L'invention concerne plus particulièrement la transformation des cellules végétales et des plantes, l'androctonine produite par les plantes transformées leur conférant une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.

Il existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes contre les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter, d'avoir recours à des traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de protéger 1'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies consiste à transformer les plantes de manière qu'elles produisent des substances à mme d'assurer leur défense contre ces maladies.

On connaît différentes substances d'origine naturelle, en particulier des peptides, présentant des propriétés bactéricides ou fongicides, notamment contre les champignons responsables des maladies des plantes. Toutefois, le problème consiste à trouver de telles substances qui pourront non seulement tre produites par des plantes transformées, mais encore conserver leurs propriétés bactéricides ou fongicides et les conférer aux dites plantes. Au sens de la présente invention, on entend par bactéricide ou fongicide tant les propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites que les propriétés bactériostatiques ou fongistatiques.

Les androctonines sont des peptides produits par les scorpions, en particulier de 1'espèce Androctonus australis. Une androctonine et sa préparation par synthèse chimique est décrite par Ehret-Sabatier & coll., de mme que ses propriétés antifongiques et antibactériennes in vitro.

On a maintenant identifié les gènes des androctonines, et on a également trouvé qu'ils pouvaient tre insérés dans un organisme hôte, en particulier une plante, pour exprimer une androctonine tant pour la préparation et l'isolation de cette androctonine que pour conférer au dit organisme hôte des propriétés de résistance aux maladies fongiques et aux maladies d'origine bactérienne, apportant une solution particulièrement avantageuse au

problème énoncé ci-dessus.

L'invention a donc d'abord pour objet un fragment d'acide nucléique codant pour une androctonine, un gène chimère comprenant ledit fragment codant pour une androctonine ainsi que des éléments de régulation en position 5'et 3'hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier dans les plantes et un vecteur pour la transformation des organismes hôtes contenant ce gène chimère, et l'organisme hôte transformé. Elle concerne aussi une cellule végétale transformée contenant au moins un fragment d'acide nucléique codant pour une androctonine et une plante résistante aux maladies contenant la dite cellule, en particulier régénérée à partir de cette cellule. Elle concerne enfin un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention.

Par androctonine, on entend selon l'invention tout peptide pouvant tre produit et isolé des scorpions, en particulier de l'espèce Androctonus australis ces peptides comprenant au moins 20 acides aminé, de préférence au moins 25, et 4 résidus cystéine formant entre eux des ponts disulfure. De manière avantageuse, I'androctonine comprend essentiellement la séquence peptidique de formule générale (I) suivante : Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae (I) dans laquelle Xaa représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, Xab représente un reste peptidique de 5 acides aminés, Xac représente un reste peptidique de 5 acides aminés, Xad représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et Xae représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé.

De manière avantageuse, Xab et/ou Xad et/ou Xae comprennent au moins un acide aminé basique, de préférence 1. Par acides aminé basique, on entend selon l'invention les acides aminés choisis parmi la lysine, l'aspargine ou l'homoaspargine.

De manière préférentielle, Xaa représente la séquence peptidique Xaa'-Val, dans laquelle Xaa'représente NH2 ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, et/ou Xab représente la séquence peptidique-Arg-Xab'-Ile, dans laquelle Xab'représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou Xac représente la séquence peptidique-Arg-Xac'-Gly-, dans laquelle Xac'représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou

Xad représente la séquence peptidique-Tyr-Xad'-Lys, dans laquelle Xad'représente un reste peptidique de 1 acide aminé, et/ou Xae représente la séquence peptidique-Thr-Xae', dans laquelle Xae'représente COOH ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé.

De manière plus préférentielle, Xaa'représente la séquence peptidique Arg-Ser-, et/ou Xab'représente la séquence peptidique-Gln-Ile-Lys-, et/ou Xac'représente la séquence peptidique-Arg-Arg-Gly-, et/ou Xad'représente le reste peptidique-Tyr-, et/ou Xae'représente la séquence peptidique-Asn-Arg-Pro-Tyr.

Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, I'androctonine est représentée par la séquence peptidique de 25 acides aminés décrite l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1) et les séquences peptidiques homologues.

