Hintergrund der Erfindung : Bei einer Reihe von Erkrankungen ist ursächlich eine pathologi- sche Thl-oder eine abgeschwächte Th2-Reaktion nachgewiesen worden, bzw. es werden diese Reaktionen diskutiert. Tierexpe- rimentelle Befunde lassen vermuten, dass bei diesen Erkrankungen eine Umstimmung der Immunantwort in Richtung Th2 protektiv wirkt. Zu nennen sind hier Organ-spezifische Autoimmun-Krankhei- ten wie Multiple Sklerose [Shevach, E. M. et al., Springer Semin.

Immunopathol. 21 (1999) 249-262 ; Leonard, J. P. et al., Crit.

Rev. Immunol. 17 (1997) 545-553], autoimmune Uveitis [Singh, V. K. et al., Immunol. Res. 20 (1999) 147-161 ; Sun, B. et al., Int. Immunol. 11 (1999) 1307-1312 ; Egwuagu, C. E. et al., J.

Immunol. 162 (1999) 510-517], Insulin-pflichtiger Diabetes mellitus [Rabinovitch, A. et al., Biochem. Pharmacol. 55 (1998) 1139-1149 ; Cooke, A. et al., Parasite Immunol. 21 (1999) 169- 176], rheumatoide Arthritis [Muller, B. et al., Springer Semin.

Immunopathol. 20 (1998) 181-196], Behcet's Syndrom [Frassanito, M. A. et al., Arthritis Rheum. 42 (1999) 1967-1974] weiterhin die Helicobacter pylori-Infektion (die Ursache u. a. von Magenulcus und atrophischer Gastritis) [Smythies, L. E. et al., J. Immunol.

165 (2000) 1022-1029 ; Fox, J. G. et al., Nat. Med. 6 (2000) 536- 542 ; Mattapallil, J. J. et al., Gastroenterology 118 (2000) 307- 315], entzündliche Darmerkrankungen wie Morbus Crohn und andere [Romagnani, P. et al., Curr. Opin. Immunol. 9 (1997) 793-799 ; MacDonald, T. T., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 236 (1999) 113- 135], die akute Organtransplantat-Abstoßungsreaktion [Morelli, A. E. et al., Transplantation 69 (2000) 2647-2657] und spontane rekurrente Aborte [Jenkins, C. et al., Fertil. Steril. 73 (2000) 1206-1208].

Für die Weichenstellung zur Thl-bzw. Th2-Antwort werden Zytoki- ne als Schlüsselfaktoren angesehen [Paul, W. E. et al., Cell 76 (1994) 241-251]. Dabei dürfte IL-4 das entscheidende Zytokin- signal für die Differenzierung von naiven T-Helferzellen zu Th2- Zellen darstellen. Die Weichenstellung zur Thl-Antwort wird dagegen im wesentlichen durch IL-12 und IFN-y kontrolliert, welche durch dendritische Zellen und andere akzessorische Zellen produziert werden. Abgesehen von Zytokinen können auch andere Faktoren die T-Zelldifferenzierung beeinflussen [Constant, S. L. et al., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 297-322]. Für die Weichen- stellung müssen IL-4 bzw. IL-12 bereits zum Zeitpunkt des Pri- ming anwesend sein, d. h. früh während einer Immunantwort (vgl.

Fig. 1).

Die frühe Produktion von IL-4 oder IL-12 und damit die T-Zell- Differenzierung werden durch exogene und endogene Faktoren kon- trolliert. Unter den exogenen Faktoren ist vor allem die Art des Pathogens wichtig. Einige Pathogene stimulieren präferentiell eine Thl, andere eine Th2-Antwort [Scott, P. et al., Immunol. To- day 12 (1991) 346-348]. Dies lässt vermuten, dass molekulare Ei- genschaften des entsprechenden Pathogens verantwortlich für den jeweiligen Effekt sind. Da die Art des Pathogens die frühe Zyto- kinproduktion entscheidend beeinflusst, stellt sich die grund- sätzliche Frage, welches die molekularen Triggerfaktoren sind, die frühes IL-4 bzw. frühes IL-12 induzieren, und welches die zelluläre Quelle ist, die diese Zytokine bereitstellt.

Die zelluläre Quelle für das frühe IL-4 ist Gegenstand einer kontroversen Diskussion [Coffman, R. L. et al., J. Exp. Med. 185 (1997) 373-375]. Grundsätzlich sind mehrere Zelltypen fähig, IL- 4 zu produzieren, wenn sie entsprechend stimuliert werden : Typ 2-T-Zellen, murine NK1. 1+ T-Zellen, Eosinophile, Mastzellen und Basophile. Während einer primären Immunantwort dürfte das frühe IL-4 sehr wahrscheinlich von Zellen der angeborenen Immunität stammen, da zum Zeitpunkt des Erstkontaktes mit einem Immunogen reife Antigen-spezifische T-Zellen noch nicht zur Verfügung stehen. Selbst im Falle präexistenter kreuzreaktiver Th2-Zellen bleibt die Frage, welche Struktur deren Entwicklung ausgelöst hat. Damit sind Typ 2-T-Zellen als Quelle des frühen IL-4 auszu- schließen. Die postulierte exklusive Rolle von NK1. 1+ T-Zellen als Lieferanten des frühen IL-4 in der Maus wurde durch Experi- mente mit genetisch defizienten Tieren in Frage gestellt [Coff- man, R. L. et al., J. Exp. Med. 185 (1997) 373-375].

Verschiedene Autoren haben vermutet, dass Basophile in die Ent- stehung einer Th2-Antwort involviert sind [Paul, W. E. et al., Cell 76 (1994) 241-251 ; Romagnani, S., Immunol. Today 13 (1992) 379-381 ; Dahinden, C. A., Int. Arch. Allergy Immunol. 113 (1997) 134-137]. Dafür spricht, dass menschliche Basophile innerhalb weniger Stunden beträchtliche Mengen an IL-4 nach Antigen-spezi- fischer und unspezifischer Stimulation freisetzen [Brunner, T. et al., J. Exp. Med. 177 (1993) 605-611 ; Kasaian, M. T. et al., Int.

