RESPUESTA POR PARTE DE PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE

Al, TRATAMIENTO CON AGENTES QUE RECONOCEN EL RECEPTOR

DE MEMBRANA CD20 DE LOS LINFOCITOS B

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método in vitro (en adelante método de la invención) para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes que reconocen eJ receptor de membrana CD20 de los liníocitos B, como por ejemplo rituximab, por parte de pacientes con Artritis Reumatoide (AR). Así, la presente invención puede englobarse dentro del campo de Ia medicina personalizada, de la reumatología o de la genética humana como campo que estudia las enfermedades de base genética.

ESTADO DE LA TÉCNICA

I.a AR es una de las enfermedades autoinmunes más frecuentes en el mundo (prevalencia mundial ~ 1%). La AR conduce a la inflamación crónica de las articulaciones sinoviales y al desarrollo de daño articular progresivo que puede dar lugar a una marcada incapacidad funciona!. Además, la AR es una enfermedad muy heterogénea y compleja en todos sus aspectos, incluyendo tanto sus manifestaciones clínicas como ia variabilidad en su respuesta a las diferentes terapias.

Fruto de la intensa investigación llevada a cabo durante los últimos años, se han identificado varios tratamientos para el control de la AR. Rituximab es un anticuerpo monoclona! que reconoce el receptor de membrana CD20, específico de linfocitos B. La unión de rituximab con CD2Q provoca una depleción transitoria de los linfocitos B. En principio, el fármaco se diseñó para el tratamiento de los linfomas B de tipo No Hodgkin. Recientemente, se ha podido comprobar que también es un tratamiento eficaz para controlar la AR (Edwards, J. C. et al. Efficacy qf B-cell-largeted therapy wiih rituximab in patients with rheumaiohi arthritm. N Engi J Med SSO, 2572-8} (2004)]. Sin embargo, existe un porcentaje de pacientes que no responden al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B y deben ser redirigidos hacia terapias alternativas. Por lo tanto, los métodos para el pronóstico o predicción de ios pacientes que se pueden beneficiar de este tratamiento y su diferenciación de los pacientes no respondedores a dicho tratamiento que serán focalizados hacia terapias alternativas, son una necesidad creciente dirigida hacia el reto que supone ia medicina individualizada.

£1 artículo //Λm. S. et al. Highiy sensitive B ceü analysis predicis respome to rítuximab therapy in rheumatoid arthritis. Arthritís Rheum 58, 2993-9 (2008) f divulga la asociación entre el nivel de depleción de linfocitos B y la respuesta clínica al cabo de varias semanas. En particular, los individuos en los que la depleción es incompleta, la respuesta a rituximab es peor. La asociación es estadísticamente significativa pero no muy fuerte (7* ~ 0.01). Además, la predicción en este estudio se realiza después de realizar el tratamiento. Hn el documento ¡Teng, Y. K. et αl. hnmunohistochemicαl αnαlysis αs α tneαns to predict responsiveness to rítuximab treatment. Arthritis Rheum 56, 3909-18 (2007)] se divulga la positividad para los anticuerpos anti-peptidos citrulinados (anti CCPs) en suero en aquellos pacientes con una alta infiltración de linfocitos B CD79af e» la membrana sinovia!. El problema de este método es que sólo permite predecir un subgrupo de pacientes y, además, requiere la obtención de una biopsia sinovia!. Comparado con la extracción de sangre, la extracción de biopsias sinoviales es un método altamente invasivo para el paciente y muy poco práctico (pocos centros clínicos cuentan con el personal entrenado y la tecnología para realizarlo).

En el documento [Cohén, S. B. et al, Rituximab fυr rheumatoid arthritis rφactory to anti tumor necrosis factor therapy: Results of a multicenter, randomized, double- blind, placebo-controlled, phase Ul trial evaluating primary efficacy and sqfety at twenty-four weeks. Arthritis Rheum 54, 2793-806 (2006)) se divulga uno de los primeros estudios donde se evaluaba la eficacia y seguridad de rituximab en AR.

Encuentran una leve asociación de la respuesta con ei Factor Reumatoíde aunque con poca significación. En /RoIl, P., Dormir. T. & Tony, H. P. Ami-CD20 therapy in patients wiih rheumatoid arthritis: predictors qf respome and B cell suhset regeneration after repeated treatment. Arthritis Rheum 58, 1566-75 (200S)J se lleva a cabo un análisis de citometría de flujo pero, como en Dass et ai., encuentran avocaciones débiles de subgrupos de Imfocitos con ia respuesta clínica después del tratamiento.

