本発明のマイクロ総合分析システムは、� ��イクロチップ内の化学反応の進行に応じて� ��せられる蛍光の発光量に基づいてマイクロ� ��ップ内の測定部の標的分子の存在や量を測� ��するマイクロ総合分析システムであって、� ��該化学反応前後に蛍光発光量を測定し、か� ��当該蛍光発光量を測定する際に、マイクロ� ��ップ内の試薬及びマイクロチップ内の測定� ��位を含む反応系の温度を、当該化学反応前� ��において、同一となるように制御すること� ��特徴とする。この特徴は、請求の範囲第1項 乃至第6項に係る発明に共通する技術的特徴� �ある。

 なお、本願において、「マイクロチップ� ��とは、1枚の基板(チップ)上に数十~数百ミク ロンの微細流路(マイクロチャネル)を作製し� ��ものであって、当該チャネル内の小空間に� ��合、反応、分離、検出などの化学操作(分析 システム)等を集積化し可能としたものをい� �。また、「バイオ検査用マイクロチップ」� �は、上記マイクロチップであって、特にDNA,R NAなど核酸やタンパク質などのバイオ分子の� ��合、分離、合成、抽出などの化学操作と生� ��学反応を当該マイクロチップ内ですること� ��可能としたものである。「マイクロ総合分� ��システム(Micro Total Analysis Systems:μ-TAS)」と は、上記マイクロチップないしバイオ検査用 マイクロチップと化学操作・化学反応等の結 果生ずる物理化学的現象の分析装置とを組み 合わせて構成されるシステムをいう。

 本願において、「反応系の温度を、当該� ��学反応前後において、同一となるように制� ��する」とは、当該反応系の温度が、反応前� ��で温度差が±10%以内の差異で一致するよう� �制御することをいう。また、「サイクリン� �プローブ法」とは、[背景技術]の欄において 詳しく説明した核酸の標的配列等の検出方法 をいう。

 以下、図面に基づいて本発明の実施形態� ��構成要素等について詳細な説明をするが、� ��例であり、本実施形態に限定するものでは� ��い。

 ≪蛍光検出装置(検査装置)の構成≫
 〈外部構成〉
 図1は、本実施形態に係るマイクロチップを 用いる検査装置80の外観図である。検査装置8 0は、マイクロチップ1に予め注入された検体� ��試薬とを自動的に反応させ、反応結果を自� ��的に出力する装置である。

 検査装置80の筐体82には、マイクロチップ 1を装置内部に挿入するための挿入口83、表示 部84、メモリカードスロット85、プリント出� �口86、操作パネル87、外部入出力端子88が設� �られている。

 検査担当者は、図1の矢印方向にマイクロ チップ1を挿入し、操作パネル87を操作して検 査を開始させる。

 開始操作に伴って、後述するように、検� ��装置80内にあるマイクロチップ1内では蛍光� ��応が開始され、蛍光の検出結果に基づく検� ��結果が表示部84に表示される。

 検査結果は操作パネル87の操作により、� �リント出力口86よりプリントを出力したり、 メモリカードスロット85に挿入されたメモリ� ��ードに記憶したりすることができる。また� ��外部入出力端子88からケーブルを介して、� �ソコンなどに検査結果を転送し保存するこ� �ができる。検査終了後、検査担当者はマイ� �ロチップ1を挿入口83から取り出す。

 〈内部構成〉
 図2は、本実施形態に係るマイクロチップを 用いる検査装置80の内部構成図である。図2に おいては、マイクロチップが図1に示す挿入� �83から挿入され、セットが完了している状態 を示している。

