hKGF- I基因位于 15号染色体， 编码含 194个氨基酸残基的蛋白前体， 包 含一段 31个氨基酸残基的分泌信号肽， 成熟的 hKGF- I是一个含 163个氨基酸 残基的单链多肽。 大量研究结果显示， hKGF- I由间质细胞表达， 通过旁分泌的 方式作用于上皮细胞， 是一种多功能的细胞生长因子， 具有广泛的生物学作用。 hKGF- I能够促进包括肝实质细胞、 胃肠上皮细胞、 II型肺泡上皮细胞、 尿道上 皮细胞、角膜上皮细胞和各种鳞状上皮的角化 细胞等多种上皮细胞（Finch PW et al, Science, 1989,245:752-755； Farrell CL et al, Int J Radiat Biol, 1999,75:609-20； Farrell CL et al, Cancer Res, 1998,58:933-939; Ellison CA et al, J Clin Immunol, 2008,28:600-615； Terry NH et al, Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2004,58:435-444； Imayasu M et al, Curr Eye Res 2003,27:133-141 ) 的增殖、 迁移、 分化、 存活， 维 持细胞骨架结构蛋白的稳定， 拮抗辐射损伤、 促进 DNA修复以及诱导解毒酶的 表达来加强上皮功能，有效保护上皮细胞免于 毒性物质和射线的损伤。损伤修复 过程中 hKGF- I可被大量诱生表达，促进伤口愈合，加快角� �上皮细胞损伤恢复 的速度， 縮短角膜上皮细胞愈合时间。

天然野生型 hKGF- I由 163个氨基酸组成， 分子量为 21kD， 含 5个 Cys， 分别位于第 1位、第 15位、第 40位、第 102位和第 106位，其中形成 Cysl-Cysl5、 Cysl02-Cysl06两对二硫键， Cys40以游离巯基形式存在于分子内部（Osshmd TD et al， Protein Sci, 1998,7:1681- 1690)。 全长 hKGF- I蛋白质具有不稳定性， 容易 发生断裂和聚集，利用基因工程技术，通过突 变或缺失某些氨基酸可以改善蛋白 质的稳定性。文献报道 (Osslund TD et al, Protein Sci, 1998,7:1681-1690； Hsu E et al， Protein Eng Des Sel, 2006, 19:147-153和美国专利 US 5677278) 缺失 N端 23 个氨基酸， 且形成 Cysl02-Cysl06二硫键 （记为 Δ23 hKGF- I ) 时， 不影响其 生物活性， 且会提高稳定性。 该事实说明， N端第 1-23位氨基酸及 Cysl-Cysl5 二硫键与 KGF- I的生物学活性无关。 本发明人曾将 hKGF- I天然序列第 102位 的 Cys突变为 Ser， 使之无法形成 Cysl02-Cysl06二硫键， 并缺失 N端 24个氨 基酸， 形成新型的 hKGF- I突变体 （记为 102S Δ24 hKGF- I )。 该新型 hKGF- I突变体能促进角质细胞增殖和抑制成纤维细� �生长， 具有抗疤痕、抗纤维化和 促进表皮愈合的功能， 该发明已获得中国专利 （CN 03101156.X) 授权。

在上述专利的基础上，本发明通过二硫键配对 分析发现， 重组表达的缺失型 hKGF- I ( Δ23 hKGF- I ) 及上述的 102S Δ24 hKGF- I突变体均未形成对应于 天然 hKGF- I第 40位和第 106位 Cys间的二硫键，其中 Δ23 hKGF- I仅有 Cysl02 和 Cysl06间的二硫键形成， 102S Δ24 hKGF- I中无二硫键形成。本发明对两种 序列中对应于天然 hKGF- I的 Cys40和 Cysl06人为形成分子内二硫键的方法进 行了详细的研究摸索， 并对该二硫键形成后分子构象进行了确证。 与 Cys40 和 Cysl06 间未形成二硫键的结构相比， 形成非天然 Cys40-Cysl06 二硫键后的 hKGF- I缺失型突变体在空间构象上有显著变化， 并经系列研究发现， 出现了新 的生物学功能， 既能促进上皮细胞增殖， 又可逆转组织纤维化， 并有效抑制新生 血管生长。同时，本发明人构建和制备了将第 106位 Cys突变成 Ser的 106S Δ23 hKGF- I缺失型突变体重组蛋白， 采用本专利实施例的方法， 结果未能实现非天 然二硫键 Cys40-Cysl02的有效形成。

组织纤维化是一种严重危害人类健康的慢性疾 病， 是许多疾病致残、致死的 主要原因。 世界卫生组织的统计表明， 全球因各种疾病致死的病人中， 约 40% 可以归因于组织纤维化疾病， 如矽肺、 肺囊虫感染、 病毒性肝硬化、 酒精性肝硬 化、 肾小球肾炎、 肾盂肾炎等。 组织纤维化可导致器官组织内结缔组织增多， 实 质细胞减少， 持续发展可致组织硬化， 使器官功能减退乃至衰竭， 严重威胁人类 健康和生命。

到目前为止， 尚无治疗组织纤维化的有效药物。 而本发明提供的缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白具有新的抑制纤维增� �的生物学作用， 能逆转组 织纤维化，有望开发成液体水针、冻干粉针、 缓控释剂和滴眼药剂等形式的制剂， 临床上用于治疗慢性肝纤维化、肺纤维化、 肾纤维化、角膜纤维化和皮肤纤维化 等组织纤维化疾病。 还可开发成外用药剂用于防治因皮肤纤维化导 致的疤痕形 成。

本发明提供的缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白还具有新的抑制新生 血管生长的生物学作用， 可用于抑制新生血管瘤的生长以及肿瘤的血管 增生，有 望开发成抗癌药物。

检索国内外专利和文献发现， 尚无关于 hKGF- I的非天然二硫键形成、构象 变化及其生物学作用的报道。 发明内容 本发明的目的在于提供一种具有新的生物学作 用的缺失型人角质细胞生长 因子- I (hKGF- I )二硫键变构体重组蛋白，其特征在于，含有� �应于天然 hKGF- I第 40位和第 106位半胱氨酸（Cys)间的非天然二硫键结构， 其新的生物学作 用包括抑制纤维增生和抑制新生血管生长。

