Titre : BACTERIES CLOSTRIDIUM GENETIQUEMENT MODIFIEES, PREPARATION ET UTILISATIONS DE CELLES-CI

La présente invention concerne la modification génétique de bactéries du genre Clostridium, typiquement de bactéries solvantogènes du genre Clostridium, en particulier de bactéries possédant à l’état sauvage un gène codant une amphénicol-O-acetyltransférase. Elle concerne ainsi des méthodes, outils et kits permettant une telle modification génétique, en particulier l’élimination ou la modification d’une séquence codant, ou contrôlant la transcription d’une séquence codant, une amphénicol-O- acetyltransférase, les bactéries génétiquement modifiées obtenues et leurs utilisations, en particulier pour produire un solvant, de préférence à l’échelle industrielle.

ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE

Le genre Clostridium contient des bactéries à Gram positif, anaérobies strictes et sporulantes, appartenant au phylum des Firmicutes. Les Clostridia sont un groupe d’importance pour la communauté scientifique pour plusieurs raisons. La première est qu’un certain nombre de maladies graves (e.g. tétanos, botulisme) sont dues à des infections de membres pathogènes de cette famille (Gonzales et al., 2014) La deuxième est la possibilité d’utiliser des souches dites acidogènes ou solvantogènes en biotechnologie (John & Wood, 1986, et Moon et al., 2016). Ces Clostridia, non pathogènes, ont naturellement la capacité de transformer une variété importante de sucres pour produire des espèces chimiques d’intérêt, et plus particulièrement de l’acétone, du butanol, et de l’éthanol (John & Wood, 1986) au cours d’un processus fermentaire dit ABE. De manière similaire, la fermentation IBE est possible chez certaines espèces particulières, lors de laquelle l’acétone est réduit en proportion variable en isopropanol (Chen et al., 1986, George et al., 1983) grâce à la présence dans le génome de ces souches de gènes codant des alcool déshydrogénases secondaires (s-ADH ; Ismael et al., 1993, Hiu et al., 1987). Les espèces de Clostridia solvantogènes présentent des similarités phénotypiques importantes, ce qui rendait difficile leur classification avant l’émergence des techniques de séquençage modernes (Rogers et al., 2006). Avec la possibilité de séquencer les génomes complets de ces bactéries, il est aujourd’hui possible de classer ce genre bactérien en 4 espèces majeures : C. acetobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. saccharobutylicum et C. beijerinckii. Une publication récente a permis de classer ces Clostridia solvantogènes en 4 clades principaux après analyse comparative des génomes complets de 30 souches (Figure 1).

Ces groupes séparent notamment les espèces que sont C. acetobutylicum et C. beijerinckii avec comme références respectives C. acetobutylicum ATCC 824 (également désignée DSM 792 ou encore LMG 5710) et C. beijerinckii NCIMB 8052 qui sont les souches modèles pour l’étude de la fermentation de type ABE.

Les souches de Clostridium naturellement capables d’effectuer une fermentation IBE sont peu nombreuses et appartiennent majoritairement à l’espèce Clostridium beijerinckii (cf. Zhang et al. , 2018, Tableau 1). Ces souches sont typiquement sélectionnées parmi les souches C. butylicum LMD 27.6, C. aurantibutylicum NCIB 10659, C. beijerinckii LMD 27.6, C. beijerinckii VPI2968, C. beijerinckii NRRL B-593, C. beijerinckii ATCC 6014, C. beijerinckii McClung 3081, C. isopropylicum IAM 19239, C. beijerinckii DSM 6423, C. sp. A1424, C. beijerinckii optinoii, et C. beijerinckii BGS1.

Il n’existe toutefois à ce jour pas de souche de bactérie Clostridium naturellement capable de produire de l’isopropanol, en particulier naturellement capable d’effectuer une fermentation IBE, qui ait été modifiée génétiquement, en particulier une souche modifiée génétiquement de manière à la rendre sensible à un antibiotique appartenant à la classe des amphénicols tel que le chloramphénicol ou le thiamphénicol, de préférence pour permettre la production optimisée d’isopropanol.

RESUME DE L’INVENTION

Les inventeurs décrivent, dans le contexte de la présente invention et pour la première fois, une bactérie C. beijerinckii génétiquement modifiée, ainsi que les outils permettant une modification génétique de bactéries du genre Clostridium, typiquement de bactéries solvantogènes du genre Clostridium naturellement (i.e. à l’état sauvage) capable de produire de l’isopropanol, en particulier naturellement capables d’effectuer une fermentation IBE, en particulier de bactéries comprenant à l’état sauvage un gène conférant à la bactérie la résistance à un ou plusieurs antibiotiques, en particulier un gène codant une amphénicol-O-acetyltransférase, par exemple une chloramphénicol-O-acetyltransférase ou une thiamphénicol-O-acetyltransferase.

Une bactérie génétiquement modifiée préférée selon l’invention est une bactérie n’exprimant pas une enzyme lui conférant la résistance à un ou plusieurs antibiotiques, en particulier une bactérie n’exprimant pas une amphénicol-O-acetyltransférase, par exemple une bactérie dépourvue du gène catB ou incapable d’exprimer ledit gène.

Une bactérie génétiquement modifiée préférée selon l’invention est la bactérie identifiée dans la présente description en tant que C. beijerinckii DSM 6423 A catB telle qu’enregistrée sous le numéro de dépôt LMG P-31151 (également identifié en tant que Clostridium beijerinckii IFP962 delta catB) auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique) le 6 décembre 2018. La description concerne également toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci. Un objet particulier décrit par les inventeurs est un acide nucléique reconnaissant (liant au moins en partie), et de préférence ciblant, i.e. reconnaissant et permettant la coupure, dans le génome d’une bactérie d’intérêt, d’au moins un brin i) d’une séquence codant, ii) d’une séquence contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou iii) d’une séquence flanquant la séquence codant, une enzyme permettant à ladite bactérie d’intérêt de croître dans un milieu de culture contenant un antibiotique, typiquement un antibiotique appartenant à la classe des amphénicols, de préférence sélectionné parmi le chloramphénicol, le thiamphénicol, l’azidamfénicol et le florfénicol, typiquement une amphénicol-O- acetyltransférase telle qu’une chloramphénicol-O-acetyltransférase ou une thiamphénicol-O- acetyltransferase

Les inventeurs décrivent aussi l’utilisation d’un tel acide nucléique pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie du genre Clostridium, de préférence une bactérie du genre Clostridium naturellement capable de produire de l’isopropanol, en particulier une bactérie du genre Clostridium capable d’effectuer une fermentation IBE.

Les inventeurs décrivent en particulier l’utilisation d’un acide nucléique reconnaissant le gène catB de séquence SEQ ID NO : 18 ou une séquence identique à au moins 70% à celle-ci au sein du génome de C. beijerinckii DSM 6423 pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie C. beijerinckii DSM 6423.

La bactérie capable de produire de l’isopropanol à l’état sauvage peut être par exemple une bactérie sélectionnée parmi une bactérie C. beijerinckii, une bactérie C. diolis, une bactérie C. puniceum, une bactérie C. butyricum, une bactérie C. saccharoperbutylacetonicum, une bactérie C. botulinum, une bactérie C. drakei, une bactérie C. scatologenes , une bactérie C. perfringens, et une bactérie C. tunisiense, de préférence une bactérie sélectionnée parmi une bactérie C. beijerinckii, une bactérie C. diolis, une bactérie C. puniceum et une bactérie C. saccharoperbutylacetonicum. Une bactérie naturellement capable de produire de l’isopropanol particulièrement préférée est une bactérie C. beijerinckii.

Selon un aspect particulier, l’acide nucléique reconnaissant, et de préférence ciblant, i) une séquence codant une amphénicol-O-acetyltransférase, ii) une séquence contrôlant la transcription d’une telle séquence, ou iii) une séquence flanquant une telle séquence, est utilisé pour transformer un sous-clade de C. beijerinckii sélectionné parmi DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593, NCCB 27006 et un sous-clade présentant au moins 97% d’identité avec la souche DSM 6423.

Les inventeurs décrivent par ailleurs un procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie du genre Clostridium. Ce procédé comprend une étape de transformation de ladite bactérie par introduction dans cette bactérie d’un acide nucléique reconnaissant, et de préférence ciblant, i) une séquence codant, ii) une séquence contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou iii) une séquence flanquant une séquence codant, une enzyme d’intérêt, de préférence une amphénicol-O-acetyltransférase. Ce procédé est typiquement réalisé à l’aide d’un outil de modification génétique, par exemple à l’aide d’un outil de modification génétique sélectionné parmi un outil CRISPR, un outil basé sur l’utilisation d’introns de type II et un outil d’échange allélique. Sont également décrites les bactéries transformées et modifiées génétiquement à l’aide d’un tel procédé, dont la bactérie C. beijerinckii DSM 6423 AcatB est un exemple.

Un autre aspect décrit par les inventeurs concerne l’utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement selon l’invention, de préférence de la bactérie C. beijerinckii DSM 6423 AcatB telle qu’enregistrée sous le numéro de dépôt LMG P-31151 , ou d’une version génétiquement modifiée de celle-ci, pour produire un solvant, de préférence l’isopropanol, ou un mélange de solvants, de préférence à l’échelle industrielle.

La description concerne enfin des kits, en particulier un kit comprenant un acide nucléique décrit dans le présent texte et un outil de modification génétique, en particulier un outil de modification génétique sélectionné parmi les éléments d’un outil génétique sélectionné parmi un outil CRISPR, un outil basé sur l’utilisation d’introns de type II et un outil d’échange allélique ; un acide nucléique en tant qu’ARN guide (ARNg) ; un acide nucléique en tant que matrice de réparation ; au moins une paire d’amorces ; et un inducteur permettant l’expression d’une protéine codée par ledit outil.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Bien qu’utilisées en industrie depuis plus d’un siècle, les connaissances sur les bactéries appartenant au genre Clostridium sont limitées par les difficultés rencontrées pour les modifier génétiquement.

Différents outils génétiques ont été conçus au cours des dernières années pour optimiser les souches de ce genre, la dernière génération étant basée sur l’utilisation de la technologie CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromie Repeats)/Cas (CRISPR-associated protein). Cette méthode est basée sur l’emploi d’une enzyme appelée nucléase (typiquement une nucléase de type Cas dans le cas de l’outil génétique CRISPR/Cas, telle que la protéine Cas9 de Streptococcus pyogenes), qui va, guidée par une molécule d’ARN, réaliser une coupure double brin au sein d’une molécule d’ADN (séquence cible d’intérêt). La séquence de l’ARN guide (ARNg) déterminera le site de coupure de la nucléase, lui conférant ainsi une très forte spécificité (Figure 17).

Une coupure double brin au sein d’une molécule d’ADN indispensable étant létale pour un organisme, la survie de ce dernier dépendra de sa capacité à la réparer (cf. par exemple Cui & Bikard, 2016). Chez les bactéries du genre Clostridium, la réparation d’une coupure double brin dépend d’un mécanisme de recombinaison homologue nécessitant une copie intacte de la séquence clivée. En fournissant à la bactérie un fragment d’ADN permettant d’effectuer cette réparation tout en modifiant la séquence originelle, il est possible de forcer le micro-organisme à intégrer les changements désirés au sein de son génome. La modification réalisée ne doit plus permettre le ciblage de l’ ADN génomique par le complexe ribonucléoprotéique Cas9-ARNg, via la modification de la séquence cible ou du site PAM (Figure 18). Différentes approches ont été décrites pour tenter de rendre fonctionnel cet outil génétique au sein de bactéries du genre Clostridium. Ces microorganismes sont en effet connus pour être difficiles à modifier génétiquement en raison de leurs faibles fréquences de transformation et de recombinaison homologue. Quelques approches sont basées sur l’emploi de Cas9, exprimée de manière constitutive chez C. beijerinckii et C. ljungdahlii (Wang et al, 2015 ; Huang et al, 2016) ou sous contrôle d’un promoteur inductible chez C. beijerinckii, C. saccharoperbutylacetonicum et C. authoethanogenum (Wang et al, 2016 ; Nagaraju et al, 2016 ; Wang et al, 2017). D’aubes auteurs ont décrit l’utilisation d’une version modifiée de la nucléase, Cas9n, qui réalise des coupures simple brin, au lieu de coupures double brin, au sein du génome (Xu et al, 2015 ; Li et al, 2016). Ce choix est dû aux observations selon lesquelles la toxicité de Cas9 est trop importante pour son utilisation chez des bactéries du genre Clostridium dans les conditions expérimentales testées. La plupart des outils décrits précédemment reposent sur l'utilisation d'un plasmide unique. Enfin, il est également possible d’utiliser des systèmes CRISPR/Cas endogènes lorsqu’ils ont été identifiés au sein du génome du micro-organisme, comme par exemple chez C. pasteurianum (Pyne et al, 2016).

A moins qu'ils n'utilisent (comme dans le dernier cas décrit ci-dessus) la machinerie endogène de la souche à modifier, les outils basés sur la technologie CRISPR présentent l'inconvénient majeur de limiter significativement la taille de l'acide nucléique d'intérêt (et donc le nombre de séquences codantes ou gènes) susceptible d'être inséré dans le génome bactérien (1,8 kb environ au mieux d'après Xu et al. , 2015).

Les inventeurs ont mis au point et décrit un outil génétique plus performant de modification de bactéries, adapté aux bactéries, typiquement aux bactéries appartenant au phylum des Firmicutes, en particulier aux bactéries du genre Clostridium, basé sur l’utilisation de deux acides nucléiques distincts, typiquement de deux plasmides (cf. WO2017064439, Wasels et al., 2017 et Figure 3) qui résout notamment ce problème. Dans un mode de réalisation particulier, le premier acide nucléique de cet outil permet l’expression de cas9 et un deuxième acide nucléique, spécifique de la modification à effectuer, contient une ou plusieurs cassettes d’expression d’ ARNg ainsi qu’une matrice de réparation permettant le remplacement d’une portion de l’ADN bactérien ciblée par Cas9 par une séquence d’intérêt. La toxicité du système est limitée en plaçant cas9 et/ou la (les) cassette(s) d’expression d’ARNg sous conbôle de promoteurs inductibles. Les inventeurs ont récemment amélioré cet outil en permettant d’augmenter très significativement l’efficacité de bansformation et donc l’obtention, en nombre et quantité utile (en particulier dans un contexte de sélection de souches robustes pour une production à l’échelle indusbielle), de bactéries génétiquement modifiées d’intérêt (cf. FR 18/54835). Dans cet outil amélioré au moins un acide nucléique comprend une séquence codant une protéine anti-CRISPR (« acr »), placée sous le contrôle d’un promoteur inductible. Cette protéine anti-CRISPR permet de réprimer l’activité du complexe endonucléase d’ADN/ARN guide. L’expression de la protéine est régulée pour permettre son expression uniquement pendant l’étape de bansformation de la bactérie. Par bactérie appartenant au phylum des Firmicutes on entend, dans le contexte de la présente description, les bactéries appartenant à la classe des Clostridia, Mollicutes, Bacilli ou des Togobacteria, de préférence à la classe des Clostridia ou des Bacilli.

