CAMPO DE LA INVENCION La presente invención está relacionada con los principios y técnicas utilizadas en la

Biología Molecular para el desarrollo y construcción de dispositivos médicos y de diagnóstico, así como en la Microfluídica para el desarrollo de sistemas que permitan la manipulación de pequeñas cantidades de fluido, y más particularmente, está relacionada con un método de hibridación para la detección de ácidos nucleicos empleando partículas magnéticas funcionalizadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El diagnóstico médico se establece a partir de síntomas, signos y exploraciones complementarias que en la mayoría de los casos incluyen el análisis clínico o pruebas de laboratorio. Este análisis se apoya en el estudio de muestras biológicas y puede ser cuantitativo (determinación de concentración de analito) o cualitativo (decisión positivo/negativo) para apoyar al estudio, diagnóstico, prevención y tratamiento de diferentes patologías. Los análisis clínicos pueden ser bioquímicos, hemáticos, microbiológicos, genéticos, entre otros, y el resultado se encuadra dentro de valores de referencia establecidos para una población y requiere una interpretación médica.

En particular, los análisis bioquímicos miden las cantidades de analitos que los órganos y los tejidos producen, tales como los metabolitos, electrolitos, lípidos, proteínas, enzimas, entre otros. Los análisis inmunológicos detectan cuantitativamente antígenos y anticuerpos; mientras que los análisis de biología molecular utilizan métodos a partir de los ácidos nucleicos o caracterización genética. Las pruebas de detección de ácidos nucleicos son ideales para determinar la existencia de patologías tanto genéticas como no genéticas. Es decir, puede utilizarse como herramienta de diagnóstico o investigación de enfermedades tales como el cáncer (si los ácidos nucleicos están identificados como los biomarcadores oncológicos), así como para enfermedades ocasionadas por agentes infecciosos (por ejemplo, coronavirus (COVID-19), SIDA, hepatitis B y C, clamidia, toxoplasmosis, influenza, entre otras, siendo en este caso la secuencia de ácidos nucleicos el marcador específico de la enfermedad). Si bien el diagnóstico es un ámbito importante de aplicación de la prueba, han surgido nuevas oportunidades en las áreas de investigación de oncología molecular, farmacogenómica, virología, microbiología, genómica, entre otras.

Un escenario cada día más relevante de la detección de ácidos nucleicos para determinar patologías genéticas es el de los microRNAs (miRNAs). Los miRNAs se descubrieron hace aproximadamente 35 años y sus métodos de medición son aún muy inmaduros, igual que el conocimiento sobre sus funciones. Por estas razones la disponibilidad de un sensor que pueda adaptarse tanto a un chip como a un ensayo de medición in vitro, tendrá un impacto significativo en el mercado de tecnologías relacionadas a los miRNAs. Se considera a los miRNAs como moduladores biológicos clave, siendo una clase de RNA pequeños (17-25 nucleótidos), no codificantes, complementarios de RNA mensajero (mRNA), específicos de 3'-UTR. Los miRNAs, tras hibridar con el mRNA objetivo, modulan la expresión génica a través del silenciamiento del mRNA y por ende ajustan los niveles proteicos al inhibir la traducción. Además, se estima que los miRNAs regulan la expresión postranscripcional de aproximadamente el 70% de los genes humanos, por lo que desempeñan un papel fundamental en la regulación de casi todos los procesos fisiológicos y patológicos (Condrat et al., 2020, Engelmann et al., 2018, Castro-Magdonel etai, 2017, Galardi etal., 2019). Sólo por poner unos ejemplos, dentro de estos procesos patológicos se incluyen fallas cardíacas (Cruz et ai, 2020) e incluso infecciones virales. Aún más, se ha considerado como un enfoque prometedor la modulación específica de la expresión de ciertos miRNAs para futuras estrategias antivirales (Engelmann etal., 2018). Sin embargo, los miRNAs han despertado un especial interés en áreas como oncología, pues la expresión aberrante de miRNA está presente en casi todos los tipos de tumores, incluidos los pediátricos.

Es posible obtener muestras de miRNA de forma no invasiva dado que éstos pueden ser transportados por exosomas, que son un tipo de vesículas presentes en diferentes fluidos biológicos (Galardi etal., 2019 y Castro-Magdonel et al., 2017). Además, los perfiles de expresión de miRNAs de alto rendimiento son más sensibles para discriminar diferentes tejidos humanos, que incluyen diferentes tipos de cáncer, que los perfiles de mRNA; inclusive, los perfiles de expresión de miRNA se modifican con las etapas progresivas del desarrollo tumoral (Castro-Magdonel et al., 2017).

Los miRNAs cumplen con criterios requeridos que los apuntalan como un biomarcador ideal: fácil acceso (miRNA exosómico), alta especificidad y sensibilidad (Condrat et al., 2020). A pesar de las limitaciones actuales (como la falta de protocolos estandarizados para su medición), hoy en día, se considera a los miRNA como una herramienta confiable para su uso como biomarcadores para diversas afecciones y se proyecta que se convertirán en un enfoque terapéutico de rutina por la posibilidad de desarrollar perfiles personalizados de pacientes (Condrat et al., 2020). Enfatizando lo anterior, el cáncer de mama provoca una alta mortalidad en mujeres de todo el mundo. Se ha señalado que una posibilidad por la que la incidencia de cáncer de mama incrementa cada año, a pesar de ser un padecimiento extensamente estudiado y de contar con herramientas avanzadas de diagnóstico y estrategias de tratamiento, es la falta de biomarcadores precisos y confiables para lograr el reconocimiento de este padecimiento en estadios ( medicina ) tempranos y con valores pronósticos y predictivos de metástasis. No obstante, se ha resaltado la importancia de diferentes miRNAs exosómicos como biomarcadores que cumplen con dichos requerimientos (Kashyap et al., 2020).

Un ejemplo del empleo de los miRNA para el estudio del cáncer, es el realizado en la detección de la retinoblastoma (Rb), un tumor maligno intraocular El estudio de este cáncer, (Castro-Magdonel et al., 2017) se ha realizado analizando los miRNAs circulantes en plasma como potenciales biomarcadores, la medición se realiza usando chips Affymetrix de muestras de plasmas congelados de casos y controles (pacientes afectados por retinoblastoma y controles sanos) como modelo de estudio. Con los perfiles de miRNAs obtenidos con la plataforma Affymetrix se identificaron una firma de 19 miRNAs que tienen todos los casos y que no tienen los controles. Sin embargo, el problema planteado por los autores es que no han podido validar todos estos miRNAs con la técnica estándar de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-qPCR). Para su validación se requiere de un método que no involucre amplificación enzimática, que sea robusto, pero de bajo costo (Castro-Magdonel et al., 2017). Debido al potencial aplicativo que en general tienen los miRNAs circulantes, existe la seria necesidad de desarrollar métodos de medición que no estén basados en amplificación enzimática, lo cual es importante en el desarrollo de biomarcadores accionables y acelerará el aspecto aplicativo de estas firmas. La relevancia fisiológica de los miRNAs indica que pierden su regulación en muchas enfermedades, por lo que es probable que sean informativos si están en circulación tanto en procesos fisiológicos como en procesos patológicos. Por otra parte, la detección de ácidos nucleicos adquiere particular relevancia en enfermedades infecciosas ocasionadas por virus, ya sean de DNA o de RNA, pues se ha vuelto esencial para determinar específicamente el tipo de virus que desarrolla una infección. La identificación de patógenos basada en la caracterización genética procede mucho más rápidamente que los métodos tradicionales virológicos, microscópicos o serológicos, particularmente, debido a la similitud de muchas de las proteínas que se encuentran en la membrana y cápside de las diferentes familias virales. Sin embargo, los métodos más comúnmente empleados para la detección e identificación molecular, como la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tienen un elevado costo y la complejidad práctica de la obtención y el análisis de muestras y de datos que han retrasado su aplicación en los diagnósticos clínicos, especialmente cuando se presentan emergencias de la envergadura del COVID-19. Como ejemplo de la importancia del desarrollo de métodos específicos y alternativos de detección molecular, se puede decir que los miembros de la familia Coronaviridae son virus de RNA de cadena positiva. Los viriones son esféricos, con un diámetro que va desde 120 hasta 160 nm y están envueltos en una membrana. Entre los virus del RNA, los Cov tienen genomas no segmentados excepcionalmente largos (hasta 32 kb) (Forni et al., 2017). Las membranas de todos los coronavirus contienen al menos tres proteínas virales. Estos son los que codifican a la espiga (S), la glucoproteína de tipo I que da al virus su morfología de corona en las imágenes de microscopía electrónica; la proteína de membrana (M), una proteína transmembranal; y, la proteína de membrana pequeña (E), una proteína altamente hidrofóbica (Gralinski et al., 2020). Estas proteínas estructurales están codificadas en un tercio del genoma, para todos los coronavirus, en el orden S-E-M-N. El reconocimiento de algunos de estos genes, permite la identificación temprana y específica del virus 2019-nCov.