因此， 在本发明的第一个方面， 提供了一种具有新的生物学作用的缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白。

本发明所述的二硫键变构体是指具有对应于天 然 hKGF- I第 40位和第 106 位半胱氨酸 （Cys) 间的非天然二硫键结构， 其是分子构象已发生显著改变的 hKGF- I缺失型突变体。该突变体在非天然二硫键形� �以前既可特指本发明的二 硫键变构体， 也可更广义地被称为突变体； 在非天然二硫键形成后， 因分子构象 已发生显著变化， 更狭义地被称为二硫键变构体。

本发明所述的二硫键变构体重组蛋白具有如 Seq ID No:l 所示的氨基酸序 列，是在天然野生型 hKGF- I的氨基末端缺失 23个氨基酸的缺失突变体（即 Δ23 hKGF- I )。 Seq ID No:l序列中第 17位、 第 79位和第 83位的半胱氨酸 （Cys) 分别对应于天然野生型 hKGF- I的第 40位、 第 102位和第 106位的半胱氨酸。 本发明所述的缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白（即天然野生型 hKGF- I的氨基末端缺失 23个氨基酸的缺失突变体）还可以为在 Seq ID No _: l序列的基 础上， 氨基末端增加或减少 1-5个氨基酸的突变体。 如在 Seq ID No _: l序列的氨 基末端增加一个甲硫氨酸 （Met ) , 或增加序列为 Pro-Glu-His-Thr-Arg 或 Met-Glu-His-Thr-Arg的 5个氨基酸； 或从 Seq ID No:l序列的氨基末端减少一个 丝氨酸 （Ser)， 或减少序列为 Ser-Tyr-Asp-Tyr 的 4 个氨基酸， 或减少序列为 Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met的 5个氨基酸。

本发明所述的缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白还可以为在 Seq ID No:l序列的基础上， 将第 79位 （对应于天然野生型 hKGF- I的第 102位） 的 Cys突变为非极性氨基酸。 所述非极性氨基酸主要指 Ser、 Ala, Gly、 Thr、 Leu 或 lie, 本发明优选的非极性氨基酸是 Ser， 与其相应的缺失突变体记为 Δ23 S79 hKGF- I， 具有如 Seq ID No :2所示的氨基酸序列。

本发明上述的任何一种缺失型 hKGF- I的二硫键变构体或突变体，通过重组 DNA技术制备而成。所述的重组 DNA技术是指利用分子生物学技术，合成或提 取外源目的基因，对外源基因进行缺失或点突 变，然后将外源基因转入表达宿主， 利用表达宿主表达外源目的蛋白。表达宿主可 以是原核系统，也可以是真核系统， 其中的原核表达系统可以是大肠杆菌， 真核表达系统可以是酵母或哺乳动物细 胞。 本发明优选大肠杆菌原核表达系统。

在本发明的第二个方面，提供了一种制备上述 缺失型 hKGF- I二硫键变构体 重组蛋白的方法， 其主要通过二硫键配对复性方法形成非天然二 硫键 （即 Cysl7-Cys83二硫键）， 其中， 所述的缺失型 hKGF- I的二硫键变构体均含有第 17位和第 83位 （对应于天然 hKGF- I第 40位和第 106位） 半胱氨酸间的非天 然二硫键结构。

本发明所述的 hKGF- I的二硫键变构体或突变体的获得是通过重组 DNA技 术、微生物大规模培养技术和生物工程下游纯 化技术实现的。根据变构体的氨基 酸序列，结合宿主菌的遗传密码子偏好型，化 学合成对应的缺失型 hKGF- I突变 体 cDNA， 连接到重组质粒载体中， 并成功构建高效表达工程菌株； 接种到培养 基， 采用微生物大规模培养技术， 高密度表达缺失型 hKGF- I突变体蛋白； 离心 收集菌体并破菌后， 采用生物工程下游纯化技术， 通过色谱层析手段， 得到纯度 95%以上的缺失型 hKGF- I的突变体重组蛋白。 本发明所述的色谱层析手段， 主要指离子交换层析、肝素亲和层析、 反相层 析和凝胶过滤层析， 更优选地， 为离子交换层析和肝素亲和层析。

本发明通过特有的二硫键配对复性方法，促使 第 17位与第 83位的 Cys之间 形成非天然二硫键， 即 Cysl7-Cys83 二硫键 （对应于天然野生型 hKGF- I的 Cys40-Cysl06二硫键）。 其主要步骤为：

①将得到的纯度 95%以上的缺失型人角质细胞生长因子- I突变体重组蛋 白， 在碱性条件下用还原剂处理， 使其第 17位和第 83位（对应于天然人角质细 胞生长因子 - I第 40位和第 106位） 的 Cys的巯基 （-SH) 均处于游离状态；

②在碱性条件下经菲洛林和铜离子配对复性 ，促进形成所述缺失型人角质细 胞生长因子- I突变体重组蛋白的 Cysl7-Cys83二硫键， 以获得具有第 17位和第 83位（对应于天然人角质细胞生长因子- I第 40位和第 106位） Cys间非天然二 硫键的变构体重组蛋白样品；

③采用色谱层析手段，从上述复性样品中分离 并得到纯度 95%以上的本发明 所述的缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白。

本发明的上述制备方法中， 所述的还原剂主要指二硫苏糖醇 (Dithiothreitol, DTT)、 β-巯基乙醇、 三 [2-羧乙基]膦 （Tris[2-carboxyethyl]phosphine， TCEP ) 或 半胱氨酸等试剂， 更优选地， 为 DTT。

所述的菲洛林是指 1 , 10-菲洛林（l JO-Phenanthroline) , 铜离子主要是指硫酸 铜形式的铜离子， 但不限于硫酸铜， 还可以是其它形式的铜离子。 菲洛林和铜离 子的摩尔比例范围 1 : 10〜100: 1均可， 更优选地， 为 1 : 1〜5 : 1。

