DISPOSITIVO Y MÉTODO PARA CULTIVO TRIDIMENSIONAL DE CÉLULAS

ADHERENTES

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un dispositivo y método para cultivo tridimensional de células adherentes basado en el uso de soportes filamentosos inmersos en un medio de cultivo.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El cultivo celular es ampliamente empleado en Ia industria biotecnológica como un método para obtener diferentes productos biológicos producidos por las células y también como un método para producir células para diferentes aplicaciones, como puede ser Ia terapia celular. El cultivo celular también es empleado en investigación como un método muy conveniente para estudiar interacciones celulares o el efecto de diferentes sustancias en el metabolismo celular.

En los métodos de cultivo celular, las células pueden ser cultivadas en suspensión o adheridas a una superficie, como es el caso de las células dependientes de anclaje.

Las células dependientes de anclaje se cultivan tradicionalmente como una única capa de células en Ia superficie interna de recipientes con diferentes formas. Estas superficies se sumergen en un medio de cultivo apropiado, como puede ser el caso de las botellas rodantes o los frascos de cultivo tipo "T", donde el medio de cultivo se introduce en el interior del recipiente, de manera que baña las paredes donde se realiza el cultivo celular. Este tipo de cultivos son empleados, entre otras cosas, para realizar estudios de eficacia de diversas sustancias sobre el desarrollo de determinados fenómenos celulares como pueden ser Ia angiogénesis o Ia metástasis. Sin embargo, el hecho de que el crecimiento en monocapa no reproduzca las condiciones en las que las células se encuentran en Ia naturaleza, limita Ia aplicación e interpretación de los resultados obtenidos en dichos estudios. Otras alternativas emplean soportes particulados con estructura macroporosa para el cultivo celular. Las células crecen en Ia superficie externa de las partículas y dentro de las cavidades internas, o poros, de las partículas del soporte, las cuales se mantienen en suspensión mediante diferentes modos de agitación.

También es conocido Ia preparación de los llamados esferoides, preparados de manera artesanal y en los que muchas células crecen juntas en suspensión, adheridas unas a otras, hasta el límite impuesto por Ia fuerza gravitacional que actúa sobre el esferoide en crecimiento que se mantiene en suspensión. Los esferoides son de particular interés en el estudio de cultivos celulares tridimensionales, ya que los esferoides simulan con mayor precisión que los cultivos superficiales las condiciones naturales en las que las células se encuentran en los organismos vivos, donde más que estructurarse en forma de monocapas, las células forman estructuras tridimensionales y tejidos.

En Ia solicitud de patente PCT/EP2006/064483, se describe el cultivo de células en Ia superficie de microhilos en forma de monocapas. En Ia descripción de Ia invención, se describen distintas distribuciones de microhilos adecuadas para llevar a cabo el objetivo de cultivar las células en monocapas en Ia superficie de los hilos.

De especial interés es el desarrollo de cultivos tridimensionales de células adherentes en el caso de Ia producción de células terapéuticas, tanto somáticas como troncales, ya que un factor clave para el éxito de las terapias desarrolladas a partir de Ia implantación de células, es disponer de métodos de producción con suficiente productividad y que no afecten al grado de diferenciación de las células cultivadas. En estas aplicaciones, es necesario disponer de métodos de producción de células donde se consiga una elevada productividad, superior a cientos de miles de células por lote, y con elevada homogeneidad.

Los métodos o dispositivos existentes aplicados al cultivo tridimensional de células adherentes adolecen de los siguientes problemas:

- En el caso de los recipientes sobre cuya superficie interior crecen las células, estas se ven forzadas a crecer en dos dimensiones hasta que toda Ia superficie disponible para cultivo ha sido saturada por células, momento en el cual podrían iniciar el crecimiento tridimensional. Sin embargo, las células que están en contacto con Ia superficie, una vez que son cubiertas por sucesivas capas celulares, ven limitado su acceso a los nutrientes provistos por el medio de cultivo, por Io que crecen en un entorno drásticamente diferente al de las células de las capas superiores del cultivo.