Ninguno de ios documentos localizados en el estado de la técnica describe los genes, cuyo nivel de expresión es analizado en la presente invención, con el objetivo de pronosticar la respuesta al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de ios linfocitos B, como por ejemplo rituximab, por parte de pacientes con AR. Por lo tanto, no se ha localizado en el estado de la técnica ninguna evidencia relacionada con la utilización de los genes citados en la presente invención, los cuales, tal y como se explica en la descripción, han sido específicamente seleccionados mediante un exhaustivo proceso de cribado entre miles de genes.

Así, la presente invención soluciona los problemas planteados en el estado de la técnica presentando un método para el pronóstico o predicción de los pacientes que se pueden beneficiar del tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los lintbcitos B y su diferenciación de los pacientes no respondedores a dicho tratamiento que serán focalizados hacia terapias alternativas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Breve descripción de Ia invención

La presente invención se refiere a un método in vitro para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B por parte de pacientes con AR, que comprende la determinación en una muestra de sangre de dichos pacientes y mediante la cuanüficación del nivel de expresión transcripcional (ARNm), antes de iniciar el tratamiento, de al menos uno de los genes seleccionado de las Tablas 1 a 3, particularmente del grupo: ARGl, CPD, TRAFl, ClQA, LRRN3, HLA-DQAl, NLK, TLR4, LOC89944. TOM1 L1, BACH, NCALD, EΪF2C2, NFIC, PCDHB7, FLJ32770, ARID3A, C14ORF9, CSNK.1 E, BCASl, TF.AD2, C6ortl45 y SNTAl; y la comparación de dicho nivel de expresión con respecto a los valores de expresión previamente obtenidos de pacientes que demostraron ser respondedores al tratamiento o no respondedores al mismo.

En una realización preferida de la invención dicho pronóstico se realiza a través del valor de expresión resultante del ratio ARGLTRAFl en sangre total. En los pacientes no respondedores la expresión de ARGl es superior a TRAFl (ratio positivo) y en todos los pacientes respondedores es al revés (ratio negativo). A su vez, la elevada expresión de AROl está claramente asociada a Ia falta de respuesta así como la elevada expresión de TRAFl es predictiva de una respuesta clínica a rituximab favorable. Tal y como se observa en las Tablas 1 a 3, debe tenerse en cuenta que, de entre los genes particularmente preferidos, los genes sobre- expresados en pacientes respondedores o infra expresados en pacientes no-respondedores antes de iniciar el tratamiento son:

• TRAFl , LRRN3 y NLK en sangre total. • TLR4, TOM ILl, PCDHB7 y FLJ32770 en cclυias OD4+T.

• CI4ORF9, CSNKl E, BCASl, TEAD2. C6orfl45 y SNTAl en células B. Además, de entre los genes particularmente preferidos, los genes infra-expresados en pacientes respondedores o sobre-expresados en pacientes no-respondedores antes de iniciar ei tratamiento son: • ARG 1 , CPD, C 1 QA y HlA-DQAl en sangre total.

• LOC89944, BACH, NCALD, HIF2C2 y NFlC en células CD4+T.

• ΛRÍD3A en células B.

Así, el problema técnico resuelto por Ia presente invención se refiere a un método in vitro para el pronóstico o predicción de Ia respuesta al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los Hnfociíos B (como por ejemplo rituximab) por parte de pacientes aquejados de AR, a partir de células sanguíneas tomadas de muestras de sangre total de dichos pacientes (comprenden el 100% de las poblaciones celulares en ella presentes y no sólo de las células PBMCs), que es sencillo (se basa en ei análisis de un pequeño número de genes) y poco invasivo para el paciente (no requiere la realización de biopsias). Además, en la presente invención se analizó el parrón de expresión génica en subpoblaciones de células sanguíneas tales como las células CD4 -f T y las células B encontrándose una serie genes cuya expresión presenta una relación estadísticamente significativa con la respuesta de ios pacientes con AR al tratamiento con rituxirnab.

Bs importante hacer notar que cada uno de los genes estudiados en la presente invención, incluidos en las Tablas 1 a 3, tiene potencial predictivo por sí mismo. Por lo tanto en el método de la invención podría utilizarse, con suficientes visos de efectividad, cualquiera de los genes comprendido en las Tablas i a 3, particularmente seleccionado del grupo: ARGl, CPD, TRAFK ClQA, LRRN3, HLA-DQAl, NLK,

TLR4, LOC89944, TOMl Ll, BACH, NCALD, EIF2C2, NFlC, PCDHB?, FU32770. ARID3A, C14ORF9, CSNEClE, BCASl, TEAD2, C6orfl45 y SNTAl, así como cualquier sub-combinación de los mismos con un número de genes ≥2, o el conjunto de genes en su totalidad.