步骤①和②中所述的碱性条件是指 7.0〜12.0的 pH值范围， 更优选地， 为 9.0〜11.0。

所述的色谱层析主要指离子交换层析、肝素亲 和层析、反相层析或凝胶过滤 层析， 更优选地， 为反相层析。

本发明所述的缺失型 hKGF- I的二硫键变构体或突变体在非天然二硫键形 成后， 因分子构象已发生显著变化， 更狭义地被称为二硫键变构体， 并在其代号 后追加 " -M"以示区别。具有 Seq ID No _: l的氨基酸序列特征的缺失突变体（ Δ23 hKGF- I )， 形成非天然二硫键后被记为 Δ23 hKGF-M, 具有 Seq ID No:2的氨基 酸序列特征的突变体（Δ23 S79 hKGF- I )，形成非天然二硫键后被记为 Δ23 S79 hKGF-M。 在本发明的第三个方面，提供了本发明所述的 缺失型 hKGF- I二硫键变构体 重组蛋白在制备预防和治疗纤维化增生性疾病 和血管增生性疾病的药物中的用 途。

本发明所述的缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白， 与天然 hKGF- I相 比， 构象上发生了显著变化。首先经质量肽图结果 证实了其中的 Cysl7-Cys83二 硫键 （对应于天然 hKGF- I的 Cys40-Cysl06二硫键） 的形成。 计算机模建数据 表明，与未形成前相比和与形成 Cys79-Cys83二硫键结构相比（Δ23 hKGF- I )， 形成 Cysl7-Cys83二硫键后的分子构象发生了极显著变� �� （附图 1 )。 利用本发 明提供的方法， 制备获得的二硫键变构体重组蛋白进行的圆二 色谱 （CD) 的分 析结果同样表明， 形成非天然 Cysl7-Cys83二硫键后 CD图谱出现明显差异（附 图 2)。

本发明所述的缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白，具有抑制纤维增生� � 抑制新生血管生长的生物学作用。本发明通过 细胞体外活性测定实验证明， 形成 Cysl7-Cys83二硫键后的缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白除保留原有促上 皮细胞增殖 （附图 3 ) 的生物学活性外， 还出现了新的生物学作用， 即能够较明 显地抑制人组织纤维细胞（附图 4)和人血管内皮细胞（附图 5 ) 的生长和增殖。 此外， 本发明通过 SD大鼠肝纤维化模型、 SD大鼠肺纤维化模型和鸡胚绒毛尿 囊膜实验证明，形成 Cysl7-Cys83二硫键后的缺失型 hKGF- I变构体重组蛋白能 够有效地逆转慢性肝损伤造成的肝纤维化（附 图 6和附图 7)和急性肺损伤造成 的肺纤维化（附图 8)，并能够有效地抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血� ��生长（附图 9)。

本发明所述的抑制纤维增生的生物学作用适用 于预防和治疗纤维化增生性 疾病， 包含但不限于慢性肝纤维化、 肺纤维化、 肾纤维化、 角膜纤维化和皮肤纤 维化， 还包含其它组织器官的纤维化。

本发明所述的抑制新生血管生长的生物学作用 适用于预防和治疗血管增生 性疾病， 包含但不限于视网膜黄斑、 新生血管瘤以及肿瘤的血管增生。

在本发明的又一个方面，提供了一种用于预防 和治疗纤维化增生性疾病和血 管增生性疾病的药物组合物，其包含有效剂量 范围的缺失型 hKGF- I二硫键变构 体重组蛋白作为有效成分， 并且， 其还可含有药学上可接受的载体及辅料。

本发明所述的药物组合物适用于各种给药方式 ，例如口服给药、静脉内给药、 肌肉内给药、 局部给药、 经皮给药、 经鼻给药等。 根据所采用的给药方式， 可将 含有本发明缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白的药物组合物制成合� �的剂 型，其中包含在有效剂量范围的缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白和至少一 种药学上可接受的药用载体。

本发明所述的适当剂型的实例包含但不限于片 剂、 胶囊、 粒剂、 糖浆、 口服 溶液、 气雾胶、 鼻喷剂、 滴眼剂、 缓控释剂、 透皮制剂、 用于皮肤表面的油膏和 药贴、 以及可用于注射的无菌溶液等。

含有本发明缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白的药物组合物可以制� � 无菌液体或者冻干粉末， 优选地， 用于胃肠外给药。

本发明所述的适当剂型中还可含有其它常规组 分， 如防腐剂、稳定剂、表面 活性剂、 缓冲剂、 乳化剂、 增甜剂、 着色剂、 调味剂、 调节渗透压的盐等等。 本 发明药物组合物中使用的稳定剂优选柠檬酸钠 、甘氨酸、甘露醇等。含有本发明 药物组合物的无菌液体或者冻干粉末更优选的 配方包括:缺失型 hKGF- I二硫键 变构体重组蛋白 0.1-5.0mg， 甘露醇 15-60mg， 甘氨酸 0.1-8.0mg， pH 3.0-6.0, 液 体配方还含有注射用水 0.5-2.0ml。

若有特殊治疗要求， 本发明所述的药物组合物还可包含其他活性药 理成分， 这种相伴使用有利于疾病的预防和治疗。

本发明所述的药物组合物中，缺失型 hKGF- I二硫键变构体重组蛋白的用量 可以在一个较大范围内变动，本领域技术人员 可以根据一些已知的因素，诸如疾 病的种类、病情严重程度、病人体重、剂型、 所选给药途径等很容易的加以确定。 每日用量根据制剂和治疗目的的不同而有较大 差异， 通常的人体用量范围为 1.0-10(^g/kg， 但不限于此范围。

至此已对本专利进行了详细的描述，通过参考 下面的实施例能够更清楚地理 解本发明， 所述实施例仅为说明目的而并不旨在对本发明 进行限制。 附图说明 图 1 :缺失型 hKGF- I二硫键异构体中不同二硫键配对的计算机模� �分子构 象比较图。 其中， 图 A 为不含二硫键的 Δ23 hKGF- I的构象图， 图 B 为含 Cys79-Cys83二硫键的 Δ23 hKGF- I的构象图， 图 C为含 Cysl7-Cys83二硫键的 △23 hKGF- I二硫键变构体的构象图， 图 D为不含二硫键的 Δ23 S79 hKGF- I 的构象图，图 E为含 Cysl7-Cys83二硫键的 Δ23 S79 hKGF- I二硫键变构体的构 象图。

