MILIEU NATUREL HETEROGENE

Domaine technique

La présente invention appartient au domaine technique de la caractérisation des nanomatériaux.

Elle se rapporte plus particulièrement à l'amélioration des procédures d'évaluation in vitro des caractéristiques physico-chimiques des nanomatériaux, afin de mieux prédire le comportement réel des nanomatériaux dans un milieu naturel hétérogène complexe.

Art antérieur

Les nanomatériaux sont de plus en plus utilisés dans les produits de grande consommation et trouvent de nombreuses applications notamment dans les domaines de la médecine, de la biologie, de la pharmacie et de la cosmétique. Il est donc indispensable d'obtenir des analyses précises et fiables de ces matériaux pour étudier leur comportement in vivo afin d'évaluer les mécanismes d'action, les interactions possibles avec un environnement biologique naturel et les risques éventuels pour la santé et l'environnement découlant de leur utilisation.

Les nanomatériaux sont par définition constitués de particules dont au moins une des trois dimensions (longueur, largeur ou hauteur), et généralement les trois, est comprise entre 1 et 100 nanomètres.

Du fait de leur très petite taille, les caractéristiques physicochimiques de ces nanomatériaux influencent très fortement leurs propriétés ultérieures comme leur pharmacocinétique et leur toxicité. Afin de prédire leur comportement in vivo, on souhaite mesurer des caractéristiques telles que leur taille, leur forme, leurs propriétés de surface, leur pureté, leur stabilité, ou autres.

Actuellement, la plupart de ces mesures de caractérisation sont réalisées après mise en solution des nanomatériaux dans des milieux liquides simples de type solvants organiques, dans du diméthyl-sulfoxyde (DMSO) par exemple.

Cependant, les résultats de ces mesures sont souvent très différents de ceux obtenus dans un milieu hétérogène naturel et ne reflètent pas du tout le comportement in vivo des nanomatériaux testés et notamment leur pharmacocinétique.

En effet, les milieux naturels hétérogènes, qu'ils soient physiologiques ou environnementaux, sont des milieux biologiques hétérogènes complexes qui contiennent de nombreux constituants différents pouvant interagir avec les nanoparticules. Ainsi par exemple, les protéines contenues dans le sang peuvent venir s'agréger autour des nanoparticules, modifiant ainsi la taille et la forme des nanoparticules par un effet dit « de couronne », ce qui entraîne une modification de leurs propriétés.

Or de tels effets ne sont absolument pas prévisibles à partir des mesures réalisées dans des milieux simples. Il est donc très difficile de prédire, à partir de ces résultats, le comportement réel des nanomatériaux lorsqu'ils se trouveront dans un milieu naturel hétérogène comme le sang ou l'eau d'une rivière par exemple.

Pour obtenir des résultats plus proches de la réalité, une autre approche développée dans l'art antérieur consiste à utiliser de véritables milieux biologiques pour réaliser ces mesures. On utilise pour cela des produits sanguins issus d'animaux, le plus souvent du sérum de veau fœtal.

Le problème avec de tels milieux naturels est qu'il est très difficile d'en connaître exactement la composition. En effet, elle est variable d'un individu à l'autre et est particulièrement compliquée à analyser entièrement. Il est en outre difficile de vérifier la traçabilité métrologique de ces milieux.

Il est donc quasiment impossible de garantir la reproductibilité des mesures effectuées par la suite dans ces milieux.

Par ailleurs, cette méthode nécessite l'utilisation d'animaux ce qui va à l'encontre de la directive n° 2010/63/UE de l'Union Européenne sur l'expérimentation animale, qui promeut le principe dit des « 3 » : Réduction, Raffinement et Remplacement et vise à limiter le recours à l'expérimentation animale.

On connaît également plusieurs études antérieures dans lesquelles des milieux de culture cellulaire ont été utilisés pour réaliser des mesures de caractérisation physico-chimique de nanomatériaux.

C'est notamment le cas de celle décrite par Zhaoxia et al. dans « Dispersion and Stability optimization of T1O ₂ Nanoparticles in Cell Culture Media », ENVIRONMENT AL SCIENCE & TECHNOLOGY, vol. 44, pp. 7309-7314, 2010-10-01. Cet article relate une étude comparative de la taille et de l'agglomération des nanoparticules de Ti0 ₂ lorsqu'elles sont incorporées dans six milieux de cultures différents. Les différentes mesures réalisées (diamètre hydrodynamique, index de polydispersité, potentiel Zêta, mobilité électrophorétique, pH, analyse microscopique, . ..) sont comparées avec les valeurs obtenues pour une suspension directe de particules de T1O2 dans de l'eau distillée servant de témoin. La taille des agglomérats de Ti0 ₂ dans ces milieux de culture cellulaire est mesurée pour différentes concentrations de nanoparticules de Ti0 ₂ .

L'article «Agglomération and sédimentation of T1O ₂ nanoparticles in cell culture médium», Z. E. Allouni et al., COLLOIDS AND SURFACES B, BIOINTERFACES, vol. 68, pp. 83-87, 2009-01-01, décrit une étude similaire. Les milieux de culture utilisés sont de type RPMI et les auteurs étudient les effets de la concentration, de la force ionique, du pH, et de l'ajout de sérum de veau fœtal (FBS) et d'albumine de sérum humaine (HSA) sur la stabilité colloïdale des nanoparticules de T1O2.