Par séquences peptidiques homologues, on entend toute séquence équivalente comprenant au moins 65 % d'homologie avec la séquence représentée par l'identificateur de séquence n° l, étant entendu que les 4 résidus cystéine et le nombre d'acides aminés les séparant restent identiques, certains acides aminés étant remplacés par des acides aminés différents mais équivalents sur des sites n'induisant pas de modification substantielle de l'activité antifongique ou antibactérienne de la dite séquence homologue. De préférence, les séquences homologues comprennent au moins 75 % d'homologie, plus préférentiellement au moins 85 % d'homologie, encore plus préférentiellement 90 % d'homologie.

Le résidu NH2-terminal de l'androctonine peut présenter une modification post traductionnelle, par exemple une acétylation, alors que le résidu C-terminal peut présenter une modification post traductionnelle, par exemple une amidation.

Par séquence peptidique comprenant essentiellement la séquence peptidique de formule générale (I), on entend non seulement les séquences définies ci-dessus, mais également de telles séquences comprenant à l'une ou l'autre de leurs extrémités, ou les deux, des résidus peptidiques nécessaires à leur expression et ciblage dans un organisme hôte, en particulier une cellule végétale ou une plante.

Il s'agit en particulier d'un peptide de fusion « peptide-androctonine » ou « androctonine-peptide », avantageusement « peptide-androctonine », dont la coupure par les systèmes enzymatiques des cellules végétales permet la libération de l'androctonine,

définie ci-dessus. Le peptide fusionné à l'androctonine peut tre un peptide signal ou un peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de l'androctonine de manière spécifique dans une partie de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante, comme par exemple le cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans un type particulier de compartiments cellulaires ou de tissus ou dans la matrice extracellulaire.

Selon un mode de réalisation, le peptide de transit peut tre un signal d'adressage chloroplastique ou mitochondrial, lequel est ensuite clivé dans les chloroplastes ou les mitochondries.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide signal peut tre un signal N-terminal ou « prépeptide) >, éventuellement en association avec un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, ou un peptide d'adressage vacuolaire ou « propeptide ». Le réticulum endoplasmique est le lieu où sont pris en charge par la « machinerie cellulaire » des opérations de maturation de la protéine produite. comme par exemple le clivage du peptide signal.

Les peptides de transit peuvent tre soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande EP 0 508 909.

Comme peptide de transit utile selon l'invention, on peut citer en particulier le peptide signal du gène PR-la du tabac (WO 95/19443), représenté avec sa séquence codante par l'identificateur de séquence n° 2 (SEQ ID NO 2) et fusionné à l'androctonine par l'identificateur de séquence n° 3 (SEQ ID NO 3), en particulier correspondant à la protéine de fusion correspondant aux bases 12 à 176 de cette séquence, en particulier lorsque l'androctonine est produite par des cellules végétales ou des plantes, ou le précurseur du facteur Mat oc l lorsque l'androctonine est produite dans des levures..

La présente invention concerne donc d'abord un fragment d'acide nucléique, en particulier d'ADN, codant pour l'androctonine définie ci-dessus. Il peut s'agir selon l'invention d'un fragment isolé de Androctonus australis, ou encore un fragment dérivé, adapté pour 1'expression de l'androctonine dans l'organisme hôte où le peptide sera

exprime. le fragment d'acide nucléique peut tre obtenu selon les méthodes standards d'isolation et de purification, ou encore par synthèse selon les techniques usuelles d'hybridations successives d'oligonucléotides synthétiques. Ces techniques sont notamment décrites par Ausubel & coll.

Selon la présente invention, on entend par « fragment d'acide nucléique » une séquence nucléotidique pouvant tre de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, en particulier ADNc, notamment double brin.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le fragment d'acide nucléique codant pour l'androctonine est la séquence d'ADN décrite par l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence, plus particulièrement la partie codante de cette SEQ ID Nô 1, correspondant aux bases 1 à 75.

Par « homologue », on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique décrite par l'identificateur de séquence n° 1 et codant pour l'androctonine.