图 2: 缺失型 hKGF- I二硫键异构体中不同二硫键配对的圆二色谱 （CD) 比较图。 其中， 图 A 为不含二硫键的 Δ23 hKGF- I的 CD 图， 图 B 为含 Cys79-Cys83二硫键的 Δ23 hKGF- I的 CD图， 图 C为含 Cysl7-Cys83二硫键的 △23 hKGF- I二硫键变构体的 CD图，图 D为不含二硫键的 Δ23 S79 hKGF- I的 CD图， 图 E为含 Cysl7-Cys83二硫键的 Δ23 S79 hKGF- I二硫键变构体的 CD 图。 其中， CD表示圆二色谱图， 纵坐标为吸收值毫度 （mdeg)。

图 3: NBL-7细胞株体外生物学活性测定刺激细胞生长� ��最大百分率的示意 图。 其中， A为对照品 hKGF- I， B为 Δ23突变体， C为 Δ23-Μ变构体， D为 △23 S79-M变构体。

图 4: HSC细胞体外生物学活性测定刺激或抑制细胞生 长的最大百分率的示 意图。 其中， A为对照品 hbFGF, B为 Δ23突变体， C为 Δ23-Μ变构体， D为 △23 S79-M变构体。

图 5: HUVEC细胞体外生物学活性测定刺激或抑制细胞� ��长的最大百分率 的示意图。 其中， A为对照品 hVEGF, B为 Δ23突变体， C为 Δ23-Μ变构体， D为 Δ23 S79-M变构体。

图 6: CC 肝损伤 SD大鼠慢性肝纤维化模型中预防给药各实验组� ��病理照 片 （VG染色） 的图。 其中， 图 A为模型对照组， 图 B为 Δ23突变体组， 图 C 为 Δ23-Μ变构体组， 图 D为 Δ23 S79-M变构体组。

图 7: CC 肝损伤 SD大鼠慢性肝纤维化模型中治疗给药各实验组� ��病理照 片 （Masson染色） 的图。 其中， 图 A为正常对照组， 图 B为模型对照组， 图 C 为 Δ23突变体组， 图 D为 Δ23-Μ变构体组， 图 E为 Δ23 S79-M变构体组。

图 8:博莱霉素肺损伤 SD大鼠急性肺纤维化模型中各实验组的病理照� �� (HE 染色） 的图。 其中， 图 A为正常对照组， 图 B为模型对照组， 图 C为 Δ23突变 体组， 图 D为 Δ23-Μ变构体组， 图 E为 Δ23 S79-M变构体组。

图 9: 鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生长实验照片示意图 。其中， 图 A为生理盐 水组， 图 B为 bFGF组， 图 C为 Δ23 S79-M变构体组。

图 10: cDNA测序图谱结果的图。 其中， 图 A为 pET-3C-A23的测序报告， 其中的第 35位至第 454位为 Δ23 hKGF- I的 cDNA序列； 图 B为 pET-3C-A23 S79测序报告， 其中的第 46位至第 465位为 Δ23 S79 hKGF- I的 cDNA序列。

图 11 : Δ23 S79 hKGF-M二硫键变构体的胰蛋白酶酶切质量肽图色 谱图。 其中， 图 A为非还原肽图， 图 B为还原肽图。

图 12: 家兔角膜损伤修复实验中各组的角膜病理显微 照片的图（HE染色）。 其中， 图 A为模型对照组， 图 B为 bFGF对照组， 图 C为 A23 S79-M变构体组。 具体实 式

实施例 1： 编码人野生型 KGF- I的 cDNA序列的获得

根据天然野生型 hKGF- I的氨基酸和 cDNA序列 （GI: 186738)， 并按照大 肠杆菌偏爱的密码子， 设计以下 Seq ID No _: 3的碱基序列 （共 489bp)， 委托宝生 物（大连）有限公司 （TAKARA, 大连）进行全基因合成， 嵌入 pUC18载体（购 自宝生物 （大连） 生物技术有限公司） 且命名为 UC18-KGF。

ACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCTATCACC-3'。

实施例 2： 缺失型 Δ23 h GF- I重组质粒和工程菌株的构建

根据 Δ23 hKGF- I的氨基酸序列 （Seq ID No: l ) 设计并合成引物 P1和 P2: P1 : 5*- gCA TAT gTA CgA CTA CAT ggA Agg Tgg TgA C -3* ( Seq ID No :4) P2: 5*- ggg ATC CTC Agg TgA Tag CCA TCg g -3* ( Seq ID No :5 )

PI为 Δ23正向引物， 其中 g为保护碱基， CATATg为 Nde I酶切位点； P2为 Δ23反向引物， 其中 g为保护碱基， ggATCC为 BamH l酶切位点。 以 pUC18-KGF质粒为模板， 用引物 P1和 P2扩增 Δ23 hKGF- I基因片段。 PCR反应条件为： 94°C lmin， 56°C lmin, 72 °C lmin, 共 30个循环， 第一个循 环 94°C变性 10min， 最后一个循环 72°C延伸 10min， 结果显示获得了 420bp的 扩增片段。 PCR产物经低熔点琼脂糖回收后， 用 Nde I和 BamH I双酶切， 回收 目的片段， 再用 T4 DNA连接酶与质粒 pET-3C (购于 Invitrogen) 同样经 Nde I 和 BamH I酶切回收的片段连接， 转化大肠杆菌克隆宿主菌 ToplO (购自宝生物 (大连） 生物技术有限公司）， 用酶切和 PCR 验证的方法筛选重组质粒 pET-3C-A23。 经 DNA测序 （TAKARA, 大连） 证明重组质粒中 Δ23 hKGF- I 的 cDNA序列正确后（图 10 A)，转化大肠杆菌表达宿主菌 BL21 Star(DE3 )plysS (Novagen), 成功构建 pET-3C-A23/BL21 Star (DE3 ) plysS重组表达工程菌。