Además en la presente invención se aisla y se analiza el ARNm de sangre total, sin realizar ningún fraccionamiento previo. HI perfil de expresión, por tanto, incluye todas las poblaciones celulares de la sangre. Este aspecto adquiere importancia al tener en cuenta que cada tipo o población celular pueden tener asociados diferentes perfiles de expresión génica.

El tipo de muestra tomada en una realización preferida de Ia presente invención (sangre tota!) hace que el método sea muy poco invasivo para el paciente a\ no requerir biopsias sinoviales para la extracción de las muestras, pudiéndose aplicar a todos los pacientes con AR. En comparación con la muestra sinovial, la muestra sanguínea puede ser obtenida en cualquier centro clínico con muy poco riesgo para el paciente. En particular, los genes identificados utilizando el método PaxGene (ver ejemplo 2) para preservar el ARN, son los que permiten un procesamiento más rápido ya que no es necesario llevar a cabo ningún paso de separación celular. En cambio, los genes identificados en CD4+ y linfocitos B. requieren un procedimiento técnico más laborioso.

La predicción de la respuesta al tratamiento por parte de pacientes aquejados de AR es útil en dos sentidos principales: 1. Predicción de pacientes no respondedores al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B: de esta forma se podría dirigir al paciente hacia tratamientos alternativos sin necesidad de aplicarle, como primer tratamiento, la terapia con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B. Algunos de los posibles efectos secundarios debidos al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los Hnfocitos B se citan en la referencia:

[Long íerm treatmeni o/ rheumatoid ai'thriñs wüh rUtecimah. AutoimmunUy Reviews, Volunte 8, fssue 7, June 2009, Pagas 591-594 Roberto Caporali, María Caprioii. Francesco Bobbio-Pallavicim. Serena Bugatti and Carlomaurizio Montee uceo] 2- Predicción de respondedores al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los iintbcitos B: esta herramienta es muy útil para empezar el tratamiento de forma temprana ya que en el caso particular de la AR se ha demostrado que el tratamiento en fases precoces de la enfermedad pueden ser muy efectivas evitando el avance de las erosiones articulares.

Descripción de las figuras

Figura I. Muestra el análisis jerárquico de las mediciones del índice de mejora Re!DAS28 (ver ejemplo 1) de los pacientes tratados con rituximab. Se identificaron claramente dos grupos distintos de pacientes. A partir de estos resultados los pacientes fueron clasificados como respondedores ai tratamiento con rítuximab (n^, cluster superior) o no respondedores (n-5, ciuster inferior). La altura (h) del dendrograma corresponde a Ia diferencia entre los individuos calculada, en este caso, mediante la distancia eucHdes. En este sentido, las diferencias más grandes (grupos más diferenciados o "clusters") serán aquellas que se den antes en el árbol y las menores corresponderán a las últimas ramificaciones. Las siglas Ri , R2, R3 y R4 significan respectivamente: Respondedor 1, Respondedor 2, Respondedor 3 y Respondedor 4. Las siglas NRl, NR2, NR3, NR4 y NR5 significan respectivamente: No respondedor 1 , No respondedor 2, No respondedor 3, No respondedor 4 y No respondedor 5.

Figura 2. Muestra que el ratio entre la expresión de los genes ARGl y TRAFl (ARGl /TRAFl) en pacientes respondedores al tratamiento con rituximab (diamantes del cuadrante inferior izquierdo y no respondedores (diamantes de cuadrante superior derecho) es consistente en el análisis por microarray (eje X) y por RT-PCR (eje Y). Además se separan claramente ambos grupos de pacientes.

Figura 3. Muestra Ia expresión de los genes ARGl y TRAFl en sangre total de los pacientes tratados con rituximab. Se puede ver claramente corno en ios no respondedores la expresión de ARGI es superior a TRAFl (ratio positivo) y en Unios los pacientes respondedores es ai revés (ratio negativo). A su vez, la elevada expresión de ARGt está claramente asociada a Ia falta de respuesta así como la elevada expresión de TRAF 1 es predicti va de una respuesta clínica a rituximab favorable.