 検査装置80は、マイクロチップ1に予め注� ��された検体及び試薬を送液するための駆動� ��11を貯留する駆動液タンク10、マイクロチッ プ1に駆動液11を供給するためのマイクロポン プ5、マイクロポンプ5とマイクロチップ1とを 駆動液11が漏れないように接続するパッキン6 、マイクロチップ1の必要部分を温調する温� �調節ユニット3、マイクロチップ1を温度調節 ユニット3及びパッキン6に密着させ、保持さ� ��るためのチップ押圧板2、チップ押圧板2を� �降させるための押圧板駆動部21、マイクロチ ップ1をマイクロポンプ5に対して正確に位置� ��めする規制部材22、マイクロチップ1内の検� ��と試薬との反応状態等を検出する光検出部4 、等を備えている。

 《チップ押圧板》
 チップ押圧板2は、初期状態においては、図 2に示す位置より上方に退避している。これ� �より、マイクロチップ1は矢印X方向に挿抜可 能であり、検査担当者は挿入口83(図1参照)か� ��規制部材22に当接するまでマイクロチップ1� ��挿入する。

 その後、チップ押圧板2は、押圧板駆動部 21により下降してマイクロチップ1に当接し、 マイクロチップ1の下面が温度調節ユニット3� ��びパッキン6に密着される。これにより、マ イクロチップ1のセットが完了する。

 規制部材22、押圧板2、温度調節ユニット3 及びパッキン6等で本発明のマイクロチップ� �容部が構成される。また、チップ押圧板2の� ��部には、セットされたマイクロチップ1の被 検出部125,126(図3参照。)を加熱するためのヒ� �タ23が設けられている。

 《温度調節ユニット》
 温度調節ユニット3は、マイクロチップ1と� �向する面にペルチェ素子31及びヒータ23を備� ��、マイクロチップ1が検査装置80にセットさ� ��たときに、ペルチェ素子31及びヒータ23がマ イクロチップ1に密着するようになっている� �試薬が収容されている部分をペルチェ素子31 で冷却して試薬が変性しないようにしたり、 検体と試薬とが反応する部分をヒータ23で加� ��して反応を促進させたりする。

 《光検出部》
 光検出部4は、本発明の発光部としてのLED等 の励起光源41、励起光源41から発せられた励� �光の波長帯域を制限する励起光フィルタ42、 励起光フィルタ42を透過した励起光をマイク� ��チップ1の2つの被検出部125,126(図3参照。)を� ��バーするサイズに適合したビームスポット� ��整形するための集光レンズ43、集光レンズ43 を透過した励起光を反射してマイクロチップ 1の2つの被検出部125,126に照射するとともに当 該励起光により発せられたマイクロチップ1� �被検出部125,126からの蛍光を透過するダイク� ��イック・ミラー44、ダイクロイック・ミラ� �44を透過した蛍光を受光部の47に導光するた� ��の受光レンズ45、受光レンズ45を透過した蛍 光の波長帯域を制限する検出光フィルタ46、� ��出光フィルタ46を透過した蛍光を受光する� �ォトダイオードからなる受光部47等から構成 されている。

 《マイクロポンプ》
 マイクロポンプ5は、ポンプ室52、ポンプ室5 2の容積を変化させる圧電素子51、ポンプ室52� ��マイクロチップ1側に位置する第1絞り流路53 、ポンプ室の駆動液タンク10側に位置する第2 絞り流路54、等から構成されている。第1絞り 流路53及び第2絞り流路54は絞られた狭い流路� ��なっており、また、第1絞り流路53は第2絞り 流路54よりも長い流路となっている。

 駆動液11を順方向(マイクロチップ1に向か う方向)に送液する場合には、まず、ポンプ� �52の容積を急激に減少させるように圧電素子 51を駆動する。そうすると、短い絞り流路で� ��る第2絞り流路54において乱流が発生し、第2 絞り流路54における流路抵抗が長い絞り流路� ��ある第1絞り流路53に比べて相対的に大きく� ��る。これにより、ポンプ室52内の駆動液11は 、第1絞り流路53の方に支配的に押し出され送 液される。次に、ポンプ室52の容積を緩やか� ��増加させるように圧電素子51を駆動する。� �うすると、ポンプ室52内の容積増加に伴って 駆動液11が第1絞り流路53及び第2絞り流路54か� ��流れ込む。このとき、第2絞り流路54の方が� ��1絞り流路53と比べて長さが短いので、第2絞 り流路54の方が第1絞り流路53と比べて流路抵� ��が小さくなり、ポンプ室52内には第2絞り流� ��54の方から支配的に駆動液11が流入する。以 上の動作を圧電素子51が繰り返すことにより� ��駆動液11が順方向に送液されることになる� �

 一方、駆動液11を逆方向(駆動液タンク10� �向かう方向)に送液する場合には、まず、ポ� ��プ室52の容積を緩やかに減少させるように� �電素子51を駆動する。そうすると、第2絞り� �路54の方が第1絞り流路53と比べて長さが短い ので、第2絞り流路54の方が第1絞り流路53と比 べて流路抵抗が小さくなる。これにより、ポ ンプ室52内の駆動液11は、第2絞り流路54の方� �支配的に押し出され送液される。次に、ポ� �プ室52の容積を急激に増加させるように圧電 素子51を駆動する。そうすると、ポンプ室52� �の容積増加に伴って駆動液11が第1絞り流路53 及び第2絞り流路54から流れ込む。このとき、 短い絞り流路である第2絞り流路54において乱 流が発生し、第2絞り流路54における流路抵抗 が長い絞り流路である第1絞り流路53に比べて 相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室 52内には第1絞り流路53の方から支配的に駆動� ��11が流入する。以上の動作を圧電素子51が繰 り返すことにより、駆動液11が逆方向に送液� ��れることになる。

 (マイクロチップの構成)
 図3は、本実施形態に係るマイクロチップ1� �構成図である。一例の構成を示すものであ� �、これに限定されない。

 図3(a)において矢印は、検査装置80にマイ� ��ロチップ1を挿入する挿入方向であり、図3(a )は挿入時にマイクロチップ1の下面となる面� ��図示している。また、2つの被検出部125,126� �に示した円は励起光のビームスポットを示� �。図3(b)はマイクロチップ1の側面図である。

 図3(b)に示すように、マイクロチップ1は� �形成基板108と、溝形成基板108を覆う被覆基� �109から構成されている。

 溝形成基板108には、図3(c)に示すように、 検体と試薬とをマイクロチップ1上で混合・� �応させるための微細流路及び流路エレメン� �が配設されている。図3(c)では、微細流路を� ��印で、流路エレメントを四角形で模式的に� ��している。

 マイクロチップ1上には、以下の流路エレ メントが設けられている。

 駆動液注入部110a~110eは、マイクロポンプ� ��ら駆動液11を注入するための注入部である� �

 検体注入部113は、マイクロチップ1に検体 を注入するための注入部である。

 駆動液注入部110a~110eの下流には、それぞ� ��、検体を収容する検体収容部120、標的遺伝� ��のポジティブコントロール用試薬収容部121� ��ネガティブコントロール用試薬収容部122、� ��的遺伝子を増幅するための酵素及び基質の� ��容部123、プライマー及び蛍光標識されたDNA� ��ローブの収容部124が設けられている。

 なお、標的遺伝子及びその増幅産物は、� ��発明に係る標的分子に相当する。DNAプロー� ��は、本発明に係る標的DNAとハイブリダイゼ� ��ション反応を起こす蛍光標識したプローブ� ��相当する。ポジティブコントロール用試薬� ��、標的遺伝子として特定したいDNA配列を持� ��試薬である。

 標的遺伝子を増幅させるための試薬、ポ� ��ティブコントロール用試薬、ネガティブコ� ��トロール用試薬、プライマー及びDNAプロー� ��は、各収容部に予め収容されている。