Ces modifications peuvent tre obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à 1'expression d'un mme acide aminé, les différences entre la séquence de référence décrite par l'identificateur de sequence n° 1 et l'homologue peuvent tre importantes, d'autant plus qu'il s'agit d'un fragment d'ADN de taille inférieure à 100 acides nucléiques, réalisable par synthèse. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de I'androctonine résultante.

La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5'et 3'hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier les cellules végéales ou les plantes, liés de manière fonctionnelle à ladite séquence codante, ladite séquence codante comprenant au moins un fragment d'ADN codant pour landroctonine tel que défini ci-dessus (y compris le peptide de fusion « peptide- androctonine » ou « androctonine-peptide »).

Par organisme hôte. on entend tout organisme mono ou pluricellulaire. inférieur ou supérieur dans lequel le gène chimère selon l'invention peut tre introduit, pour la production d'androctonine. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. colis de levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, de champignons, en particulier Aspergillus, d'un bacylovirus, ou de préférence des cellules végétales et des plantes.

Par"cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.

On entend par"plante"selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le mais, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc.

Les éléments de régulation nécessaires à 1'expression du fragment d'ADN codant pour 1'androctonine sont bien connus de l'homme du métier en fonction de l'organisme hôte. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des peptides de transit, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier.

Pour la transformation des microorganismes comme les levures ou les bactéries, les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier, et comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de trancription, des peptides de transit, des séquences terminatrices et des codons start et stop.

Pour diriger 1'expression et la sécrétion du peptide dans le milieu de culture de la levure, un fragment d'ADN codant l'héliomycine est intégré dans un vecteur navette qui comprend les éléments suivants : -des marqueurs permettant de sélectionner les transformants, -une séquence nucléique permettant la réplication (origine de réplication) du plasmide dans la levure.

-une séquence nucléique permettant la réplication (origine de réplication) du plasmide dans E. coli, -une cassette d'expression constituée

(I) d'une séquence de régulation promotrice, (2) d'une séquence codant pour un peptide signal (ou prépeptide) en association avec un peptide d'adressage (ou propeptide, (3) d'une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation.

Ces éléments ont été décrits dans plusieurs publications dont Reichhart et al., 1992, Invert. Reprod. Dev., 21, pp 15-24 et Michaut et al., 1996, FEBS Letters, 395, pp 6-10.

De manière préférentielle, on transforme des levures de l'espece S cerevisiae avec le plasmide d'expression par la méthode à l'acétate de lithium (Ito et al., 1993, J.

Bacteriol, 153, pp 163-168).

L'invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes. Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) ou d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou un promoteur inductible par les pathogènes comme le PR-la du tabac, tout promoteur convenable connu pouvant tre utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante de manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698.

Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington & Freed.

Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.

Selon la présente invention, le gène chimère peut également tre associé à un marqueur de sélection adapté à l'organisme hôte transformé. De tels marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme du métier. Il pourra s'agir d'un gène de résistance aux antibiotiques, ou encore un gène de tolérance aux herbicides pour les plantes.

La présente invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication, et le cas échéant un marqueur de sélection approprié. Ce vecteur peut tre constitué par un plasmide, un cosmide. un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.

Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut tre employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.

L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales par intégration d'au moins un fragment d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut tre obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention.

Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri dagrobacterium rhi_ogenes.

D'autres méthodes peuvent tre utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.

L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.

La présente invention a encore pour objet les organismes hôtes, en particulier cellules végétales ou plantes, transformés et contenant une quantité efficace d'un gène chimère comprenant une séquence codante pour l'androcionine définie ci-dessus.

La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La

régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus.

Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants : US 4,459,355, US 4t536, 475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565, 346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5, 489, 520, US 5, 510,318, US 5,204,253, US 5,405, 765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234. EP 539 563, EP 674 725 WO 91/02071 et WO 95/06128.

La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.

Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en particulier à certaines maladies fongiques ou bactériennes. De ce fait, la séquence d'ADN codant pour 1'androctonine peut tre intégrée avec pour objectif principal la réalisation de plantes résistantes aux dites maladies, 1'androctonine étant efficace contre des maladies fongiques telles que celles causées par Cercospora, en particulier Cercospora beticola, Citiclosporilim en particulier Cladospori2lm herbarum Fusarillm, en particulier Fusarium culrnorutnz ou Ftlsarizl) n gral71inearzgm, en particulier Phytophthora, cinrmrfnomi.