Actualmente las pruebas que han sido usadas para diagnosticar, por ejemplo, la enfermedad COVID-19 producida por el virus SARS-CoV-2, son de dos tipos: pruebas moleculares y/o pruebas serológicas, en donde las: 1) pruebas moleculares se hacen principalmente por amplificación del material genético y que detectan fragmentos del material genético del virus y lo amplifican de manera que sea cuantificable, que pueden ser tres: a) por reacción en cadena de la polimerasa (PCR); b) isotérmica llamada LAM (lipoarabinomanano); y, c) aquella que utiliza el modelo de Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y regularmente interespaciadas de enzimas Cas9 (o CRISPR- CAS9, acrónimo en inglés de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats);

2) pruebas serolóqicas detectan la presencia de anticuerpos generados por el cuerpo como reacción a la infección por el virus.

De los dos tipos de pruebas antes mencionadas, la prueba de PCR es la única de las pruebas moleculares aceptadas por el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de los EEUU (o CDC, acrónimo en inglés de Center for Disease Control and Prevention), las otras dos aún están en investigación. Dicha prueba de PCR es muy específica, sólo identifica al virus causante del COVID-19 y puede detectar muy pocas copias, Por el contrario, las pruebas serológicas permiten diagnosticar la inmunidad a la enfermedad, es decir después de varios días después de la aparición de la enfermedad y pueden ser no tan específicas, ya que existen situaciones en las que el cuerpo reacciona de la misma forma que lo hace contra el virus SARS-CoV-2. Por esta razón se ha optado a nivel mundial usar las pruebas de PCR para realizar el diagnóstico del COVID-19.

En escenarios de alta demanda a nivel mundial y en la situación en la cual se tiene que diagnosticar en etapas tempranas de la enfermedad, como es el caso de la pandemia de COVID-19, se produce una escasez de los insumos necesarios para realizar este tipo de análisis. Aunado a esto, la técnica de PCR es una técnica costosa que requiere de personal altamente capacitado y equipo especializado que no resulta común en la mayoría de los hospitales.

Durante una pandemia, las estrategias públicas de contención y tratamiento derivan de una adecuada implementación del diagnóstico. Así, las pruebas que permiten el tamizaje rápido de una gran parte de la población aseguran, entre otras situaciones, la posibilidad de aislar oportuna y adecuadamente a los enfermos, proteger al personal de salud de manera rápida y eficaz, diferenciar el tipo de enfermedad respiratoria que presentan los pacientes, aumentar el diagnóstico poblacional para tener una clara idea del desarrollo de las fases epidemiológicas.

El método actual de diagnóstico de PCR, por sus requerimientos técnicos y su enorme demanda mundial, así como por la ventana de detección tardía y menos específica de las pruebas rápidas serológicas, dificultan la planificación y ejecución de las estrategias públicas de contención y tratamiento de los países. Es por ello que el desarrollo de pruebas rápidas que cumplan con las características de especificidad (por la detección de ácidos nucleicos), sensibilidad a etapas tempranas de la infección y economicidad, permitirán avanzar en este sentido. Por otro lado, en el estado de la técnica se encuentra la patente mexicana de patente No. 369,940 que describe y reclama un dispositivo biosensor para la detección y medición de biomoléculas (comercialmente denominado como “Sensor Versátil de Biomoléculas (SVB)”, cuyos inventores son los mismos que para la presente invención, en donde dicho dispositivo biosensor se basa las técnicas de la microfluídica o ingeniería de miniaturización y fue diseñado y desarrollado para detectar y medir biomoléculas (antígenos), el cual emplea una mínima cantidad de muestra que es no mayor a 15 microlitros o equivalentes a una o dos gotas de un fluido corporal que se selecciona del grupo comprendido por sangre, saliva, sudor, lágrimas, o cualquier otro fluido corporal que contenga la o las biomoléculas o antígenos a detectar. Como ya se mencionó, dicho dispositivo se emplea para la detección y cuantificación unitaria de una biomolécula o antígeno, en el que un usuario coloca una muestra de sangre que contiene dicho antígeno a detectar en un primer depósito, y por medio de un botón dicha muestra es movida o desplazada automáticamente hacia un segundo depósito a través de un microcanal que intercomunica a dichos primero y segundo depósitos para mezclarla con anticuerpos específicos de reconocimiento que previamente fueron colocados en el referido segundo depósito y marcados con fluoróforo para su detección, y dependiendo de la concentración de las biomoléculas de interés en la muestra, éstas se unirán a una determinada cantidad de anticuerpos, dejando libre el resto. Seguidamente, una micropartícula magnética que previamente fue colocada en un tercer depósito y funcionalizada con la misma biomolécula que se quiere detectar, además de haber bloqueado los espacios libres con albúmina sérica bovina, es movida o desplazada automáticamente hacia el segundo depósito a través del microcanal que intercomunica dichos segundo y tercero depósitos aplicando para ello campos magnéticos externos con medios de desplazamiento magnético, y en dicho segundo depósito se hace reaccionar la mezcla de muestra y anticuerpos con la micropartícula magnética, de tal manera que los anticuerpos específicos marcados que están libres, es decir, aquellos que no reaccionaron con las biomoléculas de la muestra se unirán a dicha micropartícula magnética. Posteriormente, la micropartícula magnética que lleva unidos a los anticuerpos es desplazada o movida con los medios de desplazamiento magnético de regreso al tercer depósito, y una vez que dicha micropartícula magnética se encuentra en dicho tercer depósito o zona de detección se hace la lectura de la medición obtenida. Debido a la alta eficiencia de funcionalización de las micropartículas magnéticas y a la reacción inversa de competencia con la biomolécula de la muestra, el dispositivo biosensor al utilizar el método de inmunodetección se hace tener un intervalo de detección muy amplio, desde concentraciones muy bajas hasta concentraciones muy altas, permitiendo el monitoreo de biomoléculas cuyas concentraciones varían significativamente en condiciones normales o patológicas.

Es importante señalar que en el estado de la técnica se encontraron documentos que describen cómo aislar, separar o extraer material genético (RNA o DNA), pero no describen como detectarlo sin que tenga que ser amplificado.

