子検出法。

［1 0］ 工程 （丨 丨） に於いて、 吸光度法により工程 （丨） で生じたピロリ ン酸の量を測定する、 態様 ［8］ に記載の遺伝子検出法。

［1 1］ 態様 ［1］ 〜 ［5］ のいずれか一項に記載の遺伝子増幅法を実施 す るための遺伝子増幅用キッ トであって、 口 八ポリメラーゼ、 緩衝剤、 及び 反応試薬を含む、 前記遺伝子増幅用キッ ト。

［1 2］ 態様 ［6］ 〜 ［1 0］ のいずれか一項に記載の遺伝子検出法を実施 するための遺伝子検出装置またはシステムで あって、 態様 ［1 1］ に記載の 遺伝子増幅用キッ トを含む、 前記遺伝子検出装置またはシステム。 発明の効果

［0012］ 従来技術では、 酸性条件下で測定対象の遺伝子を選択的に増 幅させ、 該遺 伝子を検出することが不可能であったが、 本発明に係る遺伝子増幅法に於い ては、 従来技術で見られたような遺伝子の脱プリン 化も見られず、 酸性条件 下でも 0 八ポリメラーゼの作用により測定対象遺伝子 を有意に増幅させる ことが出来る。 更に、 引き続き、 増幅反応に使用した酸性反応液を用いて、 該遺伝子を選択的且つ簡便に検出又は測定す ることが可能となる。

図面の簡単な説明

［0013］ ［図 1］T h e r mo c o c c u s属由来の D N Aポリメラーゼにおける遺伝子 増幅反応液中の緩衝液の影響を示す図である 。

［図 2］T h e r m u s属由来 D N Aポリメラーゼにおける遺伝子増幅反応液中 の緩衝液の影響を示す図である。

［図 3］T h e r mo c o c c u s属由来 D N Aポリメラーゼにおける酸性条件 下での遺伝子増幅反応における緩衝液及び塩 化カリウム濃度の影響を示す図 である。

［図 4］遺伝子増幅反応におけるマグネシウム濃� �の影響を示す図である。

［図 5］遺伝子増幅反応における塩化カリウム濃� �の影響を示す図である。

［図 6］遺伝子増幅反応におけるトレハロースの� �加効果を示す図である。

［図 7］本発明と公知文献記載の遺伝子増幅反応� �成における酸性条件下での遺 伝子増幅反応の比較を示す図である。

［図 8］ B a c i l l u s s u b t i I i sバクテリオファージ由来の DNA ポリメラーゼにおける遺伝子増幅反応液中の 緩衝液の影響を示す図である。 ［図 9］B a c i I I u s s u b t i I i sバクテリオファージ由来の DNA ポリメラーゼにおける遺伝子増幅反応液中の 塩化カリウム濃度の影響を示す 図である。

発明を実施するための形態

［0014］ 本発明は、 第一に、 遺伝子増幅法に係る。 本発明の遺伝子増幅法の工程 （

I） では、 p H 4.2〜 6.9、 例えば、 T h e r m u s属及び T h e r m o c o c c u s属由来の DNAポリメラーゼの場合、 好ましくは、 p H 5. 7 〜 6. 9又は、 B a c i I l u s s u b t i l i sバクテリオファージ由 来の DN Aポリメラーゼの場合、 好ましくは、 p H 5.0〜 6.5の範囲にあ る （酸性） 反応液中での DN Aポリメラーゼ反応において、 測定の対象とな る遺伝子 （DNA） を増幅させる。 尚、 上記の酸性反応液の p Hは遺伝子増 \¥02020/175406 6 卩（：17 2020 /007232

幅反応が進むにつれて多少変動するので、 遺伝子増幅反応開始時の I·!で規 定する。 本発明方法に使用する〇 八ポリメラーゼは、 原核生物、 真核生物 及びウィルス由来の何れの 八ポリメラーゼでも良く、 例えば、 680 1 I 1 リ 3属、 丁 1"16 「 111リ 3厲、 7 「 00000リ 3属、 丁 1"16 「 11100 000リ 3属、 I 干〇 I 〇 13リ 3属などの微生物由来や巳 8〇 I I I リ 3 3リ匕 1： 丨 丨 丨 3バクテリオファージなどのウィルス由来の� � 八ポリ メラーゼが好ましい。 また、 組換え型口 八ポリメラーゼでも良く、 合成し た 0 八ポリメラーゼでも良い。 可溶性酵素が好ましいが、 不溶性酵素に界 面活性剤を組み合わせても良く、 可溶化タンパクとの融合又は膜結合部分の 削除等により不溶性酵素を可溶化させた酵素 でも良い。 口 八ポリメラーゼ の公知のアミノ酸配列を利用でき、 組換え型の口 八ポリメラーゼとしては 、 公知の口 八ポリメラーゼと 60 %、 65 %、 70 %、 75 %、 80 %、

85%、 90%又は 95%以上の同一性を有するアミノ配列を有し、 〇 八 ポリメラーゼ活性を有する蛋白質を使用して も良い。 尚、 本発明の遺伝子増 幅法に於いては、 特定の !!範囲の酸性反応液中での 0 八ポリメラーゼ反 応において、 測定対象の遺伝子の増幅を繰り返し行うこと によって、 ピロリ ン酸等の反応産生物（反応副産物）を増加さ せ、 その後、 該反応副産物を係る 酸性 !!条件下で測定することが可能となる。 従って、 このような反応液の 1 ^~ 1の範囲に於いて有意な遺伝子増幅活性� �有する 0 八ポリメラーゼを使 用することが好ましい。 尚、 既に述べたように、 口 八ポリメラーゼ自体の 至適 !!と遺伝子増幅活性の至適 !!とは必ずしも一致していない。

[0015] 本発明の遺伝子増幅法に使用する口 ポリメラーゼの調製方法としては 、 当業者に公知の任意の方法 ·手段、 例えば、 口 八ポリメラーゼを含む対 象物に加水し、 粉砕機、 超音波破砕機などで粉砕後、 破砕した破砕物を遠心 分離、 濾過などで固形物を取り除いた抽出物、 さらに当該抽出物をカラムク ロマトグラフィーなどにより精製又は単離す る方法があり、 その精製又は単 離した口 八ポリメラーゼなどを用いることができる。