 ポジティブコントロール用試薬とネガテ� ��ブコントロール用試薬は、検査が正常に行� ��れたか否かをモニタリングするための試薬� ��ある。

 これらの各収容部は、マイクロチップ1を 検査装置80にセットした際にペルチェ素子31� �対向し、収容されている検体や試薬が変性� �ないように冷却される。

 検体収容部120及びポジティブコントロー� ��収容部121の下流には、標的遺伝子とポジテ� ��ブコントロール用試薬を増幅させるための� ��薬とが反応して増幅産物を生成するための� ��応部125が設けられている。

 また、ネガティブコントロール収容部122� ��び検体収容部120の下流には、標的遺伝子を� ��幅させるための試薬とが反応して増幅産物� ��成するための反応部126が設けられている。� ��の反応部125、126は、被検出部を兼ね、本発� ��のマイクロチップ内の測定部位に相当する� ��

 反応部125、126は、マイクロチップ1を検査 装置80にセットした際にヒータ23に対向し、� �幅促進のために過熱される。

 反応部125、126には、123及び124の収納部か� ��からの流路が合流し、増幅用試薬やプロー� ��が同時もしくは、遂次供給される。

 これら試薬の反応により、標的遺伝子の� ��幅と、増幅産物と蛍光プローブのハイブリ� ��イゼーション反応及び蛍光物質とクエンチ� ��ーとの遊離反応も同時進行させ、増幅から� ��光物質生成までの反応を一括して進行させ� ��。

 被検出部125,126の窓にあたる被覆基板109は 、光学的な検出を行うことができるよう、透 明なガラスや樹脂等の材料から構成されてい る。

 検体及び各試薬の流れについて説明する� ��まず、マイクロチップ1による検査を行うに 先立って、検査担当者は検体を検体注入部113 から注射器等を用いて注入する。検体注入部 113から注入された検体は、連通する微細流路 を通って検体収容部120に収容される。

 次に、検体の注入されたマイクロチップ1 は、検査担当者により図1に示す検査装置80の 挿入口83に挿入され、図2に示すようにセット される。これにより、マイクロポンプ5を駆� �して駆動液注入部110a~110eから駆動液11を注入 することが可能となる。

 駆動液注入部110aから駆動液11を注入する� ��、連通する微細流路を通って検体収容部120� ��収容されている検体が押し出され、被検出� ��125に検体が送り込まれる。

 駆動液注入部110cから駆動液11を注入する� ��、連通する微細流路を通ってネガティブコ� ��トロール収容部122に収容されているネガテ� ��ブコントロール用試薬(例えば純水)が押し� �され、反応部(被検出部)126にネガティブコン トロール用試薬が送り込まれ、先に送液され た検体と混合する。

 駆動液注入部110bから駆動液11を注入する� ��、連通する微細流路を通ってポジティブコ� ��トロール収容部121に収容されているポジテ� ��ブコントロール用試薬(標的と同一のDNA配列 箇所を持つ試薬)が押し出され、反応部(被検� ��部)125にポジティブコントロールが送り込ま れ、先に送液された検体と混合する。

 駆動液注入部110dと110eから駆動液11を注入 し、連通する微細流路を通って収容部123、124 から、標的遺伝子を増幅するための酵素及び 基質とプライマー及び蛍光標識されたDNAプロ ーブが、反応部(被検出部)125、126にそれぞれ� ��りこまれ、先に送液された検体・コントロ� ��ル液の混合液と混合する。

 その後、反応部(被検出部)125,126をヒータ2 3により加熱することでそれぞれの被検出部� �おいて標的遺伝子(及びポジティブコントロ� ��ルDNA)の増幅と、増幅産物と蛍光プローブの ハイブリダイゼーション反応及び蛍光物質と クエンチャーとの遊離反応も同時進行させ、 増幅から蛍光物質生成までの反応を一括して 進行させる。

 そして、被検出部125、126に光検出部4の励 起光源41から励起光を照射し、被検出部125、1 26から発せられる蛍光を受光部47で受光する� �とにより光検出を行うことが可能となる。