Descripción detallada de Ia invención

En la presente invención se evaluaron ios perfiles de ARN en tres poblaciones diferentes de células de la sangre (sangre total, células CD4+ y Hnfocitos B) para identificar genes asociados con la respuesta de pacientes con AR ai tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los Hnfocitos B. Como consecuencia de dicha evaluación se identificaron marcadores capaces de predecir la respuesta de pacientes con AR al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfbcitos B, de forma previa ai inicio del tratamiento con dichos agentes.

Así, por ejemplo, se evidenció que un aumento de la expresión del gen ARG 1 en 1a sangre total está significativamente asociado con un peor resultado en la terapia con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de ios linfocítos B. Recientemente se ha descubierto que el gen ARG I es un importante modulador de la respuesta inflamatoria mediante la reducción de Ia disponibilidad extraeeiυlar de arginina y, por io tanto, del sustrato para Ia producción del Óxido Nítrico pro- intϊaraatorio. Paradójicamente, el segundo gen más asociado con la respuesta a terapia en ia sangre total, que además se encuentra sobre-expresado en pacientes no respondedores al tratamiento con rituximab, es el CPO que codifica para la carboxípepíidasa D. La carboxipeptidasa D es una exopeptidasa que aisla residuos de arginina de proteínas aumentando la disponibilidad de Ja arginina libre para ia producción de Óxido Nítrico. IΛ síntesis de Óxido Nítrico a partir de arginina produce citrulma que es el antígeno de los anticuerpos anti-CCP. Estos hallazgos sugieren que este mecanismo de acción es relevante en ia AR. Durante el análisis de Ia sangre total, además se evidenció que Ia sobre-expresión del gen TRAFI está asociado con una respuesta positiva al rituximah por parte de pacientes con AR. Además, se identificó un aumento en Ia expresión del gen TLR4 en células CD4+T en pacientes respondedores al tratamiento con rituximab.

AR1D3A codifica para un factor de transcripción especifico en las células B que aumenta la transcripción de la cadena pesada de las inmunoglobulinas. En la presente invención se evidenció que dicho gen se encuentra sobre-expresado en pacientes con AR no respondedores a rituximab antes de iniciar el tratamiento.

Dichos hallazgos permitieron el diseño de un método ¡n vilro para el pronóstico o predicción de Ia respuesta al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los iinfocitos B por parte de pacientes con AR, que comprende la determinación en una muestra de sangre de dichos pacientes, y mediante la cuantificación del nivel de mRNA. del nivel de expresión de al menos uno de los genes comprendidos en las Tablas 1 a 3, particularmente en el grupo: ARGl. CPD, TRAFl, ClQA. LRRN3, HLA-DQAl, NLK, TLR4, LOC89944, TOMlLL BACH, NCALD, EΪF2C2, NFlC, PCDHB7, FLJ32770, ARID3Λ, C14ORF9. CSNtClE, BCASl, TEAD2, C6orfl45 y SNTAI, y la comparación de dicho nivel de expresión con respecto a los valores de expresión previamente obtenidos de pacientes que demostraron ser respondedores al tratamiento o no respondedores al mismo. En el caso de llevar a cabo el método de la invención en base al valor de expresión resultante del ratio ARGl /TRAFl, el pronóstico puede realizarse directamente sin comparar dicho valor con los valores obtenidos en individuos control. Se identificó un grupo de genes significativamente asociados a la respuesta al tratamiento con rituximab en pacientes con AR usando un microarray. Se determinaron los genes estadísticamente significativos en la sangre total, células CD4 >T y células B. Además, se llevó a cabo la validación de los candidatos más relevantes mediante RT-P(UR. Los subgrupos de genes validados representan un nuevo grupo de marcadores para la predicción de la respuesta al tratamiento con rituximab de los pacientes con AR. EJEMPLOS

EJEMPLO 1. Selección de pacientes

Inicialmente se seleccionaron ios pacientes aquejados de AR en la Unidad de

Rcumatología del Hospital Universitario Val! d'Hebron (Barcelona, España). A todos los pacientes se les había diagnosticado AR siguiendo ios criterios establecidos por

ACR "American College of Rheumatotogy". Los pacientes seleccionados para el tratamiento presentaban AR activa: índice DAS28 ("Discase activity score" > 5.1). La evaluación clínica de los pacientes usando el índice DAS28 se llevó a cabo cada tres meses de tratamiento. Todos los procedimientos realizados cumplen con la Declaración de Helsinki. El estudio íue aprobado por el Comité Ético άcí Hospital

Universitario Val! d'Hebron.