Immunol. 8 (1996) 1287-1297]. Weiterhin können Basophile als be- wegliche Zellen des peripheren Blutes schnell an Orten der Aus- einandersetzung mit Pathogenen akkumulieren. Wanderung und Akku- mulation werden durch eine Reihe von Chemokinen gesteuert. Be- sonders hervorzuheben ist Eotaxin, das Basophile, Eosinophile und Th2-Zellen durch Bindung an deren Chemokinrezeptor CCR3 anlockt. Interessanterweise führt IL-4 zur Freisetzung von Eota- xin aus menschlichen Hautfibroblasten und Endothelzellen, was einen Amplifikationsmechanismus für die Rekrutierung von Baso- philen darstellen dürfte. Neben seiner chemotaktischen Wirkung verstärkt Eotaxin deutlich die Antigen-induzierte IL-4-Freiset- zung aus Basophilen. Verglichen mit Basophilen ist die IL-4- Produktion durch Mastzellen und Eosinophile niedrig, was deren Rolle bei der Th2-Induktion relativiert. Zusammenfassend kommen somit vor allem Basophile als Produzenten des frühen IL-4 in Betracht.

Die Frage nach den Triggerfaktoren für das frühe IL-4 ist bis heute nicht sicher beantwortet. Für das frühe IL-12 kennt man dagegen bereits auslösende Faktoren. So können z. B. bakterielle Produkte, wie Lipopolysaccharid und CpG-Oligodesoxynucleotide, Makrophagen oder dendritische Zellen zur raschen Freisetzung von IL-12 veranlassen und eine Thi-Induktion in vivo bewirken [Paul, W. E. et al., Cell 76 (1994) 241-251 ; Bohle, B. et al., Eur.

J. Immunol. 29 (1999) 2344-2353]. Die Identifikation von Fakto- ren für die Th2-Induktion steht noch aus. Allerdings wurden bereits potentielle Triggerfaktoren beschrieben, die in vitro eine rasche IL-4-Freisetzung aus Basophilen induzieren : die B- Zell-Superantigene Protein Fv [Patella, V. et al., J. Immunol.

161 (1998) 5647-5655] und HIV-Glykoprotein 120 [Patella, V. et al., J. Immunol. 164 (2000) 589-595], die durch Bindung an das VH3-Segment von IgE wirksam werden, sowie Lektine [Haas, H. et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 918-927], die an die Kohlenhy- dratseitenketten von IgE oder des IgE-Rezeptors binden.

Zur Therapie bestimmter Erkrankungen wäre es wünschenswert, die Immunantwort in Richtung einer T-Helferzellantwort vom Typ2 (Th2-Antwort) zu lenken. Hierfür gibt es bisher noch keine be- friedigenden Möglichkeiten, und die Gabe von IL-4 als solchem ist für den routinemäßigen Einsatz nicht praktikabel, da sie zu aufwendig und zu teuer ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, hochpotente Th2-Induktoren sowie Arzneimittel zur Immunmodulation zur Ver- fügung zu stellen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch neue Proteine gelöst, die aus parasitären Würmern isoliert werden.

Parasitäre Würmer lassen sich im wesentlichen drei großen taxo- nomischen Gruppen von Helminthen zuordnen (Zestoden, Trematoden und Nematoden) und zeichnen sich aus durch eine parasitäre Le- bensweise innerhalb von Wirbeltieren und/oder Wirbellosen. Dort befallen sie jeweils bestimmte Organe/Gewebe : das Darmlumen (Darmnematoden), Epithelien (Lungenwürmer), Blutgefäße (Schisto- somen), Lymphgefäße und Haut (Filarien) sowie verschiedene Kör- pergewebe (Larvenstadien von Bandwürmern) und sind dabei mit unterschiedlichen immunologischen Bedingungen konfrontiert.

Weltweit sind ca. 3,5 Milliarden Menschen mit parasitären Wür- mern infiziert. Auch wenn die direkte Mortalität niedrig ist, können die Betroffenen dadurch beträchtliche Gedeih-, Entwick- lungs-und Organschäden sowie oft chronisches Siechtum erfahren.

Wichtigste Vertreter parasitärer Würmer beim Menschen : Spulwurm (Ascaris lumbricoides ; ca. 1 Milliarde Menschen infiziert), Hakenwürmer (Ankylostoma duodenale und Necator americanus ; knapp 1 Milliarde), Peitschenwurm (Trichuris trichiura ; ca. 800 Mil- lionen), Schistosomen (ca. 200 Millionen), Filarien (Brugia, Onchocerca und Wuchereria, ca. 100 Millionen) und Bandwurmarten (Taenia ; ca. 50 Millionen).

Bei Tieren ist die Durchseuchung mit parasitären Würmern, von denen es sehr viele verschiedene Arten gibt, noch weitaus höher als beim Menschen. Der wirtschaftliche Schaden bei Nutztieren kann erheblich sein.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass vor allem parasi- täre Würmer zuverlässig eine Th2-Antwort induzieren. Dabei kann die Eigenschaft der Th2-Induktion auf ein bestimmtes Entwick- lungsstadium beschränkt sein. So induziert bei Infektion von Mäusen mit dem Trematoden Schistosoma mansoni das Ei-Stadium eine Th2-artige Immunreaktion, während das Schistosomula- (Lar- ven-) Stadium eine Thl-artige Immunreaktion auslöst [Pearce, E. J. et al., J. Exp. Med. 173 (1991) 159-166]. Die IL-4-induzierende Potenz der Schistosomeneier ist so ausgeprägt, dass auch naive Mäuse nach transienter ThO-Antwort innerhalb von 7-10 Tagen mit einer Th2-Antwort und IgE-Synthese auf die Gabe von Schistoso- meneiern reagieren [Vella, A. T. et al., J. Immunol. 148 (1992) 2283-2290]. Bereits nach intranasaler Applikation von S. manso- ni-Ei-Extrakt kommt es im Mausmodell zu einer systemischen IgE- Produktion [Okano, M. et al., J. Immunol. 163 (1999) 6712-6717].