 なお、被検出部125、126の検出結果を基に� ��検査の総合判定を行うルールの一例を次に� ��載する(表1参照。)。

 ポジティブコントロール用試薬は、その� ��薬単独でも、標的遺伝子と同等の増幅反応� ��蛍光プローブとのハイブリダイゼーション� ��応及び蛍光物質の生成反応を起こす。ネガ� ��ィブコントロール用試薬は、その試薬単独� ��は、蛍光物質の生成反応を起こさない。

 これらの試薬を検体と混合した液で反応� ��検出を行うことで、検査結果の良否の判定� ��可能となる。

 陽性すなわち検体に標的遺伝子が含まれ� ��場合、ポジティブコントロール用試薬+検体 、及びネガティブコントロール用試薬+検体� �いずれも蛍光発光が測定される。

 陰性すなわち検体に標的遺伝子が含まれ� ��い場合、ポジティブコントロール用試薬+検 体は、ポジティブコントロール用試薬の反応 による蛍光発光が測定されるが、ネガティブ コントロール用試薬+検体は、反応が生じず� �光が発光しない。これら2つのケースは、正� ��な反応を行った検査結果として扱うことが� ��きる。

 一方、例えば、検体に反応の阻害物質が� ��入した場合などは、ポジティブコントロー� ��用試薬+検体及びネガティブコントロール用 試+検体のいずれも蛍光発光が生じない。

 また、ポジティブコントロール用試薬+検 体の蛍光発光無し、ネガティブコントロール 用試+検体の蛍光発光は有りの様な検査結果� �得られる場合は、チップに収容した試薬の� �活などの異常が考えられる。これら2つのケ� ��スは、異常な反応を行った検査結果として� ��再検査を促すことが可能となる。

 なお、バイオチップ内での反応制御等に� ��いて補足説明をする。

 1)チップ内でDNA増幅や標的DNAと蛍光物質� �修飾された標識プローブとの反応を制御・� �進させる。

 2)チップに設けた微細流路に、予め反応� �薬を導入しておき、マイクロポンプによる� �液制御で、所定の手順・時間・タイミング� �、混合・分岐などの化学操作が自動的に進� �する様に制御される。

 3)反応を促進させたり、制御するために� �試薬や混合試薬を温調する機構を設ける。

 また、装置に搭載したヒータなどの温調� ��構により、チップを介して温度制御する。

 4)チップ上の反応検出部は、標的DNAを検� �するエリアの他に、試薬や反応の正常/異常� ��反応阻害物質の混入などを試験するための� ��ジティブコントロールやネガティブコント� ��ールなどのモニタリング用の反応を併設す� ��方が、確度を高めるために好ましい。

 5)この様に、複数の反応を同時に検出す� �ために、蛍光検出部を走査してチップ上の� �検出部を測定できる様な構成にする。

 6)なお、当該チップは、励起光を透過す� �分光透過特性を持つカバー部材(図3における 被覆基板109及び被検出部の窓111c)を蛍光発光� ��の上面に有していることが好ましい。また� ��当該カバー部材は蛍光をも透過する分光透� ��特性を持っていることが好ましい。

 図4は、本実施形態に係るバイオチップを 用いる検査装置の制御構成の要部を示す図で ある。本発明の制御に関係する主な構成要素 について示している。

 プログラムに従って検査装置80の制御を� �行するCPU90を中心に、バス91により、ROM92、RA M93、不揮発性メモリ94、光検出部4、ペルチェ 素子31、ヒータ23、表示部84、操作パネル87、� ��が相互に接続されている。