L'article «Physicochemical characterization of engineered nanoparticles under physiological conditions: Effect of culture média components and particle surface coating», J. Fatisson et al, COLLOIDS AND SURFACES B, BIOINTERFACES, vol. 91 , pp. 198-204, 2011-10-31, décrit une troisième étude portant sur un ensemble de six nanoparticules différentes placées dans plusieurs milieux, dont entre autres deux milieux de culture cellulaire (DMEM et F12-K).

Dans tous ces articles, les milieux de culture cellulaire sont choisis arbitrairement par les auteurs, comme autant de représentants de la diversité des milieux complexes. Les auteurs ne les utilisent pas de façon conjointe, ils constatent simplement que des variations des caractéristiques physico-chimiques mesurées existent d'un milieu à un autre. Les résultats ne sont pas combinés les uns avec les autres pour obtenir un résultat commun, mais simplement présentés en parallèle, leur analyse finale étant simplement comparative.

Ces articles ne divulguent aucun kit de simulation d'un milieu naturel hétérogène particulier, ni aucun procédé d'obtention ou d'utilisation d'un tel kit. Dans ces études, aucun milieu naturel hétérogène est cité ou choisi dans le but d'être simulé par l'ensemble de ces mesures ou de ces milieux. Et, ces études ne permettent pas d'étudier l'influence des différents constituants ou groupes de constituants d'un tel milieu naturel hétérogène sur les mesures physico-chimiques des nanoparticules.

Enfin, tous ces articles concluent à l'amélioration de la stabilité des nanoparticules lorsque du sérum de veau fœtal (FBS) est ajouté au milieu de culture cellulaire. L'homme du métier est ainsi fortement incité, par l'ensemble de ces articles, à rajouter dans les milieux de mesure un produit issu d'animaux, ce qui est parfaitement contraire à l'objectif visé par l'invention et empêche toute de traçabilité métrologique des analyses réalisées.

L'objectif de l'invention est de pallier les inconvénients de ces méthodes de l'art antérieur, tout en améliorant considérablement la prédictibilité du comportement réel des nanomatériaux dans les milieux naturels hétérogènes. Plus précisément, il s'agit de simuler ou mimer un milieu naturel hétérogène à partir d'un ensemble de milieux de culture cellulaire utilisés conjointement, afin d'identifier les éléments du milieu naturel qui interagissent avec les nanoparticules et contribuent à modifier leurs propriétés physico-chimiques en combinant les résultats obtenus.

Les milieux de culture synthétiques utilisés pour mimer ces milieux naturels hétérogènes peuvent être constitués d'une centaine d'éléments. Faire varier indépendamment chacun de ces composants reviendrait à réaliser plus de 10 ³⁰ expériences, ce qui serait totalement impossible en pratique.

La solution proposée dans l'invention consiste à utiliser conjointement (et non indépendamment comme dans les articles identifiés précédemment) un échantillon de milieux de mesure judicieusement choisis (et non arbitrairement comme dans ces articles). Une fois les mesures réalisées sur tous ces milieux, l'ensemble des réponses récoltées sont utilisées conjointement pour résoudre un système de d'équations de grandes dimensions, connu sous le nom de problème « large p small n » en apprentissage statistique, grâce à des méthodes de régression particulières permettant de trouver la solution du problème. L'utilisation de telles méthodes de régression n'est pas non plus divulguée dans ces articles dans l'art antérieur.

Exposé de l'invention

L'invention propose un kit de simulation de milieux natrurels hétérogènes comprenant un ensemble de milieux de mesures qui sont entièrement synthétiques et donc sans aucun produit issu des animaux.

Leur composition est parfaitement connue, définie et traçable.

De plus, grâce au procédé d'obtention de ce kit de simulation et au procédé de prédiction de l'invention, il est possible d'identifier les composants des milieux naturels hétérogènes qui sont à l'origine de modifications et variations de propriétés physico-chimiques des nanoparticules lorsqu'elles sont incorporées dans ces milieux hétérogènes, et ainsi d'obtenir pour de nombreux milieux naturels hétérogènes des résultats beaucoup plus fiables et réalistes que ceux obtenus dans l'art antérieur à partir de milieux simples.

Pour cela, l'invention enseigne un procédé d'obtention d'un kit de simulation d'un milieu naturel hétérogène pour la réalisation de mesures d'une caractéristique physico-chimique d'un nanomatériau permettant d'étudier l'influence de constituants ou de groupes de constituants ou de paramètres du milieu naturel hétérogène sur cette caractéristique physico-chimique du nanomatériau lorsqu'il est incorporé dans ce milieu naturel hétérogène.