Bislang ist es jedoch nicht gelungen, den oder die Wirkstoffe zu identifizieren oder zu isolieren, die für die ausgeprägte IL-4- induzierende Kapazität von S. mansoni-Eiern verantwortlich sind.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung : Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird nunmehr erstmals ein Verfahren zur Verfügung gestellt, mit dem die Isolierung der IL- 4 induzierenden Substanzen aus S. mansoni-Eiern sowie aus Eiern anderer parasitärer Würmer möglich ist.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung eines IL-4 induzierenden Proteins aus parasitären Würmern, bei dem man Ei-Antigen (EA) oder Extrakt aus Th2-bzw. IgE- induzierenden Stadien parasitärer Würmer (EX) gegen Wasser dia- lysiert und lyophilisiert, man das lyophilisierte EA od EX mit- tels Kationenaustausch-Chromatographie auftrennt, man die Frak- tionen, die bei Inkubation humaner basophiler Granulozyten eine IL-4-Induktion bewirken, poolt, einengt, man eine Affinitäts- chromatographie mit NHS-aktivierter Sepharose durchführt, an die Aleuria aurantia-Agglutinin gekoppelt ist, man die Fraktionen, die bei Inkubation humaner basophiler Granulozyten eine IL-4- Induktion bewirken, poolt und einengt. Vorzugsweise lyophili- siert man das erhaltene Protein anschließend.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man EA von Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum, Schisto- soma haematobium, Fasciola hepatica, Dicrocoelium lanceolatum, Echinococcus multilocularis, Ascaris lumbricoides, Ascaris suum, Ankylostoma duodenale, Necator americanus, Trichuris trichiura, <BR> <BR> Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Wuchereria bancrofti, Taenia solium, Taenia bovis und verwandten Arten.

Als Alternative zu A. aurantia-Agglutinin werden monoklonale Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Proteine und Polypeptide (Protein-und Kohlenhydratkomponenten) hergestellt, die zur Aufreinigung verwandter Moleküle anderer Wurmspezies herangezo- gen werden.

Diese monoklonalen Antikörper werden auch für immunhistologische Untersuchungen eingesetzt, so z. B. zur Lokalisation der erfin- dungsgemäßen Proteine und Polypeptide und daraus abgeleiteten Molekülen im Parasiten oder um die Interaktion dieser Proteine, Polypeptide oder abgeleiteten Moleküle mit Wirtszellen zu cha- rakterisieren. Weiterhin können diese Antikörper-u. U. in huma- nisierter Form-zur biologischen Neutralisation des Effekts der genannten Proteine, Polypeptide und daraus abgeleiteter Moleküle bzw. damit verwandter Molekülen (wie Allergenen) in vitro und in vivo (letzteres bei Zuständen einer unerwünschten Th2-/IgE-Im- munantwort) Verwendung finden.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung nimmt man das lyophilisierte EA oder EX zur Durchführung der Kationenaus- tausch-Chromatographie in 20 mM Kaliumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5,0 auf. Gemäß einer weiteren besonderen Ausfüh- rungsform der Erfindung puffert man die aus der Kationenaus- tausch-Chromatographie erhaltenen aktiven Fraktionen nach dem Poolen und Einengen auf 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, um, bevor man die Affinitätschromatographie durchführt.

Bei Verwendung von Schistosoma mansoni-Ei-Antigen (SmEA) erhält man auf diese Weise ein als IPSE bezeichnetes Protein, das die in SEQ ID NO : 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist. Das Protein ist vorzugsweise glykosyliert, es weist jedoch auch in nicht- glykosylierter Form ausgeprägte IL-4-induzierende Eigenschaften auf.

Als"SEQ ID NO"wird vorliegend die Numerierung nach der im WIPO-Standard ST. 25 verwendeten numerischen Kennzahl <400> ver- standen.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Proteine oder Polypeptide, die Homologe, Derivate oder Fragmente der erfindungsgemäßen Proteine und Polypeptide und insbesondere von IPSE sind, die ebenso die Aktivität aufweisen, bei humanen basophilen Granu- lozyten die Produktion von IL-4 und/oder IL-13 zu stimulieren.

Unter Homologen sind vorliegend solche Proteine oder Polypeptide zu verstehen, die gegenüber der in SEQ ID NO : 2 dargestellten Sequenz ein oder mehrere Aminosäureaustausche aufweisen, unter Derivaten sind solche Moleküle zu verstehen, bei denen einzelne Aminosäuren beispielsweise durch nicht natürliche (artifizielle) Aminosäuren oder Aminosäuren in der D-Form ersetzt sind.