Hasta antes de la presente invención, nadie había desarrollado un método como el que aquí se describe y reclama que pueda leer o detectar material genético sin la necesidad de una posterior amplificación del mismo. De acuerdo con lo anterior, a continuación, se discuten algunos documentos de patente relacionados con la materia de la presente invención:

Patente japonesa No. JP3853161 B2 la cual describe cómo preparar una cantidad muy pequeña de ARNm que se puede aplicar a la producción de bibliotecas de ADNc, clonación por sustracción, producción / análisis de microarreglos y análisis de expresión génica. Provee un método de amplificación de aproximadamente 8 veces.

La solicitud de patente de los Estados Unidos Serie No. US 2015/0159202 A1 se refiere a un método para sintetizar ADNc, en secuencia, incluye recoger una célula individual completa de una muestra que contiene al menos una célula individual que tiene una membrana celular, lisar la membrana celular y extraer ácidos nucleicos de la célula, degradando el ADN del ácido nucleico extraído con DNasa, hibridando mRNA del RNA total contenido en la célula única completa con oligo (dT) fijado en un portador, realizando la transcripción inversa del mRNA hibridado con el oligo (dT) para fijar el ADNc derivado de la célula única en el vehículo, preparando así una biblioteca de ADNc derivada de una sola célula fijada en un vehículo, y amplificando el ADNc fijado en el vehículo. La patente china No. CN101892294 B describe un método basado en un sensor de electro quimioluminiscencia de beads magnéticas para detectar iones de mercurio y una aplicación de los mismos. En el método, se diseñan dos sondas, una es una sonda de captura que se etiquetará en la superficie de las beads magnéticas y formará una sonda de beads magnéticas; y la otra sonda se marca con tris (2,2'-bipihdil) rutenio (II) para formar una sonda de electro quimioluminiscencia. Como las dos sondas tienen estructuras de desajuste T:T, las dos sondas no pueden formar una estructura de doble hélice coincidente a temperatura ambiente en ausencia de iones de mercurio. El método de la invención tiene una alta especificidad y sensibilidad y facilita la medición cualitativa y la medición cuantitativa de iones de mercurio. Como puede verse, dicha invención, aun cuando utiliza beads magnéticas funcionalizadas, no es para detectar material genético, sino para atrapar mercurio con dichas beads magnéticas funcionalizadas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención está relacionada con un método de hibridación para la detección de ácidos nucleicos, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) extraer una muestra que contiene el material genético que se desea detectar, ya sea, DNA o RNA; (b) unir partículas magnéticas a una cadena de oligonucleótidos sintéticos, y, de tal manera que a la unión de la partícula magnética con la cadena de oligonucleótido sintético se le denomina reacción de funcionalización, obteniéndose partículas magnéticas funcionalizadas; (c) incubar la muestra que contiene el material a detectar (ácidos nucleicos, ya sea, DNA o RNA) con una sonda de oligonucleótidos de cadena complementaria con un mareaje fluorescente, a esta reacción se le denomina reacción de competencia y se refiere al proceso de hibridación en el que la cadena de ácidos nucleicos que se quiere detectar en la muestra al unirse a la sonda de oligonucleótidos de cadena complementaria marcados fluorescentemente; y (d) hacer reaccionar las partículas magnéticas funcionalizadas obtenidas en la etapa b) con la reacción de competencia obtenida en la etapa c), de tal manera que las sondas fluorescentes libres se unen a la cadena de oligonucleótidos sintéticos que se encuentra unida a las partículas magnéticas, formando así un conjunto de partículas magnéticas funcionalizadas que han sido marcadas fluorescentemente para ser detectadas, cuya cantidad se cuantificará con un medidor óptico de fluorescencia, esta etapa se denomina como reacción de detección.

Tanto la reacción de funcionalización como la reacción de competencia se llevan a cabo en un tiempo mínimo de 15 minutos y a una temperatura que va desde la temperatura ambiente hasta 70 ^e C. El método de hibridación se puede llevar a cabo en una variedad de dispositivos, su potencial de uso masivo en hospitales y clínicas a través de su implementación en placa de pozos o tubos y para realizarse como una prueba POCT en un dispositivo biosensor (SVB). Asimismo, dicho método de hibridación es compatible con las técnicas de miniaturización actuales y con los materiales convencionales usados en biochips de ensayos clínicos, como el SVB: asimismo, puede ser empleado en tubos de microcentrífuga o similares y/o para la detección masiva de casos, empleando la misma estrategia en placas multipozos de ELISA.

El método de hibridación de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el método presenta una versatilidad tal que le permite ser utilizado para medir más de un analito, en donde dicha medición puede ser unitaria o múltiple.

Debido a la alta eficiencia de funcionalización de las micropartículas magnéticas funcionalizadas y a la reacción inversa de competencia con la secuencia de ácidos nucleicos de la muestra, con el método de la presente invención es posible tener un rango de detección muy amplio, desde concentraciones muy bajas hasta concentraciones muy altas, lo cual permite el monitoreo de secuencias de RNA o DNA cuyas concentraciones varían significativamente en condiciones normales o patológicas.

El método de hibridación puede ser aplicado en investigaciones donde se requiera detectar ácidos nucleicos, así como en el ámbito clínico para realizar diagnósticos, proyecciones terapéuticas, para coadyuvar a la toma de decisiones de estrategias a implementarse en el sector salud.

El método de hibridación es funcional para la detección de: 1) microRNAs; y, 2) material genético viral de SARS-CoV-2 que ocasiona COVID-19.

El método de la presente invención se puede adaptar a su uso en el SVB, permitiendo su uso de manera masiva, aún en sitios remotos y/o de difícil acceso. Se constituirá en un dispositivo de diagnóstico personalizado de tipo “lab-on-chip” que podrá ser comercializado de concepto validado con muestras de pacientes para su posterior validación en un hospital. El dispositivo SVB es un lab-on-chip que ha mostrado ser capaz de detectar una o varias biomoléculas de interés (antígeno, anticuerpo, miRNA, y actualmente se prueba para la detección viral) en muestras de sangre total o fluidos como saliva u otros.

OBJETOS DE LA INVENCIÓN

Teniendo en cuenta los defectos y limitaciones de las técnicas antes descritas para la detección molecular, es un objeto de la presente invención proveer un método de hibridación que permite la detección de ácidos nucleicos directamente en muestras de pacientes empleando micropartículas magnéticas funcionalizadas.

Otro objeto de la presente invención es proveer el método de hibridación para la detección de ácidos nucleicos empleando partículas magnéticas funcionalizadas que puede ser aplicable a un dispositivo biosensor de construcción sencilla, pero altamente eficaz y seguro para detectar y cuantificar o medir desde sólo un tipo de biomolécula por hibridación (detección unitaria) hasta dos o más tipos de biomoléculas por hibridación (detección múltiple).

Un objeto adicional de la presente invención es proveer el método de hibridación para la detección de ácidos nucleicos empleando partículas magnéticas funcionalizadas que adicionalmente puede ser aplicado en dispositivos comunes de laboratorio como lo son los tubos de centrifugadora y las placas de multipozos, permitiendo cuantificar todas aquellas moléculas incluidas en fluidos corporales de cualquier especie de ser vivo o tomadas de superficies, y para las cuales haya o se pueda hacer una cadena de ácidos nucleicos iguales y complementarias y que la misma se emplee para funcionalizar las partículas magnéticas ya sea en escala micro o nano y para detectar, incluyendo, por ejemplo, todos los genomas virales, los miRNAs, las muestras de DNA o RNA para detección genómica, entre otros.