Ce procédé comporte les étapes suivantes:

- on choisit le milieu naturel hétérogène à simuler ;

- on choisit les constituants ou groupes de constituants de ce milieu dont l'influence est à étudier ;

- on définit les valeurs limites des proportions dans lesquelles ces constituants ou groupes de constituants sont rencontrés dans le milieu naturel hétérogène ;

- on choisit la caractéristique physico-chimique du nanomatériau à mesurer et on définit un protocole de mesure à suivre pour réaliser cette mesure ;

- on recense un ensemble de milieux de culture cellulaire définis, disponibles commercialement ;

- on réduit le nombre de milieux recensés en écartant éventuellement:

les milieux qui sont pas compatibles avec le protocole de mesure défini,

. les milieux qui ne contiennent pas les constituants ou groupes de constituants choisis,

. les milieux qui contiennent les constituants ou groupes de constituants choisis dans des proportions qui ne sont pas comprises entre les valeurs limites définies,

. les milieux qui contiennent les constituants ou groupes de constituants choisis dans des proportions sensiblement identiques à un autre milieu recensé, de manière à ne conserver qu'un seul de ces milieux ;

- on sélectionne parmi cet ensemble réduit de milieux recensés un échantillon de plusieurs milieux de culture contenant les constituants ou groupes de constituants choisis dans des proportions différentes ;

- on se procure ou on réalise les milieux sélectionnés ;

- on forme un lot de milieux de mesure comprenant les milieux sélectionnés, à utiliser conjointement pour réaliser des mesures de la caractéristique physicochimique du nanomatériau selon le protocole de mesure défini, qui constitue le kit de simulation du milieu naturel hétérogène choisi.

Selon un mode de réalisation de l'invention, l'échantillon sélectionné contient un nombre inférieur ou égal à 20 milieux de culture cellulaire, de préférence entre 5 et 20 milieux de culture cellulaire, plus préférentiellement entre 5 et 15 milieux de culture cellulaire, et encore plus préférentiellement environ 10 milieux de culture cellulaire.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le milieu naturel hétérogène est choisi parmi le sang, un produit sanguin, la lymphe, la salive, les sécrétions corporelles, le sperme, le lait ou l'eau d'une rivière ou d'un étang.

Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, le milieu naturel hétérogène choisi est le sang humain et les constituants ou groupes de constituants sont choisis parmi les protéines, les acides aminés, les vitamines ou les sels minéraux rencontrés dans le sang humain.

Le lot de milieux de mesure peut ainsi constituer un panel représentatif des différents constituants rencontrés dans le sang humain, ou plus spécifiquement des acides aminés ou des vitamines ou des sels minéraux ou des protéines pouvant être rencontrés dans le sang humain.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé comporte en outre l'étape suivante :

- on ajoute dans le lot de milieux de mesure un solvant organique simple servant de témoin.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé comporte en outre les étapes suivantes:

- on réalise un milieu de mesure supplémentaire, qui est un milieu de culture cellulaire défini, compatible avec le protocole de mesure défini, à partir de ses constituants de base ou en mélangeant plusieurs milieux de culture cellulaire recensés, et

- on l'ajoute dans le lot de milieux de mesure.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé comporte en outre les étapes suivantes:

- on choisit le paramètre du milieu naturel hétérogène dont l'influence est à étudier ;

- on définit des valeurs limites de ce paramètre rencontrées dans le milieu naturel hétérogène ;

- on réduit également le nombre de milieux recensés en écartant éventuellement les milieux dont la valeur du paramètre n'est pas comprise entre les valeurs limites définies ; et en ce que, pendant l'étape de sélection d'un échantillon,

- on sélectionne parmi l'ensemble réduit de milieux recensés un échantillon de plusieurs milieux de culture contenant les constituants ou groupes de constituants choisis dans des proportions différentes et dont le paramètre présente une valeur différente.

L'invention enseigne également un kit de simulation d'un milieu naturel hétérogène obtenu par le procédé exposé ci-dessus.

L'invention enseigne également l'utilisation d'un tel kit de simulation pour la réalisation de mesures d'une caractéristique physico-chimique d'un nanomatériau.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le nanomatériau est incorporé dans tous les milieux de mesure du kit de simulation. Au moins une mesure est réalisée avec chacun de ces milieux et les résultats de ces mesures sont analysés conjointement.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la caractéristique physico -chimique mesurée est la taille, la forme, la composition, la pureté, les propriétés de surface ou la stabilité du nanomatériau.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les mesures sont réalisées par microscopie, spectroscopie, diffusion dynamique de la lumière, dichroïsme circulaire, résonance magnétique nucléaire, cristallographie, mesure du potentiel zeta, ou par diffusion des rayons X aux petits angles.

Selon un mode de réalisation, le kit de simulation de l'invention est utilisé pour étudier l'effet couronne dû aux interactions entre le nanomatériau et les protéines du milieu naturel hétérogène.

Enfin, l'invention enseigne un procédé de prédiction d'une caractéristique physico -chimique d'un nanomatériau incorporé dans un milieu naturel hétérogène ou de l'influence de constituants ou de groupes de constituants ou d'un paramètre de ce milieu naturel hétérogène sur l'évolution de cette caractéristique physico-chimique, au moyen d'un kit de simulation de ce milieu naturel hétérogène obtenu par le procédé selon l'invention.