- En el caso de los soportes particulados macroporosos que se mantienen en suspensión mediante agitación, las células que crecen en Ia superficie de las partículas están sometidas a un choque continuo contra el resto de partículas en suspensión, por Io que son dañadas por las fuerzas de fricción. Mientras que las células que crecen en el interior de los poros, se encuentran sometidas a diferentes micro-ambientes creados en el interior de dichos poros, Io cual implica unas condiciones heterogéneas de cultivo. Además, una vez concluido el cultivo, Ia recuperación de las células está dificultada por el impedimento estérico, ya que incluso si las células son despegadas de Ia superficie interna de los poros, Ia mayoría de ellas queda atrapada en el interior de las partículas y no puede ser recuperada.

- En el caso de los esferoides, aunque tanto el entorno de cultivo como su similitud con un cultivo tridimensional perfecto son adecuadas, el método de preparación es extremadamente improductivo, y los tamaños de los cultivos obtenidos están limitados a pocos cientos o miles de células. Este tamaño máximo tan reducido de los cultivos tridimensionales que se pueden alcanzar con los esferoides es debido a los límites impuestos por Ia fuerza gravitacional que hace caer a los esferoides que crecen en suspensión

Para solucionar estos problemas, es necesario encontrar el modo de mantener indefinidamente en suspensión y en un ambiente homogéneo, un cultivo tridimensional, sin someterlo a fuerzas de fricción provocadas por choques entre las partículas o turbulencias provocadas por Ia agitación del medio de cultivo.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe un dispositivo y un método para cultivo tridimensional de células adherentes mediante Ia aplicación de un medio de cultivo al dispositivo, previamente inoculado el medio de cultivo con células adherentes.

El dispositivo comprende uno o más soportes filamentosos estáticos dispuestos de modo que se favorece el desarrollo de cultivos tridimensionales.

Los soportes filamentosos se encuentran dispuestos de forma paralela en el interior del dispositivo para cultivo celular tridimensional y fijados a él por sus extremos. Los soportes filamentosos también pueden estar dispuestos en estructuras de soporte que pueden ser apilables y que se fijan al dispositivo de cultivo celular tridimensional formando una o más capas de soportes filamentosos

Los soportes filamentosos pueden haber sido sometidos a un tratamiento de modificación superficial que afecte al modo en que las células se adhieren a los mismos o al modo en que las células se comportan una vez adheridas.

El dispositivo para cultivo celular tridimensional puede adoptar diferentes geometrías, pudiendo ser de forma cilindrica o en forma de prisma entre otras.

El método para cultivo celular tridimesional de Ia presente invención es de aplicación tanto a Ia producción de células o derivados de estas células, como a Ia generación de cultivos tridimensionales para el estudio de diferentes aspectos estructurales, metabólicos o de interacción entre diferentes tipos celulares.

El método se inicia con el llenado del dispositivo de Ia presente invención con una suspensión de células adherentes en medio de cultivo. Tras D

mantener inmóvil el dispositivo y pasado el tiempo en el que las células se adhieren a Ia superficie de los soportes filamentosos, se retira el medio de cultivo y es reemplazado por medio fresco. El reemplazo del medio de cultivo puede ser realizado de forma continua mediante un sistema de filtrado.

La observación de Ia evolución del cultivo puede ser realizada de forma visual cuando el dispositivo dispone de paredes transparentes o mediante Ia extracción de los soportes filamentosos cuando su disposición así Io permita.

Por último y una vez que el cultivo tridimensional ha alcanzado el tamaño deseado, se inducen comportamientos en las células mediante Ia adición de agentes químicos. En caso necesario, las células pueden recuperarse para otros fines mediante tratamiento químico, aplicando enzimas u otros agentes químicos, o mediante tratamientos físicos, que alteren las propiedades de las células adheridas y las desprendan de los soportes filamentosos. A continuación, las células se recuperan como una suspensión celular a través del puerto de recolección.

