本申请要求享有于 2011 年 3 月 17 日向中国国家知识产权局提交的申请号为

201110063821.6的发明专利申请的优先权， 其公开的全部内容通过引用的方式并入本文。 背景技术 胰岛素 （Insulin) 是由胰岛 β细胞受内源性或外源性物质 （如葡萄糖、 乳糖、 核糖、 精氨酸、 胰高血糖素等） 刺激而分泌的一种蛋白质， 含有 51 个氨基酸， 分子量约 5800 道尔顿。胰岛素分子有靠两个二硫键结合的 Α链（21个氨基酸）与 B链（30个氨基酸）， 如果二硫键被打开则失去活性。 β细胞先合成一个大分子的前胰岛素原， 以后加工成八十 六肽的胰岛素原，再经水解成为胰岛素与连接 肽。胰岛素的主要生理作用是调节代谢过程: 1、 促进组织细胞对葡萄糖的摄取和利用， 促进糖原合成， 抑制糖异生， 降低血糖； 2、 促 进脂肪酸合成和脂肪贮存， 减少脂肪分解； 3、 促进氨基酸进入细胞， 增加蛋白质合成速 度。

糖尿病 （DM， Diabetes Mellitus) 是一种胰腺功能病变的代谢疾病， 特点是慢性高 血糖， 伴随因胰岛素分泌或作用缺陷引起糖、脂肪和 蛋白质代谢紊乱， 其主要特征是高血 糖。 主要分为两种病型： I型 （IDDM), 胰岛素绝对不足引起； II型 (NIDDM), 胰岛 素相对不足引起。 糖尿病已成为一种常见病、 多发病， 且成为继癌症、 心脑血管病之后， 第三大威胁人类生命的疾病。

胰岛素通过与体内细胞膜上胰岛素受体的相互 作用， 调节血糖维持在正常水平， 是 最有效的糖尿病治疗药物之一。 胰岛素受体是一种四聚体的跨膜糖蛋白， 由两个 （ 亚基 和两个 β亚基通过二硫键连接。 两个（ 亚基位于细胞质膜的外侧， 有胰岛素结合位点； 两个 β 亚基是跨膜蛋白， 起信号转导作用。 无胰岛素结合时， 受体的酪氨酸蛋白激酶没 有活性。 当胰岛素与受体的 ( 亚基结合时， 改变 β亚基的构型， 酪氨酸蛋白激酶被激活， 激活后催化两个反应： ①使四聚体复合物中 β 亚基特异位点的酪氨酸残基磷酸化， 即自 我磷酸化； ②磷酸化的酪氨酸残基 IRSs结合并激活第二信使， 放大、 级联信号， 引起代 谢调节。胰岛素与受体结合的程度取决于受体 数目与亲和力，此二者又受血浆胰岛素浓度 调节。 当胰岛素浓度增高时胰岛素受体数下降， 即下降调节。肥胖的非胰岛素依赖型糖尿 病人由于脂肪细胞膜上受体数下降， 对胰岛素不敏感性， 称胰岛素抵抗。 经饮食控制、体 育锻炼后体重减轻，脂肪细胞膜上胰岛素受体 数增多，与胰岛素结合力加强而使血糖利用 改善， 调节血糖恢复到正常水平。

胰岛素与受体结合率越高， 调节血糖的效果越明显， 结合率的检测采用竞争结合试 验法： 受体与 I ¹²⁵ -胰岛素一起孵育，在反应体系中加或不� �饱和浓度的未标记的待测胰岛 素 （或胰岛素类似物）， 放射性标记和未标记的待测胰岛素一起得到总 的胰岛素结合量， 单独加入放射性标记的 I ¹²⁵ -胰岛素得到非特异性结合量。总结合量� �去非特异性结合量得 到胰岛素的特异性结合量， 特异性结合量除以反应体系中胰岛素总浓度得 到特异性结合 率。 竞争结合试验中的受体优选经过麦胚凝集素琼 脂糖凝胶柱 （WGA) 层析后得到的大 鼠肝脏的胰岛素受体， 原因是大鼠肝脏中胰岛素受体含量高， 提取方便， 且与胰岛素受体 高度同源的胰岛素样生长因子 -1 受体在肝脏中的表达水平低， 对检测干扰极小 （马歇克 等著 蛋白质纯化与鉴定实验指南.科学出版社， 1999，P141-192; 程宁莉等.新生小牛肝组织 胰岛素受体的功能.上海第二医科大学学报，19 97，12(；2):23-25； Sinha MK.Subunit structure, autopho sphorylation, and tyrosine-specific protein kinase activity of hepatic insulin receptors in fetal, neonatal, and adult rats. Diabetes，1987;36(l):1161 )。