Le gène chimère pourra également tre associé, et de manière avantageuse, à au moins un marqueur de sélection, tel qu'un ou plusieurs gènes de tolérance aux herbicides.

La séquence d'ADN codant pour l'androctonine peut également tre intégrée comme marqueur de sélection lors de la transformation de plantes avec d'autres séquences codant pour d'autres peptides ou protéines d'intért, comme par exemple des gènes de tolérance aux herbicides.

De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de l'homme du métier et notamment décrits dans les demandes de brevet EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 ou WO 97/04103.

Bien entendu, les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent comprendre outre la séquence codant pour l'androctonine, d'autres séquences hétérologues codant pour des protéines d'intért comme d'autres peptides complémentaires susceptibles de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou

fongique, et/ou d'autres séquences codant pour des protéines de tolérance aux herbicides, notamment définies ci-dessus et/ou d'autres séquences codant pour des protéines de résistance aux insectes, comme les protéines Bt notamment.

Les autres séquences peuvent tre intégrées au moyen du mme vecteur comprenant le gène chimère selon l'invention, lequel comprend une séquence codant pour 1'androctonine, et comprenant au moins un autre gène comprenant une autre séquence codant pour un autre peptide ou protéine d'intért.

Elles peuvent également tre intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant au moins la dite autre séquence, selon les techniques usuelles définies ci-dessus.

Les plantes selon l'invention peuvent encore tre obtenues par croisement de parents, l'un portant le gène selon l'invention codant pour 1'androctonine, l'autre portant un gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intért.

Parmi les séquences codant pour d'autres peptides antifongiques, on peut citer celle codant pour la drosomicine, décrite dans la demande de brevet FR 2 725 992 et par Fehlbaum & coll. (1994), et dans la demande de brevet non publiée FR 97 09115 déposée le 24 juillet 1997.

La présente invention concerne enfin un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention. le procédé consistant à planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un milieu de culture, en particulier d'un champ, approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.

Par composition agrochimique, on entend selon l'invention toute composition agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant l'une des activités suivantes, herbicide, fongicide, bactéricide, virucide ou insecticide.

Selon un mode préférentiel de réalisation du procédé de culture selon l'invention, la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité fongicide et/ou bactéricide, plus préférentiellement présentant une activité complémentaire de celle de l'androctonine produite par les plantes transformées selon l'invention.

Par produit présentant une activité complémentaire de celle de l'androctonine, on entend selon l'invention un produit présentant un spectre d'activité complémentaire, c'est

à dire un produit qui sera actif contre des attaques de contaminants (champignons, bactéries ou virus) insensibles à I'androctonine, ou encore un produit dont le spectre d'activité recouvre celui de I'androctonine, totalement ou en partie, et dont la dose d'application sera diminuée de manière substantielle du fait de la présence de 1'androctonine produite par la plante transformée.

Enfin, la culture des organismes hôtes transfomrés permet de produire de l'androctonine à large échelle. La présente invention concerne donc également un procédé de préparation de l'androctonine, comprenant les étapes de culture de l'organisme hôte transformé comprenant un gène codant pour l'androctonine tel que défini ci-dessus dans un milieu de culture approprié, puis l'extraction et la purification totale ou partielle de l'androctonine obtenue.

Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, la préparation de la séquence codant pour 1'androctonine, du gène chimère, du vecteur d'intégration et des plantes transformées. Les figures 1 à 5 en annexe décrivent les structures schématiques de certains plasmides préparés pour la construction des gènes chimères. Dans ces figures, les différents sites de restriction sont marqués en italiques.

Exemple 1 : Construction des gènes chimères Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits dans Ausubel & coll. pRPA-MD-P : Création d'un plasmide contenant le signal peptide du gène PR-la du tabac.

Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 1 et Oligo 2 ci- après. sont hybrides à 65 °C pendant 5 minutes puis par diminution lente de la température à 30°C pendant 30'.