Von Okano et al. wurde vorgeschlagen, daß die Kohlenhydrat-Kom- ponenten von S. mansoni-Ei-Antigenen (SmEA) die Thl-Antworten herunterregulieren und auch für die SmEA-stimulierte Th2-Induk- tion erforderlich sind (vgl. Velupillai, P. et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 91 (1994) 18-22, Okano et al., J. Immunol. 163 (1999) 6712-6717). Die Autoren führten den Nachweis an einem Mausmodell bei intranasaler Sensitivierung mit deglykosyliertem (Perjodat-behandeltem) SmEA, das-im Gegensatz zum nativen Ei- Antigen-nicht in der Lage war, IL-4, IL-5, IL-10 und die SmEA- spezifische IgE-Produktion zu induzieren. Ferner wurde festge- stellt, daß Lacto-N-Fucopentaose III, eine prädominante Glykan- Komponente von SmEA, die Lewis (Le) enthält, als Th2-induzie- rendes Adjuvans in. Mäusen wirkt, wenn es kovalent an humanes Serumalbumin gebunden ist (M. Okano et al., J. Immunol. 167 (2001) 442-450).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Proteine bzw. Polypeptide, insbesondere IPSE, auch in Abwesenheit von Kohlehydraten, d. h. in unglykosylierter Form, funktionell wirksam sind. Insbesondere weist unglykosy- liertes, rekombinantes IPSE einen starken IL-4-induzierenden Effekt auf. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse schließen jedoch nicht die Möglichkeit aus, daß Koh- lenhydrate zu einer Th2-Ausrichtung beitragen, wobei es andere Zelltypen als Basophile einschließen könnte, die von Fucopentao- se III-gekoppeltem humanem Serumalbumin nicht aktiviert werden.

Erfindungsgemäß eingeschlossen sind daher ferner die oben ge- nannten Proteine oder Polypeptide in unglykosylierter Form, da festgestellt wurde, dass diese einen ebenso wirksamen IL-4-indu- zierenden Effekt aufweisen wie deren glykosylierte Analoga.

Die Erfindung betrifft ferner ein Nukleinsäuremolekül, das eine für ein oben genanntes Protein oder Polypeptid kodierende Nu- kleinsäuresequenz aufweist. Gemäß einer besonderen Ausführungs- form der Erfindung weist das Nukleinsäuremolekül die in SEQ ID NO : 1 gezeigte Nukleinsäuresequenz auf.

Vorteile der Erfindung : Die erfindungsgemäßen Proteine und Polypeptide führen bereits in sehr niedriger Konzentration zur Freisetzung der zellulären Botenstoffe Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) aus basophilen Granulozyten (weißen Blutkörperchen) nicht-sensibili- sierter gesunder Blutspender. IL-4 und IL-13 sind Schlüsselfak- toren für die Entstehung der Immunglobulin-E-vermittelten (IgE-vermittelten) Allergie. Die erfindungsgemäßen Proteine spielen eine zentrale Rolle bei der für parasitäre Würmer typi- schen Weichenstellung zur T-Helferzell-Antwort vom Typ2 (Th2- Antwort) und zur Synthese von IgE. Da Th2-induzierende Faktoren die Entstehung einer Thl-Antwort (zelluläre Immunantwort) hem- men, können die hochpotenten Moleküle der vorliegenden Erfindung immunpharmakologisch eingesetzt werden, z. B. bei Erkrankungen die mit einer pathologischen Thl-Antwort einhergehen, wie der Multiplen Sklerose.

Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung des erfin- dungsgemäßen Proteins oder Polypeptids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunmodulation, vorzugs- weise zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Stimulation der IL-4-und/oder IL-13-Produktion bzw. zur Her- stellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Stimulation der IgE-Produktion.

Die Induktion oder Verstärkung einer Th2-betonten Immunantwort ist auch im Hinblick auf Entwicklung bestimmter Impfstoffe wün- schenswert. So ist eine Th2-Antwort bei einigen parasitären Wurminfektionen protektiv (z. B. bei Nematoden-Infektionen oder der Schistosomiasis), während hier eine Thl-betonte Immunantwort den gegenteiligen Effekt hat. Dies ist bei der Herstellung ant- helminthischer und anderer Vakzinen zu berücksichtigen.

Untersuchungen hinsichtlich des Wirkungsmechanismus zeigten, dass die Basophilenaktivierung (Degranulation, Histamin-, IL-4- und IL-13-Freisetzung) durch IPSE die Anwesenheit von IgE an der Oberfläche der Basophilen erfordert. Dies ergaben sogenannte IgE-Stripping-und IgE-Resensibilisierungs-Experimente, bei denen Rezeptor-gebundenes IgE durch kurzfristige pH-Erniedrigung von den Basophilen abgelöst wird, und die Zellen anschließend wieder erneut im IgE beladen werden. Die IgE-Abhängigkeit der IL-4-Induktion lässt vermuten, dass IPSE durch Bindung und Quer- vernetzung von Rezeptor-gebundenem IgE wirksam wird.

Um zu prüfen, ob es sich bei IPSE um einen Immunglobulin-binden- den Faktor handelt, wurden Western-und Dotblotting-Techniken eingesetzt. Dabei wurden IPSE bzw. IgE mittels Blotting an Ni- trozellulose-Membran fixiert und der jeweilige Partner in der löslichen Phase zugesetzt. Unter beiden Bedingungen kam es zur Bindung zwischen IgE und IPSE. Erste Untersuchungen mit dem Biacore-Verfahren (Surface-Plasmon-Resonanz ; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) bestätigten diesen Befund, wobei sich eine hohe Bindungsaffinität zwischen IPSE und IgE nachwei- sen ließ. Um zu ermitteln, ob die Immunglobulin-bindende Aktivi- tät von IPSE auf den IgE-Isotyp beschränkt ist oder auch andere Immunglobulinklassen betrifft, wurden Westernblot-Untersuchungen mit IgG aus Seren gesunder nordeuropäischer Blutspender durch- geführt. Dabei stellte sich heraus, dass IPSE auch die mensch- lichen IgG-Subklassen 1-4 bindet. Interessanterweise ergaben kompetitive Inhibitionsversuche, dass IPSE an IgE mit etwa 100fach höherer Affinität bindet als an IgG.

Darüber hinaus bindet IPSE an alle Peptidfragmente von IgG nach Papainverdau, d. h. sowohl an die Fab-als auch vor allem an die Fc-Fragmente.