El desarrollo de cultivos tridimensionales de células adherentes sobre soportes filamentosos estáticos permite imitar con más precisión que con otros sistemas existentes el entorno de crecimiento de las células y los tejidos en Ia naturaleza, por Io que es una herramienta más útil que los cultivos bidimensionales para i) analizar Ia interacción entre células del mismo o diferente tipo; ii) estudiar Ia evolución de enfermedades; iii) producir células o; iv) producir modelos experimentales de órganos y organismos.

En el contexto de esta memoria serán de aplicación las siguientes definiciones:

Esferoide: agregado de células que forman un cultivo homogéneo con forma esferoidal y diámetro inferior a 500 micrómetros. Típicamente un esferoide puede contener un máximo de 25.000 células.

Cultivo tridimensional: agregado de células que se multiplican en varias dimensiones formando capas de células. A diferencia de Ia estructura bidimensional de los cultivos de células en monocapa, en los que las células únicamente interaccionan con otras células a través de sus paredes laterales, los cultivos tridimensionales forman estructuras en las que Ia mayor parte de las células está en contacto con otras células en toda su superficie.

Célula adherente: célula cuyo crecimiento se produce adherida a un sustrato o soporte.

Microhilo: elemento con forma filamentosa y cuya sección transversal presenta una distancia máxima entre dos puntos cualesquiera contenidos en dicha sección inferior a 1000 micrómetros.

Soporte: superficie a Ia que se adhieren las células adherentes.

Estructura de soporte: armazón al que se fijan los extremos de los soportes filamentosos.

Descripción detallada de Ia invención

El dispositivo para cultivo celular tridimensional de Ia presente invención consiste en uno o más soportes filamentosos estáticos, preferiblemente microhilos, que se encuentran sujetos al dispositivo que los contiene. Preferiblemente los microhilos se encuentran inmovilizados por ambos extremos a las paredes del dispositivo, conteniendo el dispositivo el medio de cultivo que alimenta a las células durante su crecimiento.

La disposición de los microhilos en el interior del dispositivo para cultivo tridimensional, es tal que microhilos contiguos se encuentran dispuestos de forma paralela, permitiendo el desarrollo de varias capas de células creciendo unas sobre otras sin tocar las células que crecen sobre microhilos contiguos. De forma preferible Ia distancia entre microhilos contiguos es igual o mayor a 100 micrómetros, o incluso mayor a 300 micrómetros.

En un modo de realización preferente, los extremos de uno o más microhilos se encuentran fijados a una estructura de soporte preferiblemente apilable que se introduce en el dispositivo de cultivo tridimensional y que se fija de forma desmontable al dispositivo de cultivo tridimensional formando al menos una capa de microhilos. De forma preferente, Ia estructura de soporte es un marco apilable.

En otro modo de realización preferente, el dispositivo puede contener una o más estructuras de soporte apiladas, con uno o más microhilos fijados a cada estructura de soporte formando una o más capas de microhilos. Los microhilos contenidos en las estructuras de soporte pueden disponer o no de células en su superficie. Las estructuras de soporte a las que se fijan uno o más microhilos, se separan entre sí mediante uno o más elementos espaciadores que mantienen Ia distancia deseada entre las sucesivas estructuras de soporte con uno o más microhilos. De forma preferente las estructuras de soporte contiguas se disponen de forma paralela. De forma opcional, un mismo dispositivo de cultivo celular tridimensional puede disponer de varias estructuras de soporte con uno o más microhilos a los que se adhieren células siendo las células de una estrucutura de soporte de un tipo distinto a las de otra estrucutura de soporte.

Los microhilos contenidos en el dispositivo para el cultivo celular pueden haber sido sometidos a un tratamiento de modificación superficial que afecte al modo en que las células se adhieren a los microhilos o al modo en que las células se comportan una vez adheridas.

El dispositivo puede adoptar diferentes geometrías, siendo preferible un dispositivo de forma cilindrica dispuesto con el fondo circular paralelo al suelo.