Ce procédé de prédiction comprend les étapes suivantes:

- planification statistique du déroulement de la procédure expérimentale pendant laquelle la caractéristique physico-chimique du nanomatériau incorporé dans des milieux de mesure dudit kit de simulation sera mesurée d'après le protocole de mesure défini, qui spécifie :

. la nature des milieux de mesure dudit kit de simulation à utiliser pour réaliser ces mesures,

. le nombre de répétition de chacune des mesures à réaliser, et

. l'ordre des mesures à réaliser,

- incorporation du nanomatériau dans les milieux de mesure dudit kit de simulation spécifiés dans la procédure expérimentale ;

- réalisation de mesures de la caractéristique physico-chimique du nanomatériau incorporé dans ces milieux de mesure, avec le nombre de répétition et dans l'ordre spécifié dans la procédure expérimentale,

- analyse statistique des résultats des mesures réalisées et déduction à partir de cette analyse d'une prédiction de la caractéristique physico-chimique du nanomatériau lorsqu'il est incorporé dans le milieu naturel hétérogène ou de l'influence de ces constituants ou groupes de constituants ou de ce paramètredu milieu naturel hétérogène sur l'évolution de cette caractéristique physico-chimique.

Brève description des figures

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui va suivre, description faite en référence aux dessins annexés, dans lesquels :

. la figure 1 est un schéma de principe illustrant les différentes étapes d'un procédé d'obtention d'un kit de simulation selon l'invention ; et

. la figure 2 est un schéma de principe illustrant les différentes étapes d'un procédé de prédiction du comportement d'un nanomatériau à partir d'un kit de simulation selon l'invention.

Exposé détaillé de l'invention

Le principe de l'invention consiste à utiliser un nouveau type de milieu pour réaliser des mesures de caractérisation physico-chimique de nanomatériaux.

Il ne s'agit plus ni de solvants organiques simples (DMSO par exemple), ni de milieux complexes issus d'animaux (plasma sanguin, sérum de veau fœtal...) comme dans l'art antérieur, mais d'un ensemble de milieux complexes entièrement synthétiques, c'est-à-dire artificiels et sans composants issus d'animaux, et dont la composition est définie, reproductible d'un échantillon à l'autre et parfaitement connue.

Les milieux synthétiques utilisés sont des milieux qui sont traditionnellement utilisés pour une application différente dans un domaine technique éloigné. Il s'agit en effet de milieux élaborés et commercialisés pour réaliser des cultures cellulaires. Selon l'invention, on utilise ces milieux de culture cellulaire pour une application différente : la réalisation de mesures de caractérisation de nanomatériaux.

En outre, pour réaliser ces mesures, on n'utilise pas un milieu de culture cellulaire unique, mais un ensemble ou lot de milieux de cultures cellulaires judicieusement sélectionnés parmi les milieux de culture cellulaire disponibles commercialement pour être représentatif de l'hétérogénéité du milieu naturel hétérogène ciblé et qui forment ainsi un kit de simulation de ce milieu naturel hétérogène.

Comme on le verra par la suite, un petit nombre de milieux, spécifiquement fabriqués à partir de leurs ingrédients de base, peut être rajouté à ces milieux commerciaux.

Ce lot de milieux de cultures cellulaires est spécifiquement sélectionné en fonction de différents critères, tels que la nature du nanomatériau, du milieu naturel hétérogène que l'on souhaite simuler, des mesures à réaliser et des appareils devant être utilisés pour cela, et en fonction du type de questions auxquelles on souhaite répondre à l'aide de ces mesures. Ce lot est sélectionné de manière à former un panel représentatif de paramètres ou de constituants pouvant être rencontrés dans le milieu naturel hétérogène ciblé et constitue ainsi un kit de simulation de ce milieu naturel hétérogène.

Les milieux du kit de simulation de l'invention ne sont pas utilisés indépendamment les uns des autres, mais conjointement. Les résultats des différentes mesures réalisées dans chacun de ces milieux sont analysés conjointement afin de résoudre un problème mathématique complexe consistant à inverser une équation matricielle de grande dimension comme il sera expliqué ci- après, et ainsi de modéliser le milieu naturel hétérogène ciblé. Ils contribuent ensemble à l'établissement d'une conclusion générale globale relative au comportement du nanomatériau dans le milieu naturel hétérogène simulé.

L'objectif du procédé de prédiction selon l'invention est d'une part de pouvoir caractériser des écarts de comportement du nanomatériau lorsqu'il se trouve incorporé à un milieu naturel hétérogène, et d'autre part de pouvoir en plus déterminer le ou les composants biologiques du milieu naturel hétérogène qui sont à l'origine de ces écarts. Avantageusement, le procédé de prédiction selon l'invention permet de répondre à plusieurs types de questions, notamment :

- l'identification de grandes familles biologiques (par exemple : les protéines, les vitamines, les acides aminés, les sels minéraux...) du milieu naturel hétérogène ciblé, pouvant être responsables de variations significatives des mesures lorsque le nanomaténau est incorporé dans ce milieu naturel hétérogène ;

- l'identification plus précise, parmi les membres de cette famille biologique identifiée, des composants biologiques responsables de ces variations significatives de mesures ;

- la prédiction des effets de la concentration de ces composants biologiques sur les caractéristiques physicochimiques mesurées ;

- l'analyse raffinée des effets additifs ou synergiques des composants biologiques sur les variations de mesure ;

- l'analyse de l'effet couronne dû aux interactions entre le nanomaténau et les différentes protéines du milieu naturel hétérogène ;

- la prédiction des effets de certains paramètres du milieu naturel hétérogène ciblé, comme par exemple sa viscosité, son pH ou autre, sur les caractéristiques physico chimiques mesurées.