Des bactéries particulières appartenant au phylum des Firmicutes comprennent par exemple les bactéries du genre Clostridium, les bactéries du genre Bacillus ou les bactéries du genre Lactobacillus.

Par « bactérie du genre Bacillus », on entend en particulier B. amyloliquefaciens, B. thurigiensis, B. coagulans, B. cereus, B. anthracis ou encore B. subtilis.

Par « bactérie du genre Clostridium », on entend en particulier les espèces de Clostridium dites d’intérêt industriel, typiquement les bactéries solvantogènes ou acétogènes du genre Clostridium. L’expression « bactérie du genre Clostridium » englobe les bactéries sauvages ainsi que les souches dérivées de celles- ci, modifiées génétiquement dans le but d’améliorer leur performance (par exemple surexprimant les gènes ctfA, ctfB et adc) sans avoir été exposées au système CRISPR.

Par « espèce de Clostridium d’intérêt industriel » on entend les espèces capables de produire, par fermentation, des solvants et des acides tels que l’acide butyrique ou l’acide acétique, à partir de sucres ou d’oses, typiquement à partir de sucres comprenant 5 atomes de carbone tels que le xylose, l’arabinose ou le fructose, de sucres comprenant 6 atomes de carbones tels que le glucose ou le mannose, de polyosides tels que la cellulose ou les hémicelluloses et/ou de toute autre source de carbone assimilable et utilisable par les bactéries du genre Clostridium (CO, CO2, et méthanol par exemple). Des exemples de bactéries solvantogènes d’intérêt sont les bactéries du genre Clostridium productrices d’acétone, de butanol, d’éthanol et/ou d’isopropanol, telles que les souches identifiées dans la littérature en tant que « souche ABE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’acétone, de butanol et d’éthanol] et « souche IBE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’isopropanol (par réduction de l’acétone), de butanol et d’éthanol]. Des bactéries solvantogènes du genre Clostridium peuvent être sélectionnées par exemple parmi C. acetobutylicum, C. cellulolyticum, C. phytofermentans, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. sporogenes, C. butyricum, C. aurantibutyricum et C. tyrobutyricum, de manière préférée parmi C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. butyricum, C. tyrobutyricum et C. cellulolyticum, et de manière encore plus préférée parmi C. acetobutylicum et C. beijerinckii.

Les bactéries du genre Clostridium naturellement productrice d’isopropanol, typiquement possédant dans leur génome un gène adh codant une alcool-déshydrogénase primaire/secondaire qui permet la réduction de l’acétone en isopropanol, se distinguent à la fois génétiquement et fonctionnellement des bactéries capables à l’état naturel d’une fermentation ABE.

Les inventeurs sont avantageusement parvenus, dans le contexte de la présente invention, à modifier génétiquement une bactérie du genre Clostridium naturellement productrice d’isopropanol, la bactérie C. beijerinckii DSM 6423, ainsi que la souche de référence C. acetobutylicum DSM 792. Les inventeurs décrivent ainsi, pour la première fois, une bactérie solvantogène du genre Clostridium naturellement (i.e. à l’état sauvage) capable de produire de l’isopropanol, en particulier naturellement capable d’effectuer une fermentation IBE, qui a été modifiée génétiquement, ainsi que les outils, en particulier les outils génétiques, ayant permis son obtention. Ces outils présentent l’avantage de faciliter considérablement la transformation et la modification génétique des bactéries capables, à l’état sauvage, de produire de l’isopropanol, en particulier d’effectuer une fermentation IBE, en particulier celles porteuses d’un gène codant une enzyme responsable de la résistance à un antibiotique.

Une partie des travaux décrits dans la partie expérimentale ont été réalisés au sein d’une souche capable de fermentation IBE, i.e. la souche C. beijerinckii DSM 6423 dont le génome et une analyse transcriptomique ont été décrits récemment par les inventeurs (Maté de Gerando et al. , 2018).

Lors de G assemblage du génome de cette souche, les inventeurs ont en particulier découvert, en plus du chromosome, la présence d’éléments génétiques mobiles (numéro d’accession PRJEB 11626 - https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB11626): deux plasmides naturels (pNFl et pNF2) et un bactériophage linéaire (F6423).

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, les inventeurs sont parvenus à supprimer de la souche C. beijerinckii DSM 6423 son plasmide naturel pNF2.

Dans un autre mode de réalisation particulier, ils sont parvenus à supprimer le gène upp à l’origine présent sur le chromosome de la souche C. beijerinckii DSM 6423. Ces expériences démontrent ainsi rutilisation possible des outils et plus généralement de la technologie décrite dans le présent texte par les inventeurs pour modifier génétiquement une bactérie capable, à l’état sauvage, de produire de l’isopropanol, en particulier d’effectuer une fermentation IBE.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les inventeurs sont en particulier parvenus à rendre sensible à un amphénicol, une bactérie naturellement porteuse (porteuse à l’état sauvage) d’un gène codant une enzyme responsable de la résistance à ces antibiotiques.

Des exemples d’amphénicols d’intérêt dans le contexte de l’invention sont le chloramphénicol, le thiamphénicol, G azidamfénicol et le florfénicol (Schwarz S. et al. , 2004), en particulier le chloramphénicol et le thiamphénicol.

Un premier aspect de l’invention concerne ainsi un outil génétique utilisable pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie d’intérêt, typiquement une bactérie telle que décrite dans le présent texte appartenant au phylum des Firmicutes, par exemple une bactérie du genre Clostridium, du genre Bacillus ou du genre Lactobacillus, de préférence une bactérie solvantogène du genre Clostridium naturellement (i.e. à l’état sauvage) capable de produire de l’isopropanol, en particulier naturellement capable d’effectuer une fermentation IBE, de préférence une bactérie résistante naturellement à un ou plusieurs antibiotiques, telle qu’une bactérie C. beijerinckii. Une bactérie préférée possède à l’état sauvage à la fois un chromosome bactérien et au moins une molécule d’ADN distincte de l’ADN chromosomique .

Selon un aspect particulier, cet outil génétique consiste en un acide nucléique (également identifié dans le présent texte en tant que « acide nucléique d’intérêt ») reconnaissant (liant au moins en partie), et de préférence ciblant, i.e. reconnaissant et permettant la coupure, dans le génome d’une bactérie d’intérêt, d’au moins un brin i) d’une séquence codant une enzyme permettant à la bactérie d’intérêt de croître dans un milieu de culture contenant un antibiotique vis-à-vis duquel elle lui confère une résistance, ii) d’une séquence contrôlant la transcription d’une séquence codant une enzyme permettant à la bactérie d’intérêt de croître dans un milieu de culture contenant un antibiotique vis-à-vis duquel elle lui confère une résistance, ou iii) d’une séquence flanquant une séquence codant une enzyme permettant à la bactérie d’intérêt de croître dans un milieu de culture contenant un antibiotique vis-à-vis duquel elle lui confère une résistance. Cet acide nucléique d’intérêt est utilisé typiquement dans le contexte de la présente invention pour supprimer la séquence reconnue du génome de la bactérie ou pour modifier son expression, par exemple pour moduler/réguler son expression, en particulier l’inhiber, de préférence pour la modifier de manière à rendre ladite bactérie incapable d’exprimer une protéine, en particulier une protéine fonctionnelle, à partir de ladite séquence. La séquence reconnue est également identifiée dans le présent texte en tant que « séquence cible » ou « séquence ciblée ».

Dans un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique d’intérêt comprend au moins une région complémentaire de la séquence cible identique à 100% ou identique à 80% au moins, de préférence à 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% au moins à la région/portion/séquence d’ADN ciblée au sein du génome bactérien et est capable de s’hybrider à tout ou partie de la séquence complémentaire de ladite région/portion/séquence, typiquement à une séquence comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 1, 2, 3, 4, 5, 10, 14, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 1, 10 ou 20 et 1000 nucléotides, par exemple entre 1, 10 ou 20 et 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 ou 200 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 100 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 50 nucléotides, ou entre 1, 10 ou 20 et 40 nucléotides, par exemple entre 10 et 40 nucléotides, entre 10 et 30 nucléotides, entre 10 et 20 nucléotides, entre 20 et 30 nucléotides, entre 15 et 40 nucléotides, entre 15 et 30 nucléotides ou entre 15 et 20 nucléotides, de préférence à une séquence comprenant 14, 15, 16, 17, 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides. La région complémentaire de la séquence cible présente au sein de l’acide nucléique d’intérêt peut correspondre à la région « SDS » d’un ARN guide (ARNg) utilisé dans un outil CRISPR tel que décrit dans le présent texte.

Dans un aube mode de réalisation particulier, l’acide nucléique d’intérêt comprend au moins deux régions complémentaires chacune d’une séquence cible, identiques à 100% ou identiques à 80% au moins, de préférence à 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% au moins à ladite région/portion/séquence d’ADN ciblée au sein du génome bactérien. Ces régions sont capables de s’hybrider à tout ou partie de la séquence complémentaire de ladite région/portion/séquence, typiquement à une séquence telle que décrite ci-dessus comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 100 nucléotides, typiquement entre 100 et 1000 nucléotides. Les régions complémentaires de la séquence cible présentes au sein de l’acide nucléique d’intérêt peuvent reconnaître, de préférence cibler, les régions flanquantes en 5’ et en 3’ de la séquence ciblée dans un outil de modification génétique tel que décrit dans le présent texte, par exemple l’outil génétique ClosTron®, l’outil génétique Targetron® ou un outil d’échange allélique type ACE®.

Typiquement, la séquence cible est une séquence codant une amphénicol-O-acetyltransférase, par exemple une chloramphénicol-O-acetyltransférase ou une thiamphénicol-O-acetyltransférase, contrôlant la transcription d’une telle séquence ou flanquant une telle séquence, au sein du génome d’une bactérie d’intérêt du genre Clostridium capable de croître dans un milieu de culture contenant un ou plusieurs antibiotiques appartenant à la classe des amphénicols, par exemple du chloramphénicol et/ou du thiamphénicol.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence reconnue est la séquence SEQ ID NO : 18 correspondant au gène catB (CIBE_3859) codant une chloramphénicol-O-acetyltransférase de C. beijerinckii DSM 6423 ou une séquence d’acides aminés identique à au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% à ladite chloramphénicol-O-acetyltransférase, ou une séquence comprenant tout ou au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de la séquence SEQ ID NO : 18. Autrement formulé, la séquence reconnue peut être une séquence comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 1 et 40 nucléotides, de préférence une séquence comprenant 14, 15, 16, 17, 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides de la séquence SEQ ID NO : 18.

Des exemples de séquences d’acides aminés identique à au moins 70% à la chloramphénicol-O- acetyltransférase codée par la séquence SEQ ID NO : 18 correspondent aux séquences identifiées dans la base de données NCBI sous les références suivantes : WP_077843937.1, SEQ ID NO : 44 (WP_063843219.1), SEQ ID NO : 45 (WP_078116092.1), SEQ ID NO : 46 (WP_077840383.1), SEQ ID NO : 47 (WP_077307770.1), SEQ ID NO : 48 (WP_103699368.1), SEQ ID NO : 49 (WP_087701812.1), SEQ ID NO : 50 (WP_017210112.1), SEQ ID NO : 51 (WP_077831818.1), SEQ ID NO : 52 (WP_012059398.1), SEQ ID NO : 53 (WP_077363893.1), SEQ ID NO : 54 (WP_015393553.1), SEQ ID NO : 55 (WP_023973814.1), SEQ ID NO : 56 (WP_026887895.1), SEQ ID NO 57 (AWK51568.1), SEQ ID NO : 58 (WP_003359882.1), SEQ ID NO : 59 (WP_091687918.1), SEQ ID NO : 60 (WP_055668544.1), SEQ ID NO : 61 (KGK90159.1), SEQ ID NO : 62 (WP_032079033.1), SEQ ID NO : 63 (WP_029163167.1), SEQ ID NO : 64 (WP_017414356.1), SEQ ID NO : 65 (WP_073285202.1), SEQ ID NO : 66 (WP_063843220.1), et SEQ ID NO : 67 ( WP_021281995.1).

Des exemples de séquences d’acides aminés identiques à au moins 75% à la chloramphénicol-O- acetyltransférase codée par la séquence SEQ ID NO : 18 correspondent aux séquences WP_077843937.1, WP 063843219.1, WP_078116092.1, WP_077840383.1, WP_077307770.1 ,

WP_103699368.1, WP_087701812.1, WP_017210112.1, WP_077831818.1, WP_012059398.1,

WP_077363893.1, WP_015393553.1, WP_023973814.1, WP_026887895.1 AWK51568.1,

WP_003359882.1 , WP_091687918.1, WP_055668544.1 et KGK90159.1.

Des exemples de séquences d’acides aminés identiques à au moins 90% à la chloramphénicol-O- acetyltransférase codée par la séquence SEQ ID NO : 18, sont les séquences WP_077843937.1, WP_063843219.1, WP_078116092.1, WP_077840383.1, WP_077307770.1 , WP_103699368.1,

WP_087701812.1, WP_017210112.1, WP_077831818.1, WP_012059398.1, WP_077363893.1,

WP_015393553.1, WP_023973814.1, WP_026887895.1 et AWK51568.1.

Des exemples de séquences d’acides aminés identiques à au moins 95% à la chloramphénicol-O- acetyltransférase codée par la séquence SEQ ID NO : 18 correspondent aux séquences

WP_077843937.1, WP_063843219.1, WP_078116092.1, WP_077840383.1, WP_077307770.1 ,

WP_103699368.1, WP_087701812.1, WP_017210112.1, WP_077831818.1, WP_012059398.1,

WP_077363893.1, WP_015393553.1, WP_023973814.1, et WP_026887895.1.

Des séquences d’acides aminés préférées, identiques à au moins 99% à la chloramphénicol-O- acetyltransférase codée par la séquence SEQ ID NO : 18, sont les séquences WP_077843937.1, SEQ ID NO : 44 (WP_063843219.1) et SEQ ID NO : 45 (WP_078116092.1).