实施例 3： 突变型 Δ23 S79 h GF- I重组质粒和工程菌株的构建

根据 Δ23 S79 h GF- I的氨基酸序列 （Seq ID No:2) 设计并合成两对引物： P1 : 5*- gCA TAT gTA CgA CTA CAT ggA Agg Tgg TgA C -3* ( Seq ID No :4) P2: 5*- ggg ATC CTC Agg TgA Tag CCA TCg g -3* ( Seq ID No :5 )

P5 : 5*- gCT AAA AAA gAA TCC AAC gAA gAC C -3* ( Seq ID No :6) P6: 5*- TTC gTT ggA TTC TTT TTT AgC gTA -3* ( Seq ID No :7)

P5为正向引物， 用于对应于天然序列第 102位 Ser点突变的扩增；

P6为反向引物， 用于对应于天然序列第 102位 Ser点突变的扩增。

以 pET-3C-A23质粒为模板，用引物 P3和 P6扩增含突变点的 5'端的 cDNA 片段， 用引物 P4和 P5扩增含突变点的 3'端的 cDNA片段。 再将扩增后得到的 两个片段混合后作为模板，用引物 P3和 P6扩增含 Ser突变位点的 Δ23 S79 h GF- I基因片段（420bp)。 PCR产物经低熔点琼脂糖回收后， 用 Nde I和 BamH I双 酶切， 回收目的片段， 再用 T4 DNA连接酶与质粒 pET-3C (购于 Invitragen) 同 样经 Nde I和 BamH I酶切回收的片段连接， 转化大肠杆菌克隆宿主菌 ToplO, 用酶切和 PCR 验证的方法筛选重组质粒 pET-3C-A23 S79。 经 DNA 测序 ( TAKARA, 大连）证明重组质粒中 Δ23 S79 hKGF- I的 cDNA序列正确后（图 10 B), 转化大肠杆菌表达宿主菌 BL21 Star (DE3 ) plysS (Novagen), 成功构建 pET-3C-A23 S79/BL21 Star (DE3 ) plysS重组表达工程菌。

实施例 4： 缺失型突变体 Δ23和 Δ23 S79 hKGF- I的微生物大规模培养 将表达最佳的 pET-3C-A23/BL21 Star(DE3 )plysS和 pET-3C-A23 S79/BL21 Star (DE3 ) plysS重组工程菌划线接种于 LA琼脂平板， 37°C培养过夜。 从过夜 培养的 LA平板上挑取菌苔接种于含 LB液体培养基 （胰蛋白胨 10g， 酵母提取 物 5g， NaCl lOg, 加水定容至 1000ml, 121 °C , 高压灭菌 30min) 试管中， 37°C 培养 12小时， 然后按 1%的比例转接到含 200ml LB培养液的 1000ml三角瓶中， 37°C培养过夜即成为上罐种子液。 将上罐种子液按 5%的比例接种于含 YT培养 液 （胰蛋白胨 4g/L， 酵母提取物 3g/L， Na ₂ HP0 ₄ · 12H ₂ 0 30g/L， KH ₂ P0 ₄ 3g/L, NaCl lg/L, MgS0 ₄ · 7H ₂ 0 lg/L， 葡萄糖 8g/L， 121 °C , 高压灭菌 30min) 的 30L 发酵罐中， 37°C培养， 整个发酵过程中， 通过调节转速、 通空气量、 通纯氧量来 保持溶氧在 30%以上， 用 28%的氨水调节 pH并保持在 7.0。 至菌液 OD _6QQ 达到 10〜14时， 加入终浓度为 0.2mM的 IPTG (异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷）， 继续培 养 4小时后停止发酵， 收集菌液， 8000rpm离心 10分钟， 弃上清， 收集菌体放 入 -20°C冰箱保存备用。

实施例 5： 缺失型突变体 Δ23和 Δ23 S79 h GF- I重组蛋白的分离纯化

(1)破菌：

从 -20°C冰箱中取出菌体，放入细菌裂解液（50mM PB， pH 7.0， 10mM EDTA, 0.2g/L溶菌酶）， 37°C低速搅拌 1小时， 冷却后超声（400W, 工作时间 5s， 间歇 5s, 超声 40个循环）， 12000rpm离心 10分钟， 弃沉淀， 取上清。

(2)粗纯化：

将破菌上清用 CM-Sepharose FF柱（购自 General Electrics)层析进行粗纯化。 用平衡液（50mM PB， pH 7.0)平衡后， 破菌上清上样， 复平衡。 用含 50mM PB 的 0〜500mM的 NaCl线性梯度洗脱， 收集含目的蛋白的洗脱峰。

(3)精纯化：

将粗纯化收集的目的蛋白洗脱峰， 用 Heparin CL-6B亲和柱 （购自 General Electrics)层析进行精纯化。用平衡液（50mM ΡΒ, ρΗ 7.0)平衡后，上 CM-Sepharose FF分离纯化的目的蛋白， 用含 50mM PB的 0〜1000mM的 NaCl线性梯度洗脱， 收集含目的蛋白的洗脱峰。

将纯化后的二种重组蛋白经 12%的聚丙酰胺凝胶电泳后，考马斯亮蓝显示分 子量约为 16KD的单一条带， 纯度均大于 95%， C ₁₈ 柱 RP-HPLC检测均为单一 色谱峰。 纯化制备的 Δ23和 Δ23 S79 hKGF- I重组蛋白经过 N端序列分析， 其 N 端 15 个 氨 基 酸 序 列 均 为 Ser-Tyr-Asp- Tyr-Met-Glu-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg-Val-Arg-Arg-Leu ， 与 理 论序 列 一 致 ； MALDI-TOF质谱（委托中科院上海生科院蛋白质组 研究分析中心）测定的分子 量分别为 16279.8和 16263.7， 与理论分子量一致。