 ROM92は、CPU90によって実行される各種制御 プログラムやデータ等を記憶する。

 RAM93は、CPU90によってワークエリアとして 利用され、CPU90が制御を実行する際に必要な� ��ログラムやデータを一時的に記憶する。

 不揮発性メモリ94は、光検出部4による検� ��結果等を記憶する。

 CPU90がROM92に記憶されているプログラムに 基づいて制御を実行する。本発明の制御部と して機能する。

 光検出部4、ペルチェ素子31、ヒータ23、� �示部84及び操作パネル87についての説明は、� ��述したので省略する。

 (検出制御のフロー)
 図5~8は、本実施形態に係る検出制御のフロ� ��の一例を示す図である。ヒータ23による加� �が行われることによりサイクリングプロー� �法によるDNA増幅及び標識プローブとのハイ� �リダイゼーション反応が開始される場合を� �例に説明する。ヒータ23が本発明の反応開始 手段に相当する。

 検出制御は、ROM92に記憶されている検出� �御プログラムに基づいてCPU90が処理を実行す ることにより行われる。尚、前提として、検 査装置80の操作パネル87から検査開始の入力� �されて検査が開始され、既に被検出部125、12 6には、チップ内の流路で混合などの化学操� �された各試薬が送り込まれているものとす� �。

 以下において、本発明の実施形態に係る3 種の検出制御フローについて説明する。

 1)検出制御(1)のフロー;図5参照
 まず、CPU90は、光検出部4により反応前の蛍� ��強度を測定する(ステップS11)。これにより� �クエンチャーに吸収されなかった蛍光物質� �らの微弱な蛍光を検出することが可能とな� �。この際、被検出部125,126の温度を測定する( ステップS12)。

 次に、CPU90は、所定時間が経過した後、� �ータ23により被検出部125,126の加熱(温調)を開 始する(ステップS13)。DNA増幅及びハイブリダ� ��ゼーション反応に適した温度に温調制御さ� ��る。

 次に、十分にDNA増幅及びハイブリダイゼ� ��ション反応が進行するために要する所定時� ��T1が経過すると(ステップS14)、加熱を止め(� �テップS15)、その後、反応前の温度と実質上� ��一の温度になるまで待機する(ステップS16)� �つまり、ステップS16においてCPU90は、マイク ロチップ内の試薬及びマイクロチップ内の測 定部位を含む反応系の温度を、当該化学反応 前後において、同一となるように制御する。

 次に、CPU90は、光検出部4により反応後の� ��光強度を測定する(ステップS17)。

 以上のように、本実施形態によれば蛍光� ��行量の温度依存性を無視できるような条件� ��反応系の温度を制御することにより、精度� ��い蛍光測定を行うことができる。

 2)検出制御(2)のフロー;図6参照
 上記実施形態では、反応前の測定をヒータ2 3による加熱前に蛍光強度の測定を行ったが� �加熱を開始しても暫くDNA増幅及びハイブリ� �イゼーション反応が進行しないような場合� �は、加熱と同時、又は加熱後DNA増幅及びハ� �ブリダイゼーション反応が進行する前に蛍� �強度の測定を行ってもよい。加熱後DNA増幅� �びハイブリダイゼーション反応が進行する� �に蛍光強度の測定を行うようにすると、例� �ば、被検出部125,126の加熱による液の対流等� ��蛍光強度に与える影響を取り除くことがで� ��る。また、温度により蛍光強度が大きく変� ��する蛍光物質の場合、その影響を取り除く� ��とができる。この場合には、加熱開始から� ��定時間経過した後に反応前の検出を行うよ� ��制御すればよい。具体的には、下記の検出� ��御フローに従って行うことができる。

 まず、CPU90は、ヒータ23により被検出部125 ,126の加熱(温調)を開始する(ステップS21)。次� ��、CPU90は、被検出部の温度が所定の温度に� �達したか判断する(ステップS22)。これにより 、DNA増幅及びハイブリダイゼーション反応に 適した所定の温度に温調制御される。被検出 部125,126の温度が所定の温度に到達した場合� �は(ステップ22:Yes)、CPU90は、光検出部4により 反応前の蛍光強度を測定する(ステップS23)。� ��お、温度が所定の温度に到達していない場� ��には(ステップ22:No)、所定の温度に到達する まで待機し続け、到達した後に当該測定をす る。これにより、クエンチャーに吸収されな かった蛍光物質からの微弱な蛍光を検出する ことが可能となる。