Une séquence particulière identique à la séquence SEQ ID NO : 18 est la séquence identifiée dans la base de données NCBI sous la référence WP_077843937.1.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence cible est la séquence SEQ ID NO : 68 correspondant au gène catQ codant une chloramphénicol-O-acetyltransférase de C. perfringens dont la séquence d’acides aminés correspond à SEQ ID NO : 66 (WP_063843220.1), ou une séquence identique à au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% à ladite chloramphénicol-O-acetyltransférase, ou une séquence comprenant tout ou au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de la séquence SEQ ID NO : 68.

Autrement formulé, la séquence reconnue peut être une séquence comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 1 et 40 nucléotides, de préférence une séquence comprenant 14, 15, 16, 17, 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides de la séquence SEQ ID NO : 68.

Dans encore un autre mode de réalisation particulier, la séquence reconnue est sélectionnée parmi une séquence d’acide nucléique catB (SEQ ID NO : 18), catQ (SEQ ID NO 68), catD (SEQ ID NO : 69, Schwarz S. et al. , 2004) ou catP (SEQ ID NO : 70, Schwarz S. et al. , 2004) connue de l’homme du métier, présente naturellement au sein d’une bactérie du genre Clostridium ou introduite artificiellement dans une telle bactérie. Comme indiqué précédemment, selon un autre mode de réalisation, la séquence cible peut aussi être une séquence contrôlant la transcription d’une séquence codante telle que décrite précédemment (codant une enzyme permettant à la bactérie d’intérêt de croître dans un milieu de culture contenant un antibiotique vis-à-vis duquel elle lui confère une résistance), typiquement une séquence promotrice, par exemple la séquence promotrice (SEQ ID NO : 73) du gène catB ou celle (SEQ ID NO : 74) du gène catQ.

L’acide nucléique d’intérêt, utilisé comme outil génétique, reconnaît alors, et est donc typiquement capable de se lier à une séquence contrôlant la transcription d’une séquence codante telle que décrite précédemment.

Selon un autre mode de réalisation, la séquence cible peut être une séquence flanquant une séquence codante telle que décrite précédemment (codant une enzyme permettant à la bactérie d’intérêt de croître dans un milieu de culture contenant un antibiotique vis-à-vis duquel elle lui confère une résistance), par exemple une séquence flanquant le gène catB de séquence SEQ ID NO : 18 ou une séquence identique à au moins 70% à celle-ci. Une telle séquence flanquante comprend typiquement 1, 10 ou 20 et 1000 nucléotides, par exemple entre 1, 10 ou 20 et 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 ou 200 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 100 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 50 nucléotides, ou entre 1, 10 ou 20 et 40 nucléotides, par exemple entre 10 et 40 nucléotides, entre 10 et 30 nucléotides, entre 10 et 20 nucléotides, entre 20 et 30 nucléotides, entre 15 et 40 nucléotides, entre 15 et 30 nucléotides ou entre 15 et 20 nucléotides. Selon un aspect particulier, la séquence cible correspond à la paire de séquences flanquant une telle séquence codante, chaque séquence flanquante comprenant typiquement au moins 20 nucléotides, typiquement entre 100 et 1000 nucléotides, de préférence entre 200 et 800 nucléotides.

Par « acide nucléique », on entend au sens de l’invention, toute molécule d’ADN ou d’ARN naturelle, synthétique, semi-synthétique ou recombinante, éventuellement modifiée chimiquement (i.e. comprenant des bases non naturelles, des nucléotides modifiés comprenant par exemple une liaison modifiée, des bases modifiées et/ou des sucres modifiés), ou optimisée de manière à ce que les codons des transcrits synthétisés à partir des séquences codantes soient les codons les plus fréquemment trouvés chez une bactérie du genre Clostridium en vue de son utilisation chez celle-ci. Dans le cas du genre Clostridium, les codons optimisés sont typiquement des codons riches en bases adénines (« A ») et thymines (« T »).

Dans les séquences peptidiques décrites dans ce document, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature suivante : C : cystéine; D : acide aspartique; E : acide glutamique; F : phénylalanine; G : glycine; H : histidine; I : isoleucine; K : lysine; L : leucine ; M : méthionine ; N : asparagine ; P : proline ; Q : glutamine ; R : arginine ; S : sérine ; T : thréonine ; V : valine ; W : tryptophane et Y : tyrosine.

Dans le contexte de la présente invention, l’acide nucléique d’intérêt, utilisé comme outil génétique pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie d’intérêt, est un fragment d’ADN i) reconnaissant une séquence codant, ii) contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou iii) flanquant une séquence codant, une enzyme d’intérêt, de préférence une amphénicol-O- acetyltransférase, par exemple une chloramphénicol-O-acetyltransférase ou une thiamphénicol-O- acetyltransférase, au sein du génome d’une bactérie du genre Clostridium, en particulier d’une bactérie solvantogène du genre Clostridium naturellement capable de produire de l’isopropanol, en particulier naturellement capable d’effectuer une fermentation IBE.

La bactérie capable de produire naturellement de l’isopropanol peut être par exemple une bactérie sélectionnée parmi une bactérie C. beijerinckii, une bactérie C. diolis, une bactérie C. puniceum, une bactérie C. butyricum, une bactérie C. saccharoperbutylacetonicum, une bactérie C. botulinum, une bactérie C. drakei, une bactérie C. scatologenes , une bactérie C. perfringens, et une bactérie C. tunisiense, de préférence une bactérie sélectionnée parmi une bactérie C. beijerinckii, une bactérie C. diolis, une bactérie C. puniceum et une bactérie C. saccharoperbutylacetonicum. Une bactérie capable de produire de l’isopropanol à l’état sauvage particulièrement préférée est une bactérie C. beijerinckii.

Selon un aspect particulier, la bactérie du genre Clostridium est une bactérie C. beijerinckii dont le sous- clade est sélectionnée parmi DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NCCB 27006 et un sous-clade présentant au moins 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d’identité avec la souche DSM 6423.

Comme indiqué précédemment, l’acide nucléique d’intérêt selon l’invention est capable de supprimer la séquence (« séquence cible ») reconnue du génome de la bactérie ou de modifier son expression, par exemple de la moduler, en particulier de l’inhiber, de préférence de la modifier de manière à rendre ladite bactérie incapable d’exprimer une protéine, de préférence une amphénicol-O-acetyltransférase, en particulier une protéine fonctionnelle, à partir de ladite séquence.

Cet acide nucléique d’intérêt se présente typiquement sous la forme d’une cassette d’expression (ou «construction») telle que par exemple un acide nucléique comprenant un promoteur transcriptionnel lié de manière opérationnelle (au sens où l’entend l’homme du métier) à une ou plusieurs séquences (codantes) d’intérêt, par exemple un opéron comprenant plusieurs séquences codantes d’intérêt dont les produits d’expression concourent à la réalisation d’une fonction d’intérêt au sein de la bactérie, ou un acide nucléique comprenant en outre une séquence activatrice et/ou un terminateur de transcription ; ou sous la forme d’un vecteur, circulaire ou linéaire, simple ou double brin, par exemple un plasmide, un phage, un cosmide, un chromosome artificiel ou synthétique, comprenant une ou plusieurs cassettes d’expression telles que définies ci-dessus. De manière préférée, le vecteur est un plasmide.

Les acides nucléiques d’intérêt, typiquement les cassettes ou vecteurs, peuvent être construits par des techniques classiques bien connues de l’homme du métier et peuvent comporter un(e) ou plusieurs promoteurs, origines de réplication bactérienne (séquences ORI), séquences de terminaison, gènes de sélection, par exemple gènes de résistance à un antibiotique, et séquence(s) (par exemple « région(s) flanquée(s) ») permettant l’insertion ciblée de la cassette ou du vecteur. Par ailleurs, ces cassettes et vecteurs d’expression peuvent être intégrés au sein du génome par des techniques bien connues de l’homme du métier.

Des séquences ORI d’intérêt peuvent être choisies parmi pIP404, rAMbI, pCB 102, repH (origine de réplication chez C. acetobutylicum), ColEl ou rep (origine de réplication chez E. colï), ou toute autre origine de réplication permettant le maintien du vecteur, typiquement du plasmide, au sein d’une cellule de Clostridium.

Des séquences de terminaison d’intérêt peuvent être choisies parmi celles des gènes adc, thl, de l’opéron bcs, ou de tout autre terminateur, bien connu de l’homme de l’art, permettant l’arrêt de la transcription au sein de Clostridium.

Des gènes de sélection (gènes de résistance) d’intérêt peuvent être choisis parmi ermB, catP, bla, tetA, tetM, et/ou tout autre gène de résistance à l’ampicilline, à l’érythromycine, au chloramphénicol, au thiamphénicol, à la tétracycline ou à tout autre antibiotique pouvant être utilisé pour sélectionner des bactéries du genre Clostridium bien connu de l’homme de l’art.

Dans un mode de réalisation particulier où la séquence reconnue codant une enzyme est une séquence conférant à la bactérie une résistance au chloramphénicol et/ou au thiamphénicol, le gène de sélection utilisé n’est pas un gène de résistance au chloramphénicol et/ou au thiamphénicol, et n’est de préférence aucun des gènes catB, catQ, catD ou catP.

Dans un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique d’intérêt comprend un ou plusieurs ARN guides (ARNg) ciblant une séquence (« séquence cible », « séquence ciblée » ou «séquence reconnue») codant, contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou flanquant une séquence codant, une enzyme d’intérêt, en particulier une amphénicol-O-acetyltransférase, et/ou une matrice de modification (également identifiée dans le présent texte en tant que « matrice d’édition »), par exemple une matrice permettant d’éliminer ou de modifier tout ou partie de la séquence cible, de préférence dans le but d’inhiber ou supprimer l’expression de la séquence cible, typiquement une matrice comprenant des séquences homologues (correspondant) aux séquences situées en amont et en aval de la séquence cible telles que décrites précédemment, typiquement des séquences (homologues auxdites séquences situées en amont et en aval de la séquence cible) comprenant chacune entre 10 ou 20 paires de base et 1000, 1500 ou 2000 paires de base, par exemple entre 100, 200, 300, 400 ou 500 paires de base et 1000, 1200, 1300, 1400 ou 1500 paires de base, de préférence entre 100 et 1500 ou entre 100 et 1000 paires de bases, et de manière encore plus préférée entre 500 et 1000 paires de base ou entre 200 et 800 paires de base. Un acide nucléique d’intérêt particulier se présente sous la forme d’un vecteur comprenant une ou plusieurs cassettes d’expression, chaque cassette codant au moins un ARN guide (ARNg).

Un outil génétique particulier selon l’invention comprend plusieurs (au moins deux) acides nucléiques d’intérêt tels que décrits précédemment, lesdits acides nucléiques d’intérêt étant différents les uns des autres. Dans un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique d’intérêt utilisé comme outil génétique pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie d’intérêt, typiquement une bactérie du genre Clostridium, est un acide nucléique reconnaissant une séquence codant, une séquence contrôlant la transcription, ou une séquence flanquant, une séquence codant une enzyme conférant à la bactérie la résistance à un ou plusieurs antibiotiques, et capable de supprimer ladite séquence au sein du génome de cette bactérie ou de la rendre non fonctionnelle, en particulier un acide nucléique ne présentant pas de méthylation aux niveaux des motifs reconnus par les méthyltransférases de type Dam et Dcm (préparé à partir d’une bactérie Escherichia coli présentant le génotype dam- dcm-).

Lorsque la bactérie d’intérêt à transformer et/ou modifier génétiquement est une bactérie C. beijerinckii, en particulier appartenant à l’un des sous-clades DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593 et NCCB 27006, l’acide nucléique d’intérêt utilisé comme outil génétique, par exemple le plasmide, est un acide nucléique ne présentant pas de méthylation aux niveaux des motifs reconnus par les méthyltransférases de type Dam et Dcm, typiquement un acide nucléique dont l’adénosine (« A ») du motif GATC et/ou la deuxième cytosine « C » du motif CCWGG (W pouvant correspondre à une adénosine (« A ») ou à une thymine (« T »)) sont déméthylés.

Un acide nucléique ne présentant pas de méthylation aux niveaux des motifs reconnus par les méthyltransférases de type Dam et Dcm peut typiquement être préparé à partir d’une bactérie Escherichia coli présentant le génotype dam dcm (par exemple Escherichia coli INV 110, Invitrogen). Ce même acide nucléique peut comporter d’autres méthylations réalisées par exemple par des méthyltransférases de type EcoKI, cette dernière visant les adénines (« A ») des motifs AAC(N6)GTGC et GCAC(N6)GTT (N pouvant correspondre à n’importe quel base).

Dans un mode de réalisation préféré, la séquence ciblée correspond à un gène codant une amphénicol- O-acetyltransférase par exemple une chloramphénicol-O-acetyltransférase tel que le gène catB, à une séquence contrôlant la transcription de ce gène, ou à une séquence flanquant ce gène.

Un acide nucléique d’intérêt particulier utilisé comme outil génétique dans le cadre de l’invention est par exemple un vecteur, de préférence un plasmide, par exemple le plasmide pCas9ind-Aca/B de séquence SEQ ID NO : 21 ou le plasmide pCas9ind-gRNA_ca/B de séquence SEQ ID NO : 38 décrit dans la partie expérimentale de la présente description, en particulier une version de ladite séquence ne présentant pas de méthylation au niveau des motifs reconnus par les méthyltransférases de type Dam et Dcm.

La présente description concerne aussi l’utilisation d’un acide nucléique d’intérêt tel que décrit dans le présent texte pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie d’intérêt, en particulier une bactérie solvantogène du genre Clostridium capable à l’état sauvage de produire de l’isopropanol, en particulier capable à l’état sauvage d’effectuer une fermentation IBE. Une bactérie capable de produire de l’isopropanol à l’état sauvage, en particulier capable d’effectuer une fermentation IBE à l’état sauvage, peut être par exemple une bactérie sélectionnée parmi une bactérie C. beijerinckii, une bactérie C. diolis, une bactérie C. puniceum, une bactérie C. butyricum, une bactérie C. saccharoperbutylacetonicum, une bactérie C. botulinum, une bactérie C. drakei, une bactérie C. scatologenes, une bactérie C. perfringens, et une bactérie C. tunisiense, de préférence une bactérie sélectionnée parmi une bactérie C. beijerinckii, une bactérie C. diolis, une bactérie C. puniceum et une bactérie C. saccharoperbutylacetonicum.