实施例 6： 含 Cysl7-Cys83非天然二硫键的 Δ23-Μ和 Δ23 S79-M变构体重 组蛋白的制备

将纯度达 95%以上的 Δ23和 Δ23 S79 hKGF- I重组蛋白溶液（Heparin亲和 层析后）， 调节 pH至 10.5， 加入终浓度 5mM的 DTT， 4°C反应 2h。 再透析过夜 (透析液为 20mM乙醇胺， ρΗΙΟ.5 ) 后， 补入终浓度 0.2mM的菲洛林铜离子复 性液 （购自 Bio Basic Inc. ), 25°C搅拌反应 2h， 补入 10mM的 EDTA, 25°C搅拌 反应 lho 复性液经过 C ₁₈ 制备型 RP-HPLC (流动相 A液为 5%乙腈、 0.1%三氟乙酸； 流动相 B液为 95%乙腈、 0.1%三氟乙酸； 洗脱条件为 A液从 100%至 0%， B液 从 0至 100%)，分离除去未形成 Cysl7-Cys83二硫键的其它蛋白，得到纯度 95% 以上的二硫键变构体 Δ23-Μ和 Δ23 S79-M重组蛋白。

实施例 7： 二硫键变构体 Δ23 S79-M和 Δ23-Μ的二硫键配对分析 原理： 缺失型 hKGF- I二硫键变构体 Δ23 S79-M蛋白的氨基酸序列中仅含 有两个 Cys残基（第 17位和第 83位），本发明通过特有的二硫键配对复性方� ��， 促使第 17位与第 83位的 Cys之间形成一对非天然二硫键，即 Cysl7-Cys83二硫 键（对应于天然野生型 hKGF- I的 Cys40-Cysl06二硫键）。为了证明 Cysl7-Cys83 非天然二硫键已正确形成，通过选用专一性强 的胰蛋白酶进行酶切后， 再用还原 剂 （TCEP) 进行酶切后肽段的还原处理。 采用液质联用的质谱分析还原处理前 后的各个肽段的差异， 从而确定其中参与二硫键形成的肽段以及 Cys 的配对形 式。 表 1为 Δ23 S79 hKGF-M经胰蛋白酶酶切的理论肽段序列表。

表 1

序号 肽段 肽段序列 肽段分子量

1 1-11 SYDYMEGGDIR 1305.5416

2 12-13 VR 274.1873

3 14-14 R 175.1189

4 15-18 LFCR 538.2806

5 19-24 TQWYLR 866.4519

6 25-27 IDK 375.2238

7 28-28 R 175.1189

8 29-30 GK 204.1342

9 31-32 VK 246.1812

10 33-38 GTQEMK 693.3236

11 39-47 顺 YNIMEIR 1166.5623

12 48-57 TVAVGIVAIK 970.6295

13 58-69 GVESEFYLAMNK 1387.6562

14 70-72 EGK 333.1768

15 73-76 LYAK 494.2973

16 77-77 K 147.1128 17 78-86 ESNEDCNFK 1085.4204

18 87-101 ELILENHYNTYASAK 1765.8755

19 102-116 WTHNGGEMFVALNQK 1731.8271

20 117-121 GIPVR 541.3456

21 122-123 GK 204.1342

22 124-124 K 147.1128

23 125-126 TK 248.1605

24 127-127 K 147.1128

25 128-130 EQK 404.2140

26 131-140 TAHFLPMAIT 1101.5761 方法：将 Δ23 S79-M样品透析除盐后冻干，用 1% NH ₄ HC0 ₃ 溶解成 2mg/ml， 取 0.9ml样品两份， 分别补加入 50μ1胰蛋白酶（质量比 1 :50， sigma公司）， 37 °C 反应 24小时。 然后， 一份样品补加入 0.4Μ ΤΧΈΡ 10μ1， 另一份样品再补加入相 同体积纯化水， 37°C反应 30min，再经 RP-HPLC液相色谱质谱联用仪（LC 1100， MSD G1956B, Agilent公司）分析两个样品的质量肽图， 记录 RP-HPLC色谱图， 并记录经质谱测定的各色谱图中肽段的分子量 。

结果： A23 S79-M非还原肽图 （图 11 A) 分析发现， 保留时间为 19.185分 钟的肽段的分子量为 1621.4道尔顿， 通过与酶切理论肽段的序列表对比， 未发 现肽段与之对应。 而 TCEP处理后的还原肽图 （图 11 B), 保留时间为 19.185分 钟的肽段消失， 同时增加了保留时间分别为 17.994分钟和 22.053分钟的新肽段 色谱峰， 分子量分别为 538.2和 1085.3道尔顿， 与酶切理论肽段的序列表对比发 现，这两个肽段分别为序号为 4和 17的 LFCR和 ESNEDCNFK。两者均含有 Cys 残基， 前者 Cys位于第 17位， 后者 Cys位于第 83位， 证明该二个肽段由 Cysl7 和 Cys83形成一对二硫键，在非还原肽图中出现保� ��时间为 19.185分钟的肽段。 该二个肽段形成二硫键后肽段分子量之和为 1621.5道尔顿，与保留时间为 19.185 分钟的肽段的分子量完全一致。

采用同样方法证明 Δ23-Μ中的二硫键配对位于第 17位和第 83位 Cys之间。 实施例 8: 体外生物学活性测定

样品： Δ23: 形成 Cys79-Cys83天然二硫键的 rhKGF- I突变体 （由实施例 5得到）; Δ23-Μ: 形成 Cysl7-Cys83非天然二硫键的 rhKGF- I变构体重组蛋白 （由 实施例 6得到）；

△23 S79-M: 形成 Cysl7-Cys83非天然二硫键的 rhKGF- I变构体重组蛋白 (由实施例 6得到）。

对照品： hKGF- I， 购于 NIBSC, 每支 l(^g或 1 X 10 ⁴ IU;

hbFGF, 购于中国药品生物制品检定所， 每支 40μ _§ 或 1 X 10 ⁵ IU;

hVEGF, 购于 R&D公司， 每支 100μ§。

(1)貂肺上皮细胞株 BL-7测活

将上述各样品和 hKGF- I对照品用含 0.25%胎牛血清的 1640培养基稀释至 ^g/ml, 每个样品按 1 :4梯度稀释 8个浓度。 将 NBL-7细胞（购自中国科学院上 海生命科学研究院细胞资源中心） 按每孔 3.0 X 10 ³ 个的细胞量， 接种于 96孔细 胞培养板， 在 37°C、 5% C0 ₂ 条件下置于二氧化碳培养箱培养过夜。 吸净上清后 各孔依次加入上述不同稀释浓度的样品和对照 品， 相同条件继续培养 48〜72h。 取出后每孔加 MTT ΙΟμΙ染色， 再培养 4〜6h后弃掉培养液， 每孔加入 ΙΟΟμΙ的 DMSO, 振荡混匀后在 570nm波长下测定各孔 OD值。 与空白对照组相比， 计 算对照品和样品刺激细胞生长的最大百分率， 其中 hKGF- I对照品的刺激细胞生 长率为 210%， Δ23的刺激细胞生长率为 194%， Δ23-Μ和 Δ23 S79-M刺激细 胞生长率分别为 160%和 142% (图 3 )。