Sigue siendo un objeto más de la presente invención proveer el método de hibridación para la detección de ácidos nucleicos empleando partículas magnéticas funcionalizadas en el cual los medios de lectura de las mediciones obtenidas pueden ser un teléfono celular con cámara digital, un sistema óptico de detección fotosensible capaz de realizar la detección de múltiples longitudes de onda, o un microscopio óptico.

Los anteriores y otros objetos, características y ventajas del método de hibridación para la detección de ácidos nucleicos empleando partículas magnéticas funcionalizadas de la presente invención serán evidentes para un técnico en la materia a partir de la descripción detallada de ciertas modalidades y de los dibujos que se acompañan, así como de las reivindicaciones anexas. Más aún, los dibujos se emplean aquí para proporcionar una comprensión adicional de dichas ciertas modalidades y forman parte de la descripción, pero no constituyen una limitación de la presente invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS DE LA INVENCION Los aspectos novedosos que se consideran característicos de la presente invención, se establecerán con particularidad en las reivindicaciones anexas. Sin embargo, la invención misma, tanto por su organización, así como por su método de operación, conjuntamente con otros objetos y ventajas de la misma, se comprenderán mejor en la siguiente descripción detallada de las modalidades de la presente invención, cuando se lea en relación con los dibujos que se acompañan, en los cuales:

La figura 1 es una vista esquemática que muestra uno de los procedimientos de extracción de una muestra que contiene el material de ácidos nucleicos que se desean detectar, aplicando para tal objeto un método de hibridación de competencia para la detección de ácidos nucleicos empleando micropartículas magnéticas, el cual ha sido desarrollado de conformidad con una modalidad particularmente preferida de la presente invención.

La figura 2 es una vista esquemática que muestra las tres etapas del método de hibridación, en donde: (a) reacción de funcionalización; (b) reacción de competencia; y (c) reacción de detección.

La figura 3 es una vista esquemática que muestra el método de detección de ácidos nucleicos aplicado en un sensor versátil de biomoléculas, de conformidad con la modalidad particularmente preferida de la presente invención. La figura 4 es una vista esquemática que muestra el método procedimiento de detección aplicado en una placa de múltiples pozos, de conformidad con un aspecto adicional de la presente invención. La figura 5 son gráficos que muestran los resultados obtenidos en experimentos para la medición de miRNA, en los cuales: (A) resultados obtenidos con diferentes concentraciones de cDNA biotinilado (funcionalización); (B) la variación en la concentración de sondas marcadas fluorescentemente; y, (C) la sensibilidad muestra una curva de concentración de miRNA.

La figura 6 muestra imágenes de fluorescencia (emisión 480 nm) de la señal de las partículas magnéticas para la detección del gen RdRp2 específico del SARS-CoV-2, en las cuales: A) control negativo, ausencia de virus de reacción, representa la máxima captación de fluorescencia de la sonda; B) control positivo, presencia de la máxima cantidad de virus, representa la mínima captación de la sonda fluorescente; C) solución de baja concentración de virus, mayor fluorescencia de las partículas magnéticas; D) solución de concentración media de virus, fluorescencia media y E) solución de alta concentración de virus, baja fluorescencia de las partículas magnéticas. La figura 7 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos con la variación en la concentración de sondas marcadas fluorescentemente en diferentes números de beads.

La figura 8 es un gráfico de sensibilidad que muestra una curva de concentración de carga viral.

La figura 9 es un gráfico que muestra el resultado de muestras de coronavirus distintos al SARS-CoV-2. La figura 10 es un gráfico que ilustra los resultados de muestras de pacientes positivos provistas por el InDRE. La figura 11 es un gráfico que muestra el resultado obtenidos para muestras de pacientes negativos y positivos a COVID-19, provistas por el INER.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Desde hace más de una década, el desarrollo de nuevas soluciones para el diagnóstico se ha enfocado en el diseño de pruebas de tipo biosensor en el punto de atención (Point-of-Care Testing ~ POCT) para distribuir la medición en la población y centralizando la información en manos del médico y el sector salud en general. Por lo tanto, los sensores inteligentes de biomoléculas que usen pocas cantidades de muestra fisiológica de pacientes tienen el potencial de mejorar drásticamente la forma en la que se practica la medicina y de cambiar el enfoque de un tratamiento reactivo a un mantenimiento preventivo.

En razón de lo anterior, los inventores de la presente invención desarrollaron un método de hibridación para la detección de ácidos nucleicos empleando partículas magnéticas funcionalizadas, el cual es lo suficientemente sensible y versátil como para poder emplearlo en diversas aplicaciones tales como la detección y cuantificación de enfermedades no genéticas, por ejemplo, las infecciosas por entidades virales, así como para otras aplicaciones tales como la búsqueda de biomarcadores accionables, es decir, biomarcadores que posibilitan tomar acciones en favor de pacientes o de la población en etapas muy tempranas del desarrollo de la patología. Para los efectos de un mejor entendimiento de la presente invención, a continuación, se definen los siguientes términos que son utilizados a lo largo de la descripción detallada: El término “funcionalización” se utiliza en la presente invención para describir el proceso de cubrir partículas magnéticas con una molécula similar a la de un(os) analito(s) que se requiera(n) medir (ácido nucleico recombinante, sintético, DNA, RNA o proveniente de muestra biológica o superficie). El término “reacción de competencia” se utiliza en la presente invención para describir la reacción por hibridación de los analitos a medir (secuencia de ácido nucleico recombinante, sintético, DNA, RNA o proveniente de muestra biológica o superficie) con una(s) molécula(s) complementaria(s) como elemento(s) de detección (ácido nucleico marcado fluorescente o enzimáticamente), dejando libre una cantidad inversa a la concentración de la molécula a detectar.

El término “reacción de detección” se utiliza en la presente invención para describir la reacción por hibridación de partículas magnéticas funcionalizadas con elementos de detección libres, posterior o al mismo tiempo que la reacción de competencia, para posteriormente proceder a la detección de la marca emitida en las partículas magnéticas.