En un dispositivo para cultivo celular tridimensional con geometría circular, los microhilos se disponen unidos por sus extremos a las paredes del recipiente en el que se realiza el cultivo. En el caso de que uno o más microhilos se dispongan en una o más capas mediante el apilamiento de estructuras de soporte, se dispone cada estructura de soporte de manera perpendicular al eje del cilindro hueco que contiene al medio de cultivo. En otro modo de realización, el dispositivo para cultivo celular tridimensional posee forma de prisma rectangular en el que uno o más microhilos se fijan por sus extremos a las paredes del recipiente en el que se realiza el cultivo. En el caso de que uno o más microhilos se dispongan en una o más capas mediante el apilamiento de estructuras de soporte, se dispone cada estructura de soporte de forma horizontal y paralela al suelo. O

El tamaño preferido de los dispositivos para cultivo celular en cualquiera de sus geometrías es de 100 cm en su mayor dimensión, aunque preferiblemente el tamaño máximo es de 50 cm o incluso mejor, de 2 o incluso 1 cm en su mayor dimensión.

El dispositivo para cultivo celular tridimensional dispone de tapas tanto en Ia parte inferior como en Ia superior de manera que, junto con las paredes, forma un recipiente cerrado, impermeable tanto a líquidos como a gases. El dispositivo para cultivo celular tridimensional puede disponer de membranas de un filtro que comunica el interior y el exterior del recipiente para permitir el intercambio gaseoso de manera estéril. Adicionalmente, el dispositivo puede contener filtros para Ia entrada y salida de medio de cultivo y un puerto de inoculación en Ia parte superior y otro de recolección en Ia parte inferior.

El método para cultivo celular tridimensional de Ia presente invención se inicia tras retirar Ia tapa del dispositivo, con el llenado con una suspensión de células adherentes en medio de cultivo y Ia restitución de Ia tapa para cerrar el dispositivo.

Alternativamente, las células pueden ser introducidas en el dispositivo para cultivo celular tridimensional a través de un puerto de inoculación dispuesto en Ia parte superior del mismo.

Posteriormente el dispositivo para cultivo celular tridimensional se mantiene inmóvil para garantizar que las células sedimenten sobre Ia superficie de los soportes filamentosos y se adhieran comenzando a multiplicarse.

Transcurrido el tiempo necesario para que las células ubicadas sobre Ia superficie de los microhilos se adhieran a estos, se retira el medio de cultivo usado y es reemplazado por medio fresco. De forma opcional el medio de cultivo puede ser reemplazado continuamente al ritmo deseado a través de un sistema de filtrado que permite introducir medio de cultivo al interior del sistema mientras se retira el medio de cultivo usado de manera continua. La introducción del medio de cultivo a través del sistema de filtración permite reducir las turbulencias generadas por el recambio del medio. La evolución del cultivo tridimensional puede ser analizada visualmente mediante observación directa de las células en crecimiento sobre los soportes filamentos en el caso de que el dispositivo para cultivo tridimensional disponga de paredes transparentes. En caso de que los soportes filamentosos estén dispuestos en estructuras de soporte, éstos pueden ser extraídos para proceder a analizar el cultivo tridimensional en otro entorno.

Cuando el cultivo tridimensional ha alcanzado el tamaño deseado, se inducen comportamientos en las células en cultivo mediante Ia adición de agentes químicos. Estos agentes químicos pueden ser introducidos a través del puerto de inoculación o bien por Ia parte superior del dipositivo tras retirar Ia tapa. Estos comportamientos pueden ser, de manera orientativa aunque no limitativa, Ia inducción de Ia diferenciación celular para formar tejidos u órganos a partir de las células en cultivo, Ia inducción o inhibición de tumores, Ia inducción o inhibición de angiogénesis.

En caso necesario, las células pueden recuperarse para otros fines mediante tratamiento químico, aplicando enzimas u otros agentes químicos, o mediante tratamientos físicos, que alteren las propiedades de las células adheridas y las desprendan de los soportes filamentosos. A continuación, las células se recuperan como una suspensión celular a través del puerto de recolección o mediante Ia succión, de Ia suspensión celular por Ia parte superior del dispositivo una vez retirada Ia tapa.