Une bactérie (naturellement) capable de produire de l’isopropanol à l’état sauvage, en particulier capable d’effectuer une fermentation IBE à l’état sauvage, particulièrement préférée est une bactérie C. beijerinckii.

Les bactéries acétogènes d’intérêt sont des bactéries productrices d’acides et/ou de solvants à partir de CO2 et ¾. Des bactéries acétogènes du genre Clostridium peuvent être sélectionnées par exemple parmi C. aceticum, C. thermoaceticum, C. ljungdahlii, C. autoethanogenum, C. difficile, C. scatologenes et C. carboxydivorans .

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie du genre Clostridium concernée est une « souche ABE », de préférence la souche DSM 792 (également désignée souche ATCC 824 ou encore LMG 5710) de C. acetobutylicum, ou la souche NCIMB 8052 de C. beijerinckii.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la bactérie du genre Clostridium concernée est une « souche IBE », typiquement l’une des bactéries C. beijerinckii identifiées dans la présente description, par exemple une bactérie C. beijerinckii dont le sous-clade est sélectionnée parmi DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593, NCCB 27006, ou une bactérie C. aurantibutyricum DSZM 793 (Georges et al. , 1983), et un sous-clade d’une telle bactérie C. beijerinckii ou C. aurantibutyricum présentant au moins 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d’identité avec la souche DSM 6423. Une bactérie C. beijerinckii, ou un sous-clade de bactérie C. beijerinckii, particulièrement préféré(e) est dépourvu(e) du plasmide pNF2.

Les génomes respectifs des sous-clades LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593 et NCCB 27006 d’une part, et DSZM 793 d’autre part, présentent des pourcentages d’identité de séquence d’au moins 97% avec le génome du sous-clade DSM 6423.

Les inventeurs ont réalisé des tests fermentaires confirmant que les bactéries C. beijerinckii de sous- clade DSM 6423, LMG 7815 et NCCB 27006 sont capables de produire de l’isopropanol à l’état sauvage (cf. tableau 1). [Tableau 1]

Bilan des essais de fermentation de glucose à l’aide des souches naturellement productrices d’isopropanol C. beijerinckii DSM 6423, LMG 7815 et NCCB 27006.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l’invention, la bactérie C. beijerinckii est la bactérie de sous-clade DSM 6423.

Dans encore un autre mode de réalisation préféré de l’invention, la bactérie C. beijerinckii est une souche C. beijerinckii IFP963 AcatB ApNF2 (enregistrée le 20 février 2019 sous le numéro de dépôt LMG P- 31277 auprès de la collection BCCM-LMG, et également identifiée dans le présent texte en tant que C. beijerinckii DSM 6423 AcatB ApNF2).

La bactérie destinée à être transformée, et de préférence modifiée génétiquement, est selon un mode de réalisation particulier une bactérie qui a été exposée à une première étape de transformation et à une première étape de modification génétique à l’aide d’un acide nucléique ou outil génétique selon l’invention ayant permis de supprimer au moins une molécule d’ADN extrachromosomique (typiquement au moins un plasmide) naturellement présente au sein de ladite bactérie à l’état sauvage.

Un autre aspect décrit par les inventeurs a trait à un procédé pour transformer, et de préférence en outre modifier génétiquement, une bactérie du genre Clostridium à l’aide d’un outil génétique selon l’invention, typiquement à l’aide d’un acide nucléique d’intérêt selon l’invention tel que décrit plus haut. Ce procédé comprend une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie de l’acide nucléique d’intérêt décrit dans le présent texte. Le procédé peut comprendre en outre une étape d’obtention, de récupération, de sélection ou d’isolement de la bactérie transformée, i.e. de la bactérie présentant la ou les recombinaisons/modifications/optimisations recherchées.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie du genre Clostridium fait intervenir un outil de modification génétique par exemple un outil de modification génétique sélectionné parmi un outil CRISPR, un outil basé sur l’utilisation d’introns de type II (par exemple l’outil Targetron® ou l’outil ClosTron®) et un outil d’échange allélique (par exemple l’outil ACE®), et comprend une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie d’un acide nucléique d’intérêt selon l’invention tel que décrit plus haut. La présente invention est typiquement avantageusement mise en œuvre dès lors que l’outil de modification génétique sélectionné pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie du genre Clostridium, est destiné à être utilisé sur une bactérie telle que C. beijerinckii, porteuse à l’état sauvage d’un gène codant une enzyme responsable de la résistance à un ou plusieurs antibiotiques, et que la mise en œuvre dudit outil génétique comprend une étape de transformation de ladite bactérie à l’aide d’un acide nucléique permettant l’expression d’un marqueur de résistance à un antibiotique auquel cette bactérie est résistante à l’état sauvage et/ou une étape de sélection des bactéries transformées et/ou modifiées génétiquement à l’aide dudit antibiotique (auquel la bactérie est résistante à l’état sauvage).

Une modification avantageusement réalisable grâce à la présente invention, par exemple à l’aide d’un outil de modification génétique sélectionné parmi un outil CRISPR, un outil basé sur l’utilisation d’introns de type II et un outil d’échange allélique, consiste à supprimer une séquence codant une enzyme conférant à la bactérie la résistance à un ou plusieurs antibiotiques, ou à rendre cette séquence non fonctionnelle. Une autre modification avantageusement réalisable grâce à la présente invention consiste à modifier génétiquement une bactérie afin d’améliorer ses performances, par exemple ses performances dans la production d’un solvant ou d’un mélange de solvants d’intérêt, ladite bactérie ayant préalablement déjà été modifiée grâce à l’invention pour la rendre sensible à un antibiotique auquel elle était résistante à l’état sauvage.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention est basé sur l’utilisation de (met en œuvre) la technologie / l’outil génétique CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromie Repeats), en particulier l’outil génétique CRISPR/Cas (CRISPR-associated protein).

Cette méthode est basée sur l’emploi d’une enzyme appelée nucléase (typiquement une nucléase de type Cas dans le cas de l’outil génétique CRISPR/Cas, telle que la protéine Cas9 (CRISPR-associated protein 9) de Streptococcus pyogenes), qui va, guidée par une molécule d’ARN, réaliser une coupure double brin au sein d’une molécule d’ADN (séquence cible d’intérêt). La séquence de l’ARN guide (ARNg) déterminera le site de coupure de la nucléase, lui conférant ainsi une très forte spécificité. Une coupure double brin au sein d’une molécule d’ADN indispensable à la survie du microorganisme étant de fait létal pour un organisme, la survie de ce dernier dépendra de sa capacité à la réparer (cf. par exemple Cui & Bikard, 2016). Chez les bactéries du genre Clostridium, la réparation d’une coupure double brin dépend d’un mécanisme de recombinaison homologue nécessitant une copie intacte de la séquence clivée. En fournissant à la bactérie un fragment d’ADN permettant d’effectuer cette réparation tout en modifiant la séquence originelle, il est possible de forcer le micro-organisme à intégrer les changements désirés au sein de son génome.

La présente invention peut être mise en œuvre sur une bactérie du genre Clostridium à l’aide d’un outil génétique CRISPR/Cas classique utilisant un unique plasmide comprenant une nucléase, un ARNg et une matrice de réparation tel que décrit par Wang et al. (2015). Le système CRISPR/Cas contient deux éléments essentiels distincts, i.e. i) une endonucléase, dans le cas présent la nucléase associée au système CRISPR, Cas, et ii) un ARN guide. L’ARN guide se présente sous la forme d’un ARN chimérique qui consiste en la combinaison d’un ARN bactérien CRISPR (ARNcr) et d’un ARNtracr ( trans-activating ARN CRISPR). L’ARNg combine la spécificité de ciblage de l’ ARNcr correspondant aux "séquences espaçantes" qui servent de guides aux protéines Cas, et les propriétés conformationnelles de l’ ARNtracr en un transcrit unique. Lorsque l’ ARNg et la protéine Cas sont exprimés simultanément dans la cellule, la séquence génomique cible peut être modifiée de manière permanente grâce à une matrice de réparation fournie. L’homme du métier peut aisément définir la séquence et la structure des ARNg selon la région chromosomique ou l’élément génétique mobile à cibler en utilisant des techniques bien connues (voir par exemple l’article de DiCarlo et al. , 2013).

L’introduction dans la bactérie des éléments (acides nucléiques ou ARNg) de l’outil génétique est réalisée par toute méthode, directe ou indirecte, connue de l’homme du métier, par exemple par transformation, conjugaison, microinjection, transfection, électroporation, etc., de préférence par électroporation (Mermelstein et al, 1993).

Les inventeurs ont récemment mis au point et décrit un outil génétique de modification de bactéries, adapté aux bactéries du genre Clostridium et utilisable dans le contexte de la présente invention, basé sur G utilisation de deux plasmides (cf. WO2017/064439, Wasels et al., 2017, et Figure 15 associée à la présente description).

Dans un mode de réalisation particulier, le « premier » plasmide de cet outil permet l’expression de la nucléase Cas et un « deuxième » plasmide, spécifique de la modification à effectuer, contient une ou plusieurs cassettes d’expression d’ARNg (ciblant typiquement des régions différentes de l’ADN bactérien) ainsi qu’une matrice de réparation permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, le remplacement d’une portion de l’ADN bactérien ciblée par Cas par une séquence d’intérêt. Le gène cas et/ou la (les) cassette(s) d’expression d’ARNg sont placés sous le contrôle de promoteurs d’expression constitutifs ou inductibles, de préférence inductibles, connus de l’homme du métier (par exemple décrits dans la demande WO2017/064439 et incorporés par référence à la présente description), et de préférence différents mais inductibles par le même agent inducteur.

Les ARNg peuvent être des ARN naturels, synthétiques ou produits par des techniques de recombinaison. Ces ARNg peuvent être préparés par toutes méthodes connues de l’homme du métier telles que, par exemple, la synthèse chimique, la transcription in vivo ou des techniques d’ amplification. Lorsque plusieurs ARNg sont utilisés, l’expression de chaque ARNg peut être contrôlée par un promoteur différent. De préférence, le promoteur utilisé est le même pour tous les ARNg. Un même promoteur peut dans un mode de réalisation particulier être utilisé pour permettre l’expression de plusieurs, par exemple de quelques-uns seulement, ou en d’autres termes de tout ou partie, des ARNg destinés à être exprimés.

Dans un autre mode de réalisation particulier, utilisable dans le contexte de la présente invention, ii) au moins l’un desdits « premier » et « deuxième » acides nucléiques code en outre un ou plusieurs ARN guides (ARNg) ou l’outil génétique comprend en outre un ou plusieurs ARN guides, chaque ARN guide comprenant une structure ARN de fixation à G enzyme Cas et une séquence complémentaire de la portion ciblée de l’ADN bactérien, et iii) au moins l’un desdits « premier » et « deuxième » acides nucléiques comprend en outre une séquence codant une protéine anti-CRISPR placée sous le contrôle d’un promoteur inductible, ou l’outil génétique comprend en outre un « troisième » acide nucléique codant une protéine anti-CRISPR placée sous le contrôle d’un promoteur inductible, de préférence différent des promoteurs contrôlant l’expression de Cas et/ou du ou des ARNg et inductible par un aube agent inducteur.

Dans un mode de réalisation préféré, la protéine anti-CRISPR est capable d’inhiber, de préférence neutraliser, l’action de la nucléase, de préférence durant la phase d’introduction des séquences d’acide nucléique de l’outil génétique dans la souche bactérienne d’intérêt.

Un procédé particulier faisant intervenir la technologie CRISPR, susceptible d’être mis en œuvre dans le cadre de la présente invention pour transformer, et typiquement pour modifier génétiquement par recombinaison homologue, une bactérie du genre Clostridium, comprend les étapes suivantes :

a) d’introduction dans la bactérie d’un outil génétique CRISPR décrit par les inventeurs en présence d’un agent inducteur de l’expression d’une protéine anti-CRISPR, et

b) de culture de la bactérie transformée obtenue à l’issue de l’étape a) sur un milieu ne contenant pas (ou dans des conditions n’impliquant pas) l’agent inducteur de l’expression de la protéine anti-CRISPR, permettant typiquement l’expression du complexe ribonucléoprotéique Cas/ ARNg.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend en outre, pendant ou après l’étape b), une étape d’induction de l’expression du ou des promoteurs inductibles contrôlant l’expression de Cas et/ou du ou des ARN guides lorsqu’un tel ou de tels promoteurs sont présents au sein de l’outil génétique, afin de permetbe la modification génétique d’intérêt de la bactérie une fois ledit outil génétique inboduit dans ladite bactérie. L’induction est réalisée à l’aide d’une substance permettant de lever l’inhibition d’expression liée au promoteur inductible sélectionné.

Dans un autre mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape c) additionnelle d’élimination de l’acide nucléique contenant la matrice de réparation (la cellule bactérienne étant alors considérée comme « curée » dudit acide nucléique) et/ou d’élimination du/des ARNs guides ou séquences codant le/les ARNs guides introduits avec l’outil génétique lors de l’étape a).

Dans encore un autre mode de réalisation particulier, le procédé comprend une ou plusieurs étapes additionnelles, postérieure(s) à l’étape b) ou à l’étape c), d’introduction d’un énième, par exemple troisième, quabième, cinquième, etc., acide nucléique contenant une matrice de réparation distincte de celle(s) déjà introduite(s) et d’une ou plusieurs cassettes d’expression d’ARN guides permettant l’intégration de la séquence d’intérêt contenue dans ladite matrice de réparation distincte dans une zone ciblée du génome de la bactérie, en présence d’un agent inducteur de l’expression de la protéine anti- CRISPR, chaque étape additionnelle étant suivie d’une étape de culture de la bactérie ainsi transformée sur un milieu ne contenant pas l’agent inducteur de l’expression de la protéine anti-CRISPR, permettant typiquement l’expression du complexe ribonucléoprotéique Cas/ARNg.

Dans un mode de réalisation particulier du procédé selon l’invention, la bactérie est transformée à l’aide d’un outil CRISPR ou d’un procédé, tels ceux décrits plus haut, utilisant (par exemple codant) une enzyme responsable de la coupure d’au moins un brin de la séquence cible d’intérêt, dans lequel l’enzyme est dans un mode particulier une nucléase, de préférence une nucléase de type Cas, préférentiellement sélectionnée parmi une enzyme Cas9 et une enzyme MAD7. De manière préférée, la séquence cible d’intérêt est une séquence, par exemple le gène catB, codant une enzyme conférant à la bactérie la résistance à un ou plusieurs antibiotiques, de préférence à un ou plusieurs antibiotiques appartenant à la classe des amphénicols, typiquement une amphénicol-O-acetyltransférase telle qu’une chloramphénicol-O-acetyltransférase, une séquence contrôlant la transcription de la séquence codante ou une séquence flanquant ladite séquence codante.