Es muy importante señalar que las anteriores definiciones de los términos utilizados a lo largo de la descripción detallada, así como en las reivindicaciones anexas, sólo se establecen para tener una comprensión más cabal de la invención, pero de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la misma, toda vez que las reacciones descritas forman parte del método de hibridación que se describe más adelante de conformidad con una modalidad particularmente preferida de la presente invención. Por lo tanto, debe observarse que la modalidad descrita aquí tiene únicamente la intención de ilustrar dicha presente invención, más no así para limitarla, y una persona experta en la materia puede diseñar modalidades alternativas con base en dicha modalidad descrita aquí, pero sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Como ya se mencionó en el apartado de antecedentes de la invención, la detección oportuna de ácidos nucleicos en la muestra que contiene el virus, ya sea DNA o RNA, causante de enfermedades infecciosas, adquiere particular relevancia, ya que se ha vuelto esencial para determinar específicamente el tipo de virus que desarrolla una infección. La identificación de patógenos basada en la caracterización genética procede mucho más rápidamente que los métodos tradicionales virológicos, microscópicos o serológicos, particularmente, debido a la similitud de muchas de las proteínas que se encuentran en la membrana y cápside de las diferentes familias virales. Asimismo, los métodos más comúnmente empleados para la detección e identificación molecular, así como la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tienen un elevado costo, aunado esto a la complejidad práctica de la obtención y el análisis de muestras y de datos que han retrasado su aplicación en los diagnósticos clínicos, especialmente cuando se presentan emergencias de la envergadura del COVID-19. Haciendo referencia a las figuras 1 a 3 de los dibujos que se acompañan, en ellas se ilustra el método de hibridación de competencia para la detección de ácidos nucleicos empleando micropartículas magnéticas, el cual se describe a continuación en total conformidad con una modalidad particularmente preferida de la presente invención, en donde dicho método de hibridación comprende las etapas de: a) extraer una muestra (1) que contiene el material que se desea detectar (ácidos nucleicos, ya sea, DNA o RNA), en donde la extracción se lleva a cabo conforme a las indicaciones procedentes para plasma, sangre, exudado, orina, por ejemplo, para una medición viral, la muestra (1) que contiene un virus (2) con el material genético a detectar debe ser puesta para este caso particular, pero no exclusivamente, en una solución comercial de Trizol™ (solución comercial de isotiocianato de guanidina-fenol) (3), la reacción rompe la membrana y la cápside viral (4) por lo que deja expuesta la muestra (1) que contiene el material genético a detectar; para la obtención de miRNA u otro material de DNA o RNA, así como todas las muestras que ya cuentan con material genético disponible a detectar y para las cuales no será necesario utilizar este paso en Trizol™, siguiéndose los procedimientos estándares ya publicados para células, exornas, entre otros; b) unir partículas magnéticas (5) que pueden ser de tamaño nano o micro, preferiblemente micropartículas, con una cadena de oligonucleótidos sintéticos (6), en donde la superficie de dichas micropartículas magnéticas (5) se encuentra recubierta preferiblemente con una proteína (7), y todavía más preferiblemente con estreptavidina, y en la presente invención se prefiere, pero no se limita a que dicha cadena de oligonucleótidos sintéticos (6) se encuentren con un mareaje de biotina (8), en donde dicha biotina (8) coadyuva a la conjugación del oligonucleótido (6) con ella misma y así poder unirse a la estreptavidina (7); a la unión (9) de estreptavidina (7) con biotina (8) se le denomina reacción de funcionalización (10) en donde dicha unión es como un puente entre el oligonucleótido (6) y la partícula magnética (5), y dicha reacción de funcionalización se lleva a cabo a temperatura y tiempo óptimos que son determinados para cada caso en específico, ya que la interacción entre estreptavidina (7) y biotina (8) es muy fuerte y conocida como estable en amplios rangos de temperatura abajo de 70 ^e C, por lo que en la presente invención la reacción de funcionalización se lleva a cabo en un tiempo para este caso de 15 minutos y a una temperatura que va desde la temperatura ambiente hasta 70 ^e C, obteniéndose micropartículas magnéticas funcionalizadas (11), tal como se puede apreciar de manera más específica en la figura 2(a); c) incubar la muestra (1) que contiene el material a detectar (ácidos nucleicos, ya sea, DNA o RNA) con una sonda de oligonucleótidos de cadena complementaria (12) preferiblemente con un mareaje fluorescente, y más preferiblemente con un fluoróforo (13) o una enzima o de cualquier otro tipo de mareaje, siempre que éste permita una señal medible, a esta reacción se le denomina reacción de competencia (14) y se refiere a un proceso de hibridación (15) en el que la cadena objetivo o blanco de ácidos nucleicos que se quiere detectar en la muestra (1), al unirse a la sonda de oligonucleótidos de cadena complementaria marcados fluorescentemente (12) forma un par sonda-blanco (16) , en donde dicha reacción de competencia (14) se lleva a cabo en un tiempo para este caso de 15 minutos y a una temperatura que va desde la temperatura ambiente hasta 70 ^e C, y dependerá de las características del constructo de oligonucleótidos; además, en función de la cantidad de material a detectar, una cantidad conocida de sonda fluorescente (12) queda como sonda fluorescente libre (17), tal como se aprecia de manera más específica en la figura 2(b); d) hacer reaccionar las micropartículas magnéticas funcionalizadas (11) con el par sonda-blanco (16) obtenido en la reacción de competencia (14), de tal manera que las sondas fluorescentes libres (17) se unen a la cadena de oligonucleótidos sintéticos (6) que se encuentra unida a las micropartículas magnéticas (5), formando así un conjunto de micropartículas magnéticas funcionalizadas que han sido marcadas fluorescentemente (18) para ser detectadas, cuya cantidad se cuantificará con un medidor óptico de fluorescencia, esta etapa se denomina como reacción de detección (19), tal como se puede apreciar de manera específica en la figura 2(c).

El método de hibridación a de la presente invención se puede llevar a cabo en una variedad de dispositivos, su potencial de uso masivo en hospitales y clínicas a través de su implementación en placa de pozos o tubos y para realizarse como una prueba POCT en el dispositivo biosensor (SVB). En todos ellos, se puede emplear para las siguientes mediciones:

- Método de detección único, cuyo propósito es el de realizar la detección y medición de una sola secuencia de ácidos nucleicos, y - Método de detección múltiple, con el cual se podrán detectar y medir en el mismo dispositivo varias secuencias de ácidos nucleicos, dos o más secuencias, dependiendo de los marcadores; fluoróforos convencionales, puntos cuánticos o Quantum Dots (qdots), entre otros, que se utilicen para su detección.

Es importante señalar que el método de hibridación de competencia de la presente invención es compatible con las técnicas de miniaturización actuales y con los materiales convencionales usados en biochips de ensayos clínicos, como el SVB. De igual manera, puede ser empleado en tubos de microcentrífuga o similares y/o para la detección masiva de casos, empleando la misma estrategia en placas multipozos de ELISA. Además, su versatilidad permite que se pueda utilizar para medir más de un analito, en donde dicha medición puede ser unitaria o múltiple.

Así pues, el método de hibridación de competencia de la presente invención es aplicable en investigaciones donde se requiera detectar ácidos nucleicos, así como en el ámbito clínico para realizar diagnósticos, proyecciones terapéuticas, para coadyuvar a la toma de decisiones de estrategias a implementarse en el sector salud.

En la figura 4 de los dibujos que se acompañan se ilustra de manera esquemática la aplicación del particular del método de hibridación de competencia para la detección de ácidos nucleicos que en la presente invención se prefiere, pero no se limita a que sea en un sensor versátil de biomoléculas (100), para lo cual, las micropartículas magnéticas funcionalizadas (11) se colocan en una primera sección de reacción o pozo de funcionalización (101); en una segunda zona de reacción o pozo de competencia (102) se coloca la solución de competencia (14) que, como ya se describió, está compuesta por la cadena de ácidos nucleicos que se quiere detectar en la muestra (1) y por la sonda de oligonucleótidos de cadena complementaria marcados fluorescentemente (12), además de oligonucleótidos libres (17), es decir, aquellos que no reaccionaron con las contrapartes de la muestra (1), para posteriormente mover dichas micropartículas magnéticas funcionalizadas (5) desde el pozo de funcionalización (101) hacia dicho pozo de competencia (102) a través de un primer microcanal (103), utilizando para tal fin un medio de desplazamiento (104) que se selecciona de entre un medio mecánico, un electroimán o cualquier otro dispositivo que permita el desplazamiento de una zona a otra, utilizándose preferiblemente un electroimán como medio de desplazamiento (104), en dicho pozo de competencia (102) se realiza la unión de las sondas de dichos oligonucleótidos libres (17) a su oligonucleótido contraparte unido a la micropartícula (16). Realizada esta reacción, las micropartículas magnéticas funcionalizadas (5) son nuevamente desplazadas por medio del electroimán (104) y a través de un segundo microcanal (105) hacia una tercera zona de reacción o pozo de detección óptica (106) en donde se llevará a cabo la detección colorimétrica o de fluorescencia. Cabe señalar que tanto el primero (103) como el segundo (105) microcanal que comunican cada pozo se encuentran llenos con fluido.