正常人体内胰岛素的生理分泌受血糖浓度的调 控， 进餐后的 30-60分钟后血胰岛素 浓度达到峰值， 2-4小时后恢复到正常值，保证了血糖浓度不因 进餐而又引起较大的波动。 糖尿病患者皮下注射天然人胰岛素后， 胰岛素在注射位置扩散并进入体内循环发挥作 用， 但有效作用时间短； 频繁地注射胰岛素， 也给糖尿病患者带来诸多的不便和痛苦， 临床上 需要注射有效时间更长的长效胰岛素。化学修 饰是获得长效胰岛素的途径之一，经过化学 修饰， 可使胰岛素在保持生物活性的同时， 半衰期延长， 抗原性降低。化学修饰剂的结构 必须稳定、 无毒性、 无抗原性并具有合适大小的分子量。 聚乙二醇 (PEG)是一种具有较好 生物相容性的高分子化合物， 对人体无毒性。 PEG若与目的蛋白质结合， 需要对 PEG分 子一端或两端进行活化，根据要连接分子的特 性来选择所需要的功能基团。常见的生物相 容连接基团包括酯基、 酰胺基、 酰亚胺基、 氨基甲酸酯基、 琥珀酰亚胺基（例如琥珀酰亚 胺基琥珀酰酯 （SS)、 琥珀酰亚胺基丙酸酯 （SPA)、 琥珀酰亚胺基羧甲基化物 （SSA)、 N-羟基 -琥珀酰亚胺（NHS)、环氧基）、半胱氨酸基团� ��组氨酸基团或伯胺。活化后的 PEG 理论上可以与蛋白质中主要的氨基酸如赖氨酸 、 半胱氨酸、 组氨酸、 天冬氨酸、 谷氨酸、 丝氨酸、 苏氨酸等反应， 反应可以在 N端， 也可在 C端， 但选择和赖氨酸或 N端的基团 反应最常见。重组人胰岛素或类似物分子中有 三个裸露的氨基，即 GlyA ¹ ( _P Ka^8.0) PheB ¹ (pKa<7.0)的 α-氨基和 LysB ²⁹ (pKa-9.5)的 ε-氨基， 都可作为胰岛素的化学修饰位点。 由 于人胰岛素的 Β ²⁹ 位不直接参与与受体结合，与人胰岛素 LysB ²⁹ 的共价修饰不会影响蛋白 的生物活性（Murray-Rust J et al.， BioEssaysl992, 14 (5): 325-331 )。在 pH〉9.5时 LysB ²⁹ 上 ε-氨基的修饰是主要的， 且修饰率高 （Hinds K et al.， Bioconjug Chem 2000, 11 (2): 195-201 )。郁正艳等（CN200410089050.8)发明了一种单甲氧 基聚乙二醇-胰岛素复合物， 胰岛素和单甲氧基聚乙二醇通过前者的游离氨 基和后者的具有活性的丙醛基团连接在一 起， 分子量介于 10.8〜25.8kD， 但修饰工艺复杂， 且为修饰混合物。 印春华等 (CN200610118923.2)发明了一种单修饰的聚乙二醇化 胰岛素（PheBl-PEG-胰岛素）， 聚 乙二醇与胰岛素的 B链第一位 Phe以碳氮键相连， 分子量范围 6.55〜10.8kD， 但在体内 作用时间短， 降血糖效果不明显。 专利 CN1964899A公开了将含马来酸基团的 PEG修饰 胰岛素的 B29, 给药后与体内白蛋白结合的长效胰岛素衍生物 。 专利 CN10721712A公开 了一种双链聚乙二醇修饰胰岛素 B30复合物的方法； 专利 CN101573173A公开了 PEG化 延长的胰岛素， 其主要修饰 A21和或 B30的 C末端羧基的 PEG化， 以及 Al、 B1的 N 末端氨基的 PEG化； 专利 CN101045166A公开了一种化学修饰胰岛素的肺部给 药， 该专 利中化学修饰胰岛素包括 Al、 Bl、 B29 的至少一个位点的聚乙二醇修饰； 专利 CN101743252A公开了蛋白酶稳定的 PEG化的胰岛素类似物， 该专利中的胰岛素类似物 具有不同人胰岛素的结构，要求至少含有两个 疏水氨基酸被亲水氨基酸取代，然后再进行 B29赖氨酸的 PEG化， 并实现肺部给药的目的。 专利 CN 200810232828.4公开了用聚乙 二醇在胰岛素 A1位单修饰或在胰岛素 A1位和 B29位双修饰的工艺， 但在体内持续降血 糖时间不长且出现波动。 Novo Nordisk 公司长效地特胰岛素由脂肪酸肉豆蔻脂肪酸 (myristic fatty acid) 偶联在胰岛素类似物 B 链第 29 位赖氨酸上 （CN101784563A, CN101389650A和 EP2008/060734),体内降血糖效果明显，人体内可实 现降血糖 24小时， 但动物体内仅维持 12小时以内的降血糖作用。

本发明选用聚乙二醇作为修饰剂与人胰岛素或 DesB30 重组人胰岛素的单一位点 B29赖氨酸的 ε-氨基以酰氨键偶联， 经纯化工艺获得无其他修饰位点的单一偶联物 ， 修饰 产物性质稳定。 分子量大小不同的修饰偶联物与人胰岛素受体 结合率达 40-90%之间， 体 内半衰期显著延长，在实验动物体内（家兔和 犬）降血糖效果可实现从 24至 72小时不等。 本发明公开的重组人胰岛素及其类似物偶联物 具有作为治疗 I型和 II型糖尿病的新型长 效胰岛素的治疗药物或其药物组合物的价值。 发明内容 本发明的一个目的是提供一种重组人胰岛素或 其类似物（例如， DesB30重组人胰岛 素） 的偶联物， 其是通过使所述重组人胰岛素或其类似物的 B链的第 29位赖氨酸 （B29 赖氨酸）的 ε-氨基与活化的聚乙二醇以共价键连接形成的 偶联物，所述偶联物与胰岛素受 体具有高结合率， 且具有体内持续降血糖作用。

本发明的另一个目的是提供制备上述偶联物的 方法， 该方法包括制备重组人胰岛素 或其类似物的单体、 PEG偶联和偶联后的蛋白纯化。

本发明的又一个目的是提供一种用于治疗 I型和 II型糖尿病的重组人胰岛素偶联物 或其类似物的偶联物 （例如， DesB30重组人胰岛素偶联物） 的药物组合物， 其包含有效 剂量范围的重组人胰岛素偶联物或其类似物的 偶联物 （例如， DesB30重组人胰岛素偶联 物） 作为有效成分， 并且其可进一步含有药学上可接受的载体及辅 料。

本发明的再一个目的是提供上述偶联物在制备 治疗 I型和 II型糖尿病的药物中的用 途。 该偶联物修饰位点专一， 包括含 5kDa、 10kDa、 20kDa分子量的三种 PEG的偶联物， 与胰岛素受体结合率高， 在体内能显著延长半衰期， 持续降血糖效果明显， 可作为治疗药 物或药物组合物用于治疗 I型和 II型糖尿病。

因此， 在本发明的第一方面， 提供了一种重组人胰岛素偶联物或其类似物的 偶联物

(例如， DesB30重组人胰岛素偶联物），所述偶联物是通 过使所述重组人胰岛素或其类似 物 （例如， DesB30重组人胰岛素） 的 B29赖氨酸的 ε-氨基与活化的聚乙二醇以酰胺键连 接形成的偶联物。

其中， 用于 PEG偶联的重组人胰岛素或其类似物的氨基酸序 列如下所示。 所述的重 组人胰岛素的氨基酸序列为（ SEQ ID No: l ): Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr, 其中， 1-21位氨基酸 组成重组人胰岛素的 A链， 22-51位氨基酸组成重组人胰岛素的 B链，第 6位和第 11位、 第 7位和第 28位、 第 20位和第 40位分别形成二硫键， 斜体字部分是 B29位的赖氨酸残 基。

本发明中， 所述重组人胰岛素类似物是在 SEQ ID NO: l限定的氨基酸序列中经过取 代、 缺失或添加一个或几个氨基酸且具有重组人胰 岛素活性的由 SEQ ID ΝΟ: 1衍生的蛋 白质。