Oligo 1 51 GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3' Oligo : : 5'TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3'

Après hybridation entre l'Oligo 1 et l'Oligo 2, I'ADN reste simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin à partir de l'extrémité 3'de chaque oligo. L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite digéré par les enzymes de restriction SacII et lVaeI et cloné dans le plasmide pBS II SK (-) (Stratagene) digéré par les mme enzymes de restriction. On obtient alors un clone comprenant la région codant pour peptide signal du gène PR-la du tabac (SEQ ID NO 2). pRPA-PS-PRla-andro : Création d'une séquence codant pour I'androctonine fusionée au signal peptide PR-la sans région non transcrite en 3'.

Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires de séquences Oligo 3 et Oligo 4 selon les conditions opératoires décrites pour pRPA-MD-P.

Oligo 3 : 5'AGGTCCGTGT GCAGGCAGAT CAAGATCTGC AGGAGGAGGG GTGG 3' Oligo 4 : 5'CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCAGTATG GCCTGTTAGT GCACTTGTAG TAGCAACCAC CCCTCCTCCT GCAGATCTTG ATCTGCC 3' Après hybridation entre l'Oligo 3 et l'Oligo 4,1'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin à partir de l'extrémité 3'de chaque oligo. Cet oligonucléotide double brin contenant la partie codante de 1'androctonine (SEQ ID NO 1) est ensuite clone directement dans le plasmide pRPA-MD-P qui a été digéré avec 1'enzyme de restriction NaeI.

L'orientation correcte du clone obtenu est vérifiée par séquençage. On obtient alors un clone comprenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine située entre les sites de restriction NcoI à 1'extrémité N-terminale et ScaI, SacII et BamHl à l'extrémité C-terminale (SEQ ID NO 3). pRPA-RD-238 : Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant la la séquence codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine.

Le plasmide pRTL-2 GUS, dérivé du plasmide pUC-19, a été obtenu auprès du Dr.

Jim Carrington (Texas A&M University, non décrit). Ce plasmide dont la structure schématique est représentée sur la figure 1, contient le promoteur CaMV 35S dupliqué isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Promoteur CaMV 2x35S ; Odell & coll., 1985) qui dirige 1'expression d'un ARN contenant séquence non traduite en 5'du virus etch du tabac (TEV 5'UTR : Carrington & Freed. 1990), le gène de la p-glucuronidase de E. coli (GUS Jefferson & coll., 1987) suivi du site de polyadenylation de l'ARN 35S de CaMV (CaMV polyA ; Odell & coll., 1985).

Le plasmide pRTL-2 GUS est digéré avec les enzymes de restriction NcoI et BamHI et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-PS-PRIa-andro est digéré avec les enzymes de restriction Ncol et BamHI et le petit fragment d'ADN contenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine est purifié. Les deux fragments d'ADN purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétise une protéine de fusion PR-la-androctonine. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 2. « PR-la- androctonine » représente la région codante pour la protéine de fusion PR-la-androctonine de pRPA-RD-230. L'androctonine est transportée vers la matrice extra-cellulaire de la plante par l'action du peptide signal PR-la. pRPA-RD-195 : Création d'un plasmide contenant un site de clonage multiple modifié.

Le plasmide pRPA-RD-195 est un plasmide dérivé du pUC-19 qui contient un site de clonage multiple modifié. Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 5 et Oligo 6 ci-après, sont hybrides et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-MD-P.

Oligo 5 : 5'AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3' Oligo 6 : 5'CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3' L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite lié dans pUC-19 qui a été préalablement digéré avec les enzymes de restriction EcoRl et HindIII et rendu bouts

francs en employant le fragment klenow de 1'ADN polymérase I de E. coli. On obtient un vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter l'introduction des cassettes d'expression dans un plasmide vecteur d'Agrobacteriurn tlo7lefaciens. La structure schématique de ce site de clonage multiple est représentée sur la figure 3. pRPA-RD-233 : Introduction de la cassette d'expression de PR-la-androctonine de pRPA-RD-230 dans pRPA-RD-195.