[0016] 当該遺伝子増幅反応に使用される酸性反応液 中の口 八ポリメラーゼ濃度 は、 試料の種類、 推定される試料中の遺伝子濃度及び、 反応時間 ·温度等の 各種反応条件に応じて、 当業者が適宜決められる。 例えば、 遺伝子増幅反応 液中の B a c i I l u s属、 T h e r m u s属、 P y r o c o c c u s属、 T h e r mo c o c c u s属、 S u I f 〇 I o b u s属などの微生物由来や B a c i I l u s s u b t i I i sバクテリオファージなどのウイルス由 来の DN Aポリメラーゼの濃度は、 0.5 M9/m L以上、 より好ましくは 1 g/mL以上、 さらに好ましくは 3 g/m L以上とすることができる。 い ずれにしても、 本発明方法では、 DN Aポリメラーゼを繰り返し使用できる ので、 予想される試料中の遺伝子に対して、 過剰量の DN Aポリメラーゼを 添加する必要はない、 という利点を有する。 従って、 DNAポリメラーゼ濃 度の上限は、 経済性なども考慮して当業者が適宜設定する ことが出来る。

[0017] 本発明の遺伝子増幅法における対象遺伝子 （DNA） は、 当業者に公知の 任意の方法で ·手段で取得することが出来る。 例えば、 血液、 生鮮食品、 加 エ食品及び飲料など検査の目的に応じた試料 から適宜調製することが出来る 。 各試料中からの DN A調製方法としては、 当業者に公知の任意の方法 ·手 段、 例えば、 試料をドデシル硫酸ナトリウム、 酵素、 ビーズ破壊などで溶解 させ、 得られた溶解液中の DN Aをシリカ膜などに結合後、 溶出液で DNA を溶出させるなどにより調製した D N Aを遺伝子増幅用の D N A試料として 使用することができる。 更に、 増幅反応の種類などに応じて、 DNA c D N Aであっても良い。

[0018] 本発明の遺伝子増幅法で使用する特定の p H範囲の酸性反応液は、 DNAポ リメラーゼの種類や反応条件等に応じて、 例えば、 p H4.0〜 6. 9、 好ま しくは 1 ^~ 15.0〜6.5、 より好ましくは p H 5. 5〜 6. 5等の適当な p H範囲の緩衝液を用いて当業者が適宜調製す� �ことが出来る。 該緩衝液とし ては、 当業者に公知の任意の緩衝剤、 好ましくは、 N a H ₂ P0 ₄ -N a ₂ H P 〇 ₄ 、 N a H ₂ P〇 ₄ -N a〇 H、 N a H ₂ P〇 ₄ - K〇 Hなどのリン酸塩緩衝剤 を用いて調製するリン酸塩緩衝液やクエン酸 ークエン酸ナトリウム、 クエン 酸一 N a 0 Hなどのクエン酸緩衝剤を用いて調製するク� �ン酸緩衝液などを 使用することが出来る。 酸性反応液中の緩衝剤の （終） 濃度に関しては、 例 えば、 T h e r mo c o c c u s属由来の D N Aポリメラーゼを p H 5.5の 緩衝液を用いて調製した反応液中で反応させ る場合、 該反応液中のリン酸塩 の濃度は、 0. 1〜 200 m Mがよく、 より好ましくは 0.5〜 1 00 m M、 さらに好ましくは 5〜 5 OmMがよい。 このような緩衝剤の濃度の上限は、 経済性なども考慮して当業者が適宜設定する ことが出来る。 尚、 酸性反応液 の最終容量に対して、 通常、 1〜 1 〇倍濃度の緩衝剤を 1〜 25容量％程度 を使用することによって上記の p H範囲の酸性反応液を調製することが出来 る。

[0019] 本発明の遺伝子増幅法で使用する酸性反応液 には塩化カリウムが含まれて いることが好ましい。 該反応液中の塩化カリウムの濃度は、 DNAポリメラ —ゼの種類や反応条件に応じて、 当業者が適宜決められる。 アルカリ側 p H で反応させる従来の一般的な遺伝子増幅反応 においては、 塩化カリウム濃度 が 75 mM以上になると遺伝子増幅反応が阻害される� ��とが知られているが 、 本発明方法に於ける酸性条件下での遺伝子増 幅反応においては、 塩化カリ ウム濃度は、 使用する反応液の P Hが酸性になるほど、 過剰となるように添 加するのが好ましい。 例えば、 T h e r m u s属由来の DNAポリメラーゼ を p H 6.0の緩衝液を用いて調製した酸性反応液中で 反応させる場合、 該反 応液中の塩化カリウムの濃度は、 5〜 1 1 5 mMがよく、 より好ましくは 3 〇〜 1 1 5 m Mがよい。 例えば、 T h e r mo c o c c u s属由来の D N A ポリメラーゼを p H 5.5の緩衝液を用いて調製した酸性反応液中で 反応させ る場合、 該反応液中の塩化カリウムの終濃度は、 5〜 1 1 5 mMがよく、 よ り好ましくは 30〜 1 1 5 mMがよい。 更に、 例えば、 B a c i I I u s s u b t i l i sバクテリオファージ由来の DNAポリメラーゼを p H 4.0 の緩衝液を用いて調製した酸性反応液中で反 応させる場合、 該反応液中の塩 化カリウムの終濃度は、 5〜 1 25 m Mがよく、 より好ましくは 30〜 1 2 5 mMがよい。 塩化カリウムの濃度は、 緩衝剤の濃度を考慮し、 緩衝剤が高 濃度の場合、 塩化カリウム濃度は低濃度とし、 緩衝剤が低濃度の場合、 塩化 カリウム濃度は高濃度とするのがよい。 また、 塩化カリウム濃度の上限は、 経済性なども考慮して当業者が適宜設定する ことが出来る。