优选地， 所述的重组人胰岛素类似物 （DesB30 重组人胰岛素） 的氨基酸序列是在 SEQ ID ΝΟ: 1中 B链末端缺失第 30位苏氨酸而得到的， 可以命名为 DesB30重组人胰岛 素， 其氨基酸序列为 SEQ ID NO :2: Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys,其中， 1-21位氨基酸组成 DesB30 重组人胰岛素的 A链， 22-50位氨基酸组成 DesB30重组人胰岛素的 B链， 第 6位和第 11 位、第 7位和第 28位、第 20位和第 40位的半胱氨酸分别形成二硫键，斜体字部分� �� B29 位的赖氨酸残基。

所述的重组人胰岛素或其类似物（例如， DesB30重组人胰岛素）是指利用基因工程 重组技术而制备获得。具体为利用酵母的表达 载体构建含重组人胰岛素原前体基因的重组 子，转化酵母后，筛选表达株经发酵罐表达重 组人胰岛素原前体，分离和纯化该前体蛋白， 再利用胰蛋白酶酶切以除去前导肽和短 C肽，并经层析分离制备而得到 DesB30重组人胰 岛素。该 DesB30重组人胰岛素采用化学 C末端的縮合反应（Gurramkonda et al. , Microbial Cell Factories 2010, 9:31 US4916212 ) , 再经分离纯化获得重组人胰岛素。 如实施例中所 详述，制备的重组人胰岛素及 DesB30重组人胰岛素，纯度均达 98.0%以上，具有 27.5IU/mg 的胰岛素活性，完全正确配对的三对二硫键结 构。采用本发明公开的酵母制备的重组人胰 岛素及 DesB30重组人胰岛素可进一步利用结晶方法制备 相应的结晶胰岛素。

重组人胰岛素的 PEG 修饰氨基位点可以包含胰岛素分子中两个 N 端的 et 氨基

(Ala(Al), Phe(Bl) )和赖氨酸的 ε氨基 (Β29)， 但在本发明中， 聚乙二醇修饰位点仅限于 Β29位赖氨酸的 ε氨基。重组人胰岛素或 DesB30重组人胰岛素中 B29赖氨酸的 ε氨基与 活化的聚乙二醇（例如， 活化的单甲氧基聚乙二醇）通过共价键连接， 优选通过仲胺键或 酰胺键进行共价连接， 更优选通过酰胺键进行共价连接。

其中， 在对聚乙二醇分子进行活化时， 聚乙二醇的一端连接活性基团， 另一端连接 封闭基团，其中所述活性基团包括但不局限于 琥珀酰亚胺基（例如琥珀酰亚胺基琥珀酰酯 ( SS ) 基团、 琥珀酰亚胺基丙酸酯 （SPA) 基团、 琥珀酰亚胺基羧甲基化物 （SSA)、 N- 羟基 -琥珀酰亚胺 （NHS ) 基团）、 硝基苯、 酰胺基、 酰胺亚基、 胺基甲酸酯基、 醛基等。 更优的， 活化的 PEG连接的活性基团为琥珀酰亚胺基丙酸酯 （SPA) 基团。 聚乙二醇的 另一端采用的封闭基团包括但不局限于甲氧基 、 乙氧基、 丙氧基、 丁氧基、 半乳糖基团或 葡萄糖基团等， 更优的， 聚乙二醇的封闭基团为甲氧基。

本发明中， 所述活化的聚乙二醇可为单甲氧基聚乙二醇琥 珀酰亚胺基丙酸酯 ( mPEG-succinimidyl propionate, mPEG-SPA ) , 或单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯 ( mPEG-succinimidyl esters, mPEG-NHS )， 或单甲氧基聚乙二醇三氯苯碳酸酯 ( mPEG-trichlorophenyl-carbonate, mPEG-TCP ) ， 或单 甲氧基聚 乙二醇丁醛 (mPEG-aldehyde, mPEG-ALD) o 优选地， 所述活化的聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇琥珀 酰亚胺基丙酸酯 （ mPEG-succinimidyl propionate, mPEG-SPA)。

活化的聚乙二醇分子可以是支链的或直链的， 更优的， 为直链的聚乙二醇。 活化的 聚乙二醇分子的分子量可为 5kDa〜20kDa。 优选地， 以聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯 (mPEG-SPA)作为修饰偶联分子时， 分子量可为 5kDa、 lOkDa或 20kDa。本发明所述的 偶联物中每个重组人胰岛素及 DesB30重组人胰岛素仅偶联 1个聚乙二醇分子，无多个和 非 B29位修饰位点的其他偶联物。

根据本发明第二方面， 提供了一种制备所述的重组人胰岛素或其类似 物的偶联物的 方法， 包括使所述重组人胰岛素或其类似物的胰岛素 B29赖氨酸的 ε-氨基与活化的聚乙 二醇以酰胺键连接形成偶联物的步骤。

具体地， 提供了制备所述重组人胰岛素偶联物或 DesB30 重组人胰岛素偶联物的方 法， 包括以下步骤：

a. 利用甲醇酵母表达重组人胰岛素前体， 再利用胰蛋白酶酶切以除去前导肽和短 C 肽， 并经层析分离制备而得到 DesB30重组人胰岛素；

b. 所述 DesB30重组人胰岛素进行化学 C末端的縮合反应并经分离纯化得到重组人 胰岛素；

c 在所述重组人胰岛素及其类似物 DesB30重组人胰岛素的 B链第 29位赖氨酸的 ε- 氨基与活化的聚乙二醇以酰胺键连接形成从而 制得本发明所述的重组人胰岛素及其类似 物 DesB30 重组人胰岛素偶联物。 具体为： 在蛋白浓度为 2-4mg/ml 的重组人胰岛素或 DesB30重组人胰岛素溶液 （20 mmol/L Tris-HCl， pH10.5 ) 中， 连续两次分别加入蛋白与 mPEG-SPA摩尔质量比为 1 :1.5-1 :2.5 之间的 mPEG-SPA (分子量为 5kDa或 lOkDa或 20kDa)， 室温， lOOrpm, 搅拌 20-40min， 用 1.0mol/L HC1调 pH到 3.0终止反应。 所得产 物经反相柱层析和阳离子柱层析， 除去未修饰的胰岛素、 PEG以及非单一 B29的偶联物， 获得纯度大于 98.0%的重组人胰岛素及 DesB30重组人胰岛素偶联物。 根据本发明的制备 方法所得到的产物， 修饰率达 40%以上， 修饰特异性专一， 修饰产物均一稳定且利于实 施。