 次に、十分にDNA増幅及びハイブリダイゼ� ��ション反応が進行するために要する所定時� ��T2が経過下後、CPU90が温度調整ユニット3を� �御し続けることにより反応前の温度と実質� �同一の温度に制御される(ステップS24)。

 次に、CPU90は、光検出部4により反応後の� ��光強度を測定する(ステップS25)。

 測定終了後、CPU90は、温度調整ユニット3� ��よる被検出部125,126の加熱を止める(ステッ� �S26)。

 3)検出制御(3)のフロー:図7参照
 まず、CPU90は、光検出部4により反応前の蛍� ��強度(蛍光発光量)を測定する(ステップS31)。 これにより、クエンチャーに吸収されなかっ た蛍光物質からの微弱な蛍光を検出すること が可能となる。

 次に、CPU90は、所定時間T1が経過した後(� �テップS32)、ヒータ23により被検出部125,126を� ��熱する(ステップS33)。DNA増幅及びハイブリ� �イゼーション反応に適した温度に温調制御� �れる。

 次に、十分にDNA増幅及びハイブリダイゼ� ��ション反応が進行するために要する所定時� ��T2が経過すると(ステップS34)、CPU90は、光検� ��部4により反応後の蛍光強度を測定する(ス� �ップS35)。

 次に、CPU90は、反応前の蛍光強度を基に� �応後の蛍光強度を補正する(ステップS36)。例 えば、反応後の蛍光強度から反応前の蛍光強 度を差し引くこと、又は、反応前後の蛍光発 光量の比として補正を行う。

 次に、CPU90は、補正後の蛍光強度を表示� �84に表示したり、不揮発性メモリ94に保存し� ��りする(ステップS37)。その後、フローは終� �する。

 以上のように、本実施形態によれば、反� ��による蛍光強度の変化分を補正することに� ��り正確に測定することができる。

 4)検出制御(4)のフロー:図8参照
 図8に示す検出制御(4)のフローは前述の検出 制御(3)のフローの変形例であり、同図と共通 のフローに関しては同符号を付すことにより 説明を省略する。
まず、CPU90は、反応系の温度の測定及び、光� ��出部4により反応前の蛍光強度を測定する(� �テップS31b)。これにより、クエンチャーに吸 収されなかった蛍光物質からの微弱な蛍光を 検出することが可能となる。

 ステップS32乃至S34で反応を行わせた後に� ��CPU90は、反応系の温度の測定及び、光検出� �4により反応後の蛍光強度を測定する(ステッ プS35b)。

 次に、CPU90は、反応前後の反応系の温度� �測定結果を基に反応後の蛍光強度を補正す� �(ステップS36b)。例えば、反応後の蛍光強度� �ら反応前の蛍光強度を差し引くこと、又は� �反応前後の蛍光発光量の比として補正を行� �。

 次に、CPU90は、補正後の蛍光強度を表示部84 に表示したり、不揮発性メモリ94に保存した� ��する(ステップS37)。その後、フローは終了� �る。
以上のように、本実施形態によれば、蛍光発 光量の温度依存性を無視できるような条件に して、精度良い蛍光測定を行うことができる 。

 なお、本発明においては、マイクロチッ� ��内の化学反応に応じて発せられる蛍光の発� ��量に基づいてマイクロチップ内の測定部の� ��的分子の存在や量を測定するために、当該� ��学反応前後に蛍光発光量を測定し、かつ当� ��蛍光発光量を測定する際に、マイクロチッ� ��内の試薬及びマイクロチップ内の測定部位� ��含む反応系の温度を、当該化学反応前後に� ��いて、同一となるように制御することを特� ��とする。