Avantageusement, les milieux de culture cellulaires sélectionnés pour former le lot de milieux de mesure du kit de simulation selon l'invention sont différents selon la question à laquelle on souhaite répondre et forme un panel adapté à celle-ci.

Les différentes étapes du procédé permettant d'obtenir un kit de simulation selon l'invention ont été représentées schématiquement sur la figure 1.

Le procédé comprend une phase préliminaire non représentée au cours de laquelle on définit le milieu naturel hétérogène que l'on souhaite simuler, les constituants ou groupes de constituants de ce milieu dont on veut étudier l'influence, ainsi que les valeurs limites des proportions dans lesquelles ces constituants ou groupes de constituants sont rencontrés dans le milieu naturel hétérogène.

On peut éventuellement définir également un ou plusieurs paramètres du milieu naturel hétérogène dont on souhaite étudier l'influence, ainsi que les valeurs limites de ce paramètre rencontrées dans le milieu naturel hétérogène.

On choisit également le nanomatériau à étudier, et plus particulièrement la caractéristique physico-chimique de ce nanomatériau que l'on souhaite mesurer. On définit alors un protocole de mesure à suivre pour réaliser cette mesure, c'est-à-dire qu'on choisit le principe ou la technique de mesure employé, ainsi que l'appareillage utilisé et, en fonction de la procédure à suivre pour réaliser la mesure, on définit les éventuels critères à respecter pour les milieux de mesure ou les éventuels critères d'incompatibilité qui empêcheraient certains milieux de mesure de suivre le protocole de mesure.

Une fois cette phase préalable accomplie, la première étape représentée consiste à recenser des milieux de culture cellulaire disponibles commercialement et qui sont ainsi susceptibles d'être utilisés pour servir de milieux de mesure pour le lot.

Pour cela, on peut utiliser des bases de données publiques ou privées listant ces milieux de culture, par exemple les bases de données mises à disposition par les fabricants de milieux de culture cellulaire, ou encore constituer une base de données dédiée à cet usage.

On analyse cette base pour en extraire les milieux de culture cellulaire potentiellement utilisables.

On ne souhaite garder que les milieux entièrement synthétiques, c'est-à-dire artificiels et sans aucun constituant issu d'un animal, et dont la composition est entièrement connue et garantie par le fabricant pour être identique d'un échantillon à l'autre. On veut en effet maîtriser l'incertitude dès le début du procédé, afin de garantir la traçabilité métrologique et obtenir une bonne reproductibilité des résultats des mesures.

Les milieux de culture cellulaire cherchent à reproduire les conditions de l'environnement cellulaire in vivo. Ils contiennent des éléments nutritifs, des éléments servant à maintenir les conditions physicochimiques comme le pH ou l'osmolarité, une base permettant la prolifération des cellules.

Actuellement, on en trouve deux sortes sur le marché : ceux constitués par l'association d'un milieu artificiel de base et de sérum d'origine animale (le plus performant étant le sérum de veau fœtal) et ceux appelés « milieux définis » formés d'un milieu artificiel de base sans sérum enrichi en facteurs rigoureusement contrôlés en vue d'être reproductibles.

Seuls les milieux définis seront donc conservés et utilisés dans le cadre de l'invention.

Parmi les milieux retenus, on élimine encore un certain nombre de milieux de culture qui ne conviennent pas pour l'application considérée.

On écarte ainsi les milieux de culture cellulaires qui sont aberrants par rapport au milieu naturel hétérogène ciblé, c'est-à-dire ceux dont les paramètres ou la composition sont trop éloignés de ceux pouvant être rencontrés dans ce type de milieu naturel hétérogènes.

On écarte donc les milieux qui ne contiennent pas les constituants ou groupes de constituants choisis pendant la phase préalable, ainsi que les milieux qui les contiennent dans des proportions qui ne sont pas comprises entre les valeurs limites définies.

De la même façon, on peut également écarter les milieux dans lesquels le paramètre choisi n'est pas compris entre les valeurs limites préalablement définies pour celui-ci.

En effet, les milieux naturels ciblés peuvent être de différentes natures. Il peut s'agir d'un milieu biologique physiologique humain ou animal, tel que par exemple du sang, de la lymphe, de la salive, des sécrétions corporelles, du sperme, du lait... , ou d'un milieu biologique environnemental, notamment l'eau d'une rivière, d'un étang ou autre, selon que l'on souhaite étudier l'impact des nanomatériaux sur la santé ou l'environnement.

Les milieux de culture cellulaires définis disponibles sur le marché sont très variés et renferment plus de 14 familles de composants pouvant contenir chacune plusieurs dizaines de composants. Il est donc possible d'obtenir à partir de ces milieux un échantillonnage de l'ensemble des composants potentiellement présents dans le milieu naturel hétérogène ciblé.