通过本发明提供的方法制备的重组人胰岛素偶 联物或 DesB30 重组人胰岛素偶联物 与胰岛素受体进行竞争结合试验， 结果表明两者具有较高的结合率。对家兔、犬 以及小鼠 I型糖尿病模型 （IDDM) 皮下注射适量剂量的重组人胰岛素偶联物或 DesB30重组人胰 岛素偶联物，持续降低血糖效果明显， 因此可作为一种治疗药物或药物组合物疗治疗 I型 和 II型糖尿病。其中含 5kDa聚乙二醇的偶联物保留了与胰岛素受体 75%以上结合率， 能 持续体内降血糖 12.5小时； 含 lOkDa聚乙二醇的偶联物保留了与胰岛素受体 60%以上结 合率，能持续体内降血糖 23.8小时;含 20kDa聚乙二醇的偶联物保留了与胰岛素受体 40% 以上结合率， 能持续体内降血糖 46.5小时。

根据本发明的第三方面， 提供了一种用于治疗 I型和 II型糖尿病的重组人胰岛素或 其类似物 （例如， DesB30重组人胰岛素） 偶联物的药物组合物， 其包含有效剂量范围的 重组人胰岛素或其类似物的偶联物 （例如 DesB30重组人胰岛素偶联物） 作为有效成分， 并可进一步含有药学上可接受的载体及辅料。 根据实施例的研究以及临床的可参照治疗的 剂量，发明人发现所述偶联物在 0.01-0.5mg/kg范围内的治疗剂量下的药物配方效� �最佳。 本发明偶联物的给药方式以皮下注射和静脉注 射为主，但不排除并包括经公开已知制备技 术制成肺部给药、 口服给药。作为注射给药的配方， 除含有有效治疗的剂量的重组人胰岛 素偶联物外， 还需具有一定的 pH范围 （pH为 3.0〜8.0之间）， 包含适当的溶液缓冲 （包 括但不限于磷酸盐、 柠檬酸盐、 醋酸盐、 甘氨酸、 组氨酸） 以及保护剂（包括但不限于氨 基酸、 锌离子、 单糖或多糖） 和防腐剂 （包括但不限于苯酚和间甲苯酚）。 作为组合物， 可将本发明所述人胰岛素偶联物与鱼精蛋白或 其他人胰岛素 （包括但不限于已上市胰岛 素， 如门冬胰岛素、 赖脯胰岛素、 普通胰岛素、 地特胰岛素、 甘精胰岛素）进行一定量效 浓度组合。

根据本发明的第四方面， 提供了本发明所述的重组人胰岛素偶联物或其 类似物的偶 联物（例如 DesB30重组人胰岛素偶联物）在制备治疗 I型和 II型糖尿病的药物中的用途。 该偶联物修饰位点专一， 包括含 5kDa、 10kDa、 20kDa分子量的三种 PEG的偶联物， 与 胰岛素受体结合率高， 在体内能显著延长半衰期， 持续降血糖效果明显。

至此已对本发明进行了详细的描述， 通过参考以下实施例， 能够对本发明有更清晰 的理解， 所述实施例仅为说明目的而不是旨在对本发明 进行限制。 附图说明 图 1为 DesB30重组人胰岛素前体和 DesB30重组人胰岛素的 HPLC图： A为重组人 DesB30胰岛素前体的 HPLC图谱； B为 DesB30重组人胰岛素前体用胰蛋白酶酶切后的 HPLC图谱； C为 DesB30重组人胰岛素的 HPLC图谱。

图 2A为 DesB30-5K的 C18层析图谱， 其中用箭头标出的峰是收集的 B29位特异性 修饰产物。 图 2B为 DesB30-10K的 C18层析图谱， 其中用箭头标出的峰是收集的 B29位 特异性修饰产物。 图 2C为 DesB30-20K的 C18层析图谱， 其中用箭头标出的峰是收集的 B29位特异性修饰产物。 图 2D为 DesB30重组人胰岛素及 DesB30重组人胰岛素不同分 子量偶联物的电泳图： 1 为未修饰 DesB30; 2 为 DesB30-5K; 3 为 DesB30-5K; 4 为 DesB30-10K _; 5为 DesB30-10K; 6为 DesB30-20K; 7为 DesB30-20K; M为蛋白分子量 标准， 从下往上依次为 14.4kD、 20kD、 26kD、 33kD、 45kD、 66.2kD、 94 kD。

图 3为 DesB30重组人胰岛素和重组人 DesB30-20K经 V8酶酶切的还原肽图： A为 DesB30重组人胰岛素的 V8酶酶切还原肽图； B为重组人 DesB30-20K的 V8酶酶切还原 肽图。

图 4为 DesB30重组人胰岛素偶联物在 I型糖尿病模型昆明小鼠上持续降血糖的时 效曲线， 其中 X轴为测定 I型糖尿病模型小鼠空腹血糖值的时间 （Hr)， Y轴为血糖值 (mMol/L), ♦为对照组， 國为 DesB30-5K组， 为 DesB30-10K组， X为 DesB30-20K组。

图 5为重组人胰岛素 Ins偶联物在 I型糖尿病模型昆明小鼠上持续降血糖时效曲� �， 其中 X轴为测定 I型糖尿病模型小鼠空腹血糖值的时间（Hr)， Y轴为血糖值（mMol/L)， ♦为对照组， 國为 1^-5 组， 为 Ins-IOK组， X为 Ins-20K组。

图 6为 DesB30重组人胰岛素偶联物在 I型糖尿病模型新西兰大白兔上持续降血糖 时效曲线， 其中 X轴为测定 I型糖尿病模型新西兰大白兔空腹血糖值的时� � （Hr)， Y轴 为血糖值（mMol/L)，*为对照组，國为1^8830-5 组，人为 DesB30-10K组， X为 DesB30-20K 组。

图 7为重组人胰岛素 Ins偶联物在 I型糖尿病模型新西兰大白兔上持续降血糖时� � 曲线， 其中 X轴为测定 I型糖尿病模型新西兰大白兔空腹血糖值的时� � （Hr)， Y轴为血 糖值 （mMol/L)， ♦为对照组， 國为 ¾8-5 组， A为 Ins-IOK组， X为 Ins-20K组。

图 8为 DesB30-20k偶联物在 I型糖尿病模型 Beagle犬上剂量梯度持续降血糖时效 曲线 （单次给药）， 其中 X轴为测定 I型糖尿病模型 Beagle犬空腹血糖值的时间 （Hr)， Y轴为血糖值 （mMol/L)， ♦为对照组， ■为剂量 0.05mg/kg组， A为剂量 O.lmg/kg组。