Aufgrund seiner Eigenschaften als Immunglobulin-bindender Faktor kann man die erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere IPSE, daher zum Nachweis und zur Aufreinigung von Immunglobulinen, insbesondere von IgE und IgG, sowie von Fragmenten derselben (wie Fc-und/oder Fab-Fragmenten), verwenden, beispielsweise bei der Durchführung eines ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) oder im Rahmen einer Affinitätschromatographie.

Aufgrund der immunologischen Eigenschaften der Proteine und Polypeptide der Erfindung eignen sich diese in besonderem Maße zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur In- duktion oder Verstärkung einer Th2-Immunantwort, insbesondere zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Be- handlung von Erkrankungen, die mit einer Thl-Immunantwort ein- hergehen. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Erkrankungen um Erkrankungen aus der Gruppe bestehend aus Multipler Sklerose, autoimmuner Uveitis, Diabetes mellitus, rheumatoider Arthritis, Behcets Syndrom, Helicobacter pylori-Infektion, entzündlichen Darmerkrankungen (insbesondere Morbus Crohn), akuter Organtrans- plantat-Abstroßungsreaktion und spontanen rekurrenten Aborten.

Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Ver- wendung der erfindungsgemäßen Polypeptide, vor allem aber von IPSE, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunmodulation, beispielsweise bei allergischen Reaktionen.

Aufgrund seiner Immunglobulin-bindenden Eigenschaften sind die erfindungsgemäßen Peptide im übrigen für die Therapie von Er- krankungen geeignet, die durch einen erhöhten Serum-IgE Spiegel und/oder eine vermehrte Produktion von Interferon-gamma charak- terisiert sind, wie z. B. die allergische Rhinokonjunktivitis und das allergische Asthma bronchiale.

Eingeschlossen sind ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein erfindungsgemäßes Protein oder Polypeptid zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfs-und Trägerstoffen enthalten.

Die Proteine und Polypeptide der vorliegenden Erfindung dienen ferner zur Induktion oder Verstärkung der IL-4-, IL-13-und/oder IgE-Produktion in vitro, wobei man speziell humane basophile Granulozyten, B-Zellen, T-Zellen oder natürliche Killer (NK)- Zellen, aber auch andere Zellen (des Immunsystems oder anderer Gewebe, wie z. B. Endothelzellen oder Fibroblasten) sowie daraus abgeleitete Zelllinien mit einem oben genannten Protein oder Polypeptid inkubiert. Damit sind die Proteine und Polypeptide zur Herstellung von IL-4 und/oder IL-13 in vitro geeignet. Bei diesem Verfahren inkubiert man die oben genannten Zellen mit dem Protein oder Polypeptid und isoliert IL-4 und/oder IL-13 an- schließend aus dem Kulturüberstand.

Eine weitere Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine und Poly- peptide besteht in der Hemmung der Thl-Zytokinproduktion/Thl- Antwort durch mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (von Mensch und Tier) in vitro.

Da die oben genannten Nukleinsäuremoleküle für die erfindungs- gemäßen Proteine und Peptide kodieren, eignen sie sich als Ma- tritze zur in vitro-Herstellung der Proteine bzw. Polypeptide, d. h. zur in vitro-Expression. Hierzu wird die DNA beispielsweise in einen Expressionsvektor eingebaut und die entsprechenden Proteine rekombinant in geeigneten Wirtszellen, wie z. B. Esche- richia coli, überexprimiert. Falls die Glykosylierung für die funktionelle Aktivität der Proteine oder Polypeptide kritisch ist, erfolgt die Expression im Baculovirus-oder einem anderen eukaryontischen System.

Gegenstand der Erfindung ist daher ferner ein Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes Nukleisäuremolekül eingebaut enthält.

Die Nukleinsäuremoleküle eignen sich ferner zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur in vivo-Expression (z. B. DNA-Vakzinierung). Die Herstellung der oben genannten Proteine und Polypeptide kann somit auch in vivo erfolgen und zwar vor allem in Hinblick auf eine Umstimmung der Immunantwort.

Hierzu wird die entsprechende DNA in einen Gentransfervektor (wie z. B. einen adenoviralen Vektor) eingebaut. So führen z. B. adenovirale Expressionssysteme zu einer transienten, sehr hohen Proteinproduktion ; auch organspezifische Expression ist möglich.

Durch intramuskuläre Injektion des Vektors kann-zunächst bei Versuchstieren-eine lokale Protein-bzw. Polypeptid-Produktion ausgelöst werden. Geeignete Expressionssysteme, insbesondere für die Anwendung am Menschen, sind dem Fachmann wohlbekannt und werden hinsichtlich ihrer Anwendungssicherheit laufend verbes- sert.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Gentransfervektor, in den ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül eingebaut ist, sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen solchen Gentransfervektor zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und/oder Trägerstoffen enthält.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Methode zur Gewinnung von Schistosoma mansoni-Ei-Antigen (SmEA) Das Ausgangsmaterial für die Aufreinigung von IPSE sind Eier von Schistosoma mansoni, die nur in limitierter Menge zur Verfügung stehen, da ihre Gewinnung aufwendig und teuer ist. Aus den Schi- stosomen-Eiern wurde durch Extraktion in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung ein Gesamtextrakt gewonnen (Boros DL et al., J.

Exp. Med. 132 (1970) 488-507 ; Carter CE et al., J. Parasitol. 64 (1978) 285-290), das sog. Schistosoma mansoni-Ei-Antigen (SmEA).

Dieses wurde nach Dialyse gegen destilliertes Wasser in lyophi- lisierter Form bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt-. Da IPSE nur in sehr geringer Konzentration in SmEA enthalten ist, ist es nach Darstellung des Gesamtextrakts durch SDS-PAGE und Silber- färbung unter den zahlreichen Bestandteilen nicht zu erkennen.