Una vez que las micropartículas magnéticas funcionalizadas y marcadas fluorescentemente (18) se hallan en la tercera zona o pozo de detección óptica (106), una fuente de luz (no mostrada en las figuras) irradia dicho pozo de detección óptica (106) y excita los fluoróforos (13) que se encuentran en las sondas marcadas fluorescentemente (16) unidas a dichas micropartículas magnéticas funcionalizadas y marcadas fluorescentemente (18), y en respuesta, éstas últimas emiten luz en otra longitud de onda, que será captada por un detector óptico (no mostrado en los dibujos) que incluye un filtro óptico adecuado para recolectar la luz emitida. En este caso, los detectores pueden ser una cámara, un teléfono celular con cámara “smartphone”, una cámara CCD, un fotodiodo, una fotorresistencia, un microscopio con cámara, o cualquier detector que permita detectar luz y/o una imagen y cuantificar la intensidad. Esto es, la luz detectada es proporcional al número de sondas de oligonucleótidos libres (17) que quedaron en las micropartículas magnéticas funcionalizadas y marcadas fluorescentemente (18), esto es, aquellas que no reaccionaron con el material, DNA o RNA, de la muestra (1). Mientras más intensa es la luz detectada, mayor es el número de sondas de oligonucleótidos libres (17) unidas a dichas micropartículas magnéticas funcionalizadas y marcadas fluorescentemente (18), y por lo tanto menor la cantidad de RNA o DNA buscado en la muestra (1).

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, el método de hibridación de competencia que se ha descrito conforma a la modalidad particularmente preferida de la presente invención, se emplea para medir o detectar una sola secuencia de ácidos nucleicos, esto es, se aplica el método de detección único.

Debido a la alta eficiencia de funcionalización de las micropartículas magnéticas funcionalizadas y marcadas fluorescentemente (18) y a la reacción inversa de competencia con la secuencia de ácidos nucleicos de la muestra (1), con este método es posible tener un rango de detección muy amplio, desde concentraciones muy bajas hasta concentraciones muy altas, lo cual permite el monitoreo de secuencias de RNA o DNA cuyas concentraciones varían significativamente en condiciones normales o patológicas y secuencias virales. En un aspecto adicional del método de hibridación de la presente invención, es posible la detección múltiple de secuencias de ácidos nucleicos, por lo menos dos secuencias, para lo cual se emplea la misma técnica y zonas de reacción en pozos que las utilizadas en la aplicación del método en el SVB. La reacción se repite tantas veces como secuencias de ácidos nucleicos se pretenden detectar, y se encuentran únicamente limitadas por la relación volumen total de una muestra (1’) y la dimensión de unos canales de transporte. Es decir, para la detección múltiple, unas micropartículas magnéticas (5’) son funcionalizadas con sondas de secuencia de ácidos nucleicos iguales a las que se quiere medir o detectar, unas soluciones de competencia (14’) que están marcadas con un fluoróforo (13’) o enzima, deben cada una de ellas tener, en su caso, diferentes fluoróforos específicos.

En este caso, es importante resaltar que las longitudes de onda de los fluoróforos (13’) o reacciones de color empleadas, se encuentran con una separación tal que permiten detectar tres, cuatro o cinco secuencias de ácidos nucleicos diferentes, dado que las propiedades de la luz permiten que estos fluoróforos (13’) sean excitados en una longitud de onda específica y emitan en otra longitud de onda (corrimiento de Stokes), y consecuentemente, no se traslapa la señal detectada. Un fluoróforo que se excita en 488 nanómetros, emite en 510 nanómetros; otro fluoróforo que se excita en 510 nanómetros, emite en 560 nanómetros; y un tercer fluoróforo más que se excita en 590 nanómetros, emite en 640 nanómetros. Estas características de los fluoróforos (13’) permiten realizar una medición múltiple con el mismo método sencillo de reacción y detección, utilizando el mismo dispositivo, con los mismos emisores y detectores. Efectivamente, el tipo de detector óptico en este caso es capaz de discriminar entre longitudes de onda, como lo puede hacer la gran mayoría de los fotodetectores actuales, con o sin filtros.

Ahora bien, haciendo referencia más específica a la figura 4 de los dibujos que se acompañan, en ellas se muestra esquemáticamente la aplicación del método de hibridación de competencia en una placa de múltiples pozos (300). Esta detección se puede realizar en tubos, en placas con pozos de reacción y en un chip microfluídico como el sensor versátil de biomoléculas, entre otros. La reacción de funcionalización (10’) de las micropartículas magnéticas (5’) se realiza en cada pozo (301) colocando las partículas magnéticas (5’) con recubrimiento de estreptavidina (7’) y los oligonucleótidos conjugados con biotina(8’), la reacción de funcionalización (10’) se realiza en un tiempo de al menos 15 minutos y a una temperatura que va desde la temperatura ambiente hasta 70 ^e C, obteniéndose las micropartículas magnéticas funcionalizadas (11’), de tal manera que este mismo procedimiento se puede realizar en tubos u otro contenedor y al finalizar la colocación en cada pozo (301) de la placa (300). Una vez obtenida la solución de competencia (14’), el líquido que proviene de ésta se toma y se coloca en cada uno de los pozos (301) de la placa (300). Así, las sondas de oligonucleótidos marcadas fluorescentemente que se encuentran libres (17’) reaccionan tal como se describió anteriormente para el método de aplicación único, esto es, se unen a los oligonucleótidos complementarios para obtener micropartículas magnéticas funcionalizadas y marcadas fluorescentemente (18’) por complementariedad de bases. Una vez que este proceso termina, se coloca un electroimán (104’) en la parte inferior de la placa (300) para proceder a un lavado (302) sin remover ni desplazar las micropartículas magnéticas funcionalizadas y marcadas fluorescentemente (18’).

Por otro lado, para demostrar la funcionalidad del método de hibridación de competencia de la presente invención, se llevaron a cabo dos pruebas conceptuales realizadas en placas multipozos de ELISA, a saber: 1) detección de microRNAs (miR- 3613); y, 2) detección de fragmentos de material genético (E y RdRp2) de virus SARS-

CoV-2 que ocasiona COVID-19.

• Resultados para miRNAs:

Como ya ha sido señalado, el modelo tomado en el desarrollo de esta invención, para el sensor de RNA para medir miRNA, corresponde a la solución en la medición de biomarcadores accionables, es decir, de utilidad para la toma de decisiones en el manejo médico de pacientes oncológicos. En este estudio se enfocó la atención analizando los miRNAs circulantes en plasma como potenciales biomarcadores, los miRNA se midieron empleando chips Affymetrix en muestras de un biobanco de plasma congelado de casos y controles (pacientes afectados por retinoblastoma y controles sanos) como modelo de estudio. Con los perfiles de miRNAs obtenidos con la plataforma Affymetrix se identificó una firma de 19 miRNAs que tienen todos los casos y que no tienen los controles. Sin embargo, dado que se requiere un método que no involucre amplificación enzimática, que sea robusto y de bajo costo no se han podido validar todos estos miRNAs con RT-qPCR. Por lo que el método de hibridación de competencia de la presente invención permite evaluar las muestras y obtener resultados importantes para el desarrollo y validación de biomarcadores accionables.