图 9为以 0.1mg/kg剂量对 I型糖尿病模型 Beagle犬单次皮下注射 DesB30-20k偶联 物后测定的血药浓度曲线， 其中 X轴为测定时间 Hr， Y轴为 DesB30-20k偶联物浓度 图 10为以 0.1mg/kg剂量对 I型糖尿病模型 Beagle犬连续 6次皮下注射 DesB30-20k 偶联物后测定的血药浓度曲线， 其中 X轴为测定时间 Hr， Y轴为 DesB30-20k偶联物浓度

具体实 式 通过下面的具体实施例可进一步了解本发明， 但它们不是对本发明的限定。 以下实 施例所涉及的重组人胰岛素 （Ins) 及其类似物 (DesB30)均为根据现有技术采用基因工程 技术获得的， 它们的氨基酸序列分别为 SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2 ( SEQ ID No.l : Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr; SEQ ID No.2： Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ； Application of simple fed-batch technique to high-level secretory production of insulin precursor using Pichia pastoris with subsequent purification and conversion to human insulin. Gurramkonda C, Polez S, Skoko N， Adnan A, Gabel T, Chugh D, Swaminathan S, Khanna N， Tisminetzky S, Rinas U. Microb Cell Fact. 2010 May 12;9(1):31. )。

实施例 1.重 胰岛素类似物 (DesB30)的重组表达和纯化

在本实施例中， 根据所涉及的人胰岛素类似物 DesB30的氨基酸序列 （SEQ ID NO:

2)， 设计酵母偏爱密码子的对应 cDNA序列， 其中含有前导肽序列 EVFK和中间短 C肽 AAK相对应的 cDNA序列， 同时包含 5 ' 端和 3 ' 端分别设计的限制性内切酶 Xho I和 Not I 位 点 。 全 部 的 cDNA 序 列 如 下 （ SE ID NO: 3 ) ： 5 '

AACTACTGTAACTGATAAGCGGCCGC-3 '。委托宝生物（大连）有限公司人工合成 SEQ ID NO: 3 的 cDNA基因片段， 并嵌入 pUC18 (购于 invitrogen 公司） 载体且命名为 pUC18-DesB30。 将质粒 pUC18-DesB30和表达载体质粒 pICZaA (购于 invitrogen公司） 用限制性内切酶 Xho l (购于宝生物大连有限公司） 和 Not l (购于宝生物大连有限公司） 双酶切后， 经胶回收、 T4 酶 （购于宝生物大连有限公司） 连接， 构建并筛选含 DesB30 前体基因的表达载体 pICZctA-D _eS B30。 重组质粒用 Αντ Π (购于宝生物大连有限公司）线 性化， 用电转仪将线性化的重组质粒导入 GS115毕赤酵母（购于 invitrogen公司） 中， 经 His+和 Zeocin筛选，获得抗 Zeocin 100(^g/ml的高拷贝克隆菌。挑表达菌，接种于 5ml YPD 培养基中， 30°C过夜培养， 转接入 250ml YPD培养基中， 表达 96小时。 筛选出高表达菌 株得到种子液， 液氮 -80°C保存。 发酵及表达： 取一支保存于 -80°C的种子液， 划线 YPD平板葡萄糖 20 g/L， 多蛋白 胨 20 g/L， 酵母膏 10 g/L， 琼脂 20 g/L， 30 °C培养 3-4天即可。 从活化好的 YPD平板上 挑取菌落， 接种于装有 25 mL YPD (葡萄糖 20 g/L， 多蛋白胨 20 g/L， 酵母膏 10 g/L) 液体培养基的 250 mL的三角瓶中，于 30 V 250 rpm条件下培养 24小时， 即成一级种子 液。 将一级种子液以 1%的接种量接种于装有 250 mL YPD液体培养基的 1000 mL三角瓶 中， 于 30 V 250 rpm条件下培养过夜， 即成上罐种子液。上罐种子液以 10%的接种量接 入发酵培养基 BSM (BSM每 1000ml中含： 85 %的 H ₃ P0 ₄ 26.7 mL, CaS0 ₄ 2H ₂ 0 0.93g， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 14.9g, KOH 4.13 g, K ₂ S0 ₄ 18.2g, 甘油 40g， 微量元素 （PTM1 ) 4.4 mL, 消泡剂 0.5mL;其中 PTM1每 1000ml含： CuSO ₄ '5H ₂ 0 6g， KC1 0.08 g， MnS0 ₄ 2.68g， H ₃ B0 ₄ 0.029g, Na ₂ Mo0 ₄ -2H ₂ 0 0.2 g, ZnS0 ₄ -7H ₂ 0 20g, FeS0 ₄ 7H ₂ 0 65 g， CoCl ₂ 6H ₂ 0 0.916g， H ₂ S0 ₄ 5 mL, 生物素（Biotin) 0.2 g)， 培养温度控制在 25 °C-30 °C， 用 28 %氨水调节 pH至 5.0， 设定初始转速为 400rpm， 初始通气量（无菌空气） 10 L/min， 设定溶氧为 96% 左右。菌体开始生长阶段， 耗氧量增加导致溶氧降低， 通过调节通气量和搅拌转速以及通 纯氧， 维持溶氧水平在 30 %以上。 培养至甘油耗尽 （20 -24h左右， 所需时间与初始接种 量和培养条件有关），此时溶氧、 pH上升。然后限制性地根据菌体生长状态流加� �� 12 mL/L PTM1的甘油，流加 2-30 小时； 再限制性地根据菌体生长状态变速流加含 12 mL/L PTM1 的甲醇， 用气相色谱检测控制甲醇终浓度维持在 0.5〜1.0%， 直到发酵结束， 甲醇诱导表 达周期维持 48〜96小时之间， 温度控制在 20°C -30°C， 优选 22°C； pH值用氨水控制在 4-6 之间。 发酵结束后， lOOOOrpm, 离心收集发酵液上清， -20 °C保存备用。

粗纯化： 取发酵液在 4°C下 12000rpm离心 10分钟， 弃沉淀， 收集上清。 将收集的 上清调 pH到 8.0， 通过 Ni螯合层析柱纯化回收 DesB30前体。 平衡液条件为 20 mmol/L Trisl-HCk 300 mmol/L NaCl、 pH8.0， 洗脱液条件为 20 mmol/L Tris-HCl 、 50 mmol/L咪 唑、 300 mmol/L NaCl、 pH8.0; 洗脱的目的蛋白用 A液稀释三倍后， 再进行 Source 30Q 纯化， 流动相 A液为 20 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 流动相 B 液为 20 mmol/L Tris-HCl、 1000 mmol/L NaCl (pH8.0)， 0-100%的 B液线性洗脱， 收集含 DesB30前体的洗脱峰 (图 1A)。