[0020] 本発明の遺伝子増幅法で使用する酸性反応液 には更に二価イオンが含まれる 。 該二価イオンとしては、 マグネシウム、 マンガン、 コバルトなどが使用で きるが、 マグネシウムを使用するのが好ましい。 当該反応に使用される反応 液中のマグネシウムの濃度は、 適宜決められる。 例えば、 T h e r m〇 c〇 e c u s属由来の DN Aポリメラーゼを p H 5.5の緩衝液で反応させる場合 、 該反応液中のマグネシウム濃度は、 1.5〜 9 mMがよく、 より好ましくは 2〜 6 mMがよい。 例えば、 T h e r m u s属由来の D N Aポリメラーゼを p H 6.0の緩衝液を用いて調製した酸性反応液中で 反応させる場合、 該反応 液中のマグネシウム濃度は、 2〜 6 mMがよく、 より好ましくは 2〜 4 mM がよい。 例えば、 B a c i l l u s s u b t i l i sバクテリオファージ などのウィルス由来の DN Aポリメラーゼを p H 4.0の緩衝液を用いて調製 した酸性反応液中で反応させる場合、 該反応液中のマグネシウム濃度は、 1 〜 30 m Mがよく、 より好ましくは 1 0〜 1 4 m Mがよい。

[0021] 本発明の遺伝子増幅法では、 遺伝子を増幅させるため、 デオキシアデノシ ン三リン酸 （d AT P） 、 デオキシシチジン三リン酸 （d CT P） 、 デオキ シチミジン三リン酸 （d TT P） 、 デオキシグアノシン三リン酸 （d GT P ） の 4種が混合されたデオキシリボヌクレオチド� �リン酸 （d NT P） を用 いる。 当 s亥反応に使用される反応液中の d N T Pの濃度は、 各種反応条件に 応じて、 当業者が適宜決められるが、 例えば、 d NT P濃度は、 0.01 mM 以上がよく、 より好ましくは 0. 1 m M以上、 さらに好ましくは 0.2 m M以 上とすることができる。

[0022] 更に、 本発明の遺伝子増幅法では、 遺伝子を増幅させるために各種のブラ イマーを用いる。 該プライマーは増幅の対象とする遺伝子の具 体的なヌクレ オチド配列に基づき、 当業者が適宜、 設計 ·調製することが出来る。 当該反 応に使用される反応液中のプライマーの濃度 は、 各種反応条件に応じて、 当 業者が適宜決められるが、 例えば、 プライマー濃度は、 O. O I mM以上、 よ \¥02020/175406 10 卩（：170? 2020 /007232

り好ましくは 0. 1 01 IV!以上、 さらに好ましくは〇.201 IV!以上とすることが できる。

［0023］ 本発明の遺伝子増幅法の工程 （丨） における遺伝子増幅反応は、 当業者に 公知の任意の方法、 例えば、 各種のポリメラーゼ連鎖反応 （ 〇［¾） 等で行 われ、 該反応の各サイクルに於ける温度や時間は、 遺伝子増幅反応が生じる ような任意の温度で良い。 例えば、 丁 11㊀ 「 01リ 3属及び丁 11㊀ 「 01〇〇〇 〇〇リ 3属の 0 八ポリメラーゼを用いる場合では、 98°〇 1 036〇® 55 °0 · 3〇 36〇®72°0 · 门を繰り返すことや、

门®94。〇 · 3〇 36〇®62°0 · 3〇 36〇®72°0 · 303 ø〇を繰り 返した後、 72 ^° 〇 1 0 1 门とすることなどできる。 630 1 1 I リ 3 テリオファージ由来の〇 八ポリメラーゼを用いる場 、 I 门加熱、 30°〇まで冷却した後、 30°〇 1 6 「 ® 65 °0 1 0 I n処理することなどできる。 酸性条件下では、 高温ほど 遺伝子の脱プリン化が起こりやすいことから 低温で遺伝子増幅を行うことが 好ましい。

［0024］ また、 本発明の遺伝子増幅法で使用する酸性反応液 に糖類を含有させる （共 存させる） ことによって、 更に、 反応産生物の量を増加させることが出来る 。 糖類としては、 シヨ糖、 トレハロースなど当業者に公知の糖類が使用 でき る。 当該反応に使用される反応液中の糖類の濃度 は、 各種反応条件に応じて 、 当業者が適宜決められる。 例えば、

八ポリメラーゼを 1 ^~ 15.5の緩衝液で反応させる場合、 該反応液中の糖類 濃度は、 1 0 %以下がよく、 より好ましくは 5 %以下がよい。 例えば、 丁 リメラーゼを 1 ^~ 16.0の緩衝液を用いて調製し た酸性反応液中で反応させる場合、 該反応液中の糖類濃度は、 1 %以上がよ く、 より好ましくは 5%以上がよい。 例えば、

I I I 3バクテリオファージなどのウイルス由来の� � 八ポリメラーゼを 1 ^~ 14.0の緩衝液を用いて調製した酸性反応� �中で反応させる場合、 該反応液 中の糖類濃度は、 〇 . 1 %以上がよく、 より好ましくは 1 %以上がよい。 \¥02020/175406 11 卩（：170? 2020 /007232