De forma explicativa y no limitativa de describen los siguientes ejemplos:

Ejemplos

1- Preparación de un dispositivo para el desarrollo de cultivos celulares tridimensionales

Microhilo de 30 micrómetros de diámetro formado por un alma metálica rodeada de una cubierta vitrea fue enrollado alrededor de un marco cuadrado de acero inoxidable de 60 mm de lado y 2 mm de espesor, dejando un espacio de 600 micrómetros entre cada dos de las 100 vueltas de microhilo. A continuación, los extremos libres del microhilo se pegaron al marco metálico empleando un pegamento a base de cianocrilato. Cada marco se colocó sobre cuatro espaciadores de 2 mm de altura en el interior de un recipiente de plástico, con tapa, circular, de 8,5 cm de diámetro con tapa. Sobre el marco así dispuesto se colocó otro marco de iguales características separado del anterior por cuatro espaciadores colocados en las esquinas. Sobre este segundo marco se colocó otro marco separado del anterior del mismo modo. El conjunto de los tres marcos apilados en el interior del recipiente constituye un ejemplo de un dispositivo para Ia realización de cultivos celulares tridimensionales. - Desarrollo de un cultivo celular tridimensional

Una suspensión de células CHO-K1 a una concentración de 66.000 células por mililitro se vertió en el interior de un dispositivo para Ia realización de cultivos celulares tridimensionales que previamente había sido esterilizado mediante inmersión en etanol. A continuación, el dispositivo se introdujo en el interior de un incubador a 37 ⁰ C, 5 % de dióxido de carbono y 95 % de humedad. Cada 48 horas, el medio de cultivo se reemplazó con medio fresco. Transcurrida una semana, los cultivos se colocaron en un microscopio y se observó que las células habían crecido en capas sucesivas alrededor de los microhilos hasta generar cultivos tridimensionales de forma cilindrica y un diámetro aproximado de 500 micrómetros. - Combinación de distintos tipos celulares.

Una suspensión de células CHO-K1 a una concentración de

66.000 células por mililitro se vertió en el interior de un dispositivo para Ia realización de cultivos celulares tridimensionales que previamente había sido esterilizado mediante inmersión en etanol. En otro dispositivo de las mismas características se vertió del mismo modo una suspensión celular de células HEK293 fluorescentes a una concentración de de 60.000 células por mililitro. A continuación, ambos dispositivos se introdujeron en el interior de un incubador a 37 ⁰ C, 5 % de dióxido de carbono y 95 % de humedad. Cada 48 horas, el medio de cultivo se reemplazó con medio fresco. Al cabo de dos días y empleando los marcos contenidos en los dispositivos en cultivo, se produjo un nuevo dispositivo alternando capas de marcos con células HEK293 fluorescentes y células CHO-K1 y se continuó el cultivo del mismo modo. Al cabo de una semana de cultivo se observó Ia interacción ocurrida entre las células CHO-K1 y las células HEK293 fluorescentes que interactuaban en el cultivo tridimensional.

A- Transfección de un cultivo tridimensional. Una solución del plásmido pCMV/EGFP, que expresa Ia proteína verde fluorescente, mezclada con lipofectamina, fue introducida en el interior de un dipositivo para Ia realización de cultivos celulares tridimensionales que contenía un cultivo tridimensional de células CHO-K1. Al cabo de 24 horas se observo Ia señal fluorescente emitida por Ia proteína verde fluorescente expresada en el interior de las células que habían sido transfectadas.

5- Estructura de soporte circular en pocilios de placa multipocillos

Microhilo de 30 micrómetros de diámetro formado por un alma metálica rodeada de una cubierta vitrea fue enrollado alrededor de marcos cilindricos de plástico de 35 mm de diámetro y 1 mm de espesor, dejando un espacio de 600 micrómetros entre cada dos de las 100 vueltas de microhilo. A continuación, los extremos libres del microhilo se pegaron a los respectivos marcos circulares empleando un pegamento a base de cianocrilato. Cinco marcos así preparados se colocaron uno sobre otro separados por una arandela de plástico de 35 mm de diámetro y 0,1 mm de espesor en el interior de un pocilio de una placa multipocillo que disponía de 6 pocilios.