DesB30前体酶切： Source 30Q洗脱蛋白加入按质量比 1 : 1000的胰酶 （Trypsin, 购 于 Novagen公司）， 调节 pH7.5-8.0， 室温缓慢搅拌 12小时， 酶切效率不低于 90% (图 1B)。

精纯化： 酶切后样品用反相制备型 C18柱 （Gehealthcare公司） 进一步纯化， 流动 相 A液为 0.1%三氟乙酸和 5%乙腈， 流动相 B 液为 0.1%三氟乙酸和 95%乙腈， 0-100% 的 B液线性洗脱， 收集含人胰岛素类似物 DesB30的洗脱峰。 获得的 DesB30重组人胰岛 素经 RP-HPLC (Waters公司 C18柱， 流动相 A液为 0.1%三氟乙酸和 5%乙腈， 流动相 B 液为 0.1%三氟乙酸和 95%乙腈， 流速 lml/min、 0-100%B线性洗脱） 分析纯度为 98.1% (图 1C)， MALDI-TOF质谱 (Applied Biosystem, 4800型) 测定分子量为 5705.56， 与 理论值一致。

实施例 2.重 胰岛素类似物偶联物 (DesB30-5K)的制备

取浓度为 2mg/ml 的重组人胰岛素类似物 (DesB30)溶液 100ml (含 20 mmol/L Tris-HCl),调节 pH到 10.5，室温下 lOOrpm搅拌，首先按重组人胰岛素类似物与 mPEG-SPA 的摩尔质量比为 1： 1.5 加入 mPEG-SPA (分子量为 5K， 购于北京健凯科技有限公司）， 反应 30分钟后， 再按上述摩尔质量比例加入 mPEG-SPA， 继续反应 30分钟， 用 1%的三 氟乙酸调节 pH到 3.0终止反应， 所得产物经反相制备型 C18柱层析， 以分离除去未修饰 的 DesB30、 游离 PEG分子、 非 B29位修饰的其它偶联物 （层析图谱如图 2A所示， 其中 用箭头标出的峰是收集的 B29位修饰产物）。 分离条件为： A液为 0.1%三氟乙酸和 5%乙 腈， B 液为 0.1%三氟乙酸和 95%乙腈， 线性梯度洗脱收集 DesB30-5K偶联物， 该偶联物 经冷冻干燥成干粉保存 （图 2D)。

实施例 3.重 胰岛素类似物偶联物 (DesB30-10K)的制备

取浓度为 2mg/ml 的重组人胰岛素类似物 (DesB30)溶液 100ml (含 20 mmol/L Tris-HCl),调节 pH到 10.5，室温下 lOOrpm搅拌，首先按重组人胰岛素类似物与 mPEG-SPA 的摩尔质量比 1： 2 加入 mPEG-SPA (分子量为 10K, 购于北京健凯科技有限公司）， 反 应 30分钟后， 再按上述摩尔质量比例加入 mPEG-SPA， 继续反应 30分钟， 用 1%的 TFA 调节 pH 到 3.0 终止反应， 所得产物经反相制备型 C18 柱层析， 以分离除去未修饰的 DesB30、 游离 PEG分子、 非 B29位修饰的其它偶联物 （层析图谱如图 2B所示， 其中用 箭头标出的峰是收集的 B29位修饰产物）。分离条件为： A液为 0.1%三氟乙酸和 5%乙腈， B液为 0.1%三氟乙酸和 95%乙腈， 线性梯度洗脱收集 DesB30-10K偶联物， 该偶联物经 冷冻干燥成干粉保存 （图 2D)。

实施例 4.重 胰岛素类似物偶联物 (DesB30-20K)的制备

取浓度为 2mg/ml 的重组人胰岛素类似物 (DesB30)溶液 100ml (含 20 mmol/L Tris-HCl),调节 pH到 10.5，室温下 lOOrpm搅拌，首先按重组人胰岛素类似物与 mPEG-SPA 的摩尔质量比 1： 2.5 加入 mPEG-SPA (分子量为 20K, 购于北京健凯科技有限公司）， 反 应 30分钟后， 再按上述摩尔质量比例加入 mPEG-SPA， 继续反应 30分钟， 用 1%的 TFA 调节 pH 到 3.0 终止反应， 所得产物经反相制备型 C18 柱层析， 以分离除去未修饰的 DesB30、 游离 PEG分子、 非 B29位修饰的其它偶联物 （层析图谱如图 2C所示， 其中用 箭头标出的峰是收集的 B29位修饰产物）。分离条件为： A液为 0.1%三氟乙酸和 5%乙腈， B 液为 0.1%三氟乙酸和 95%乙腈， 线性梯度洗脱收集 DesB30-20K偶联物， 该偶联物经 冷冻干燥成干粉保存 （图 2D)。

实施例 5.重¾A胰岛素（InsiiHn)的制备

反应体系为： 10 mmol /L DesB30胰岛素前体（实施例 1中经过 Source 30Q粗纯化所 得）， 200 mol/L TPCK处理的胰蛋白酶和 0.8 mol/ L Thr(tBu)-OtBu、 7.0 mmol/ L CaCl ₂ 、 50% 二甲基亚砜 /乙醇 1 :1 (v/v) 和 26%的水， 用醋酸调 pH 至 6.0 ， 该体系在 12°C 反应 24 ho 然后加丙酮（用等体积的浓盐酸酸化）使蛋白 沉淀， 用制备型反相 C18柱分离 B30 Thr(tBu)-OtBu人胰岛素， 然后用三氟乙酸 (TFA)去保护基。再经阳离子（SP Sepharose FF) 层析， 平衡液为 20 mmol/L NaAC (pH3.0)， 洗脱液为 20 mmol/L Na ₂ HP0 ₄ (pH9.5 )， 获 得纯度大于 98.0%的重组人胰岛素。 经 MALDI-TOF质谱测定分子量为 5824.66， 与理论 值一致。