Beispiel 2 Methode zur Aufreinigung von IPSE aus SmEA A. Kationenaustauschchromatographie : Im Gegensatz zu anderen Verfahren zur Proteinreinigung wie Aus- schlusschromatographie (Superdex 200 PC, SMART-System, Pharma- cia), hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), Reversed Phase-HPLC und präparative Isoelektrofokussierung (Rotofor, Bio- Rad Laboratories, München, Deutschland), die in unseren Händen zu erheblichem bis totalem Verlust und/oder unbefriedigender Anreicherung des IL-4-induzierenden aktiven Prinzips führten, gelang uns mit der Technik der Kationenaustauschchromatographie eine deutliche Anreicherung von IPSE.

Dazu wurde lyophilisiertes SmEA (2 mg) in 0,5 ml 20 mM Kalium- phosphatpuffer, pH 5, 0, aufgenommen und mittels Kationenaus- tauschchromatographie (SP-Sepharose ; vorgepackte 1-ml HiTrap@- Säulen, Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) aufgetrennt.

Nach dem Auftragen der Probe und Waschen mit Startpuffer (20 mM K-phosphatpuffer, pH 5,0) wurde gebundenes Material mit einem linearen Salzgradienten bis 1M KCl in Startpuffer eluiert. Die Auftrennung erfolgte auf einer Äktaprime-Anlage (Amersham Phar- macia, Freiburg, Deutschland) mit einer Laufmittelgeschwindig- keit von 1 ml/min. Es wurden Fraktionen von 0,5 ml gesammelt.

Der pH von 5,0 ist kritisch, da bei höheren pH-Werten (pH 6,0) ein Großteil von IPSE zusammen mit dem Protein-reichen Effluent die Säule verlässt und somit die Anreicherung des aktiven Prinzips unterbleibt. Anschließend wurden die funktionell aktiven Fraktionen (Nachweis über Ermittlung der IL-4-Induktion im Basophilentest, s. u.) gepoolt und mittels Centricon Plus20 (Millipore, Eschborn, Deutschland) eingeengt und auf 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 umgepuffert. Die Verwendung von Centricon Plus20 zur Einengung war kritisch für die Ausbeute an IPSE, da es bei Benutzung anderer Konzentrationseinheiten wie z. B. Centricon und Centriprep zu einem Verlust des aktiven Prin- zips von über 90% kam. Um die Verluste bei Einengung mit Cen- tricon Plus20 noch weiter zu vermindern, wurden die Einheiten zusätzlich mit 5 % Tween 20 über Nacht vorinkubiert. Vor Benut- zung wurden sie dann gut mit reichlich Aqua bidest. gespült, um eine Verschleppung von Tween in die funktionellen Assays und damit eine Schädigung der Basophilen mit der Folge falsch nega- tiver Ergebnisse zu vermeiden. Dieses Vorgehen gestattete es, den Verlust an IL-4-induzierender Aktivität im Rahmen der Ein- engungsprozedur unter 50% zu halten.

Nach Einengung der Proben (um mindestens Faktor 5) gelang es, in den aktiven Fraktionen neben irrelevanten Komponenten zwei be- nachbarte Banden im Molekulargewichtsbereich um 40 kD im SDS- PAGE-Gel nach Silberfärbung zu erkennen. Für den Nachweis dieser beiden Banden war jedoch eine längere Entwicklungszeit der Sil- berfärbung (mindestens 30 min) erforderlich. In den nicht-akti- ven Fraktionen war die Doppelbande nicht nachweisbar.

Der Verdacht, dass es sich bei einer der beiden Banden (oder beiden) um das gesuchte aktive Prinzip handelte, wurde durch das Ergebnis des folgenden Experiments verstärkt : Auftrennung von SmEA über SDS-PAGE und fraktionierte Elektroelution des Gels ließ die IL-4-induzierende Aktivität dem Molekulargewichtsbe- reich um 40 kD zuordnen, d. h. dem Bereich in dem sich die beiden Banden befanden.

B. Affinitätschromatographie über Aleuria aurantia-Agglutinin- Sepharose : Zur weiteren Aufreinigung wurde die Tatsache genutzt, dass Schi- stosomen-Eier zahlreiche, z. T. ungewöhnlich glykosylierte Glyko- proteine und Glykolipide enthalten. Dementsprechend zeigte eine Affino-Blot-Analyse, dass die Komponenten des Schistosomen-Ei- Gesamtextraktes nach Trennung über SDS-PAGE und Transfer auf Nitrozellulose-Membran differentiell von einer Reihe markierter Lektine erkannt wurden, u. a. von Aleuria aurantia-Agglutinin, Concanavalin A, Datura stramonium-Agglutinin, Galanthus nivalis- Agglutinin, Maackia amurensis-Agglutinin, Peanut-Agglutinin, Ricinus communis-Agglutinin, Sambucus nigra-Agglutinin, Weizen- keim-Agglutinin. Mit den aktiven Fraktionen nach Kationen-Aus- tauschchromatographie reagierten dagegen nur noch drei Lektine.

Von diesen interagierte nur Aleuria aurantia-Agglutinin, das an a1-6-glykosidisch verknüpfte Fucose bindet, selektiv mit den beiden benachbarten Banden um 40 kD. Demgegenüber reagierten die beiden anderen Lektine (Peanut-Agglutinin und Ricinus communis- Agglutinin) ausschließlich bzw. zusätzlich mit anderen, auch in nicht-aktiven Fraktionen nachweisbaren Banden.