[0025] さらに、 本発明の遺伝子増幅法で使用する酸性反応液 に牛血清アルブミン （巳3八） 、 非イオン製剤、 アンモニウムイオンを添加する （共存させる） ことによって、 酵素や口 の安定性を増し、 反応産生物の量を増加させる ことが出来る。 巳 3 の濃度は、 各種反応条件に応じて、 当業者が適宜決め られる。 例えば、 丁 116 「 0100000リ 3属由来の口 八ポリメラーゼを 1 ^~ 15.5の緩衝液で反応させる場合、 該反応液中の巳 3 濃度は、 0.00 1 %以上がよく、 より好ましくは 0.005 %以上、 さらに好ましくは 0.0 1 %以上がよい。 非イオン製剤としては、 -40、 T r i t o n X-1 0 0など当業者に公知の非イオン製剤が使用で� �る。 当該反応に使用される反 応液中の非イオン製剤の濃度は、 各種反応条件に応じて、 当業者が適宜決め られる。 例えば、 丁 116 「 0100000リ 3属由来の口 八ポリメラーゼを 1 ^~ 15.5の緩衝液で反応させる場合、 該反応液中の非イオン製剤濃度は、 0 .0005 %以上がよく、 より好ましくは 0.001 %以上、 さらに好ましく は 0.01 %以上がよい。 また、 アンモニウムイオンとしては、 硫酸アンモニ ウムなど当業者に公知のアンモニウムイオン が使用できる。 当該反応に使用 される反応液中のアンモニウムイオンの濃度 は、 各種反応条件に応じて、 当 業者が適宜決められる。 例えば、 丁 116 1^ 0100000リ 3属由来の口 八 ポリメラーゼを 1 ^~ 15.5の緩衝液で反応させる場合、 反応液中のアンモニウ ムイオン濃度は、 1 2001 IV!以下がよく、 より好ましくは 1 0001 IV!以下、 さらに好ましくは 80 IV!以下がよい。

[0026] 本発明方法の工程 （丨） で使用する反応試薬 ·酵素等の各反応成分は、 所 定の酸性条件下で遺伝子増幅反応が生じる添 加方法である限り、 当業者に公 知の任意の手段 ·手順等で反応系に添加することができる。 例えば、 各成分 を反応開始前に一度に反応液に予め添加する か、 又は、 口 八ポリメラーゼ 又は遺伝子を含む試料を最後に添加し反応さ せても良い。 従って、 例えば、 本願明細書の実施例にあるように、 塩化カリウム、 二価イオン、 及び、 糖類 等を予め 〇 用緩衝液に含有させておくことが出来る。

[0027] 本発明は、 第二に、 1 ^~ 14. 2〜 6.9の酸性反応液中での〇 八ポリメラ \¥0 2020/175406 12 卩（：170? 2020 /007232

—ゼ反応で対象遺伝子を増幅させる工程 （丨） の後に、 該工程 （丨） で得ら れた増幅産物又は反応副産物に基づき前記対 象遺伝子を検出する工程 （ I I ） を含む、 遺伝子検出法に係る。

増幅産物又は反応副産物に基づく対象遺伝子 の検出は、 当業者に公知の任意 の方法 ·手段を用いて、 定性的、 半定量的、 又は、 定量的に実施することが 出来る。

例えば、 増幅産物である増幅遺伝子を電気泳動した後 、 これを染色するこ とによって、 定性的又は半定量的に検出することが出来る 。 又は、 反応副産 物であるピロリン酸を蛍光試薬で検出する方 法もある。

或いは、 工程 （丨） で生じたピロリン酸及び水素イオン等の反応 副産物の夫 々の量を測定し、 該反応副産物の測定量に基づき対象遺伝子の 量を決定する （定量的に検出する）ことが出来る。 この方法では、 反応副産物の量と測定対 象遺伝子の量との一定の相関関係に基づく検 量線等を利用することができる 。 特に、 本発明の工程 （丨） で生じたピロリン酸の量の測定には、 当業者に 公知の任意の方法 ·手段を使用することができる。 特に、 本発明の工程 （丨 ） では酸性条件下で測定対象遺伝子の増幅が可 能であるので、 酸性条件下で 行われる、 ピロリン酸を特異的に検出するピリジルポロ ン酸により電位変化 を測定する方法を効果的に使用することが出 来る。 また、 本発明の工程 （丨 ） で生じたピロリン酸をヒポキサンチンーグア ニンホスホリボシルトランス フェラーゼ、 キサンチンオキシダーゼ又はキサンチンデヒ ドロゲナーゼを組 み合わせた方法や、 ピロリン酸を無機ピロホスファターゼなどで 2分子のリ ン酸とし、 そのリン酸を測定することで、 より高感度の測定、 例えば、 ルミ ノールと無機ピロホスファターゼ、 ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシ ダーゼを組み合わせた方法などにより、 ピロリン酸を吸光度法で測定できる 。 さらに遺伝子増幅反応に於いてピロリン酸か ら生じるプロトン （水素イオ ン） の測定には、 水素イオンを検出するガラス電極やイオン感 応性電界効果 トランジスタにより電位変化を測定する測定 方法などを使用することができ る。 本発明の工程 （丨） で生じたピロリン酸、 水素イオンなどは、 適宜、 遺 \¥02020/175406 13 卩（：170? 2020 /007232

伝子増幅反応溶液から分離し、 測定することができる。 該反応溶液からのピ ロリン酸、 水素イオンなどの分離方法としては、 測定に影響の無い方法であ れば特に限定されないが、 例えば、 ベーパークロマトグラフィー分離、 マイ クロ流体デバイスでの分離などが挙げられる 。

[0028] 更に、 本発明は上記の本発明方法を実施するための 、 対象遺伝子を増幅す るに必要な前述の各成分、 例えば、 〇 ポリメラーゼ、 緩衝剤、 反応試薬 （プライマー及び 等） 並びに、 糖類等の各種添加剤等を含む、 遺伝 子増幅用キッ トを提供する。 当該キッ トは、 安定化剤又は緩衝剤等の当業者 に公知の他の任意成分を適宜含有させ、 前記酵素等試薬成分の安定性を高め ても良い。 測定に影響の無い成分であれば特に限定され ないが、 例えば、 卵 白アルブミン、 糖アルコール類、 カルボキシル基含有化合物、 酸化防止剤、 界面活性剤等を例示できる。

[0029] 又、 本発明は、 当該遺伝子増幅用キッ トを含み、 上記遺伝子検出法 （測定法 ） を実施するための遺伝子検出装置または遺伝 子検出システムを提供する。 係る遺伝子検出装置または遺伝子検出システ ムには、 当該遺伝子増幅用キッ 卜に加えて、 本発明方法に於ける対象遺伝子の増幅工程 （丨） で得られた増 幅産物又は反応副産物に基づき該遺伝子を検 出する工程 （ I I） を実施する 様々な手段 ·方法に応じて、 それらの各手段 ·方法に必要とされる当該技術 分野に於いて公知である任意の試薬、 装置、 器具及びキッ ト等を適宜含むこ とができる。