实施例 6.重 胰岛素偶联物 (Ins-5K 、 Ins-IOK 、 Ins-20K)的制备

重组人胰岛素偶联物 （Ins-5K) 的制备， 方法同实施例 2， 经制备的 Ins-5K偶联物 的纯度大于 98.0%。

重组人胰岛素偶联物 （Ins-IOK) 的制备， 方法同实施例 3， 经制备的 Ins-IOK偶联 物的纯度大于 98.0%。

重组人胰岛素偶联物 （Ins-20K) 的制备， 方法同实施例 4， 经制备的 Ins-20K偶联 物的纯度大于 98.0%。

实施例 7.重 ^ax胰岛素偶联物修饰位点的分析

目的： 为了证明实施例中制备的偶联物 Ins-5K、 Ins-10K、 Ins-20以及 DesB30-5K 、 DesB30-10K和 DesB30-20K的修饰位点仅是重组人胰岛素 B链的第 29位赖氨酸侧链氨 基， 通过选用专一性强的 V8 酶， 进行质量肽图分析， 该酶特异性酶解 Glu残基的 C端 肽键。分别对未修饰胰岛素和修饰后胰岛素偶 联物的酶切肽图液质分析，并结合修饰肽段 的氨基酸序列分析， 从而确定修饰位点及位点的专一性。

方法： 将 DesB30 和 DesB30-20K 两种样品冻干除盐后用 1%NH ₄ HC0 ₃ 溶解成 2mg/ml， 每个样品取 0.9ml， 再补入 5(^L V8酶 （质量比 1 : 50， sigma公司）， 37°C反应 24小时。 再补入 0.4M TCEP ΙΟμΙ^ ， 37°C反应 30min， 经 RP-HPLC液质 （Agilent 1100) 分析二者的质量肽图， 记录每个峰的保留时间和分子量。

分析： 通过对 DesB30 (图 3A) 禾 B DesB30-20K (图 3B) 还原肽图比较分析发现， 下表 1中的序号为 6的肽段 RGFFYTPK在 DesB30-20K还原肽图中消失， 其它相应 5个 肽段在两者的还原肽图中完全一致。 DesB30-20K还原肽图中出现的 42.834分钟的肽段为 被 PEG修饰了的肽段（该肽段用蒸发光检测为 PEG化物质）， 证明 PEG修饰位点位于该 片段上。

表 1

随后采用半制备型 C18柱 RP-HPLC色谱（Gehealthcare公司）纯化保留时间为 42.834 分钟的肽段， 并委托中科院上海生化所对该肽段进行氨基酸 测序分析。 测序结果为： RGFFYTPX, 其中 X表示未测出的氨基酸， 表明该片段中 Lys被 PEG化。 该结果证明 DesB30-20K修饰位点仅为 B29的氨基酸。采用同样方法分析了其他 5种偶联物（Ins-5K、 Ins-10K、 Ins-20K DesB30-5K和 DesB30-10K)， 均获得相同结论。

实施例 8.在小鼠 I型糖尿病模型中降血糖实验

取健康昆明种雄性 SPF级小鼠（购自第三军医大学实验动物中心 )70只，体重 25-30g， 禁食不禁水 14小时， 以剂量 120mg/kg快速腹腔注射用柠檬酸 -柠檬酸三钠缓冲液配制好 的链脲霉素 （STZ) 溶液 （4.8mg/ml)， 建立 I型糖尿病模型， 注射后立即给伺料和水。 造模 48小时后， 尾静脉取血， 用血糖仪检测禁食 2h后的血糖值（拜耳快速血糖仪测定）， 血糖值 11. lmmol/L为造模成功。取成模小鼠 40只，随机分为 4组，每组 10只（ A组 模 型对照、 B组 DesB30-5K、 C组 DesB30-10K、 D组 DesB30-20K)， B、 C、 D组分别都 以剂量 0.25 mg/kg皮下给药， A组注射等体积溶媒。给药前（即 0小时）和给药后的第 1、 2、 6、 10、 15、 18、 24小时分别取尾静脉血测定空腹 （禁食 2小时） 血糖值， 计算平均 血糖值后绘制时效曲线 （图 4)。

结果显示， DesB30-5K、 DesB30-10K、 DesB30-20K均有明显的降血糖作用。 其中

DesB30-5K 的降血糖可维持 8 小时左右， DesB30-10K 的降血糖可维持 12 小时左右， DesB30-20K的降血糖可维持 18小时左右。 重组人胰岛素偶联物 （Ins-5K、 Ins- 1 OK, Ins-20K)在昆明小鼠 I型糖尿病模型上持 续降血糖的实验方法同上， 计算平均血糖值后绘制时效曲线 （附图 5 )。 结果显示， 其中 Ins-5K的降血糖可维持 8小时左右， Ins-IOK的降血糖可维持 12小时左右， Ins-20K的降 血糖可维持 18小时左右。

实施例 9.在家兔 I型糖尿病模型（IDDM) 中降血糖实验

取雄性新西兰大耳白兔 （购自第三军医大学实验动物中心） 40只， 体重 2-3kg， 禁 食不禁水 24h， 以 5ml/kg剂量一次性耳缘静脉注射四氧嘧啶溶液（ 浓度为 20mg/ml)造模， 注药后立即给伺料和水。造模 3天后， 每天耳缘静脉取空腹 6h血， 用血糖仪测定血糖值， 血糖值 11. lmmol/L为造模成功。 取成模兔 24只， 每组 6只， 随机分为 4组 （ A组模型 对照、 B组 DesB30-5K、 C组 DesB30-10K组、 D组 DesB30-20K)， B、 C、 D组分别都 以剂量 0.2mg/kg皮下给药， A组注射等体积溶媒。 给药前 （即 0小时） 和给药后的第 1、 2、 4、 8、 12、 24、 36、 48、 60、 72、 84、 96 小时分别取耳静脉血测定空腹 6h的血糖值 (拜耳快速血糖仪测定），计算平均血糖值后� �制时效曲线（图 6)。结果显示， DesB30-5K、 DesB30-10K、 DesB30-20K在家兔 I型糖尿病模型 （IDDM) 上均有明显的降血糖作用。 其中 DesB30-5K的降血糖作用可维持 15小时， DesB30-10K的降血糖作用可维持 30小时 左右， DesB30-20K的降血糖作用可维持 55小时左右。

重组人胰岛素偶联物 （Ins-5k、 Ins- 10k, Ins-20k) 在兔 I型糖尿病模型 （IDDM) 上 持续降血糖实验方法同上，计算平均血糖值后 绘制时效曲线（图 7)。结果显示，其中 Ins-5K 的降血糖作用可维持 15小时左右， Ins-IOK的降血糖作用可维持 35小时左右， Ins-20K 的降血糖作用可维持 55小时左右。