 更に、前記測定結果を反応前後の蛍光発� ��量の差もしくは反応前後の蛍光発光量の比� ��して算出・出力する機能を設けた態様とす� ��ことが好ましい。これにより、試薬量、濃� ��、環境条件等の変動に拘わらず、精度良い� ��光測定を行うことができる。

 特に、本発明の上記手段をサイクリング� ��ローブ法を用いたマイクロチップの蛍光検� ��・測定に適用することにより本発明の効果� ��顕著に発現することができる。

 〈蛍光物質及びクエンチャー〉
 蛍光物質は、特定の波長の励起光を吸収し� ��吸収したエネルギーを、非常に短時間で、� ��収した波長とは異なる波長の光、いわゆる� ��光を発生じさせる物質である。この励起光� ��吸収から蛍光発生の過程では、熱放出によ� ��エネルギー損失が起こるため、蛍光は、励� ��光に比べエネルギーが低い、つまり長波長� ��にシフトした波長となる(ストークス・シフ ト)。励起光波長及びストークス・シフト(及� ��それに伴う蛍光波長)は、各種蛍光物質にお いて特徴的な特性である。

 蛍光共鳴エネルギー遷移は、例えば、蛍� ��物質としての蛍光色素(F1)と色素(F2)(多くの� ��合蛍光色素)を互いに連結して相互作用して いる際に、F2の吸収波長がF1の蛍光波長と重� �する場合に観察される。

 これは、第一の蛍光分子F1が波長λ1の光� �よって励起されたのちF1は、波長λ1+s1の光を 蛍光として放射する。このときのs1は、F1の� �トークスシフト量である。第2の蛍光分子F2� �して、その吸収波長の広がりがλ1+s1と重複� �れば、この光を吸収することができる。こ� �ように、F2は、λ1+s1によって励起され、続い て波長λ2+s2を放射する。

 この場合、励起光λ1で励起されないように� ��2の蛍光色素を選択することで、連結してい る場合には、λ1の励起でλ2+s2の蛍光が観察さ れ、連結が切れた場合には、λ1の励起で、λ1 +s1の蛍光が観察される。このような蛍光の遷 移現象は統計的で、エネルギー遷移の効率は 、r ^-6 に比例するといわれている。rは、2つの蛍光� ��子間の平均間隔を示す。

 本発明に使用できる、蛍光色素としては� ��フルオレセイン類、ローダミン類、クマリ� ��類、ダンシル型(ジメチルアミノナフタレン スルホン酸型)蛍光色素、NBD型色素、ピレン� �BODIPY誘導体、サイ(cy)色素,マラカイトグリー ンなどが上げられ、特許文献などで例示され ている蛍光色素としては、例えば米国特許第 5486616号明細書、特開平2-191674号公報、同5-2872 09号公報、同5-287266号公報、同8-47400号公報、� ��9-127115号公報、同7-145148号公報、同6-222059号� ��報に記載される蛍光色素、Journal of Fluoresce nce,5,231ページ(1995年)に記載される蛍光色素な どを用いることができ、また、特開平2-191674� ��公報等に記載されている蛍光色素などを用� ��ることが出来る。

 好ましい色素の組み合わせとしては、当� ��者が容易に組み合わせることが出来るもの( 例えばインビトロジェン社、アプライドバイ オシステムズ社、ロシュ社などのホームペー ジ参照。)をあげることができ、好ましくは� �ルオレセインとカルボキシローダミンの組� �合わせなどを挙げられる。

 F2に使用できる色素としては、蛍光をし� �いなくてもよく、例えば、ダビシル、特表20 03-516616記載のeclipse(epoch社商標)、米国特許7019 129記載のBlackHallQquencher(BQH一般にダーククエ� �チャーBiosearch Technologies社商標)、米国特許20 060177857記載のBlaccberryQuencher(Berry&Associates社 商標)などを使用することが出来る。