Es wurde daher die Arbeitshypothese aufgestellt, dass es sich bei der Doppelbande um IPSE handelt, und als nächster Schritt wurde eine Affinitätschromatographie mit Aleuria aurantia- Agglutinin (Vector Laboratories, Alexis-Deutschland GmbH, Grün- berg, Deutschland) durchgeführt. Hierzu wurde dieses Lektin an NHS-aktivierte Sepharose (HiTrap Säule ; Amersham Pharmacia) gekoppelt. Die Kopplung erfolgte gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Zur Affinitätschromatographie wurden die funktionell aktiven Fraktionen aus der Kationenaustauschchroma- tographie auf die Säule gegeben, mit Startpuffer (50 mM Natrium- phosphatpuffer, pH 7,0) gewaschen und mit Elutionspuffer (Start- puffer + 0,1 M Fucose (Sigma, Taufkirchen, Deutschland)) eluiert. Anschließend wurden die Fraktionen wiederum mittels Centricon Plus20 (Millipore GmbH, Eschborn, Deutschland), wie oben beschrieben, eingeengt und das gewonnene Material mit Hilfe von SDS-PAGE und anschließender Silberfärbung oder anschließen- dem Affinoblotting mit markiertem A. aurantia-Agglutinin erneut charakterisiert. Die IL-4-induzierende Aktivität befand sich ausschließlich in den Fraktionen mit der A. aurantia-Agglutinin- bindenden Doppelbande. Die positiven Fraktionen wurden gepoolt und portioniert oder gegen Aqua bidest. dialysiert und lyophili- siert. Es folgte Lagerung bei-80°C.

Beispiel 3 Ermittlung der kompletten Nukleotid-und Aminosäuresequenz von IPSE A. N-terminale Ansequenzierung von IPSE : Zur Gewinnung ausreichender Mengen an IPSE für die N-terminale Sequenzierung wurden die aktiven Fraktionen aus 10 Läufen der Kationenaustauschchromatographie gepoolt und über die Aleuria aurantia-Agglutinin-Affinitätschromatographie weiter aufgerei- nigt. Das auf diese Weise gewonnene Material (IPSE) kam in der SDS-PAGE (Silberfärbung bzw. Lektinblot) bei 40 kD als Doppel- bande ohne weitere Kontaminanten zur Darstellung. Die N-termina- le Ansequenzierung beider Banden (ohne weitere Auftrennung) gestattete die Identifikation von 18 der 20 N-terminalen Amino- säuren. Die Suche in Proteindatenbanken ergab keine derzeit bekannten homologen Proteine. Die Suche in einer EST-Datenbank erbrachte an erster Stelle ein Expressed Sequence Tag (EST) aus einer Schistosoma mansoni-Ei-cDNA-Bank. Aus einem der drei Leseraster dieses EST ließ sich eine Aminosäuresequenz ableiten, die in 11 benachbarten Aminosäuren mit der N-terminalen IPSE- Sequenz identisch war.

B. Isolierung der cDNA für IPSE aus S. mansoni-Ei-cDNA-Banken Die im vorherigen Abschnitt beschriebene Sequenzinformation gestattete die Herstellung einer spezifischen (nicht-degenerier- ten) DNA-Sonde zur Suche nach der Nukleotidsequenz von IPSE in Schistosoma mansoni-Ei-cDNA-Banken. Sowohl in einer von uns als auch in einer von G. Oliveira hergestellten S. mansoni-Ei-cDNA- Bank (beide im A-Zap-Vektor) fanden sich Klone, die mit dieser Sonde reagierten. Die Sequenzierung dieser Klone ergab, dass ihre gesamte N-terminale Sequenz mit der N-terminalen Sequenz von IPSE identisch ist, wobei es sich bei den beiden zunächst unbekannten Aminosäuren um Cysteine handelte (die Aminosäure Cystein ist via N-terminale Sequenzierung schwer nachweisbar).

Ein Vergleich der im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefundenen Sequenz mit dem oben angegebenen EST ergab erhebliche Unterschiede, die möglicherweise auf Fehler bei der Sequenzierung und Sprünge im Leseraster des EST zurückzuführen sind. In Fig. 2 ist die komplette Sequenz von IPSE auf DNA-Ebene sowie auf Protein-Ebene dargestellt (mit einer Leader-Sequenz von 20 Aminosäuren).

Beispiel 4 Nachweissystem für IPSE A. Reinigung und Stimulation menschlicher basophiler Granulo- zyten : Die Isolierung und Stimulation menschlicher basophiler Granulo- zyten erfolgte nach der Methode von K. Haisch et al. (J.

Immunol. Methods 226 (1999) 129-137). Dazu wurden mit Hilfe eines Ficoll/Percoll-Gradienten aus Venenblut gesunder Blut- spender mononukleäre Zellen gewonnen, aus denen über Gegenstrom- Elutriation Basophilen-reiche Fraktionen isoliert wurden.

Mittels immunmagnetischer Beads (MACS-System) wurden daraus die Basophilen hochrein isoliert (Routinemäßig über 98 W Reinheit).

Die gereinigten Basophilen wurden mit SmEA bzw. seinen Fraktio- nen für 4 h (IL-4) bzw. 18 h (IL-13) inkubiert und die Überstän- de für die Zytokinbestimmung abgenommen und bis zur Untersuchung bei-70°C aufbewahrt.

B. IL-4 und IL-13-ELISA : Die Konzentrationen der Zytokine IL-4 und IL-13 im Kulturüber- stand wurden mittels eines Sandwich-ELISAs bestimmt (u. a. kom- merziell erhältlich).

Beispiel 5 Gewinnung polyklonaler und monoklonaler Antikörper gegen IPSE Zur Gewinnung polyklonaler Antikörper wird IPSE in Anwesenheit von TiterMax-Adjuvans Kaninchen intramuskulär in beide Schenkel injiziert. Die Bildung von IPSE-spezifischen Antikörpern wird im Westernblot ermittelt. Boosterinjektionen erfolgen in 4-wöchigen Abständen.