On écarte également les milieux de culture cellulaires qui ne sont pas compatibles avec le protocole de mesure à réaliser, en se basant sur les éventuels critères d'incompatibilité préalablement définis. On écarte ainsi les éventuels milieux qui sont incompatibles avec les appareillages ou les techniques de mesure envisagées.

Selon la nature des nanomatériaux et des caractéristiques physiœchimiques à mesurer (taille, forme, propriétés de surface, composition, pureté, stabilité... du nanomatériau) différents appareillages ou instruments de mesure peuvent être utilisés, notamment un microscope (par exemple un microscope optique en champ proche, microscope électronique à balayage, microscope électronique en transmission, microscope à effet tunnel, microscope à force atomique), un spectroscope (par exemple un spectroscope de corrélation de fluorescence, spectroscope Raman, spectroscope infrarouge, spectroscope de masse), un appareil de résonance magnétique nucléaire, un appareil mesurant la diffusion (la diffusion dynamique de la lumière ou la diffusion des rayons X aux petits angles par exemple), un appareil de mesure du dichroïsme circulaire, un appareil de mesure du potentiel Zeta, un appareil de cristallographie aux rayons X, ou autres.

Les milieux de culture cellulaire incompatibles ayant été écartés, les mesures sont réalisables avec pas ou peu de modifications de ces appareillages existants.

Afin de limiter le nombre de milieux, on élimine également les milieux redondants, c'est-à-dire les milieux dont les caractéristiques de composition biologique sont proches et qui constituent des « amas » du point de vue statistique. Pour chacun de ces amas, on ne conserve qu'un seul milieu de culture cellulaire.

On élimine ainsi les milieux qui contiennent les constituants ou groupes de constituants choisis dans des proportions identiques ou très proches de celles d'un autre milieu recensé, de manière à ne conserver qu'un seul de ces milieux.

Cette opération d'élimination des amas est préférentiellement effectuée selon des principes d'analyse statistiques en fonction de l'écart minimal de composition que l'on souhaite entre les différents milieux, et par exemple en utilisant l'algorithme de Wootton, Sergent, Phan-Tan-Luu ou l'algorithme d'échange de Fedorov appliqué à un critère d'optimalité.

Après avoir mené ces différentes opérations d'élimination, on dispose d'un ensemble réduit de milieux de culture cellulaire disponibles utilisables.

Lorsque cet ensemble réduit comporte des lacunes, c'est-à-dire des zones de composition ou de valeur de paramètres potentiellement rencontrées dans le milieu naturel hétérogène ciblé qui ne sont pas représentées par les milieux de culture cellulaire de l'ensemble réduit de milieux, il est possible de compléter cet ensemble afin d'obtenir une répartition plus homogène des milieux et ainsi de « réparer » ces lacunes.

Pour cela, on définit des milieux supplémentaires qui se trouvent dans la ou les lacunes à réparer, c'est-à-dire dont la composition ou les paramètres appartiennent à la zone non représentée.

Lorsque c'est possible, on choisit préférentiellement comme milieux supplémentaires des milieux de culture cellulaire composites, c'est-à-dire pouvant être obtenus par simple mélange de plusieurs milieux de culture déjà existants et disponibles commercialement, préférentiellement choisis parmi l'ensemble réduit des milieux recensés.

Dans le cas contraire, on choisit comme milieux supplémentaires des milieux nouveaux qui sont simplement définis par leur composition et qui doivent être obtenus spécifiquement par synthèse directe à partir de leurs constituants de base.

La nature et le nombre des milieux supplémentaires à rajouter pour réparer les lacunes, la composition précise de ces milieux lorsqu'ils doivent être synthétisés à partir des ingrédients de base, ou les lois de mélange à respecter pour les obtenir à partir de milieux de culture disponibles commercialement sont déterminés par un algorithme de réparation dont un exemple est donné à titre d'illustration dans le tableau 1 ci-dessous.

Ces milieux supplémentaires sont élaborés de manière à respecter les contraintes techniques liées à l'utilisation des appareils de mesure, en terme d'acidité et de viscosité par exemple.

Une fois l'ensemble réduit de milieux complété par les milieux supplémentaires ainsi définis, on obtient un ensemble uniforme de milieux de culture cellulaire. On peut alors sélectionner dans cet ensemble, ainsi reconditionné, un panel uniforme présentant les propriétés mathématiques adaptées pour obtenir la précision recherchée pour résoudre le problème mathématique exposé ci-après.

Tableau 1 : illustrant les étapes d'un exemple d'algorithme de réparation des lacunes d'un ensemble réduit de milieux recensés et de sélection d'un panel uniforme.

Selon une autre variante de l'invention, cette étape de réparation des lacunes peut être réalisée après l'étape de sélection exposée ci-dessous. Dans ce cas, seules les éventuelles lacunes se trouvant dans le sous-ensemble sélectionné sont à réparer pour obtenir un panel sensiblement uniforme.