Des exemples de protéines Cas9 utilisables dans la présente invention incluent, sans y être limités, les protéines Cas9 de S. pyogenes (cf. SEQ ID NO : 1 de la demande WO2017/064439 et numéro d’entrée NCBI : WP_010922251.1), Streptococcus thermophilus, Streptococcus mutans, Campylobacter jejuni, Pasteurella multocida, Francisella novicida, Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica et Légionella pneumophila (cf. Fonfara et al, 2013 ; Makarova et al, 2015).

La nucléase MAD7 (dont la séquence d’acides aminés correspond à la séquence SEQ ID NO : 72), également identifiée en tant que « Cas 12 » ou « Cpfl », peut autrement être avantageusement utilisée dans le cadre de la présente invention en la combinant avec un ou des ARNg connu(s) de l’homme de métier capable(s) de se lier à une telle nucléase (cf. Garcia-Doval et al. , 2017 et Stella S. et al. , 2017). Selon un aspect particulier, la séquence codant la nucléase MAD7 est une séquence optimisée pour être facilement exprimée dans des souches de Clostridium, de préférence la séquence SEQ ID NO : 71. Lorsqu’elle est utilisée la protéine anti-CRISPR est typiquement une protéine « anti-Cas », i.e. une protéine capable d’inhiber ou d’empêcher/de neutraliser l’action de Cas, et/ou une protéine capable d’inhiber ou d’empêcher/de neutraliser l’action d’un système CRISPR/Cas, par exemple d’un système CRISPR/Cas de type II lorsque la nucléase est une nucléase de type Cas9.

La protéine anti-CRISPR est avantageusement une protéine « anti-Cas9 », par exemple sélectionnée parmi AcrlIAl, AcrIIA2, AcrIIA3, AcrIIA4, AcrIIA5, AcrlICl, AcrIIC2 et AcrIIC3 (Pawluk et al, 2018). De manière préférée la protéine « anti-Cas9 » est AcrIIA2 ou AcrIIA4. Une telle protéine est typiquement capable de limiter très significativement, idéalement d’empêcher, l’action de Cas9, par exemple en se fixant sur l’enzyme Cas9.

Une autre protéine anti-CRISPR avantageusement utilisable est une protéine « anti-MAD7 », par exemple la protéine AcrVAl (Marino et al, 2018). Tout comme la portion d’ADN ciblée (« séquence reconnue »), la matrice d’édition/de réparation peut elle-même comprendre une ou plusieurs séquences d’ acide nucléique ou portions de séquence d’ acide nucléique correspondant à des séquences naturelles et/ou synthétiques, codantes et/ou non codantes. La matrice peut également comprendre une ou plusieurs séquences « étrangères », i.e. naturellement absentes du génome des bactéries appartenant au genre Clostridium ou du génome d’espèces particulières dudit genre. La matrice peut aussi comprendre une combinaison de séquences.

L’outil génétique utilisé dans le cadre de la présente invention permet à la matrice de réparation de guider l’incorporation au sein du génome bactérien d’un acide nucléique d’intérêt, typiquement d’une séquence ou portion de séquence d’ADN comprenant au moins 1 paire de base (pb), de préférence au moins 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 1 000, 10 000, 100 000 ou 1 000 000 pb, typiquement entre 1 pb et 20 kb, par exemple 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 kb, ou entre 1 pb et 10 kb, de préférence entre 10 pb et 10 kb ou entre 1 kb et 10 kb, par exemple entre lpb et 5 kb, entre 2 kb et 5 kb, ou encore entre 2,5 ou 3 kb et 5 kb.

Dans un mode de réalisation particulier, l’expression de la séquence d’ADN d’intérêt permet à la bactérie du genre Clostridium de fermenter (typiquement simultanément) plusieurs sucres différents, par exemple au moins deux sucres différents, typiquement au moins deux sucres différents parmi les sucres comprenant 5 atomes de carbone (tels que le glucose ou le mannose) et/ou parmi les sucres comprenant 6 atomes de carbone (tels que le xylose, l’arabinose ou le fructose), de préférence au moins trois sucres différents, sélectionnés par exemple parmi glucose, xylose et mannose ; glucose, arabinose et mannose ; et glucose xylose et arabinose.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la séquence d’ADN d’intérêt code au moins un produit d’intérêt, de préférence un produit favorisant la production de solvant par la bactérie du genre Clostridium, typiquement au moins une protéine d’intérêt, par exemple une enzyme ; une protéine membranaire tel qu’un transporteur ; une protéine de maturation d’autres protéines (protéine chaperonne) ; un facteur de transcription ; ou une combinaison de ceux-ci.

Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention est basé sur l’utilisation d’introns de type II, et met par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ClosTron® ou l’outil génétique Targetron®.

La technologie Targetron® repose sur l’utilisation d’un intron de groupe II (basé sur l’intron Ll.ltrB de Lactococcus lactis) reprogrammable, capable d’intégrer le génome bactérien rapidement à un locus désiré (Chen et al., 2005, Wang et al., 2013), typiquement dans le but d’inactiver un gène ciblé. Les mécanismes de reconnaissance de la zone éditée ainsi que d’insertion dans le génome par rétro-épissage sont basés sur une homologie entre l’intron et ladite zone d’une part, et sur l’activité d’une protéine (ltrA) d’autre part. La technologie ClosTron® repose sur une approche similaire, complétée par l’ajout d’un marqueur de sélection dans la séquence de l’intron (Heap et al. , 2007). Ce marqueur permet de sélectionner l’intégration de l’intron dans le génome, et facilite donc l’obtention des mutants désirés. Ce système génétique exploite également les introns de type I. En effet, le marqueur de sélection (appelé RAM pour retrotransposition-activated marker) est interrompu par un tel élément génétique, qui empêche son expression depuis le plasmide (une description plus précise du système : Zhong et al.). L’épissage de cet élément génétique se produit avant intégration dans le génome, ce qui permet l’obtention d’un chromosome présentant une forme active du gène de résistance. Une version optimisée du système comprend des sites FLP/FRT en amont et en aval de ce gène, ce qui permet d’utiliser la recombinase FRT pour éliminer le gène de résistance (Heap et al. , 2010).

Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention est basé sur l’utilisation d’un outil d’échange allélique, et met par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ACE®.

La technologie ACE® repose sur l’utilisation d’un mutant auxotrophe (pour l’uracile chez C. acetobutylicum ATCC 824 par délétion du gène pyrE, qui provoque également une résistance à l’acide 5- fluoroorotique (A-5-FO) ; Heap et al. , 2012). Le système utilise le mécanisme d’échange allélique, bien connu de l’homme de métier. Suite à une transformation avec un vecteur pseudo-suicide (à très faible copies), l’intégration de ce dernier dans le chromosome bactérien par un premier évènement d’échange allélique est sélectionné grâce au gène de résistance présent initialement sur le plasmide. L’étape d’intégration peut être réalisée de deux manières différentes, soit au sein du locus pyrE soit au sein d’un autre locus :

Dans le cas de l’intégration au locus pyrE, le gène pyrE est également placé sur le plasmide, sans toutefois être exprimé (pas de promoteur fonctionnel). La deuxième recombinaison restaure un gène pyrE fonctionnel et peut alors être sélectionnée par auxotrophie (milieu minimum, ne contenant pas d’uracile). Le gène pyrE non-fonctionnel présentant également un caractère sélectionnable (sensibilité au A-5-FO), d’autres intégrations sont ensuite envisageables sur le même modèle, en alternant successivement l’état de pyrE entre fonctionnel et non-fonctionnel.

Dans le cas de l’intégration à un autre locus, une zone génomique permettant une expression du marqueur de contre-sélection après recombinaison est ciblée (typiquement, en opéron après un autre gène, de préférence un gène fortement exprimé). Cette deuxième recombinaison est alors sélectionnée par auxotrophie (milieu minimum ne contenant pas d’uracile).

Dans les modes de réalisation décrits basés sur l’utilisation d’introns de type II, et mettant par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ClosTron® ou l’outil génétique Targetron®, ou basés sur l’utilisation d’un outil d’échange allélique, et mettant par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ACE®, la séquence ciblée est de préférence une séquence flanquant la séquence codant une enzyme d’intérêt, de préférence, comme expliqué ci-dessus, une amphénicol-O-acetyltransférase.

Un autre objet de l’invention concerne une bactérie transformée et/ou génétiquement modifiée, typiquement une bactérie du genre Clostridium appartenant à une espèce ou correspondant à l’un des sous-clades décrits par les inventeurs, obtenue à l’aide d’un procédé tel que décrit par les inventeurs dans le présent texte, ainsi que toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci.

Une bactérie ainsi transformée et/ou génétiquement modifiée typique de l’invention est une bactérie n’exprimant plus une enzyme lui conférant la résistance à un ou plusieurs antibiotiques, en particulier une bactérie n’exprimant plus une amphénicol-O-acetyltransférase, par exemple une bactérie exprimant à l’état sauvage le gène catB, et dépourvue dudit gène catB ou incapable d’exprimer ledit gène catB une fois transformée et/ou génétiquement modifiée grâce à l’invention. La bactérie ainsi transformée et/ou génétiquement modifiée grâce à l’invention est rendue sensible à un amphénicol, par exemple à un amphénicol tel que décrit dans le présent texte, en particulier au chloramphénicol ou au thiamphénicol. Un exemple particulier de bactérie génétiquement modifiée préférée selon l’invention est la bactérie identifiée dans la présente description en tant que C. beijerinckii DSM 6423 D catB telle qu’enregistrée sous le numéro de dépôt LMG P-31151 auprès de la Belgian Co-ordinated Collections of Micro- organisms (« BCCM », K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent - Belgique) le 6 décembre 2018. La description concerne également toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de ladite bactérie restant sensible à un amphénicol tel que le thiamphénicol et/ou le chloramphénicol. Selon un mode de réalisation particulier, la bactérie transformée et/ou génétiquement modifiée selon l’invention n’exprimant pas une enzyme lui conférant la résistance à un ou plusieurs antibiotiques, en particulier une amphénicol-O-acetyltransférase telle que la chloramphénicol-O-acetyltransférase, par exemple la bactérie C. beijerinckii DSM 6423 D catB, est encore susceptible d’être transformée, et de préférence modifiée génétiquement. Elle peut l’être à l’aide d’un acide nucléique, par exemple d’un plasmide tel que décrit dans la présente description, par exemple dans la partie expérimentale. Un exemple d’acide nucléique susceptible d’être avantageusement utilisé est le plasmide pCas9 _aCr de séquence SEQ ID NO : 23 (décrit dans la partie expérimentale de la présente description).

Un aspect particulier de l’invention concerne en effet l’utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement selon l’invention, de préférence de la bactérie C. beijerinckii DSM 6423 AcatB déposée sous le numéro LMG P-31151 ou d’une version génétiquement modifiée de celle-ci, par exemple à l’aide de l’un des outils génétiques ou procédés décrits dans le présent texte, pour produire, grâce à l’expression du ou des acides nucléiques d’intérêt introduits volontairement dans son génome, un ou plusieurs solvants, de préférence au moins l’isopropanol, de préférence à l’échelle industrielle. L’invention concerne aussi un kit (trousse) comprenant (i) un acide nucléique d’intérêt selon l’invention, typiquement un fragment d’ADN reconnaissant une séquence codant, ou contrôlant la transcription d’une séquence codant, une enzyme d’intérêt dans une bactérie du genre Clostridium, en particulier dans une bactérie capable d’effectuer une fermentation IBE telle que décrite dans le présent texte, et (ii) au moins un outil, de préférence plusieurs outils, sélectionnés parmi les éléments d’un outil de modification génétique permettant de transformer, et typiquement modifier génétiquement une bactérie du genre Clostridium, en vue de produire un variant amélioré de ladite bactérie; un acide nucléique en tant qu’ARNg ; un acide nucléique en tant que matrice de réparation ; au moins une paire d’amorces, par exemple une paire d’ amorces telle que décrite dans le contexte de la présente invention ; et un inducteur permettant l’expression d’une protéine codée par ledit outil, par exemple d’une nucléase de type Cas9 ou MAD7.

L’outil de modification génétique pour transformer, et typiquement modifier génétiquement une bactérie du genre Clostridium, peut-être par exemple sélectionné parmi un outil CRISPR, un outil basé sur l’utilisation d’introns de type II et un outil d’échange allélique, comme expliqué plus haut.

Le kit peut en outre comprendre un ou plusieurs inducteurs adaptés au(x) promoteur(s) inductible(s) sélectionné(s) éventuellement utilisé(s) au sein de l’outil génétique pour contrôler l’expression de la nucléase utilisée et/ou d’un ou de plusieurs ARN guides.

Un kit particulier selon l’invention permet l’expression d’une nucléase comprenant une étiquette (ou «tag»).

Les kits selon l’invention peuvent en outre comprendre un ou plusieurs consommables tels qu’un milieu de culture, au moins une bactérie compétente du genre Clostridium (i.e. conditionnée en vue de la transformation), au moins un ARNg, une nucléase, une ou plusieurs molécules de sélection, ou encore une notice explicative.

La description concerne également l’utilisation d’un kit selon l’invention, ou de l’un ou de plusieurs des éléments de ce kit, pour la mise en œuvre d’un procédé de transformation et idéalement de modification génétique d’une bactérie du genre Clostridium décrit dans le présent texte, et/ou pour la production de solvant(s) ou de biocarburant(s), ou de mélanges de ceux-ci, de préférence à l’échelle industrielle, à l’aide d’une bactérie du genre Clostridium, de préférence d’une bactérie du genre Clostridium naturellement productrice d’isopropanol.

Des solvants susceptibles d’être produits sont typiquement l’acétone, le butanol, l’éthanol, l’isopropanol ou un mélange de ceux-ci, typiquement un mélange éthanol/isopropanol, butanol/isopropanol, ou éthanol/butanol, de préférence un mélange isopropanol/butanol.

L’utilisation de bactéries transformées selon l’invention permet typiquement la production par an à l’échelle industrielle d’au moins 100 tonnes d’acétone, d’au moins 100 tonnes d’éthanol, d’au moins 1000 tonnes d’isopropanol, d’au moins 1800 tonnes de butanol, ou d’au moins 40 000 tonnes d’un mélange de ceux-ci. Les exemples et figures ci-après ont pour but d’illustrer plus pleinement l’invention sans pour autant en limiter la portée.