Para ocho de los pacientes tratados con rituximab se obtuvo un resultado positivo en ia prueba scrológica del Factor Reumatoide (FR). Además cinco de los pacientes fueron anti-CCP (anti-eyelie cytrultinatcd peptide) positivos. Todos los pacientes rueron mujeres sobre las que el tratamiento con agentes anti-TNF había foliado. Después de la administración intravenosa de metilprednisona a una dosis de 100 mg. todos los pacientes recibieron una inlusión de l-gm de rituximab en los días 1 y 15 de tratamiento. La respuesta clínica a rituximab foe determinada en la semana 24 usando el índice Re!DAS28. Con este método, Ia eficacia a un tratamiento particular es estimada a través de la mejora en el índice relativo DAS28. Posteriormente se aplicaron métodos analíticos ("elustering" jerárquico) para identificar grupos de pacientes con respuestas similares al tratamiento con rituximab (Figura 1).

EJEMPLO 2. Recogida de sangre Las muestras de sangre para la extracción de ARN fueron extraídas de los pacientes durante el día de la primera aplicación de rituximab.

En la presente invención se utilizó el sistema "PAXGene" (PreAnalytix, Suiza) para la preservación inmediata del ARN procedente de muestras de sangre total. Este sistema utiliza un agente preservante del ARM contenido en el mismo tubo de extracción de la sangre y, por lo tanto, los perfiles de sangre obtenidos son representativos de las condiciones in vήγ>. Todos los tubos "PΛXGene" se almacenaron congelados a -80 * C hasta el aislamiento de ARN. El ARN fue extraído por medio del kit de aislamiento total "PAXGene" (Qiagen, USA). Finalmente la calidad del ARN de todas las muestras se evaluó usando el sistema de gel "BioAnalyzer" (Agilent USA).

EJEMPLO 3. Análisis por citometría de flujo

Se realizó el análisis por citometría de flujo en todos los pacientes incluidos en el estudio, el misino día de la extracción de sangre para el análisis en el microarray. A partir de la muestra de sangre total se determinaron las subpoblaciones de leucocitos, así como las células rojas de la sangre. Con el objetivo de estimar el nivel de purc/a celular obtenido en el paso de la selección de linfocitos, se llevó a cabo, además, la determinación por citometría de flujo de las células CD4 >T y OD20-» B.

EJEMPLO 4. Análisis de expresión de tos genes

Fl análisis de la expresión de genes de todo el genoma fue llevado a cabo utilizando el sistema "lllumina Human-6 v 1 Beadehip array system (Illuraina)". Mediante el uso de la tecnología "bead-based", el microarray empleado en la presente invención evaluó la expresión de 47.000 transcritos (www.ü!umina.cυm). Los ARN de buena calidad (ratio 28S- 18S > 1.8, número RNA .ntegrity Number >*>) ñicron posteriormente procesados usando dicho protocolo estándar de Ul omina. Después del mareaje c hibridación de la muestra, los "arrays ^M fueron leídos utilizando el lector de arrays " ^{ Ilumina s BeadArray Reader". Los datos fueron extraídos utilizando el programa informático "Illumiaa BeadSCudio". El resto de pasos se realizaron utilizando el programa informático R (http://cran.r-prqject.org/) y su extensión para el análisis de datos genómicos en el programa ' ^* Bioconductor". En el momento del análisis de los datos, se puso en marcha una versión actualizada del array "THunúnaHuman-6 v2, Beadehip array". Esta nueva versión incorpora un sustancial rediseño de la secuencia de las sondas y, por lo tanto, el análisis del microarray fue restringido a la porción de las sondas que fueron consideradas "válidas" según la nueva versión de! microarray (datos disponibles en www.iHumina.com). Los valores de la expresión final de los transcritos fueron transformados a Iog2 y normalizados utilizando el método quantile normalízation (Bolstad Bioinformatics '03). Antes de llevar a cabo cualquier análisis estadístico, se realizó un "clustering" jerárquico para detectar y descartar cualquier posible microarray con valores extremos ("outlier").

EJEMPLO 5. Análisis medíante RT-PCR La transcripción reversa de las maestras de RNA obtenidas de los tres tipos de células fue llevado a cabo usando el "cDNA Archive Kit" de Applied Biosystcms. IA determinación mediante RT-PCR del conjunto de genes candidatos se realizó usando ensayos TaqMan prediseftados de Applied Biosystems. Para la sangre total se usaron los ensayos de expresión génica Hs(M)] 94639_mt y I IsOO 163660 mi con el objetivo de medir los genes TRAFl y ARGl respectivamente, y analizar la correlación con los datos del microaπay usando el ratio obtenido de las dos mediciones. Para cada uno de 1os linfocitos candidatos se buscaron controles endógenos a partir del grupo de genes que mostraron una variación mínima en los datos del microarray.