L'étape suivante consiste à sélectionner parmi cet ensemble réduit de milieux de culture cellulaire recensés, éventuellement complété par des milieux supplémentaires, un échantillon de plusieurs milieux de culture contenant les constituants ou groupes de constituants choisis dans des proportions différentes. Cet échantillon est un sous-ensemble contenant un nombre limité de ces milieux de manière à former un panel représentatif des constituants ou groupes de constituants choisis du milieu naturel hétérogène ciblé.

Si l'étude de l'influence d'un paramètre est réalisée, l'échantillon sélectionné contient plusieurs milieux de culture dans lesquels le paramètre choisi présente des valeurs différentes.

La sélection est réalisée au moyen d'un algorithme de traitement statistique de l'ensemble des données qui permet d'identifier un nombre limité de milieux dont la composition est la plus diversifiée possible afin de former un échantillonnage représentatif de la complexité du milieu naturel ciblé (voir par exemple le tableau 1).

Le nombre de milieux sélectionnés lors de cette étape peut être préalablement défini par l'utilisateur, ou peut dépendre du degré de précision que l'on souhaite atteindre

Ce nombre de milieux reste toutefois limité à un nombre raisonnable, nettement inférieur au nombre de milieux de culture cellulaire initialement recensé, et de préférence inférieur ou égal à 20 milieux, plus préférentiellement voisin de 10 milieux.

La nature des milieux sélectionnés dépend également du phénomène que l'on souhaite étudier et de la question à laquelle on souhaite répondre, afin d'obtenir un échantillon ou panel spécifiquement adapté à ceux-ci.

Ainsi par exemple, on peut sélectionner un panel général représentatif des différentes grandes familles de composants présents dans le milieu naturel hétérogène si l'on souhaite savoir si une ou plusieurs de ces familles sont responsables de variations significatives des mesures physicochimiques du nanomatériau.

Alternativement, on peut sélectionner un panel plus spécifique dans lequel seront représentés les différents membres d'une même famille de composant du milieu naturel hétérogène, si l'on souhaite identifier de façon plus précise, le ou les composants particuliers dans cette famille responsables des variations détectées.

De tels panels spécifiques peuvent par exemple porter sur les protéines, les acides aminés, les vitamines ou les sels minéraux présents dans le sang humain.

Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, on peut privilégier lors de cette sélection les milieux de culture cellulaire directement disponibles dans le commerce par rapport aux milieux supplémentaires.

La sélection des milieux appartenant à cet échantillon se fait au moyen d'un algorithme de sélection basé sur des lois statistiques et des modèles mathématiques établis selon la question à laquelle on souhaite répondre. On en trouvera un exemple ci-dessous dans le tableau 2.

Tableau 2 : illustrant les étapes d'un exemple d'algorithme de sélection des milieux du lot de milieux de mesure du kit de simulation selon l'invention en fonction de l'objectif de l'analyse.

Une fois les milieux appartenant à l'échantillon ou panel sélectionnés, il convient de réaliser un lot de milieux de mesure en se procurant ou en réalisant les milieux sélectionnés.

Les milieux de culture cellulaires directement disponibles commercialement peuvent être simplement achetés chez le fabricant correspondant.

Les milieux supplémentaires sont synthétisés directement à partir de leurs composants de base ou sont obtenus plus simplement en réalisant des mélanges appropriés de milieux commerciaux selon les compositions ou les lois de mélange précédemment définies à l'étape de réparation des lacunes.

Le lot de milieux de mesure comprenant les milieux de culture cellulaire ainsi obtenus ou réalisés constitue le kit de simulationselon l'invention.

Selon une variante de l'invention, en plus de cet ensemble de milieux de culture cellulaire, on peut ajouter dans ce lot de milieux de mesure un milieu de mesure témoin, notamment un solvant organique classique tel que de la DMSO.

Ce milieu témoin permet d'évaluer le comportement du nanomatériau lorsqu'il n'est pas influencé par la présence des différents constituants du milieu naturel hétérogène et ainsi de déterminer l'ampleur des modifications liées à cette interaction, en comparant les résultats des mesures de caractérisation réalisées dans ce milieu témoin avec ceux obtenus dans les milieux de culture cellulaire.

Le kit de simulation selon l'invention peut ensuite être utilisé pour réaliser des mesures de caractérisation d'un nanomatériau dans le cadre du procédé de prédiction de l'invention. Les différentes étapes de ce procédé de prédiction ont été illustrées schématiquement sur la figure 2.

La première étape consiste à planifier les opérations de mesure devant être réalisées à partir du nanomatériau à étudier et du lot de milieux de mesure. Une procédure expérimentale est ainsi établie en fonction du phénomène que l'on souhaite étudier (de la question à laquelle on souhaite répondre) et de la précision désirée, au moyen d'un algorithme basé sur des règles statistiques. Cet algorithme est préférentiellement mis en œuvre par un logiciel adapté, spécifiquement développé pour cela.

Par cet algorithme, on obtient le plan précis à suivre pour réaliser les expériences. Il indique en effet à l'opérateur quels sont les milieux de mesure du kit de simulation qu'il doit utiliser, dans quel ordre il doit accomplir les mesures et combien de fois chaque mesure doit être répétée.