[0030] 以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが 、 本発明の技術的範囲は 以下の実施例によって限定されるものではな い。

実施例 1

[0031] （超好熱菌由来のポリメラーゼの調製）

丁 1"16 「 11100000リ 3 由来の口 八ポリメ ラーゼ遺伝子 （非特許文献 3） を組み込んだプラスミ ド 巳丁 28匕 （+） で大腸菌 〇 361 1 3 2（0巳 3） 1_ _{7 3} 3を形質転換し、 発現株として 用いた。 発現株について、 カナマイシンを終濃度 50 9/ 1_及びクロラム フエニコールを終濃度 34 M g/m L含む L B培地により 37°Cで 4時間培養 後、 終濃度〇. 2mMとなるように 丨 PTGを添加した。 さらに、 培養液を 25 ^° Cで終夜培養後、 集菌を行い、 得られた菌体を超音波破砕し、 無細胞抽 出液を調製した。 調製した無細胞抽出液について遠心分離を行 い、 得られた 上清の一部を用いて電気泳動法により目的酵 素の発現を確認した。 次いで残 りの上清をアフイニテイカラム （商品名 ： H i T r a p H e p a r i n H P、 GEヘルスケア製） により夾雑タンパクを除去し、 0. 1 5 m g/mL の T h e r mo c o c c u s属由来の D N Aポリメラーゼを得た。 なお、 T h e r m u s属由来の D N Aポリメラーゼはタカラバイオ製 （商品名 ： E x T a q HS） 、 B a c i I I u s s u b t i l i sバクテリオフアー ジ由来の D N Aポリメラーゼは関東化学製 （商品名 ： p h i 29 D N Aポ リメラーゼ） を用いた。

[0032] 尚、 上記 T h e r m〇 c〇 c c u s属由来のポリメラーゼ D N Aの塩基配列 は以下のとおりである。

[T h e r mo c o c c u s属由来の D N Aポリメラーゼ ]

ATGGGGATCCTGGACGCAGACTACATTACGGAAGATGGCAAGCCGGTCATTCGTGTGTTC AAGAAAGAA AAGGGCGAATTCAAAATCAATTATGATCGTGACTTTGAACCGTATATTTACGCTCTGCTG AAAGATGAC AGCGCGATCGAAGATATTAAAAAGATCACCGCTGAACGTCACGGTACCACGGTCCGTGTG ACGCGCGCC GAACGTGTTAAAAAGAAATTTCTGGGTCGCCCGGTTGAAGTCTGGAAACTGTATTTCACC CATCCGCAG GATGTGCCGGCTATTCGTGACAAAATCCGCGAACACCCGGCGGTGGTTGATATTTATGAA TACGACATC CCGTTTGCAAAGCGTTATCTGATTGATAAAGGCCTGATCCCGATGGAGGGTAACGAAGAA CTGCGCATG CTGGCGTTTGACATTGAAACCCTGTACCATGAAGGCGAAGAATTCGGCGAAGGTCCGATT CTGATGATC AGCTATGCGGATGAAGAAGGTGCCCGTGTGATTACCTGGAAAAATATCGACCTGCCGTAT GTTGAAAGT GTCTCCACGGAAAAAGAAATGATTAAGCGCTTTCTGAAAGTGATCCAGGAAAAAGATCCG GACGTTCTG ATTACCTATAACGGCGATAATTTTGACTTCGCGTACCTGAAGAAACGTTCAGAAACGCTG GGTGTTAAG TTCATTCTGGGCCGCGATGGTTCGGAACCGAAAATCCAACGTATGGGCGACCGCTTTGCC GTGGAAGTT AAAGGTCGCATCCACTTCGATCTGTACCCGGTGATTCGTCGCACCATCAACCTGCCGACC TATACGCTG GAAACGGTGTACGAAGCCATTTTTGGCCAGCCGAAAGAAAAGGTTTATGCAGAAGAAATC GCACAAGCT \¥02020/175406 15 卩（：170? 2020 /007232

実施例 2

[0033] （丁 6 「 〇〇〇〇〇リ 3属由来の 0 八ポリメラーゼにおける酸性条件 下での遺伝子増幅反応液中の緩衝液の影響）

ポリメラーゼ連鎖反応 （ 〇[¾） 時の終濃度として、 表 1 に示す組成のも のを 〇 [¾緩衝液とした。 各 〇 [¾緩衝液に、 2. 5 1\/1 丁 を 4 !_、 〇. 1 % 巳3八を 2. 5 ! -、 〇. 01 % 7 V \ I 〇 n X— 1 0 \¥02020/175406 16 卩（：170? 2020 /007232

0を 5 1 -、 1 0 1\/1 フォワードプライマー (1 ) :〇八〇^〇丁〇八丁〇〇八丁丁〇 丁 0010, 及びリバースプライマー ( 1 ) :〇丁八〇〇〇〇〇八八丁〇八〇丁丁丁〇〇� � 八〇丁 〇を各 2 !_、 6. 実施例 1 で取得した丁 6 「 0100000 リ 3属由来の口 八ポリメラーゼを 1 !_添加し、 50 !_の 〇 増幅反応液を調製した。 〇 の反応温度と時間は、 表 2に示す 条件で実施した。

[0034]

表 1

※各実施品の; 緩衝液け、 ·の いた物質による組成 表 2

諸 ³ \¥02020/175406 18 卩（：170? 2020 /007232

1 ^~ 1 ₂ ?〇 ₄ - 3〇1 ^~ 1 1 ^~ 15. 5及び 6. 0、 並びに、 5〇11\/1 ₃ 1 ^~ 1 ₂ ?〇

₄ - ₃₂ 1 ^~ 1 ?〇 ₄ 1 ^~ 16. 0を用いたサンプル （実施品 5〜 7） で、 目的遺 伝子の増幅が確認された。

実施例 4

[0036] （T h e 「 リ 3属由来〇 八ポリメラーゼにおける酸性条件下での遺伝 子 増幅反応液中の緩衝液の影響）

〇 反応時の終濃度として、 表 3及び表 4に示す組成のものを 〇 緩 衝液とした。 各 〇 緩衝液に、 2. 5 1\/1 丁 を 4 1 -、 1 0 1\/1 フォワードプライマー （1） 及びリバースプライマー （1） を各〇. 4 !_、 6. 4门 ₉ / !_のスー〇 八を 1 !_、 º _X 7 a q 1 ^~ 13ポリメラ