EJEMPLO 6. Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos fueron llevados a cabo usando la metodología expuesta en [R: A Language and Emϊronment for Slaüsrical Cυnφnting. In: R Development Core Team: 2()Q6 ^' \. Los genes expresados diferencialmente entre los pacientes respondedores al tratamiento con rituximab y los no respondedores al mismo fueron determinados usando el test Welch impiementaáo en el paquete muhtest. Las correcciones del test fueron realizadas usando el método de Benjamini and Hochber False Discovery Ratc. El análisis ontológico de genes se llevó a cabo usando Ia herramienta de análisis GOstat [Beltsbarth T. SpeeJ TP. GOstai: fiml statistically overnψresenled Gene (htloiogies wiihin a group of genes. Hioinformatics 2004:20(9): 1464-5}. Las correlaciones entre el microarray y las medidas de la expresión génica mediante RTPCR fueron calculadas usando el coeficiente de correlación de Pearson. RESULTADOS EJEMPLO 7. Clasificación de pacientes

El análisis jerárquico de las mediciones ReiDAS28 de los pacientes tratados con rituximab identificó claramente dos grupos distintos de pacientes (Figura 1). A partir de estos resultados los pacientes fueron clasificados como respondedores el tratamiento con rituximab (n=4, cluster izquierdo) o no respondedores (n ^::! 5, cíuster derecho).

EJEMPLO 8. Determinación de ios genes asociados a Ia respuesta a rituxünab Mediante el análisis de la expresión génica en el πύcroarray se identificaron 7 genes (ARGl, CPD, TRAFl, ClQA, LRRN3. HLA-DQAI y NLK) diferencialmente expresados en los perfiles de sangre total de pacientes con AR tratados con rituximab (P<0,05). En ei análisis de las células CD4-*-T y subpoblaciones de células B se identificaron 33 y 50 difcrencialmente expresados entre respondedores y no respondedores, En las Tablas 1 a 3 se muestra una lista de los más significativos para cada uno de los tres tipos de células.

EJEMPLO 9. Análisis de genes candidatos mediante Rl-PCR

En Ia sangre total se identificó una gran correlación entre el microarray y las determinaciones RT-PCR (r ~ 0.75). La Figura 2 muestra una clara separación entre respondedores y no respondedores ai tratamiento con rituximab que es obtenida usando los valores del microarray o la RT-PCR de los genes ARGl y TRAFl. En la validación de las células CD4+T se encontró además una gran correlación entre la determinación de TLR4 (r = 0.91). En las células B, sin embargo, no se replicó Ia expresión diferencial observada en el microarray (r ^!K 0.47).

Tabla ϊ. Listado de genes diferencíalmentc expresados en células B (Linfbcttos B) en pacientes con AR respondedores a la terapia con rituximab vs pacientes no respondedores. Los genes sombreados son los que presentaron mayor significación estadística.

Tabla 2. Listado de genes diferenciaímente expresados en células CD4+T (Linfbcitos T-CD4) en pacientes con AR respondedores a la terapia con rituximab vs pacientes no respondedores. Los genes sombreados son los que presentaron mayor significación estadística.

Tabla 3. Listado de genes diferencialmente expresados en células de la sangre total en pacientes con AR respondedores & Ia terapia con ritυximab vs pacientes no respondedores.

Los genes ARGl , TRAFl , TLR4 y ARJD3A fueron analizados mediante RT-PCR.

Todos los genes citados en las Tablas 1 a 3 son estadísticamente significativos y por Io tanto cada uno de ellos puede ser eficazmente empleado en el método de Ia invención. Sin embargo, los genes que aparecen sombreados forman parte de un aspecto preferido de Ia invención puesto que son los genes que presentaron mayor significación estadística.

Tal y como muestra las Tablas 1 a 3, en Ia sangre total se identificaron un grupo de siete genes diferencialmente expresados entre pacientes respondedores a Ia terapia con rituximab vs pacientes no respondedores. Además se presentan los genes con mayor significación estadística expresados en células CD4+T y B, diferencialmente expresados entre pacientes respondedores a Ia terapia con rituximab vs pacientes no respondedores (P<0.0001 , n = 9 n = 7, respectivamente).