Los datos obtenidos que derivaron del análisis de plasma en el biobanco de retinoblastoma del IMSS, muestras pediátricas, indicaron con precisión que se pueden extraer a partir de 400 mI de plasma entre 100 a 150 ng de RNA y entre 80-100 ng de RNA a partir de las microvesículas aisladas de la misma cantidad de plasma, es decir, aproximadamente 20 pmol y 13 pmol totales respectivamente. En 25 mI de plasma se obtienen entonces 1.25 pmol de miRNAs totales, esto se encuentra dentro del orden de magnitud en donde operará el sensor. Es importante destacar que se está proponiendo realizar todas las pruebas de sensibilidad y especificidad en placa, y posteriormente trasladar las mediciones al SVB, en donde, manteniendo la sensibilidad se puede utilizar menor cantidad de muestra. Es de igual importancia destacar que inclusive este método de medición con los valores de sensibilidad que se han observado, puede ser comercializado, ya que el problema de validación de miRNAs con RT-qPCR es un problema común que se considera tiene en arresto el aspecto aplicativo de los miRNAs circulantes. Como se compara en la tabla 1 , existen otros métodos de detección; sin embargo, casi todos están basados en algún tipo de amplificación y los pocos que existen sin amplificación emplean equipo sofisticado y costoso.

Cuando se realizan las reacciones con el método descrito, se observa el control negativo de fluorescencia, en el cual no hay cDNA fluorescente que se una a las partículas magnéticas, y por lo tanto no hay señal de fluorescencia. El control positivo, cuando todas las partículas están cubiertas por cDNA fluorescente y la emisión de fluorescencia es la máxima. Así, la fluorescencia de las partículas va cambiando al reaccionar con diferentes concentraciones de la cadena de miRNA a medir. Cuando la concentración es muy baja, y por lo tanto, queda mucha sonda marcada libre, un mayor número de ellas se pega a las partículas. Esto produce una señal de fluorescencia elevada. A una concentración intermedia de miRNA a medir, menor es la cantidad de sondas fluorescentes que en el caso anterior quedan libres y estas son las que van a reaccionar con la partícula. Por lo tanto, la fluorescencia es menor que para la concentración baja. Finalmente, a una concentración alta de cadenas de miRNA a medir, la mayoría de los oligos de cDNA fluorescentes quedan atrapados en la muestra porque reaccionan con las biomoléculas, y muy pocos se pegan a las partículas, por lo que la fluorescencia medida es menor.

Como se muestra en la figura 5 de los dibujos que se acompañan, las pruebas realizadas para la medición de miRNA son positivas, y de manera más específica: en el panel A se observa la curva de funcionalización donde se establece la mejor concentración para recubrir las partículas con la cadena de cDNA biotinilado; en el panel B se realiza la curva para determinar la concentración de sonda de cDNA marcada fluorescentemente para obtener un óptimo en la proporción cDNA biotinilado-cDNA fluoresceínado; y, en el panel e en C, se observa el resultado de la curva de sensibilidad en la cual se prueban diferentes concentraciones de miRNA libre, en simulación de diferentes concentraciones de miRNA en la muestra, estableciendo así los límites de detección para este método en estas condiciones.

Es importante hacer notar que el método de hibridación de competencia de la presente invención es muy sensible en su aplicación, ya que puede detectar menos de 0.5 pmoles de miRNA sin necesidad de amplificación. Los datos que derivaron del análisis de plasma en el biobanco de retinoblastoma del IMSS, muestras pediátricas, indicaron con precisión que se pueden extraer de 400 mI de plasma de 100 a 150 ng de RNA y entre 80- 100 ng de RNA a partir de las microvesículas aisladas de la misma cantidad de plasma, es decir, aproximadamente 20 pmoles y 13 pmoles totales respectivamente. En 25 mI de plasma se obtienen entonces 1.25 pmoles de miRNAs totales, esto se encuentra dentro del orden de magnitud en donde operará el sensor.

Tabla 1. Métodos de detección de DNA o RNA • Resultados para Covid-19:

Para la detección del virus SARS-CoV-2, el genoma viral (RNA) se obtiene a partir del tratamiento de la muestra con Trizol™, posteriormente se hace reaccionar con una secuencia complementaria de DNA marcado fluorescente o enzimáticamente (reacción de competencia), de los dos genes del virus SARS-CoV-2 seleccionados (E y RdRp2) y el control que es el RNA de la RNAsa P humana.

En particular, para esta prueba la muestra provino de un exudado nasal (se ha mostrado en la literatura reciente que el virus SARS-CoV-2 se encuentra más abundantemente en muestras nasales) y se podrá utilizar en saliva y suero si el límite de detección lo permite. El exudado obtenido se colocó en una solución de Trizol™ que permitió romper la membrana y la cápside del virus y liberar el contenido de ácido nucleico. De ser necesario, se puede utilizar también RNA ya extraído y purificado por métodos diversos o realizar el procedimiento posteriormente al tratamiento con Trizol™ de la muestra. Como, por ejemplo, colocar en tubos preparados comercialmente (Thermo Fisher phase maker) para generar las tres fases de separación de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos y con ello se podrá fácilmente obtener la muestra de RNA viral. En función de la presencia y cantidad de carga viral en la muestra, una cantidad de cDNA marcado fluorescentemente queda libre. En una segunda reacción (captura de cDNA sobrante), el cDNA-fluoresceínado que quedó libre se unió a la cadena complementaria de DNA que estaba unido a las partículas magnéticas (unión de estreptavidina-biotina ~ funcionalización de partículas). Finalmente, la fluorescencia del cDNA marcado fluorescentemente es posible medirlo en un lector de placas, microscopio o citómetro. Así, a mayor carga viral en la muestra menor la fluorescencia que se medirá y a menor carga viral mayor la fluorescencia detectada. Para la detección del virus SARS-CoV-2, se seleccionaron dos segmentos de 26 nucleótidos, cada uno de 2 secuencias génicas publicadas y avaladas por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Para lograr la detección de los dos genes en la misma muestra, se trabajó simultáneamente con estos genes a partir de DNA marcados con dos fluorocromos de colores diferentes que se pudieron cuantificar por fotodetector o cámara y la proporción para la detección de cada gen se mantuvo en 1/3. Al emplear fluorescencia, se puede trabajar con la detección de muchos genes al mismo tiempo debido a la existencia de fluoróforos o análogos con características ópticas diferentes. En este caso en específico, se trabajó con 3 fluoróforos (azul: excitación 480nm - emisión 520nm, verde: excitación 510nm -emisión 590nm, rojo: excitación 630nm -emisión 670nm).

En la figura 6 de los dibujos que se acompañan se muestran los resultados obtenidos para la detección del virus SARS-CoV-2. En las imágenes A - E, se puede observar las partículas magnéticas con la reacción específica para el gen RdRp2 (verde) y E (rojo), se muestra el control negativo (A) y positivo (B) que equivalen a los puntos de mayor y menor detección, respectivamente. En las imágenes de C - E, se observa un gradiente de intensidad en la fluorescencia de las partículas, correspondiente a la reacción de diferentes concentraciones de material genético viral. Haciendo referencia ahora a las figuras 7 a 11 de los dibujos que se acompañan, en ellas se muestran diversos gráficos. De manera más específica, en el gráfico de la figura 7 se muestran resultados de experimentos que se realizaron para analizar la eficiencia de reacción de distintas cantidades de micro partículas y de DNA biotinilado (funcionalización) contra diferentes concentraciones de cDNA fluorescente.

Como se puede observar, todos los gráficos tienen una curva sigmoidea, lo que indica que, a bajas concentraciones de cDNA fluorescente, la captación de las micro partículas funcionalizadas es mínima, posteriormente se incrementa de manera exponencial y finaliza por saturarse y presentar una meseta. Con estos valores, se determinó la concentración óptima para la funcionalización y la concentración de sonda fluorescente. Así, siendo la relación óptima 5 pmol de sonda biotinilada y 4 pmol de sonda fluorescente.