Le plasmide pRPA-RD-230 est digéré avec 1'enzyme de restriction HindIII. Le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de PR-la-androctonine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RP-195 qui a été préalablement digéré avec 1'enzyme de restriction HindIII et déphosphorylé avec la phosphatase intestinale de veau. pRPA-RD-174 : Plasmide dérivé de pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) contenant le gène de tolérance au bromoxynil de pRPA-BL-237 (EP 0 508 909).

Le gène de tolérence au bromoxynil est isolé de pRPA-BL-237 par une amplification génique par PCR. Le fragment obtenu est à bouts francs et est clone dans le site EcoRl de pRPA-BL-150A qui a été rendu bouts francs par l'action de la polymérase klenow dans des conditions standard. On obtient un vecteur d'Agrobacterizrrn lumefaciens qui contient le gène de tolérance au bromoxynil à proximité de sa bordure droite, un gène de tolérance à la kanamycine à proximité de sa bordure gauche et un site de clonage multiple entre ces deux gènes.

La structure schématique de pRPA-RD-174 est représentée sur la figure 4. Sur cette figure,"nos"représente le site de polyadenylation de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983)."NOS pro"représente le promoteur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983),"NPT II" représente le gène de la néomycine phosphotransphérase du transposon Tn5 de E. coli (Rothstein & coll., 1981),"35S pro"représente le promoteur 35S isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Odell & coll., 1985),"BRX"représente le gène de la nitrilase isolé de K ozaenae (Stalker & coll., 1988),"RB"et"LB"représentent respectivement les bordures droite et gauche de la séquence d'un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens.

pRPA-RD-184 : Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA-RD- 174.

Les oligonucleotides synthétiques complementaires Oligo 7 et Oligo 8 ci-après, sont hybrides et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-MD-P.

Oligo 7 : 5'CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 3' Oligo8 : 5'CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG 3' L'oligonucléotide double brin hybride (95 paires de bases) est purifié après séparation sur un gel d'agarose (3 % Nusieve, FMC). Le plasmide pRPA-RD-174 est digéré avec 1'enzyme de restriction XmaI, et le grand fragment d'ADN est purifié. Les deux fragents d'ADN obtenus sont ensuite liés.

On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la kanamycine marqueur de sélection.

La structure schématique du plasmide pRPA-RD-184 est représentée sur la figure 5 où les termes"nos","NPT II","NOS pro","35S pro","BRX gene","RB"et"LB"ont la mme signification que pour la figure 4. pRPA-RD-236 : Création d'un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la construction du gène codant pour 1'androctonine dirigée vers la matrice extracellulaire.

La plasmide pRPA-RD-233 est digéré avec les enzymes de restriction Pmel et Ascl et le fragment d'ADN contenant le gène de PR-la-androctonine est purifié. Le plasmide pRPA-RD-184 est digéré avec les mme enzymes de restriction. Le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de PR-la-androctonine est ensuite liée dans pRPA-RD- 184. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la séquence codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine qui conduit à 1'expression de l'androctonine dans la matrice extracellulaire de la plante.

Exemple 2 : Tolérance aux herbicides des tabacs transformés.

2.1- Transformation Le vecteurs pRPA-RD-236 est introduit dans la souche d'Agrobacterium numefczciens EHAIOI (Hood & coll., 1987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari & coll., 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh & coll.

(1985).

2. 2-Régénération La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30 g/1 de saccharose ainsi que 200 pg/ml de kanamycine. Les explants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in vitro et régénérées selon la technique des disques foliaires (Horsh & coll., 1985) en trois étapes successives : la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/1 de saccharose contenant 0,05 mg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours les pousses enracinées sont passées en terre.

2. 3-Tolérance au bromoxvnil Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour la construction pRPA-RD-236. Ces plantes ont été traitées en serre au stade 5 feuilles avec une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,2 kg de matière active bromoxynil par hectare.

Toutes les plantes montrant une tolérance complète au bromoxynil sont ensuites employées dans différentes expérimentations qui montrent que 1'expression de 1'androctonine par les plantes transformées les rend résistantes aux agressions fongiques.

REFERENCES Ausubel, F. A. & coll. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology. Publ. Wiley & Sons.

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Stalker & coll. (1988). J. Biol. Chem. 263 : 6310-6314.

Odell, J. T. & coll. (1985). Nature 313 : 810-812.