FIGURES

[Fig 1] La Figure 1 représente le Classement de 30 souches de Clostridium solvantogènes, d’après Poehlein et al., 2017. A noter que le sous-clade C. beijerinckii NRRL B-593 est également identifié dans la littérature en tant que C. beijerinckii DSM 6423.

[Fig 2] La Figure 2 représente la Carte du plasmide pCas9ind-Aca/B

[Fig 3] La Figure 3 représente la Carte du plasmide pCas9acr

[Fig 4] La Figure 4 représente la Carte du plasmide pEC750S-«ppHR

[Fig 5] La Figure 5 représente la Carte du plasmide pEX-A2-gRNA-wpp.

[Fig 6] La Figure 6 représente la Carte du plasmide pEC750S-A«pp.

[Fig 7] La Figure 7 représente la Carte du plasmide pEC750C-A«pp

[Fig 8] La Figure 8 représente la Carte du pGRNA-pNF2

[Fig 9] La Figure 9 représente l’Amplification PCR du gène catB dans les clones issus de la transformation bactérienne de la souche C. beijerinckii DSM 6423.

Amplification d’environ 1,5 kb si la souche possède encore le gène catB, ou d’environ 900 pb si ce gène est délété.

[Fig 10] La Figure 10 représente la Croissance des souches C. beijerinckii DSM6423 WT et Aral B sur milieu 2YTG et milieu sélectif 2YTG thiamphénicol.

[Fig 11] La Figure 11 représente l’Induction du système CRISPR/Cas9acr chez des transformants de la souche C. beijerinckii DSM 6423 contenant pCas9, _Cr et un plasmide d’expression de l’ARNg ciblant upp, avec ou sans matrice de réparation. Légende : Em, érythromycine ; Tm, thiamphénicol ; aTc, anhydrotétracycline ; ND, non dilué.

[Fig 12A] La Figure 12 représente la Modification du locus upp de C. beijerinckii DSM 6423 via le système CRISPR/Cas9. La Figure 12A représente l’organisation génétique du locus upp : gènes, site cible de l’ARNg et matrices de réparation, associées aux régions d’homologies correspondantes sur F ADN génomique. Les sites d’hybridation des amorces pour la vérification par PCR (RH010 et RH011) sont également indiqués.

[Fig 12B] La Figure 12 représente la Modification du locus upp de C. beijerinckii DSM 6423 via le système CRISPR/Cas9. La Figure 12B représente l’amplification du locus upp à l’aide des amorces RH010 et RH011. Une amplification de 1680 pb est attendue dans le cas d’un gène sauvage, contre 1090 pb pour un gène upp modifié. M, marqueur de taille 100 bp - 3 kb (Lonza) ; WT, souche sauvage.

[Fig 13] La Figure 13 représente l’Amplification PCR vérifiant la présence du plasmide pCas9i _nd . dans la souche C. beijerinckii 6423 A catB. [Fig 14] La Figure 14 représente l’Amplification PCR («900 pb) vérifiant la présence ou non du plasmide naturel pNF2 avant induction (contrôle positif 1 et 2) puis après induction sur milieu contenant de l’aTc du système CRISPR-Cas9.

[Fig 15] La Figure 15 représente l’Outil génétique de modification de bactéries, adapté aux bactéries du genre Clostridium, basé sur l’utilisation de deux plasmides (cf. WO2017/064439, Wasels et al. , 2017). [Fig 16] La Figure 16 représente la Carte du plasmide pCas9ind-gRNA_ca/R.

[Fig 17] La Figure 17 représente le système CRISPR/Cas9 utilisé pour l’édition du génome en tant qu’outil génétique permettant de créer, à l’aide de la nucléase Cas9, une ou des coupures double brin dans F ADN génomique dirigée(s) par l’ARNg.

ARNg, ARN guide ; PAM, Protospacer Adjacent Motif. Figure modifiée depuis Jinek et al, 2012.

[Fig 18] La Figure 18 représente la réparation par recombinaison homologue d’une coupure double brin induite par Cas9. PAM, Protospacer Adjacent Motif.

[Fig 19] La Figure 19 représente l’utilisation de CRISPR/Cas9 chez Clostridium.

ermB, gène de résistance à l’érythromycine ; catP (SEQ ID NO : 70), gène de résistance au thiamphénicol/chloramphenicol ; tetR, gène dont le produit d’expression réprime la transcription à partir de Pcm-tet02/l ; Pcm-2tet01 et Pcm-tet02/l , promoteurs inductibles à l’anhydrotétracycycline, « aTc » (Dong et al., 2012) ; miniPthl, promoteur constitutif (Dong et al. , 2012).

[Fig 20] La Figure 20 représente la carte du plasmide pCas9, _{Cr (} SEQ ID NO : 23).

ermB, gène de résistance à l’érythromycine ; rep, origine de réplication chez E. coli ; repH, origine de réplication chez C. acetobutylicum ; Tthl, terminateur thiolase ; miniPthl, promoteur constitutif (Dong et al., 2012) ; Pcm-tet02/l, promoteur réprimé par le produit de tetR et inductible par G anhydrotétracycline, « aTc » (Dong et al. , 2012) ; Pbgal, promoteur réprimé par le produit de lacR et inductible par le lactose (Hartman et al. , 2011) ; acrIIA4, gène codant la protéine anti-CRISPR AcrII14 ; bgaR, gène dont le produit d’expression réprime la transcription à partir de Pbgal.

[Fig 21] La Figure 21 représente le taux de transformation relatifs de C. acetobutylicum DSM 792 contenant pCas9i _nd (SEQ ID NO : 22) ou pCas9 _aCr (SEQ ID N : 23). Les fréquences sont exprimées en nombre de transformants obtenus par pg d’ADN utilisé lors de la transformation, rapportées aux fréquences de transformation de pEC750C (SEQ ID NO : 106), et représentent les moyennes d’au moins deux expériences indépendantes.

[Fig 22] La Figure 22 représente l’induction du système CRISPR/Cas9 chez des transformants de la souche DSM 792 contenant pCas9, _Cr et un plasmide d’expression de l’ARNg ciblant bdhB, avec (SEQ ID NO : 79 et SEQ ID NO : 80) ou sans (SEQ ID NO : 105) matrice de réparation. Em, érythromycine ; Tm, thiamphénicol ; aTc, anhydrotétracycline ; ND, non dilué.

[Fig 23A] La Figure 23 représente la modification du locus bdh de C. acetobutylicum DSM792 via le système CRISPR/Cas9. La figure 23 A représente l’organisation génétique du locus bdh. Les homologies entre matrice de réparation et ADN génomique sont mises en évidence à l’aide de parallélogrammes gris clair. Les sites d’hybridation des amorces VI et V2 sont également représentés. [Fig 23B] La Figure 23 représente la modification du locus bdh de C. acetobutylicum DSM792 via le système CRISPR/Cas9. La figure 23B représente l’amplification du locus bdh à l’aide des amorces VI et V2. M, marqueur de taille 2-log (NEB) ; P, plasmide pGRNA - bdhA bdhB ; WT, souche sauvage. [Fig. 24] La figure 24 représente l’efficacité de transformation (en colonies observées par pg d’ADN transformé) pour 20 pg de plasmide pCas9 _md dans la souche de C. beijerinckii DSM6423. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la moyenne pour un triplicat biologique.

[Fig. 25] La figure 25 représente la carte du plasmide pNF3.

[Fig. 26] La figure 26 représente la carte du plasmide pEC751S.

[Fig. 27] La figure 27 représente la carte du plasmide pNF3S.

[Fig. 28] La figure 28 représente la carte du plasmide pNF3E.

[Fig. 29] La figure 29 représente la carte du plasmide pNF3C.

[Fig. 30] La figure 30 représente l’efficacité de transformation (en colonies observées par pg d’ADN transformé) du plasmide pCas9i _nd dans trois souches de C. beijerinckii DSM 6423. Les barres d’erreur correspondent à l’écart standard de la moyenne pour un duplicat biologique.

[Fig. 31] La figure 31 représente l’efficacité de transformation (en colonies observées par pg d’ADN transformé) du plasmide pEC750C dans deux souches dérivées de C. beijerinckii DSM 6423. Les barres d’erreur correspondent à l’écart standard de la moyenne pour un duplicat biologique.

[Fig. 32] La figure 32 représente l’efficacité de transformation (en colonies observées par pg d’ADN transformé) des plasmides pEC750C, pNF3C, pFWOl et pNF3E dans la souche C. beijerinckii IFP963 A catB ApNF2. Les barres d’erreur correspondent à l’écart standard de la moyenne pour un triplicat biologique.

[Fig. 33] La figure 33 représente l’efficacité de transformation (en colonies observées par pg d’ADN transformé) des plasmides pFWOl, pNF3E et pNF3S dans la souche C. beijerinckii NCIMB 8052.

EXEMPLES

EXEMPLE n°l

Matériels et méthodes

Conditions de culture

C. acetobutylicum DSM 792 a été cultivée en milieu 2YTG (Tryptone 16 g.l ¹ , extrait de levure 10 g.l ¹ , glucose 5 g.l ¹ , NaCl 4 g.l ¹ ). E. coli NEB10B a été cultivée en milieu LB (Tryptone 10 g.l ¹ , extrait de levure 5 g.l ¹ , NaCl 5 g.l ¹ ). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g.l ¹ d’agarose aux milieux liquides. De l’érythromycine (à des concentrations de 40 ou 500 mg.l ¹ respectivement en milieu 2YTG ou LB), du chloramphénicol (25 ou 12,5 mg.l ¹ respectivement en LB solide ou liquide) et du thiamphénicol (15 mg.l ¹ en milieu 2YTG) ont été utilisés lorsque nécessaire. Manipulation des acides nucléiques

Toutes les enzymes et kits utilisés l’ont été en suivant les recommandations des fournisseurs.

Construction des plasmides

Le plasmide pCas9, _Cr (SEQ ID NO : 23), présenté en Figure 20, a été construit en clonant le fragment (SEQ ID NO : 81) contenant bgaR et acrIIA4 sous le contrôle du promoteur Pbgal synthétisé par Eurofins Genomics au niveau du site Sacl du vecteur pCas9 _md (Wasels et al, 2017).

Le plasmide pGRNA _md (SEQ ID NO : 82) a été construit en clonant une cassette d’expression (SEQ ID NO : 83) d’un ARNg sous contrôle du promoteur Pcm-2tet01 (Dong et al, 2012) synthétisée par Eurofins Genomics au niveau du site Sacl du vecteur pEC750C (SEQ ID NO : 106) (Wasels et al, 2017). Les plasmides pGRNA-xylB (SEQ ID NO : 102), pGRNA-xylR (SEQ ID NO : 103), pGRNA-glcG (SEQ ID NO : 104) et pGRNA-bdhB (SEQ ID NO : 105) ont été construits en clonant les couples d’amorces respectifs 5’-TCATGATTTCTCCATATTAGCTAG-3’ et 5’-

AAACCTAGCTAATATGGAGAAATC-3’ , 5’-TCATGTTACACTTGGAACAGGCGT-3’ et 5’- AAACACGCCTGTTCCAAGTGTAAC-3’, 5’-TCATTTCCGGCAGTAGGATCCCCA-3’ et 5’- AAACTGGGGATCCTACTGCCGGAA-3’ , 5’ -TC AT GCTT ATT ACGAC AT A AC AC A-3’ et 5’- AAACTGTGTTATGTCGTAATAAGC-3’ au sein du plasmide pGRNA _ind (SEQ ID NO : 82) digéré par Bsal.

Le plasmide pGRNA-D bdhB (SEQ ID NO : 79) a été construit en clonant le fragment d’ADN obtenu par assemblage par PCR chevauchante des produits PCR obtenus avec les amorces 5’- ATGCATGGATCCAAACGAACCCAAAAAGAAAGTTTC-3’ et 5’-

GGTT GATTTC A A ATCT GT GT A A ACCT ACCG-3’ d’une part, 5’-

ACACAGATTTGAAATCAACCACTTTAACCC-3’ et 5’-

AT GC AT GT C G ACTCTT A AG A AC AT GT AT A A AGT ATGG- 3’ d’autre part, dans le vecteur pGRNA-bdhB digéré par BamHI et Sacl.

Le plasmide pGRNA-AbdhAAbdhB (SEQ ID NO : 80) a été construit en clonant le fragment d’ADN obtenu par assemblage par PCR chevauchante des produits PCR obtenus avec les amorces 5’- ATGCATGGATCCAAACGAACCCAAAAAGAAAGTTTC-3’ et 5’-

GCT A AGTTTT A A ATCT GT GT A A ACCT ACCG-3’ d’une part, 5’-

AC AC AGATTT A A A ACTT AGC AT ACTTCTT ACC- 3’ et 5’-

ATGCATGTCGACCTTCTAATCTCCTCTACTATTTTAG -3’ d’autre part, dans le vecteur pGRNA- bdhB digéré par BamHI et Sacl.

Transformation

C. acetobutylicum DSM 792 a été transformée selon le protocole décrit par Mermelstein et al, 1993. La sélection de transformants de C. acetobutylicum DSM 792 contenant déjà un plasmide d’expression de Cas9 (pCas9 _md ou pCas9 _acr ) transformés avec un plasmide contenant une cassette d’expression d’un ARNg a été réalisée sur milieu 2YTG solide contenant de l’érythromycine (40 mg.l ¹ ), du thiamphénicol (15 mg.l ¹ ) et du lactose (40 nM).

Induction de l’expression de cas9

L’induction de l’expression de cas9 a été réalisée via la croissance des transformants obtenus sur un milieu 2YTG solide contenant de l’érythromycine (40 mg.l ¹ ), du thiamphénicol (15 mg.l ¹ ) et l’agent inducteur de l’expression de cas9 et de l’ARNg, l’aTc (1 mg.l ¹ ).

Amplification du locus bdh

Le contrôle de l’édition du génome de C. acetobutylicum DSM 792 au niveau du locus des gènes bdhA et bdhB a été réalisé par PCR à l’aide de l’enzyme Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB) à l’aide des amorces VI (5’ - AC AC ATT GA AGGGAGCTTTT-3’ ) et V2 (5’- GGCAACAACATCAGGCCTTT- 3’).