(2)人肝星状细胞（HSC)测活

将上述各样品和 hbFGF对照品用含 2.0%胎牛血清的 MEM培养基稀释至 1 μ g/ml, 每个样品按 1 :4梯度稀释 8个浓度。 将 HSC细胞 （购自中国典型培养 物保藏中心） 按每孔 1.0 X 10 ⁴ 个的细胞量， 接种于 96孔细胞培养板， 在 37°C、 5% C0 ₂ 条件下置于二氧化碳培养箱培养过夜。 吸净上清后各孔依次加入上述不 同稀释浓度的样品和对照品， 相同条件继续培养 72h。 取出后每孔加 MTT ΙΟμΙ 染色， 再培养 4〜6h后弃掉培养液， 每孔加入 ΙΟΟμΙ的 DMSO, 振荡混匀后在 570nm波长下测定各孔 OD值。与空白对照组相比， 计算对照品和样品刺激或抑 制细胞生长的最大百分率， 其中 hbFGF对照品的刺激细胞生长率达 80%， Δ23 刺激细胞生长率达 18%; 而 Δ23-Μ和 Δ23 S79-M抑制 HSC细胞生长， 最大抑 制率分别为 54%和 69% (图 4)。

(3)人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)测活 将上述各样品和 hVEGF对照品用含 0.5%胎牛血清的 1640 培养基稀释至 1μ _§ /ηι1， 每个样品按 1 :4梯度稀释 8个浓度。 将 HUVEC细胞 （购自中国典型培 养物保藏中心）按每孔 5.0 X 10 ³ 个的细胞量，接种于 96孔细胞培养板，在 37°C、 5% C0 ₂ 条件下置于二氧化碳培养箱培养过夜。 吸净上清后各孔依次加入上述不 同稀释浓度的样品和对照品， 相同条件继续培养 48h。 取出后每孔加 MTT ΙΟμΙ 染色， 再培养 4〜6h后弃掉培养液， 每孔加入 ΙΟΟμΙ的 DMSO, 振荡混匀后在 570nm波长下测定各孔 OD值。与空白对照组相比， 计算对照品和样品刺激或抑 制细胞生长的最大百分率， 其中 hVEGF对照品的刺激细胞生长率达 57%， Δ23 样品对 HUVEC细胞无明显作用； 而 Δ23-Μ和 Δ23 S79-M抑制 HUVEC细胞生 长， 最大抑制率分别为 32%和 41% (图 5 )。

实施例 9: 家兔角膜损伤修复实验

取健康家兔 24 只 （解放军第三军医大学野战外科研究所实验动 物中心提 供）， 随机分为 4组， 每组 6只， 分别为溶媒对照组、 bFGF对照组、 Δ23-Μ变 构体组和 Δ23 S79-M变构体组。 采用对侧眼自身对照法和组间对照进行实验， 在实验前 24h， 检查每只家兔两眼的刺激性体征， 并用检眼镜检查角膜、 结膜有 无损伤， 所有兔眼用 2%荧光素钠溶液染色， 检查证实没有角膜损伤。

将家兔左眼睑拉成杯状， 于眼结膜囊内滴入无水乙醇， 第 1天滴入 0.135ml

(即 3滴）， 第 2天 0.09ml， 第 3天 0.045ml， 轻合眼睑约 10s， 右眼滴加相同体 积的生理盐水作对照。 自第 4 天起， 各组家兔左眼滴入 0.135ml含相应药物

(50μ _§ /ηι1) 的滴眼液或生理盐水， 右眼滴加生理盐水作对照， 上、 下午各一次， 连续滴加 14天， 其中第 7天和第 14天做眼刺激评分（包括角膜、 虹膜、 结膜的 损伤及充血、水肿以及分泌物）， 并于第 14天取角膜做病理切片。病理结果见附 图 12， 眼刺激评分结果见下表 2。

表 2

总分值

组 别 -

7天 14天

溶媒对照组 13 7

bFGF对照组 9 5

Δ23-Μ变构体组 5 1

△23 S79-M变构体组 4 1 眼刺激性评价结果分值越高， 说明眼刺激性越严重。病理结果显示， Δ23-Μ 和 A23 S79-M二硫键变构体组的角膜恢复良好， 无血管增生， 纤维排列尚整齐， 有部分水肿。 而 bFGF对照组具有明显的角膜血管增生和角膜过� �增生。 结果表 明， Δ23-Μ和 A23 S79-M能促进角膜损伤后的修复作用， 同时抑制纤维和血管 增生。

实施例 10： CC 诱导的 SD大鼠慢性肝纤维化模型实验

(一） 预防给药

取 SD大鼠 （180g-240g) 50只 （解放军第三军医大学野战外科研究所实验 动物中心提供）， 随机分为 5组， 每组 10只， 分别为正常对照组、 模型对照组、 △23突变体组、 Δ23-Μ变构体组和 Δ23 S79-M变构体组，每日皮下注射 2mg/kg 相同剂量。 除正常对照组外， 其余各组于实验第 1天开始灌服 20% CC (灌胃 量为 2ml/kg体重），以后每隔 3天灌胃 1次。 30天后，取血清测定谷丙转氨酶 (ALT) 和谷草转氨酶 （AST), 同时解剖大鼠取出肝脏， 取肝部分左叶固定于 10%中性 甲醛液， 常规石蜡包埋， 作 HE和 Masson染色， 显微镜下观察， 记录肝纤维增 生程度。 剩余肝组织于 -20°C冻存， 用于测定羟脯氨酸含量。