实施例 10.与胰岛素受体结合率测定

大鼠肝胰岛素受体提取和受体结合率测定参照 文献进行 （Sinha MK.Subunit structure, autopho sphorylation, and tyrosine-specific protein kinase activity of hepatic insulin receptors in fetal, neonatal, and adult rats.Diabetes,1987;36(l):1161 )：在 4°C取 2周龄大鼠（购 自第三军医大学实验动物中心）肝组织 200g， 加入缓冲液 A (25 mmol/L (4-羟乙基哌嗪 乙磺酸， 即 Hepes) ,0.25 mol/L Sucrose (蔗糖）， 5 mmol/L EDTA-Na 10 mmol/L PMSF) 制成匀浆， 2000xg离心 10min， 吸取上清液， 再 50000xg离心 45min后， 取沉淀物加入 缓冲 A， 混匀后加入 10:1 的溶解液 （2mg/ml Bacitracin (杆菌肽素）， 2mmol/L PMSF, 2%Triton X-100) ，37°C孵育 30min， 120000xg离心 30min， 吸取上清液。 用麦胚琼脂糖 (WGA-Sepharose) 3.0ml预装柱， 将洗涤液 （含 25mm/L Hepes, 0.05% Triton X-100, lOOmm/L NaCl, 2.5mmol/L KCL， 1.0 mmol/L CaCl ₂ )洗涤层析柱。用洗脱液（含 0.3 mmol/L N-乙酰葡萄糖胺， 10%丙三醇） 洗脱， 洗脱后以 Lowry法测定大鼠肝胰岛素受体蛋白浓 度并调整为 2.0mg/ml。 随后在 7个微量离心管中建立如下的反应体系 （表 2): 其中 I ¹²⁵ 胰岛素购于中国原子能研究中心， 结合缓冲液含有 25 mmol/L Hepes、 0.05%Triton X-100 和 0.1% BSA。 4°C反应 16小时后加入 0.04%γ -球蛋白 100μ1， 20%聚乙二醇（8000) 400ul， 混匀后 12000xg离心 30min后去上清， 用 γ-闪烁计数仪中测定各管放射性强度 cpm值， 分别从第 1至 6管的 cpm值减去第 7管的 cpm值 （非特异性和本底 cpm值）， 得到特异 结合的 cpm值。 将各管的特异性结合 cpm值除以总 cpm值， 得到与受体结合的胰岛素所 占的份额， 该值乘以各管中的胰岛素浓度， 即得配体 -受体复合物的浓度 （HR)， 从管中 的胰岛素浓度减去配体-受体复合物， 得到游离配体浓度 （H)， 最后将 HR和 H作斯卡查 德图 （Scatchard), 以重组人胰岛素 Ins (中国生物制品鉴定所重组人胰岛素标准品， 每支 20mg) 与受体结合率为 100%， 计算出其它每一种重组胰岛素偶联物与受体的 结合率。

表 2

经计算的各种重组人胰岛素偶联物与胰岛素受 体的结合率如表 3所示。

表 3

实施例 ll.DesB30-20k偶联物在 Beagle犬 I型糖尿病模型中降血糖实验

取健康 Beagle犬 （购自第三军医大学实验动物中心） 20只， 体重 5-8kg， 禁食不禁 水 24h，以 50mg/kg和 30mg/kg的剂量在前肢皮下静脉分别推注四氧嘧� �溶液 (200mg/ml) 和 STZ溶液 (120mg/ml)， 建立 I型糖尿病模型， 注射后立即给伺料和水。造模 72小时后， 多食、 多饮、 多尿、 体重减轻， 后肢静脉血糖值^ ^!!^!^为造模成功。 取成模犬 12 只， 随机分为 3组， 每组 4只 （ A组为对照组， B组给药剂量为 0.05 mg/kg、 C组给药剂 量为 0.10 mg/kg)， 皮下给药一次， 给药后的第 0、 2、 6、 12、 18、 24、 36、 48、 72、 96、 120小时分别取后肢静脉血测定空腹（禁食 6小时）血糖值（GOD-POD法）， 计算平均血 糖值后绘制单次给药时效曲线 （图 8)。 单次给药实验数据显示 DesB30-20k在 0.10 mg/kg 剂量能有效降血糖 72小时， 随后对模型实验动物进行多次给药实验， 间隔 72小时皮下给 药一次（给药剂量 0.05 mg/kg、 0.10 mg/kg、 等体积溶媒）， 连续给药 6次， 于给药后的第 1天至第 21天期间， 每三天测定一次空腹血糖值， 于末次给药后取血做药代动力学实验。 结果显示： DesB30-20K在 Beagle犬 I型糖尿病模型上的降血糖作用明显，量效关� �显著， 单次和多次给药后的降血糖作用持续时间基本 一致， 均可维持在 72小时； 连续多次给药 期间给药组动物空腹血糖值平均维持在 5mMol/L左右， 而对照组动物空腹血糖值平均维 持在 25 mMol/L左右。

实施例 12.重 胰岛素 DesB30-20K偶联物在犬中药代动力学实验

实施例 11单次给药实验中给药后第 0、 2、 6、 12、 18、 24、 36、 48、 72小时和多次 给药实验中第 6次给药后第 0、 2、 6、 12、 18、 24、 36、 48、 72小时分别取血， 用犬胰岛 素的放免试剂盒 （购于北京北方生物研究所） 测定和计算 4 只犬平均血药浓度， 采用 DAS2.0 软件计算药代动力学参数、 绘制血药浓度曲线 （附图 9、 附图 10)。

实验结果表明， DesB30-20K单次给药后的消除半衰期 （t _1/2 ) 的时间为 9.2h， 药时曲 线下面积 （AUC) 为 15215.8 μΐυ/ηι1*1ι ， 药峰浓度 （Cmax) 为 930.1 μΐυ/ηι1*1ι; 多次给 药后 （间隔 72小时给药 1次， 连续给药 6次） 的消除半衰期 （t _1/2 ) 的时间为 9.4h， 药时 曲线下面积 （AUC) 为 15391.6 μΐυ/ηι1*1ι ， 药峰浓度 （Cmax) 为 953.2 μΐυ/ηι1*1ι。 该药 代实验结果与降血糖药效实验结果相符， 证明 DesB30-20K具有体内半衰期长的特点， 且 间隔 72小时连续给药 6次， 在体内未出现 DesB30-20K药物累积效应。