Résultats

Efficacité de transformation

Afin d’évaluer l’impact de l’insertion du gène acrIIA4 sur la fréquence de transformation du plasmide d’expression de cas9, différents plasmides d’expression d’ARNg ont été transformés dans la souche DSM 792 contenant pCas9i _nd (SEQ ID NO : 22) ou pCas9 _acr (SEQ ID NO : 23), et les transformants ont été sélectionnés sur un milieu supplémenté en lactose. Les fréquences de transformations obtenues sont présentées en Figure 21.

Génération de mutants AbdhB et AbdhAAbdhB

Le plasmide de ciblage contenant la cassette d’expression de l’ARNg ciblant bdhB (pGRNA-bdhB - SEQ ID NO : 105) ainsi que deux plasmides dérivés contenant des matrices de réparation permettant la délétion du gène bdhB seul (pG R N A-AN///# - SEQ ID NO : 79) ou des gènes bdhA et bdhB (pGRNA- AbdhAAbdhB - SEQ ID NO : 80) ont été transformés dans la souche DSM 792 contenant pCas9 _md (SEQ ID NO : 22) ou pCas9 _acr (SEQ ID NO : 23). Les fréquences de transformation obtenues sont présentées dans le Tableau 2 : [Tableau 2]

DSM 792

pCas9md pCas9acr

pEC750C 32,6 ± 27,1 ufc.pg ¹ 24,9 ± 27,8 ufc.pg ¹

pGRNA-bdhB 0 ufc.pg ¹ 17,0 ± 10,7 ufc.pg ¹

pGRNA-AbdliB 0 ufc.pg ¹ 13,3 ± 4,8 ufc.pg ¹

pGRNA -AbdhAAbdhB 0 ufc.pg ¹ 33,1 ± 13,4 ufc.pg ¹

Fréquences de transformation de la souche DSM 792 contenant pCas9 _md ou pCas9 _aCr avec des plasmides ciblant bdhB. Les fréquences sont exprimées en nombre de transformants obtenus par pg d’ADN utilisé lors de la transformation, et représentent les moyennes d’au moins deux expériences indépendantes.

Les transformants obtenus ont subi une phase d’induction de l’expression du système CRISPR/Cas9 via un passage sur milieu supplémenté en anhydrotétracycline, aTc (Figure 22).

Les modifications désirées ont été confirmées par PCR sur l’ADN génomique de deux colonies résistantes à l’aTc (Figure 23).

Conclusions

L’outil génétique basé sur CRISPR/Cas9 décrit dans Wasels et al. (2017) utilise deux plasmides :

- le premier plasmide, pCas9i _nd , contient cas9 sous contrôle d’un promoteur inductible à l’aTc, et

- le deuxième plasmide, dérivé de pEC750C, contient la cassette d’expression d’un ARNg (placé sous le contrôle d’un second promoteur inductible à l’aTc) ainsi qu’une matrice d’édition permettant de réparer la cassure double brin induite par le système.

Cependant, les inventeurs ont observé que certains ARNg semblaient encore être trop toxiques, malgré le contrôle de leur expression ainsi que de celle de Cas9 à l’aide de promoteurs inductibles à l’aTc, limitant en conséquence l’efficacité de transformation des bactéries par l’outil génétique et donc la modification du chromosome.

Afin d’améliorer cet outil génétique, le plasmide d’expression de cas9 a été modifié, via l’insertion d’un gène anti-CRISPR, acrIIA4, sous contrôle d’un promoteur inductible au lactose. Les efficacités de transformation de différents plasmides d’expression d’ARNg ont ainsi pu être améliorées de manière très significative, permettant l’obtention de transformants pour tous les plasmides testés.

Il a également été possible de réaliser l’édition du locus bdhB au sein du génome de C. acetobutylicum DSM 792, à l’aide de plasmides qui n’avaient pas pu être introduits dans la souche DSM 792 contenant pCas9 _md . Les fréquences de modification observées sont les mêmes que celles observées précédemment (Wasels et al, 2017), avec 100% des colonies testées modifiées. En conclusion, la modification du plasmide d’expression de cas9 permet un meilleur contrôle du complexe ribonucléoprotéique Cas9-ARNg, facilitant avantageusement l’obtention de transformants dans lesquels l’action de Cas9 peut être déclenchée afin d’obtenir des mutants d’intérêt.

EXEMPLE n°2

Matériels et méthodes

Conditions de culture

C. beijerinckii DSM 6423 a été cultivée en milieu 2YTG (Tryptone 16 g L ¹ , extrait de levure 10 g L ¹ , glucose 5 g L ¹ , NaCl 4 g L ¹ ). E. coli NEB 10-beta et INV 110 ont été cultivées en milieu LB (Tryptone 10 g L ¹ , extrait de levure 5 g L ¹ , NaCl 5 g L ¹ ). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g L ¹ d’agarose aux milieux liquides. De l’érythromycine (à des concentrations de 20 ou 500 mg L ¹ respectivement en milieu 2YTG ou LB), du chloramphénicol (25 ou 12,5 mg L ¹ respectivement en LB solide ou liquide) et du thiamphénicol (15 mg L ¹ en milieu 2YTG) ou de la spectinomycine (à des concentrations de 100 ou 650 mg L ¹ respectivement en milieu LB ou 2YTG) ont été utilisés si nécessaire.

Acides nucléiques et vecteurs plasmidiques

Toutes les enzymes et kits utilisés l’ont été en suivant les recommandations des fournisseurs.

Les tests de PCR sur colonie ont respecté le protocole suivant :

Une colonie isolée de C. beijerinckii DSM 6423 est resuspendue dans 100 pL de Tris 10 mM pH 7,5 EDTA 5 mM. Cette solution est chauffée à 98 °C pendant 10 min sans agitation. 0,5 pL de ce lysat bactérien peuvent alors être utilisés comme matrice de PCR dans des réactions de 10 pL avec la Phire (Thermo Scientifrc), la Phusion (Thermo Scientifrc), la Q5 (NEB) ou la KAPA2G Robust (Sigma- Aldrich) polymerase.

La liste des amorces ayant servies à l’ensemble des constructions (nom/séquence d’ADN) est détaillée ci-dessous :

AcatB_fwd : T GTT AT GG ATT AT A AGCGGCTCGAGGACGTC A A ACC AT GTT A ATC ATT GC AcatB_rev : AATCTATCACTGATAGGGACTCGAGCAATTTCACCAAAGAATTCGCTAGC AcatB_gRNA_rev

AATCTATCACTGATAGGGACTCGAGGGGCAAAAGTGTAAAGACAAGCTTC

RH076 CAT AT A AT A A A AGGA A ACCTCTT GATCG

RH077 ATT GCC AGCCT A AC ACTT GG

RH001 ATCTCCATGGACGCGTGACGTCGACATAAGGTACCAGGAATTAGAGCAGC

RH002 TCTATCTCCAGCTCTAGACCATTATTATTCCTCCAAGTTTGCT RH003 : AT A AT GGTCT AGAGCT GGAGAT AGATT ATTT GGT ACT A AG

RH004 : TATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGAAGCGCTTATTATTGCATTAGC pEX-fwd : C AGATT GT ACT GAGAGT GC ACC

pEX-rev : GT GAGCGG AT A AC A ATTTC AC AC

pEC750C-fwd : CA AT ATTCC AC A AT ATT AT ATT AT A AGCT AGC

M13-rev : C AGGA A AC AGCT AT GAC

RHO 10 : CGGAT ATT GC ATT ACC AGT AGC

RHO 11 : TTATCAATCTCTTACACATGGAGC

RH025 : T AGT AT GCCGCC ATT ATT AC GAC A

RH 134 : GTCGACGTGGAATTGTGAGC

pNF2_fwd : GGGCGC ACTT AT AC ACC ACC

pNF2_rev : T GCT ACGC ACCCCCT A A AGG

RH021 ACTTGGGTCG ACC ACG AT A A A AC A AGGTTTT A AGG

RH022 T ACC AGGG ATCCGT ATT A AT GT A ACT AT GAT ATC A ATTCTT G aad9-fwd2 AT GC AT GGTCCC A AT GA AT AGGTTT AC ACTT ACTTT AGTTTT AT GG aad9-rev AT GCGAGTT A AC A ACTTCT A A A ATCT GATT ACC A ATT AG

RH031 AT GC AT GGATCCC A AT GA AT AGGTTT AC ACTT ACTTT AGTTTT AT GG

RH032 AT GCGAGAGCTC A ACTTCT A A A ATCT GATT ACC A ATT AG

RH 138 AT GC AT GGATCCGTCT GAC AGTT ACC AGGTCC

RH 139 ATGCGAGAGCTCC AATTGTTC AAAAAAATAATGGCGGAG

RH 140

RH141

Les neuf vecteurs plasmidiques suivants ont été préparés :

- Plasmide N°1 : pEX-A258-Aca/R (SEQ ID NO : 17)

Il contient le fragment d’ADN synthétisé A catB cloné dans le plasmide pEX-A258. Ce fragment A catB comprend i) une cassette d’expression d’un ARN guide ciblant le gène catB (gène de résistance au chloramphénicol codant une chloramphénicol-O-acetyltransférase - SEQ ID NO : 18) de C. beijerinckii DSM6423 sous le contrôle d’un promoteur inductible à l’anhydrotetracycline (cassette d’expression : SEQ ID NO : 19), et ii) une matrice d’édition (SEQ ID NO : 20) comprenant 400 pb homologues situées en amont et en aval du gène catB.

- Plasmide N°2 : pCas9ind-A catB (cf. Figure 2 et SEQ ID NO : 21)

Il contient le fragment A catB amplifié par PCR (amorces AcatB_fwd et AcatB_rev) et cloné dans le pCas9ind (décrit dans la demande de brevet WO2017/064439 - SEQ ID NO : 22) après digestion des différents ADN par l’enzyme de restriction Xhol.

- Plasmide N°3 : pCas9acr (cf. Figure 3 et SEQ ID NO : 23) - Plasmide N°4 : pEC750S-wppHR (cf. Figure 4 et SEQ ID NO : 24)

Il contient une matrice de réparation (SEQ ID NO : 25) utilisée pour la délétion du gène upp et constituée par deux fragments d’ADN homologues en amont et en aval du gène upp (tailles respectives : 500 (SEQ ID NO : 26) et 377 (SEQ ID NO : 27) paires de bases). L’assemblage a été obtenu à l’aide du système de clonage Gibson (New England Biolabs, Gibson assembly Master Mix 2X). Pour ce faire, les parties amont et aval ont été amplifiée par PCR à partir de l’ ADN génomique de la souche DSM 6423 (cf. Maté de Gerando et al. , 2018 et numéro d’accession PRJEB 11626 (https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB 11626)) à l’aide des amorces respectives RH001 / RH002 et RH003 / RH004. Ces deux fragments ont ensuite été assemblés dans le pEC750S linéarisé au préalable par restriction enzymatique (enzymes de restriction Sali et Sacl).

- Plasmide N°5 : pEX-A2-gRNA-«pp (cf. Figure 5 et SEQ ID NO : 28)

Ce plasmide comprend le fragment d’ADN gRNA-upp correspondant à une cassette d’expression (SEQ ID NO : 29) d’un ARN guide ciblant le gène upp (protospacer ciblant upp (SEQ ID NO :31)) sous le contrôle d’un promoteur constitutif (ARN non codant de séquence SEQ ID NO : 30), inséré dans un plasmide de réplication nommé pEX-A2.

- Plasmide N°6 : pEC750S-A«pp (cf. Figure 6 et SEQ ID NO : 32)

Il possède comme base le plasmide pEC750S-«ppHR (SEQ ID NO : 24) et contient en plus le fragment d’ADN comportant une cassette d’expression d’un ARN guide ciblant le gène upp sous le contrôle d’un promoteur constitutif.

Ce fragment a été inséré dans un pEX-A2, appelé pEX-A2-gRNA-upp. L’insert a ensuite été amplifié par PCR avec les amorces pEX-fwd et pEX-rev, puis digéré avec les enzymes de restriction Xhol et Ncol. Enfin, ce fragment a été cloné par ligation dans le pEC750S-«ppHR préalablement digéré par les mêmes enzymes de restriction pour obtenir le pEC750S-A«pp.

- Plasmide N°7 : pEC750C-Aupp (cf. Figure 7 et SEQ ID NO : 33)

La cassette comportant l’ ARN guide ainsi que la matrice de réparation ont ensuite été amplifiés avec les amorces pEC750C-fwd et M13-rev. L’amplicon a été digéré par restriction enzymatique avec les enzymes Xhol et Sacl, puis cloné par ligation enzymatique dans le pEC750C pour obtenir le pEC750C- Aupp.

- Plasmide N°8 : pGRNA-pNF2 (cf. Figure 8 et SEQ ID NO : 34)

Ce plasmide a comme base pEC750C et contient une cassette d’expression d’un ARN guide ciblant le plasmide pNF2 (SEQ ID NO : 118).

- Plasmide N°9 : pCas9ind-gRNA_ca/B (cf. Figure 16 et SEQ ID NO : 38).

Il contient la séquence codant pour l’ARN guide ciblant le locus catB amplifiée par PCR (amorces AcatB_fwd et AcatB_gRNA_rev) et clonée dans le pCas9ind (décrit dans la demande de brevet WO2017/064439) après digestion des différents ADN par l’enzyme de restriction Xhol et ligation.

- Plasmide N°10 : pNF3 (cf. Figure 25 et SEQ ID NO : 119) Il contient une partie du pNF2, comprenant notamment l’origine de réplication et un gène codant pour une protéine de réplication de plasmide (CIBE_p20001), amplifiée avec les amorces RH021 et RH022. Ce produit de PCR a ensuite été cloné au niveau des sites de restriction Sali et BamHI dans le plasmide pUC19 (SEQ ID NO : 117).

- Plasmide N°l l : pEC751S (cf. Figure 26 et SEQ ID NO : 121)

Il contient tous les éléments du pEC750C (SEQ ID NO : 106), sauf le gène de résistance au chloramphénicol catP (SEQ ID NO : 70). Ce dernier a été remplacé par le gène aad9 d’ Enterococcus faecalis (SEQ ID NO : 130), qui confère une résistance à la spectinomycine. Cet élément a été amplifié avec les amorces aad9-fwd2 et aad9-rev à partir du plasmide pMTL007S-El (SEQ ID NO : 120) et cloné dans les sites Avall et Hpal du pEC750C, à la place du gène catP (SEQ ID NO : 70).

- Plasmide N°12 : pNF3S (cf. Figure 27 et SEQ ID NO : 123)

Il contient tous les éléments du pNF3, avec une insertion du gène aad9 (amplifié avec les amorces RH031 et RH032 à partir du pEC751S) entre les sites BamHI et Sacl.