—ゼを〇. 25 し、 終濃度 1 0%となるようにトレハロースを添加し （実 施品 8、 9、 1 0のみ添加） 、 5〇 しの 〇[¾増幅反応液を調製した。 〇 の反応温度と時間は、 表 5に示す条件で実施した。

[0037]

表 3

※各 ！ の p 尺緩衝液は、 ·の付いた物質による組成

〔 ^:0038 \¥0 2020/175406 20 20201007232

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実施例 5

［0039］ 〇［¾増幅後、 実施例 4で調製した実施品 8〜 1 6について、 アガロース 電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認したと ころ、 図 2のとおり、 2 !\/1 N a H ₂ P〇 ₄ -N a ₂ H P〇 ₄ （p H 6. 0） を用いたサンプル （実施品 8） では、 目的遺伝子の増幅が確認されたが、 クエン酸緩衝液を用いたサンプル は、 いずれも増幅が見られなかった。 また、 2mM N a H ₂ P0 ₄ -K0H （p H 6. 0） を用いたサンプル （実施品 1 1） では、 目的遺伝子の増幅が 確認されたが、 N a H ₂ P〇 ₄ -K〇H （p H 5. 0、 又は、 5. 5） を用い たサンプルは増幅が見られなかった。 さらにマッキルべイン緩衝液 （p H 5 . 0、 又は、 5. 5、 又は、 6. 0） を用いたサンプルでは、 増幅が見られ なかった。

実施例 6

[0040] （T h e r mo c o c c u s属由来 D N Aポリメラーゼにおける酸性条件下 での遺伝子増幅 反応液中の緩衝液及び塩化カリウムの濃度の 影響）

PC R反応時の終濃度として、 表 6に示す組成のものを PC R緩衝液とし た。 各 PC R緩衝液に、 2. 5 mM d NT Pを 4 !_、 0. 1 % B S A を 2. 5 !_、 0. 01 % T r i t o n X— 1 00を 5 !_、 1 0^M フォワードプライマー （1） 及びリバースプライマー （2） : GCATTGCCCGT CAGGCTAATTCTGAAを各 2 !_、 6. n g/^LのスーDNAを 2. 5 !_、 実施例 1で取得した T h e r mo c o c c u s属由来の D N Aポリメラーゼ を 1 M L添力□し、 5〇M Lの PC R増幅反応液を調製した。 また、 PCRの 反応温度と時間は、 表 7に示す条件で実施した。

[0041]

\¥0 2020/175406 22 20201007232

術卜

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実施例 7

[0042] 〇［¾増幅後、 実施例 6で調製した実施品 1 7〜 2 2について、 アガロ ス電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認した ところ、 図 3のとおり、 5 0 171 M N a H ₂ P〇 ₄ -N aOH （p H 5. 5） を用いたサンプルでは、 5 mM KC I及び 30mM KC I を添加したサンプル （実施品 1 7及び 1 8） において目的遺伝子の増幅が確認されたが、 50 m M KC I を添加したサ ンプルにおいては増幅が見られなかった。 また、 1 00mM N a H ₂ P〇 ₄ - N a 0 H （p H 5. 5） を用いたサンプルでは、 5、 30、 50 mM K C l を添加したいずれのサンプルでも増幅が見ら れなかった。

実施例 8

[0043] （遺伝子増幅反応におけるマグネシウム濃度 の影響）

PC R反応時の終濃度として、 表 8に示す組成のものを PC R緩衝液とし た。 各 PC R緩衝液に、 2. 5 mM d NT Pを 4 1_、 0. 1 % B S A を 2. 5 !_、 0. 01 % T r i t o n X— 1 00を 5 !_、 1 0^M フォワードプライマー （1） 及びリバースプライマー （2） を各 2 し、

6. 4 n g / Lのスー DNAを 1 L、 実施例 1で取得した T h e r mo c o c c u s属由来の D N Aポリメラーゼを 1 L添加し、 50 !_の PC R増幅反応液を調製した。 PCRの反応温度と時間は、 表 7に示す条件で実 施した。

実施例 9

[0044] PCR増幅後、 実施例 8で調製した実施品 23〜 27について、 アガロー ス電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認した ところ、 図 4のとおり、 PCR 反応時の終濃度で 2、 4、 6mM Mg C 丨 ₂ を含む PCR緩衝液を用いたサ ンプル （実施品 24〜 26） において、 目的遺伝子の増幅が確認された。 ま た、 P C R増幅反応後の溶液中のピロリン酸をピロリ� �酸測定キッ ト （商品 名 ： P P i L i g h t I n o r g a n i c P y r o p h o s p h a t e A s s a y、 L〇 N Z A製） を用いて測定したところ、 表 9のとおりとなり 、 PC R反応時の終濃度で 2 mM Mg C 丨 ₂ を含む PCR緩衝液を用いた時 に、 最もピロリン酸量が高かった。 なお、 ピロリン酸量は最も高い値を 1 0 0%として相対値で示した。

[0045] \¥0 2020/175406 24 卩（：17 2020 /007232

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実施例 10

［0046］ （遺伝子増幅反応における塩化カリウム濃度 の影響）

〇［¾反応時の終濃度として、 表 1 0示す組成のものを 〇 緩衝液とし た。 各 PC R緩衝液に、 2. 5 mM d NT Pを 4 1_、 0. 1 % B S A を 2. 5 !_、 0. 01 % T r i t o n X— 1 00を 5 ^L、 1 0^M フォワードプライマー （1） 及びリバースプライマー （2） を各 2 し、