En effet, en répétant chaque mesure un certain nombre de fois dans un ordre aléatoire, on s'assure d'obtenir des résultats plus fiables selon des lois statistiques bien connues de l'homme du métier

Une fois le déroulement de la procédure expérimentale déterminé, l'opérateur n'a plus qu'à la suivre pour effectuer les mesures. Il prépare les solutions nécessaires en incorporant le nanomatériau dans les milieux de mesure indiqués dans la procédure et réalise les mesures physicochimiques demandées, dans l'ordre spécifié par la procédure et avec un nombre de répétition conforme à celui-ci. Les résultats des différentes mesures sont ensuite enregistrés et analysés conjointement de façon statistique. On peut ainsi évaluer les effets des paramètres ou des constituants des milieux de mesure sur les grandeurs physicochimiques mesurées et à élaborer un modèle mathématique représentatif du comportement du nanomatériau dans le milieu complexe ciblé.

L'interprétation conjointe de ces résultats permet alors de prédire par déduction qu'elle sera la valeur de la caractéristique physico-chimique étudiée du nanomatériau lorsqu'il sera incorporé dans le milieu naturel hétérogène ciblé, ou comment celle-ci évoluera en fonction des différents paramètres ou constituants de ce milieu naturel hétérogène, ou encore quels paramètres ou constituants de ce milieu naturel hétérogène seront responsables de cette évolution.

Pour analyser ces résultats, le problème mathématique à résoudre présente la forme suivante :

Y = X . B

avec :

Y: le vecteur ou la matrice des variables physico-chimiques mesurées ;

X: la matrice correspondant aux concentrations relatives des composants au sein de chaque milieu de mesure du kit.

X a autant de lignes n que le nombre de milieux de mesure au sein du kit. X a autant de colonnes p que le nombre de composants présents dans le milieu naturel hétérogène.

Le nombre de colonnes de X est beaucoup plus grand que le nombre de lignes (p»n).

Chaque coefficient de X prend des valeurs entre 0 et 1 ; et

B: le vecteur ou la matrice des coefficients liés aux effets de chaque composant du milieu naturel hétérogène sur les mesures de caractérisation réalisées.

Si la valeur d'un coefficient est nulle, le composant biologique associé à ce coefficient n'a aucun impact sur les variations des mesures. Les coefficients de B sont les inconnues du problème que l'on cherche à déterminer grâce à l'invention.

On constate donc que, pour résoudre ce problème et répondre à l'objectif de l'invention, les mesures réalisées dans chaque milieu de mesure doivent être analysées conjointement afin de pouvoir résoudre cette équation matricielle. De plus, la précision des résultats de cette analyse dépend du choix des milieux de mesure utilisés.

Un exemple d'algorithme de planification expérimentale et d'analyse statistique des données expérimentales mesurées a été représenté dans le tableau 3 ci-dessous.

Tableau 3 : illustrant les étapes d'un exemple d'algorithme de planification des expériences de mesure et d'analyse statistiques des données expérimentales mesurées.

Grâce au procédé de prédiction selon l'invention, on améliore considérablement la prédictibilité entre les mesures in vitro et les mesures in vivo et on identifie les composants biologiques à l'origine des modifications physicochimiques sur les nanoparticules, tout en ne réalisant qu'un nombre acceptable d'expériences, par exemple compris entre 40 et 100 mesures, à l'aide du kit de simulation selon l'invention qui ne comprend qu'un nombre limité de milieux, préférentiellement inférieur à 20 et par exemple environ une dizaine.

Ce nombre de milieux du kit de simulation selon l'invention est nettement inférieur à la centaine de milieux biologiques issus d'animaux couramment utilisés dans l'art antérieur pour un résultat moins satisfaisant.

Comprendre dès les premières analyses quels composants biologiques du milieu naturel hétérogène interagissent avec les nanoparticules permet aux concepteurs de ces nano-produits de modifier leur forme ou leur écart de surface pour réduire le risque de complications ultérieures notamment durant les tests in vivo.

En outre, l'invention apporte une nouvelle solution qui permet de mesurer des caractéristiques physico-chimiques dans des milieux hétérogènes complexes sans expérimentation animale. Elle répond donc à deux des recommandations 3R de la directive sur les expérimentations animales : Remplacement et Réduction.

De plus, comme il n'y a pas besoin de développer et/ou de synthétiser de nouveaux milieux de mesure complexes spécifiques, mais uniquement d'utiliser un petit nombre de milieux de culture cellulaire commerciaux, qui sont généralement vendus à prix modique, éventuellement complétés par un petit nombre de mélanges de ces milieux ou de milieux de culture aisément fabriqués à partir d'ingrédients basiques peu coûteux, le prix de revient du kit de simulation selon l'invention est peu élevé.

Le nombre de mesures à réaliser étant raisonnable, l'ensemble du procédé de prédiction est relativement rapide à mettre en œuvre, pour un coût qui reste limité.

De manière évidente, l'invention ne se limite pas aux modes de réalisation préférentiels décrits précédemment et représentés sur les différentes figures, l'homme du métier pouvant y apporter des modifications et imaginer d'autres variantes sans sortir du cadre de l'invention défini par les revendications annexées.