- Plasmide N°13 : pNF3E (cf. Figure 28 et SEQ ID NO : 124)

Il contient tous les éléments du pNF3, avec une insertion du gène ermB de Clostridium difficile (SEQ ID NO : 131) sous le contrôle du promoteur miniPthl. Cet élément a été amplifié à partir du pFWOl avec les amorces RH138 et RH139 et cloné entre les sites BamHI et Sacl du pNF3E.

- Plasmide N°14 : pNF3C (cf. Figure 29 et SEQ ID NO : 125)

Il contient tous les éléments du pNF3, avec une insertion du gène catP de Clostridium perfringens (SEQ ID NO : 70). Cet élément a été amplifié à partir du pEC750C avec les amorces RH140 et RH141 et cloné entre les sites BamHI et Sacl du pNF3E.

Résultats n°l

Transformation de la souche C. beijerinckii DSM 6423

Les plasmides ont été introduits et répliqués dans une souche de E. coli dam dcm (INV 110, Invitrogen). Ceci permet d’éliminer les méthylations de type Dam et Dcm sur le plasmide pCas9ind-Aca/B avant de l’introduire par transformation dans la souche DSM 6423 selon le protocole décrit par Mermelstein et al. (1993), avec les modifications suivantes : la souche est transformée avec une quantité plus importante de plasmide (20 pg), à une DOeoo de 0,8, et à l’aide des paramètres d’électroporation suivants : 100 W, 25 pF, 1400 V. L’étalement sur boite de Pétri contenant de l’érythromycine (20 pg/mL) a ainsi permis d’obtenir des transformants de C. beijerinckii DSM 6423 contenant le plasmide pCas9ind-Aca/B.

Induction de l’expression de cas9 et obtention de la souche C. beijerinckii DSM 6423 AcatB

Plusieurs colonies résistantes à l’érythromycine ont ensuite été reprises dans 100 pL de milieu de culture (2YTG) puis diluées en série jusqu’ à un facteur de dilution de 10 ⁴ dans du milieu de culture. Pour chaque colonie, huit pL de chaque dilution ont été déposés sur une boîte de Pétri contenant de l’érythromycine et de l’anhydrotétracycline (200 ng/mL) permettant d’induire l’expression du gène codant la nucléase Cas9.

Après extraction d’ADN génomique, la délétion du gène catB au sein des clones ayant poussés sur cette boite a été vérifiée par PCR, à l’aide des amorces RH076 et RH077 (cf. Figure 9).

Vérification de la sensibilité de la souche C. beijerinckii DSM 6423 D catB au thiamphénicol

Pour s’assurer que la délétion du gène catB confère bien une sensibilité nouvelle au thiamphénicol, des analyses comparatives sur milieu gélosé ont été réalisées. Des précultures de C. beijerinckii DSM 6423 et C. beijerinckii DSM 6423 A catB ont été réalisées sur milieu 2YTG puis 100 pL de ces précultures ont été étalés sur des milieux gélosés 2YTG supplémentée ou non en thiamphénicol à une concentration de 15 mg/L. La figure 10 permet d’observer que seule la souche initiale C. beijerinckii DSM 6423 est capable de pousser sur un milieu supplémenté en thiamphénicol.

Délétion du gène upp par l’outil CRISPR-Cas9 dans la souche C. beijerinckii DSM 6423 AcatB

Un clone de la souche C. beijerinckii DSM 6423 AcatB a été au préalable transformé avec le vecteur pCas9 _acr ne présentant pas de méthylation aux niveaux des motifs reconnus par les méthyltransférases de type dam et dcm (préparé à partir d’une bactérie Escherichia coli présentant le génotype dam dcmj. La vérification de la présence du plasmide pCas9 _aCr maintenu dans la souche C. beijerinckii DSM 6423 a été vérifiée par PCR sur colonie avec les amorces RH025 et RH 134.

Un clone résistant à l’érythromycine a ensuite été transformé avec pEC750C-Awpp préalablement déméthylé. Les colonies ainsi obtenues ont été sélectionnées sur du milieu contenant de l’érythromycine (20 pg/mL), du thiamphénicol (15 pg/mL) et du lactose (40 mM).

Plusieurs de ces clones ont ensuite été resuspendus dans 100 pL de milieu de culture (2YTG) puis dilués en série dans du milieu de culture (jusqu’à un facteur de dilution de 10 ⁴ ). Cinq pL de chaque dilution ont été déposés sur une boîte de Pétri contenant de l’érythromycine, du thiamphénicol et de l’anhydrotétracycline (200 ng/mL) (cf. Figure 11).

Pour chaque clone, deux colonies résistantes à l’aTc ont été testées par colonie PCR avec des amorces destinées à amplifier le locus upp (cf. Figure 12).

Délétion du plasmide naturel pNF2 par l’outil CRISPR-Cas9 dans la souche C. beijerinckii DSM 6423 AcatB

Un clone de la souche C. beijerinckii DSM 6423 AcatB a été au préalable transformé avec le vecteur pCas9 _md ne présentant pas de méthylation aux niveaux des motifs reconnus par les méthyltransférases de type Dam et Dcm (préparé à partir d’une bactérie Escherichia coli présentant le génotype dam dcm). La présence du plasmide pCas9 _md au sein de la souche C. beijerinckii DSM6423 a été vérifiée par PCR avec les amorces pCas9 _md _fwd (SEQ ID NO : 42) et pCas9; _nd _rev (SEQ ID NO : 43) (cf. Figure 13). Un clone résistant à l’érythromycine a ensuite été utilisé pour transformer le pGRNA-pNF2, préparé à partir d’une bactérie Escherichia coli présentant le génotype dam dcm .

Plusieurs colonies obtenues sur du milieu contenant de l’érythromycine (20 pg/mL) et du thiamphénicol (15 pg/mL) ont été resuspendues dans du milieu de culture et diluées en série jusqu’à un facteur de dilution de 10 ⁴ . Huit pL de chaque dilution ont été déposés sur une boîte de Pétri contenant de l’érythromycine, du thiamphénicol et de l’anhydrotétracycline (200 ng/mL) afin d’induire l’expression du système CRISPR/Cas9.

L’absence du plasmide naturel pNF2 a été vérifiée par PCR avec les amorces pNF2_fwd (SEQ ID NO: 39) et pNF2_rev (SEQ ID NO : 40) (cf. Figure 14).

Conclusions

Au cours de ce travail, les inventeurs sont parvenus à introduire et maintenir différents plasmides au sein de la souche Clostridium beijerinckii DSM 6423. Ils sont parvenus à supprimer le gène catB à l’aide d’un outil de type CRISPR-Cas9 basé sur l’utilisation d’un seul plasmide. La sensibilité au thiamphénicol des souches recombinantes obtenues a été confirmée par des tests en milieu gélosé.

Cette délétion leur a permis d’utiliser l’outil CRISPR-Cas9 nécessitant deux plasmides décrit dans la demande de brevet FR1854835. Deux exemples permettant de démontrer l’intérêt de cette application ont été réalisés : la délétion du gène upp et l’élimination d’un plasmide naturel non essentiel pour la souche Clostridium beijerinckii DSM 6423.

Résultats n°2

Transformation des souches de C. beijerinckii

Les plasmides préparés dans la souche d’E. coli NEB 10-beta sont également utilisés pour transformer la souche C. beijerinckii NCIMB 8052. En revanche, pour C. beijerinckii DSM 6423, les plasmides sont préalablement introduits et répliqués dans une souche de E. coli dam dcm (INV110, Invitrogen). Ceci permet d’éliminer les méthylations de type Dam et Dcm sur les plasmides d’intérêt avant de les introduire par transformation dans la souche DSM 6423.

La transformation est autrement réalisée similairement pour chaque souche, c’est-à-dire selon le protocole décrit par Mermelstein et al. 1992, avec les modifications suivantes : la souche est transformée avec une quantité plus importante de plasmide (5-20 pg), à une DCLoo de 0,6-0, 8, et les paramètres d’électroporation sont 100 W, 25 pF, 1400 V. Après 3h de régénération dans du 2YTG, les bactéries sont étalées sur boîte de Pétri (2YTG agar) contenant l’antibiotique souhaité (érythromycine : 20-40 pg/mL ; thiamphénicol : 15 pg/mL ; spectinomycine : 650 pg/mL). Comparaison des efficacités de transformation des souches de C. beijerinckii DSM 6423

Des transformations ont été réalisées en duplicat biologique dans les souches de C. beijerinckii suivantes : DSM 6423 sauvage, DSM 6423 AcatB et DSM 6423 AcalB ApNF2 (Figure 30). Pour cela, le vecteur pCas9 _md , notablement difficile à utiliser pour modifier une bactérie car ne permettant pas de bonnes efficacités de transformation, a été utilisé. Il comporte de plus un gène conférant à la souche une résistance à l’érythromycine, antibiotique pour lequel les trois souches sont sensibles.

Les résultats indiquent une augmentation de l’efficacité de transformation d’un facteur d’environ 15-20 imputable à la perte du plasmide naturel pNF2.

L’efficacité de transformation a également été testée pour le plasmide pEC750C, qui confère une résistance au thiamphénicol, uniquement dans les souches DSM 6423 AcatB (IFP962 AcalB) et DSM 6423 AcatB ApNF2 (IFP963 AcatB ApNF2), puisque la souche sauvage est résistante à cet antibiotique (Figure 31). Pour ce plasmide, le gain en efficacité de transformation est encore plus flagrant (amélioration d’un facteur d’environ 2000).

Comparaison des efficacités de transformation des plasmides pNF3 avec d’autres plasmides

Afin de déterminer l’efficacité de transformation de plasmides contenant l’origine de réplication du plasmide naturel pNF2, les plasmides pNF3E et pNF3C ont été introduits dans la souche C. beijerinckii DSM 6423 AcatB ApNF2. L’utilisation de vecteurs contenant des gènes de résistance à l’érythromycine ou au chloamphénicol permet de comparer l’efficacité de transformation du vecteur en fonction de la nature du gène de résistance. Les plasmides pFWOl et pEC750C ont également été transformés. Ces deux plasmides contiennent des gènes de résistance à des antibiotiques différents (respectivement l’érythromycine et le thiamphénicol) et sont couramment utilisés pour transformer C. beijerinckii et C. acetobutylicum.

Comme montré dans la Figure 32, les vecteurs basés sur le pNF3 présentent une excellente efficacité de transformation, et sont notamment utilisables chez C. beijerinckii DSM 6423 AcatB ApNF2. En particulier, le pNF3E (qui contient un gène de résistance à l’érythromycine) montre une efficacité de transformation nettement supérieure à celle de pFWOl, qui comprend le même gène de résistance. Ce même plasmide n’a pas pu être introduit dans la souche C. beijerinckii DSM 6423 sauvage (0 colonies obtenues avec 5 pg de plasmides transformés en duplicat biologique), ce qui démontre l’impact de la présence du plasmide naturel pNF2.

Vérification de la transformabilité des plasmides pNF3 dans d’autres souches/espèces

Pour illustrer la possibilité d’utiliser ce nouveau plasmide dans d’autres souches solvantogènes de Clostridium, les inventeurs ont réalisé une analyse comparative des efficacités de transformation des plasmides pFWOl, pNF3E et pNF3S dans la souche ABE C. beijerinckii NCIMB 8052 (Figure 33). La souche NCIMB 8052 étant naturellement résistante au thiamphénicol, le pNF3S, conférant une résistance à la spectinomycine, a été utilisé à la place du pNF3C. Les résultats démontrent que la souche NCIMB 8052 est transformable avec les plasmides basés sur le pNF3, ce qui prouve que ces vecteurs sont applicables à l’espèce C. beijerinckii au sens large.

L’applicabilité de la suite de vecteurs de synthèse basés sur le pNF3 a également été testée dans la souche référence DSM 792 de C. acetobutylicum. Un essai de transformation a ainsi montré la possibilité de transformer cette souche par le plasmide pNF3C (Efficacité de transformation de 3 colonies observées par pg d’ADN transformé contre 120 colonies/pg pour le plasmide pEC750C).

Vérification de la compatibilité des plasmides pNF3 avec l’outil génétique décrit dans la demande FR18/73492

La demande de brevet FR 18/73492 décrit la souche D catB ainsi que l’utilisation d’un système CRISPR/Cas9 à deux plasmides nécessitant l’utilisation d’un gène de résistance à l’érythromycine et d’un gène de résistance au thiamphénicol. Pour démontrer l’intérêt de la nouvelle suite de plasmides pNF3, le vecteur pNF3C a été transformé dans la souche D catB contenant déjà le plasmide pCas9 _aCr . La transformation, réalisée en duplicat, a montré une efficacité de transformation de 0,625 ± 0,125 colonies/pg d’ADN (moyenne ± erreur standard), ce qui prouve qu’un vecteur basé sur le pNF3C peut être utilisé en combinaison avec le pCas9, _Cr dans la souche Aral B.

Parallèlement à ces résultats, une partie du plasmide pNF2 comprenant son origine de réplication (SEQ ID NO : 118) a pu être réutilisée avec succès pour créer une nouvelle suite de vecteurs navettes (SEQ ID NO : 119, 123, 124 et 125), modifiables à façon, permettant notamment leur réplication dans une souche d’E. coli ainsi que leur réintroduction chez C. beijerinckii DSM 6423. Ces nouveaux vecteurs présentent des efficacités de transformation avantageuses pour réaliser de l’édition génétique par exemple chez C. beijerinckii DSM 6423 et ses dérivées, en particulier à l’aide de l’outil CRISPR/Cas9 comprenant deux acides nucléiques différents.

Ces nouveaux vecteurs ont également pu être testés avec succès dans une aube souche de C. beijerinckii (NCIMB 8052), et d’espèce de Clostridium (en particulier C. acetobutylicum), démonbant leur applicabilité dans d’autres organismes du phylum des Firmicutes. Un test est également réalisé sur Bacillus.

Conclusions

Ces résultats démontrent que la suppression du plasmide naturel pNF2 augmente significativement les fréquences de transformation de la bactérie qui le contenait (d’un facteur d’environ 15 pour le pFWOl et d’un facteur d’environ 2000 pour le pEC750C). Ce résultat est particulièrement intéressant dans le cas des bactéries du genre Clostridium, connues pour être difficiles à transformer, et en particulier pour la souche C. beijerinckii DSM 6423 qui souffre naturellement d’une efficacité de transformation faible (inférieure à 5 colonies/pg de plasmide). REFERENCES

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