6. 4 n g / Lのスー DNAを 1 L、 実施例 1で取得した T h e r mo c o c c u s属由来の D N Aポリメラーゼを 1 L添加し、 50 !_の PC R増幅反応液を調製した。 PCRの反応温度と時間は、 表 7に示す条件で実 施した。

実施例 11

[0047] PCR増幅後、 実施例 1 0で調製した実施品 28〜 33について、 アガロ —ス電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認し たところ、 図 5のとおり、 PC R反応時の終濃度で 30、 50、 75、 又は 1 00 mM KC I を含む PC R緩衝液を用いたサンプル （実施品 30〜 33） において、 目的遺伝子の増 幅が確認された。 また、 P C R増幅反応後の溶液中のピロリン酸をピロリ� � 酸測定キッ ト （商品名 ： P Pi Li g h t I n o r g a n i c P y r o p h o s p h a t e A s s a y、 L〇N Z A製） を用いて測定したところ、 表 1 1のとおり、 PCR反応時の終濃度で 75、 又は 1 00mM KC I を 含む PC R緩衝液を用いた時に、 最もピロリン酸量が高かった。 なお、 ピロ リン酸量は、 最も高かった値を 1 〇〇%として相対値で示した。

[0048]

\¥0 2020/175406 26 卩(：17 2020 /007232

実施例 12

［0049］ （酸性条件下での遺伝子増幅反応におけるト レハロース添加効果）

〇［¾反応時の終濃度として、 表 1 2に示す組成のものを 〇 緩衝液と した。 各 PC R緩衝液に、 2. 5 mM d NT Pを 4 !_、 1 0^M フォ ワードプライマー（ 1）及びリバースプライマー（ 1）を各〇 4 M L、 6. 4 n 9/ 1_のス_0 八を 1 1_、 E x T a q HSポリメラーゼを 0. 2 5 M L添加し、 5 O M Lの遺伝子増幅反応液を調製した。 PCRの反応温度 と時間は、 表 5に示す条件で実施した。

実施例 13

[0050] PCR増幅後、 実施例 1 2で調製した実施品 34〜 37について、 アガロ

—ス電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認 したところ、 図 6のとおり、 全て のサンプルについて、 目的遺伝子の増幅が確認された。 また、 反応後の溶液 中のピロリン酸をピロリン酸測定キッ ト （商品名 ： P P i L i g h t I n o r g a n i c P y r o p h o s p h a t e A s s a y、 L〇N Z A製） を用いて測定したところ、 表 1 3のとおり、 トレハロースを添加した方が遺 伝子増幅反応で生じるピロリン酸量が多くな った。 なお、 ピロリン酸量は最 も高かった値を 1 00 %として相対値で示した。

[0051]

\¥0 2020/175406 28 20201007232

52

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術 _{2 I}

[0052] [比較例 1 ]

（本発明と公知文献記載の遺伝子増幅反応組 成における酸性条件下での遺伝 子増幅反応の比較） \¥02020/175406 29 卩（：170? 2020 /007232

市販の〇 八ポリメラーゼ （商品名 ： 巳父 丁 39 1 ^~ 13、 タカラバイオ 製） の添付資料に記載の組成をもとに緩衝液のみ 2 IV! ₃ 1 ^~ 1 ₂ ?〇 ₄ _ 3 ₂ 1 ^~ 1 ?〇 ₄ （ 1 ^~ 16. 0） に変更し、 〇 反応時の終濃度として、 表 1 4 に示す比較品 1の組成のものを 0 緩衝液とした。 0 緩衝液を 5 !_

、 2. 5〇11\/1 丁 を 4 1_、 1 0 1\/1 フォワードプライマー（1）及 びリバースプライマー（ 1）を各 0.4 !_、 6. 4 n g/MLのスー〇 八を 1 1_、 巳父 7 a q 1 ^~ 13ポリメラーゼを〇. 25 1_添加し、 50 1_ の遺伝子増幅反応液を調製した。 の反応温度と時間は、 表 5に示す条 件で実施した。

実施例 14

［0053］ 〇 反応時の終濃度として、 表 1 4の実施品 38の組成のものを

緩衝液とした。 緩衝液に、 2. 5 1\/1 1\1丁？を 4 ! -、 1 0 1\/1 フォワードプライマー（ 1）及びリバースプライマー（ 1）を各 0.4 し、 6 . 4 n g/MLのスー〇 八を 1 !_、 º X 7 a q 1 ^~ 13ポリメラーゼを 〇. 25 し添加し、 5〇 しの遺伝子増幅反応液を調製した。 〇［¾の反 応温度と時間は、 表 5に示す条件で実施した。 また、 表 1 4の実施品 39の 組成のものを 〇 緩衝液とし、 緩衝液に、 2. 5 1\/1 1\1丁？を 4 !_、 〇. 1 % 巳3八を 2. 5 !_、 〇. 01 %、 7 V \ I〇 n X- 1 00を 5 ! -、 1 0 !\/1 フォワードプライマー（ 1）及びリバースプライ マー（2）を各 2 !_、 6. 4门 9/ !_のスーロ 八を 1 !_、 丁 1"16 「 111

〇〇〇〇〇リ 3属由来の口 八ポリメラーゼを 1 !_添加し、 50 !_の遺 伝子増幅反応液を調製した。 また、 の反応温度と時間は、 表 7に示す 条件で実施した。

[0054] \¥0 2020/175406 30 卩(：17 2020 /007232 術寸 _I

実施例 15

[0055] 増幅後、 比較例 1及び実施例 1 6で調製した比較品 1及び実施品 3

8、 3 9について、 アガロース電気泳動にて目的遺伝子の増幅を 確認したと ころ、 図 7のとおり、 従来の遺伝子増幅組成では、 遺伝子増幅が認められな かったが、 緩衝液の種類や塩化カリウム濃度を変えるこ とにより、 酸性条件 下で遺伝子増幅が認められた。