病理组织切片结果见图 6。 病理组织切片结果显示， 与模型组相比， Δ23 突变体组的抗纤维化作用不明显， 而 Δ23-Μ和 Δ23 S79-M组的动物肝纤维化明 显减轻。 从下表 3中可见该两组中转氨酶 ALT和 AST、 羟脯氨酸含量均显著低 于模型组。

表 3

ALT值 AST值 羟脯氨酸含量 组别

(；单位 /dL) (；单位 /dL) g) 正常对照组 65.50 102.83 0.108 模型对照组 170.51 279.02 0.467

△23突变体组 129.14 201.60 0.402

Δ23-Μ变构体组 86.20 150.33 0.249

△23 S79-M变构体组 76.67 112.16 0.196

(二） 治疗给药

取 SD大鼠 70只，于实验第 1天开始灌胃 20% CC (灌胃量为 2ml/kg体重）， 以后每天灌服 1次。连续 42天后， 取 6只动物做病理切片并测定羟脯氨酸含量， 证实有明显肝纤维化形成后， 随机分成 4组， 每组 10只， 分别为模型对照组、 △23突变体组、 Δ23-Μ变构体组和 Δ23 S79-M变构体组，每日皮下注射 2mg/kg 相同剂量， 每日一次， 连续给药 30天。 实验结束时， 取血清测定 ALT、 AST禾口 TP, 同时解剖取出肝脏， 取部分左肝固定， 作切片进行 HE和 Masson染色， 显 微镜下观察记录肝纤维增生程度。 剩余肝组织于 -20°C冻存， 用于测定羟脯氨酸 病理组织切片结果见图 7。 病理结果显示， Δ23-Μ和 Δ23 S79-M两种二硫 键变构体均能逆转动物已形成肝纤维化， 且 Δ23 S79-M更优于 Δ23-Μ, 而 Δ23 突变体与模型组相比，仅轻度减轻肝纤维化程 度。羟脯氨酸含量测定结果同样证 明变构体可减轻并逆转肝纤维化。 同时 Δ23-Μ和 Δ23 S79-M具有降低转氨酶和 提高血总蛋白 （TP) 的作用。 从下表 4中可见该两组中转氨酶 ALT和 AST、 羟 脯氨酸含量均显著低于模型组。

表 4

ALT值 AST值 TP值 羟脯氨酸含量 组别

(；单位 /dL) (；单位 /dL) (g/dL) (ug/g) 正常对照组 57.12 98.40 70.13 0.117 模型对照组 242.38 398.39 64.23 0.659

△23突变体组 172.12 335.44 63.88 0.527

Δ23-Μ变构体组 121.20 153.23 66.98 0.33823 S79-M变构体组 109.71 122.57 67.01 0.297 实施例 11： 博莱霉素诱导的 SD大鼠急性肺纤维化模型实验

取 SD大鼠 （180g-240g) 50只， 随机分为 5组， 每组 10只， 分别为正常对 照组、 模型对照组、 Δ23突变体组、 Δ23-Μ变构体组和 Δ23 S79-M变构体组。 除正常对照组外，其余各组于实验第 1天手术游离大鼠气管，气管内一次性注入 等容积博莱霉素 （Bleomycin, BLMA5, 剂量为 5mg/kg体重）， 注药后将动物直 立并旋转， 使药物在肺内均匀分布。

手术后第 5天， 各药物组分别皮下注射相应药物 （2mg/kg/d)， 正常对照组 和模型对照组皮下注射相同体积的生理盐水。 每日给药一次， 连续 15天后， 处 死动物， 完整分离出气管和肺， 称重； 观察肺纤维化形成的病理变化； 取左肺固 定于 10%中性甲醛液， 常规石蜡包埋， 作 HE和 Masson染色， 显微镜下观察， 记录肺纤维增生程度。病理组织切片结果见图 8，病理结果显示， Δ23-Μ和 Δ23 S79-M二硫键变构体组的的肺组织中肺泡结构基� ��完整，无明显炎症细胞浸润和 肺水肿，肺间质中无明显的纤维增生和增厚。 而模型组肺组织中有明显炎症细胞 浸润、 水肿和充血， 肺间质变厚和纤维增生。 结果证明， Δ23-Μ和 Δ23 S79-M 变构体组除了对肺组织损伤有保护作用外， 尚有抑制肺纤维的显著作用。 Δ23 突变体组纤维化程度比模型组略轻，但明显差 于 Δ23-Μ和 Δ23 S79-M变构体组。

实施例 12: 鸡胚绒毛尿囊膜 （CAM) 实验

选用 6日龄鸡胚 50只 （解放军第三军医大学野战外科研究所实验动 物中心 提供）， 随机分为 5组， 每组 10只， 分别为生理盐水对照组、 bFGF阳性对照组、 △23突变体组、 Δ23-Μ变构体组和 Δ23 S79-M变构体组。 除去气室顶端蛋壳， 加 3〜5滴无菌生理盐水在蛋壳膜上， 暴露出 CAM。 无菌条件下分别加入浸有相 应药物 （10μ _§ /ηι1) 或生理盐水的 1.5mmX 1.5mm的滤纸片， 然后将蛋壳用无菌 胶布封口， 继续在 37°C孵化 3天后， 取下覆盖物， 暴露出 CAM, 解剖显微镜下 照相。 用 CMIASII图像分析软件进行滤纸片周围血管计数� � 计算每组的平均血 管数。 实验照片结果见图 9， 实验结果见下表 5。

表 5

组别 每只 CAM滤纸片周围平均血管数 (N) 生理盐水对照组 36

bFGF阳性对照组 71

△23突变体组 43

Δ23-Μ变构体组 21

△23 S79-M变构体组 18

结果显示， Δ23-Μ和 Δ23 S79-M二硫键变构体组可显著抑制鸡胚 CAM的 新生血管生长， 同时 bFGF具有明显促进新生血管增生的作用，而 Δ23突变体组 对新生血管作用不明显。