Con esas concentraciones se procedió a realizar la curva de sensibilidad, empleando una concentración de secuencia de RNA con los 26 nucleótidos correspondientes a los genes escogidos, tal como se observa en el gráfico de la figura 8, pudiéndose determinar fácilmente cargas virales de 6 x 105 en adelante.

Los gráficos de las figuras 9, 10 y 11 , corresponden a la prueba de muestras de pacientes (figuras 10 y 11) y de cultivos virales de cepas de coronavirus que no son SARS-CoV-2 (figura 9). En el gráfico de dicha figura 9, se observan los resultados obtenidos para otras cepas de la familia coronaviridae, estos virus evaluados no deben ser positivos ni para el gen RdRp ni para el gen E. El gráfico de la figura 10 muestra el resultado obtenido para pacientes positivos con diferente carga viral, determinada por PCR. Finalmente, el gráfico de la figura 11 muestra los resultados obtenidos para muestras de pacientes positivos y negativos según su resultado de PCR.

Las ventajas de aplicar el método de hibridación de competencia de la presente invención con diferentes dispositivos son que:

- no se requiere el proceso de extracción y purificación de RNA o DNA, que es costoso, consume tiempo y requiere personal altamente especializado. - no se realiza la retrotranscripción ni amplificación, que es costoso, consume tiempo y requiere personal altamente especializado.

- utiliza equipos que son comunes en las instituciones de salud. No se requiere termociclador en tiempo real o punto final. - se utiliza poca muestra biológica (4 mI_ de sangre y menos de 25 mI_ de plasma para miRNA). Para la extracción de ácidos nucleicos se requieren de 200-300 pi _¬ de muestra.

- se utilizan muy pocos reactivos y en cantidad muy pequeña.

- tiene pocas etapas de reacción, por lo que se reduce la posibilidad de cometer errores durante el proceso.

- los resultados se obtienen en un corto periodo de tiempo.

- la cuantificación puede hacerse con equipos poco sofisticados, incluso próximamente con la cámara de un celular.

- tiene una amplia curva de detección.

Por otro lado, el método de hibridación de competencia para la detección de ácidos nucleicos empleando micropartículas magnéticas de la presente invención presenta ciertas ventajas por sobre los métodos de detección encontrados en el estado del arte, tales como:

- es una prueba molecular de alta especificidad, ya que esta prueba se basa en la hibridación de cadenas de DNA y/o RNA que son altamente específicas, por lo que es comparable a técnicas tan potentes como el PCR.

- se puede analizar un gran número de muestras en un tiempo corto, ya que una sola persona puede analizar hasta 43 muestras por corrida, con duplicados y controles si lo hace en placa, y más si lo hace en tubos, en tiempos relativamente cortos (~2 horas).

- no se emplean insumos ni equipos altamente especializados, ya que, para llevar a cabo la prueba estándar, el PCR en tiempo real o punto final, se requiere de personal altamente calificado, equipos costosos que no son comunes e insumos caros con los que se está especulando debido a la emergencia. - el método de hibridación de competencia de la presente invención utiliza poco material e insumos: tubos, placas de ELISA, Trizol™, las sondas de oligonucleótidos y soluciones básicas de cloruro de sodio, EDTA y Tween.

- la lectura de las muestras se puede realizar con un lector de placas de ELISA, microscopio o citómetro.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, será posible realizar la transferencia del método de hibridación de la presente invención sin necesidad de adquirir infraestructura a muchos hospitales y laboratorios del país en los que es común encontrar ese tipo de equipamiento.

En el caso de la detección viral, el tratamiento de muestras es rápido, sencillo, seguro y barato. En cuanto se toma la muestra, los virus serán inactivados en una solución comercial de Trizol™ o una solución preparada de isotiocianato de guanidina- fenol; el material genético quedará expuesto y protegido de degradación por este reactivo. La muestra podrá ser transportada en condiciones de seguridad y no requiere mantenerse en frío.

El método de la presente invención se puede adaptar a su uso en el SVB, empleando la tecnología desarrollada que se describe y reclama en la patente mexicana No. MX 369,940, permitiendo su uso de manera masivo, aún en sitios remotos y/o de difícil acceso. Se constituirá en un dispositivo de diagnóstico personalizado “lab-on-chip” que podrá ser comercializado de concepto validado con muestras de pacientes para su posterior validación en un hospital. El dispositivo SVB es un lab-on-chip que ha mostrado ser capaz de detectar una o varias biomoléculas de interés (antígeno, anticuerpo, miRNA, y actualmente se prueba para la detección viral) en muestras de sangre total o fluidos como saliva u otros. Aun cuando en la anterior descripción detallada se ha hecho referencia a una modalidad particularmente preferida de la presente invención con base en los dibujos que se acompañan, debe entenderse que dicha modalidad es meramente ilustrativa y no pretende limitar el alcance de dicha presente invención a la misma. Una persona experta en la materia puede hacer varios cambios y modificaciones a la misma, pero sin apartarse del verdadero alcance y espíritu de la presente invención, en donde dichos cambios y modificaciones están destinados a ser incluidos en el alcance de la presente invención, tal como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas. De igual manera, debe entenderse que para simplificar la presente invención y ayudar a tener una mejor comprensión de uno o más varios aspectos de la presente divulgación, las diversas características técnicas de la presente invención, en la descripción mencionada anteriormente de modalidades ilustrativas de la presente invención, a veces se agrupan en una sola modalidad, dibujo, o descripción de los mismos.

La persona experta en la materia puede comprender que, además de la exclusión mutua de características, se puede adoptar cualquier combinación de todas las características divulgadas por la descripción (incluidas las reivindicaciones adjuntas, el resumen y los dibujos). A menos que se indique expresamente lo contrario, cada característica revelada por la presente descripción (incluidas las reivindicaciones adjuntas, el resumen y los dibujos) se puede reemplazar por una característica alternativa que proporcione el mismo propósito, equivalente o similar. Además, la persona experta en la materia puede comprender que, aun cuando la modalidad descrita aquí comprende algunas características incluidas en otras modalidades, en lugar de otras características, se considera que las combinaciones de características de diferentes modalidades caen dentro del alcance de la presente invención y forman diferentes modalidades. Por ejemplo, en las reivindicaciones, cualquiera de las modalidades para las cuales se busca protección puede usarse en varios modos de combinación.

Debe observarse que la modalidad descrita aquí tiene únicamente la intención de ilustrar la presente invención, más no así para limitarla, y la persona experta en la materia puede diseñar modalidades alternativas, pero sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas. En las reivindicaciones, cualquier signo de referencia entre paréntesis no debe interpretarse como una limitación de las reivindicaciones. La frase "caracterizado porque comprende" no excluye elementos que no figuran en las reivindicaciones. Las palabras "a", “el”, “la”, “una” o "uno", antepuestas a los elementos no excluye la existencia de una pluralidad de tales elementos. El uso de las palabras "primero(a)", "segundo(a)" y "tercero(a)" no significa ninguna secuencia, ya que dichas palabras se pueden explicar como un nombre. Lo anterior son sólo implementaciones específicas de la presente invención o la descripción de la modalidad particularmente preferida, y el alcance de la presente invención no se limita a la misma, y todos los cambios o sustituciones que pueda concebir fácilmente la persona experta en la materia dentro del alcance técnico divulgado por la presente invención deben incluirse dentro del alcance de protección de la presente invención. Por todo lo expuesto anteriormente, el alcance de la presente invención deberá estar sujeto a lo establecido en las reivindicaciones anexas, así como a lo divulgado en el estado de la técnica.