Die Herstellung monoklonaler Antikörper erfolgt nach der von Köhler und Milstein entwickelten Methode (Nature 256 (1975) 495- 497) in der Modifikation nach Current Protocols of Immunology (Editors : J. E. Coligan et al., Herausgeber : John Wiley & Sons, Inc. (1997) ; ISBN : 0-471-522767). Dazu wird IPSE in Anwesenheit von Adjuvans zwei Mäusen intraperitoneal injiziert. Eine Boosterinjektion (ohne Adjuvans) erfolgt nach 10-14 Tagen. 3 Tage später werden die Milzzellen der Mäuse mit der Myelomzelllinie SP2/0-Agl4 fusioniert. Am nächsten Tag wird Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT)-haltiges Medium zur Selektion der Hybridomzellen zugesetzt. Nach 10-14 Tagen erfolgt das Screening der primären Hybridomüberstände auf Antikörper- Reaktivität gegenüber IPSE im Westernblotverfahren. Kandidaten- Hybridom-Linien werden propagiert und durch Limiting Dilution re/kloniert.

Beispiel 6 Wirksamkeit von nicht-glykosyliertem IPSE Lacto-N-Fucopentaose III (LNFPIII) ist eine Hauptglykankomponen- te von Glykoproteinen in S. mansoni-Ei-Antigen-Extrakten. Vor dem Hintergrund der Eigenschaft der erfindungsgemäßen Polypepti- de, insbesondere IPSE, humane Basophile zu aktivieren, wurde daher untersucht, ob an humanes Serumalbumin gebundene Lacto-N- Fucopentaose III (LNFPIII-HSA) (Biocarb Chemicals, Lund, Schwe- den) ebenfalls in der Lage war, Basophile zu aktivieren. Das experimentelle Vorgehen entsprach der in Beispiel 4 A genannten Methode.

Es wurde festgestellt, daß im Gegensatz zu dem als Positivkon- trolle verwendeten S. mansoni-Ei-Antigen LNFPIII-HSA über einen weiten Konzentrationsbereich (0,03-30 g/ml) die Degranulation von Basophilen, die Freisetzung von Mediatoren oder die Express- ion von IL-4 oder IL-13 nicht induzierte.

Beispiel 7 Untersuchung der Immunglobulin-bindenden Eigenschaften von IPSE Zur Untersuchung der Immunglobulin-bindenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere IPSE, wurden Western-und Dotblotting-Techniken eingesetzt.

Dottblotting : Polyklonales IgE (BA1004 ; DPC Biermann, Bad Nau- heim, Deutschland) wurde in verschiedenen Mengen (1000-30 ng/Dot) auf Nitrozellulosemembran aufgetragen. Anschließend wurden freie Bindungsstellen der Membran durch Inkubation in 0,1 M Tris-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, unter Zusatz von 0,05 W (v/v) Tween 20 (Tris-Tween) blockiert und die Membran mit biotinyliertem rekombinatem IPSE (His Tag Fusionsprotein ; 1 yg/ml) über Nacht bei RT inkubiert. Nach Waschen wurden die Blots mit Streptavidin-Alkalischer Phosphatase (1 : 5000) für 2 h inkubiert. Die Entwicklung der Blots erfolgte nach erneutem Waschen durch Zugabe des Substrat-Chromogen-Gemisches (Nitro- Blue-Tetrazolium-Bromo-Chloro-Indolyl-Phosphat).

Parallel wurden verschiedene Mengen an His Tag IPSE Fusionspro- tein (1000-30 ng/Dot) auf Nitrozellulosemembran aufgetragen.

Nach Blockierung freier Bindungsstellen (siehe vorhergehender Absatz) wurde die Membran mit biotinyliertem polyklonalem IgE (1 yg/ml) über Nacht bei RT inkubiert. Die weitere Entwicklung erfolgte über Streptavidin-Alkalische Phosphatase wie im vorher- gehenden Absatz.

Westernblotting : Hierzu wurden natürliches IPSE oder rekombinan- tes His Tag IPSE Fusionsprotein mittels SDS-PAGE (12 % T, 4 % C) in einem Standardverfahren (Lämmli, U. K., Nature 227 (1970) 680- 685) unter nichtreduzierenden Bedingungen aufgetrennt und mit- tels Semidry-Blotting (30 min., 0,8 mA/cm) auf Nitrozellulose- membran (Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland) transferiert.

Freie Protein-Bindungsstellen wurden durch Inkubation der Mem- bran in Tris-Tween blockiert. Anschließend wurden Streifen der Membran über Nacht bei RT mit Seren gesunder, nichtsensibili- sierter Blutspender (1 : 20 bzw. 1 : 100 in Tris-Tween) inkubiert.

Nach Waschen wurden die Streifen mit Alkalische-Phosphatase- markiertem anti-human-IgE (1 : 2000 in Tris-Tween ; Allergopharma, Reinbek, Deutschland) bzw. anti-human-IgG (1 : 40 000 ; Dianova, Hamburg, Deutschland) für 2 h bei RT inkubiert. Die Entwicklung der Blots erfolgte nach erneutem Waschen durch Zugabe des Sub- strat-Chromogen-Gemisches (Nitro-Blue-Tetrazolium-Bromo-Chloro- Indolyl-Phosphat).

Um die Affinität der IPSE-Bindung an IgE bzw. IgG miteinander zu vergleichen, wurden Western-Blots von His Tag IPSE (0,5 yg/cm) mit humanem IgE (100-100.000 ng/ml) inkubiert. Der Nachweis der IgE-Bindung an His Tag IPSE erfolgte durch Inkubation mit Alka- lische Phosphatase-markiertem anti-human IgE (1 : 2000 ; Allergo- pharma, Reinbek, Deutschland) wie oben.

Es wurde festgestellt, daß IPSE die menschlichen IgG-Subklassen 1 bis 4 und, nach Papainverdau, Fc-und Fab-Fragmente sowie- mit etwa 100-fach höherer Affinität als an IgG-an IgE bindet.