実施例 16

[0056] （B a c i l l u s s u b t i l i sバクテリオファージ由来の D N Aポ リメラーゼにおける酸性条件下での遺伝子増 幅反応液中の緩衝液の影響） PCR反応時の終濃度として、 表 1 5に示す組成のものを PC R緩衝液とし た。 〇[¾緩衝液2 1_に、 0.5 ja g/jaL· p UC 1 9を 1 1_、 1 00 M - 1 3 Fプライマー： CAGTCGTCATGCATTGCCTGCTCを 2 L、 滅菌水 を 5 !_添加した、 1 0 M Lのテンプレート混合液を調製した。 テンプレー 卜混合液を 95°C、 1分加熱後、 30°Cまで 0. 1 °C/秒で冷却した。 冷却後 、 〇[¾緩衝液2 1_に、 25 mM d NT Pを 0.8 1_、 1 00 mM D TTを 1 1_、 1 00 U/mL ピロホスファターゼを 0.2 L、 50^9 /mL B a c i l l u s s u b t i l i sバクテリオファージ由来の D N Aポリメラーゼを 2M L、 滅菌水を 4M L添加した、 1 〇M Lの反応混合 液をテンプレート混合液に添加し、 30 ^° C、 1 6時間の PC R反応を行った

[0057]

\¥0 2020/175406 32 20201007232

94 ^ !※：： _/ ^.. - _{¾ ¾} ^ · " - ^ * "" ₀ - _6:

実施例 17

［0058］ 〇［¾増幅後、 実施例 1 6で調製した実施品 4 0〜 4 4について、 アガロ ス電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認した ところ、 図 8のとおり、 3 5 171 M クエン酸ークエン酸ナトリウム p H 4.0、 35 m M クエン酸ークエ ン酉愛ナトリウム p H4.5、 35 mM N a H ₂ P〇 ₄ -N a〇H p H 5. 0及び、 35 mM N a H ₂ P〇 ₄ -N a ₂ H P〇 ₄ p H 6. 0を用いたサン プル （実施品 4 1〜 44） で、 目的遺伝子の増幅が確認され、 酸性条件下に おいて室温付近で遺伝子増幅を行うことで、 p H 4台において酸性条件下で も遺伝子増幅させることができることが認め られた。

実施例 18

[0059] （B a c i l l u s s u b t i l i sバクテリオファージ由来の D N Aポ リメラーゼにおける酸性条件下での遺伝子増 幅反応液中の塩化カリウム濃度 の影響）

PCR反応時の終濃度として、 表 1 6に示す組成のものを PC R緩衝液とし た。 〇[¾緩衝液2 1_に、 0.5 ja g/jaL· p UC 1 9を 1 1_、 1 00 M- 1 3 Fプライマー： CAGTCGTCATGCATTGCCTGCTCを 2 L、 滅菌水を 5 !_添加した、 1 0 M Lのテンプレート混合液を調製した。 テンプレート 混合液を 95 °C、 1分加熱後、 30°Cまで 0. 1 °C/秒で冷却した。 冷却後、 〇[¾緩衝液2 !_に、 25 mM d NT Pを 0.8 !_、 1 00 mM DT Tを 1 1_、 1 00 U/mL ピロホスファターゼを 0.2 L、 50^9/ m L B a c i l l u s s u b t i l i sバクテリオファージ由来の D N Aポリメラーゼを 2M L、 滅菌水を 4M L添加した、 1 〇M Lの反応混合液 をテンプレート混合液に添加し、 30 ^° C、 1 6時間の PC R反応を行った。

[0060]

\¥0 2020/175406 35 卩（：170? 2020 /007232

8反応時の終濃度で 7 5、 1 1 5、 又は、 1 2 5 1\/1 ＜（3 丨 を含む 〇［¾ 緩衝液を用いたサンプル （実施品 4 5〜 4 7） において、 目的遺伝子の増幅 が確認された。

［0062］ 以上の結果から、 本発明方法における遺伝子増幅反応では、 〇 八ポリメ ラーゼを用いて、 酸性条件下で測定対象の遺伝子を選択的且つ 簡便に増幅さ せることができた。 実施例 2〜 7に示されるように、 各種〇 八ポリメラー ゼにおいて、 緩衝液の種類や該緩衝液と塩化カリウムの濃 度を適切な範囲に 設定することよって酸性条件下での遺伝子増 幅が変化することが分かった。 また、 実施例 8〜 1 1及び、 実施例 1 8〜 1 9に示されるように、 反応液中 のマグネシウムや塩化カリウム濃度を適切な 範囲に設定し、 実施例 1 2〜 1 3に示されるように、 トレハロースを反応液に添加することによっ ても酸性 条件下での遺伝子増幅が変化することが分か った。 また、 比較例 1及び実施 例 1 4〜 1 5に示されるように、 従来の遺伝子増幅条件では、 酸性条件下で 遺伝子増幅が起こらなかったが、 本発明方法に於いて、 緩衝液の種類や塩化 カリウム濃度を適切な範囲に設定することで 、 酸性条件下でも遺伝子増幅さ せることができることが分かった。 さらに実施例 1 6〜 1 7に示されるよう に、 室温付近で遺伝子増幅を行う場合には、 ! ! 4台の酸性条件下でも遺伝 子増幅させることができることが分かった。

産業上の利用可能性

［0063］ 従来の遺伝子増幅条件では、 酸性条件下で口 八ポリメラーゼを反応させ る具体的な組成や条件が示されていなかった 。 これに対して、 本発明に係る 遺伝子増幅法に於いては、 酸性条件下で測定対象の遺伝子を増幅させる ため の適切な緩衝液、 各種塩類、 添加物等の反応組成及び反応条件を見出し、 酸 性条件下で測定対象の遺伝子を増幅させるこ とができた。 その結果、 本発明 に係る遺伝子増幅法は、 遺伝子増幅反応で産生したプロトンが蓄積し ても問 題なく反応が進む。 その結果、 優れた遺伝子検出技術として有用である、 ピ ロリン酸を特異的に認識するピリジルボロン 酸を用いた遺伝子検出法等に本 発明の遺伝子増幅法で用いた酸性反応液を直 ちに利用することが可能である \¥0 2020/175406 36 卩（：17 2020 /007232

。 更に、 本発明方法は、 蛍光試薬を使用する必要がなくて安価である 。