Lichtrastermikroskop mit Autofokusmechanismus

Die Erfindung bezieht sich auf ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Autofokusvorrichtung, insbesondere ein Lichtrastermikroskop mit einem Anregungs- und einem Detektionsstrahlengang, Mitteln zur rasternden Abtastung eines Objektes durch Verschieben eines abgebildeten Spot- oder Multispotbereiches über das Objekt und einem den Spot- oder Multispotbereich abbildenden Objektiv, wobei für das Objektiv ein Fokusverstellmechanismus vorgesehen ist.

Lichtrastermikroskope sind im Stand der Technik bekannt, hierzu wird beispielsweise auf die DE 197 02 753 A1 oder die DE 102 57 237 A1 verwiesen, die ein als Laserscanningmikroskop ausgebildetes Lichtrastermikroskop beschreibt. In diesem Zusammenhang sei angemerkt, daß hier unter dem Begriff "Licht" der gesamte den optischen Gesetzen gehorchende Bereich der Strahlung verstanden wird.

Lichtrastermikroskope erreichen ein Objektbild üblicherweise durch Abbildung des genannten Spot- oder Multispotbereiches mit einer Detektion, die keine Struktur des Spots oder der Multispots auflöst (z.B. konfokale Detektion). Verschieben des Spot- oder Multispotbereiches über das Objekt liefert das Bild. Am Detektor liegt immer nur Strahlungsinformation zum jeweiligen Spot- bzw. Multispotbereich vor, und ein elektronisches Zusammenfügen dieser Bildinformation unter Berücksichtigung der Verschiebung des Spot- oder Multispotbereiches führt zum gewünschten Bild. Konfokale Detektion ist dabei eine Möglichkeit, eine sehr hohe Tiefenauflösung zu erreichen. Die Signalauswertung ist dann im wesentlichen auf die Fokalebene eingeschränkt, da außerhalb der Fokalebene liegende Bereiche keine wesentliche Signalinformation bei der konfokalen Detektion liefern; sie werden vor oder hinter die Konfokalblende abgebildet.

Die Einstellung der Fokalebenenlage ist damit für ein Lichtrastermikroskop, insbesondere wenn es mit konfokaler Detektion arbeitet, äußerst wichtig. Dies gilt insbesondere, wenn man eine

Probe verwendet, die dicker ist als der Schärfentiefebereich des Objektivs. Man muß dann vor der Messung in der Probe diejenige Ebene anfahren, die vermessen werden soll. Zwar sind bei üblichen Lichtrastermikroskopen die Fokusverstellmechanismen hochpräzise, was es erlauben würde, zuerst eine bekannte Referenzfläche anzufahren, und dann die Fokusebene auf den gewünschten Abstand zur Referenzfläche zu stellen, jedoch kann sich der Abstand der aktuellen Fokusebene gegenüber der Referenzfläche aufgrund thermischer Effekte, durch Erschütterungen oder durch andere Störeinflüsse zeitlich verändern. Man müßte dann intermittierend immer wieder den Abstand zur Referenzfläche überprüfen, was sehr aufwendig wäre.

Um mittels einer Abbildungsoptik in der Laser-Scanning-Mikroskopie präzise Abbildungen einer Probe bzw. eines Probenschnittes zu erhalten, ist es erforderlich, die Probe zum einen exakt in die Fokuslage der Abbildungslage der Optik zu stellen und zum anderen die Lage der Fokusebene in der Probe zu kennen. In diesem Zusammenhang sind im wesentlichen Triangulationsverfahren, abbildende Verfahren mit Kontrastauswertung und die Positionsbestimmung mittels schräg gestellter konvokaler Spaltblende bekannt. Bei Triangulationsverfahren wird ein kollimierter Laserstrahl in die Pupillenebene eines Objektives eingespiegelt und aus dem Verlauf dieses Laserstrahls relativ zum Abbildungsstrahlengang auf die z-Position des von der Probe reflektierten Laserlichts geschlossen. Bei der Abbildung des Laserlichts in unterschiedlich tief gelegene Ebenen der Probe treten jedoch Bildfehler auf, so daß die Autofokusgüte über einen gegebenen Tiefenschärfebereich stark variiert. Auch sind Schwankungen dahingehend festzustellen, ob das Meßergebnis vom Zentrum oder am Rand der Probe bzw. des verwendeten Detektors ermittelt wird. üblicherweise wird ein Triangolationsverfahren deshalb itterativ ausgeführt, was verhältnismäßig zeitraubend ist.

Bei abbildenden Verfahren mit Kontrastauswertung wird die Probe mit einer bestimmten Intensitätsverteilung beleuchtet, meist indem in eine Feldblendenebene eines Beleuchtungsstrahlengangs ein Gitter gestellt wird. Man nimmt eine Serie von Bildern mit unterschiedlichen Abständen zwischen Abbildungsoptik und Probe auf und ermittelt in dieser Serie das Bild mit dem höchsten Kontrast, dem dann der optimale Fokusabstand zugeordnet ist. Nachteilig hieran ist, daß zur Aufnahme der Bildserie verschiedene z-Positionen mit hoher Genauigkeit angefahren werden müssen, was wiederum zeitraubend ist.

Bei der Positionsbestimmung mittels schräg gestellter konvokaler Spaltblende wird in eine Feldblendenebene des Beleuchtungsstrahlengangs eine Spaltblende gestellt und auf die Probe abgebildet. Das von der Probe reflektierte Licht wird auf eine relativ zur Spaltblende geneigt angeordnete CCD-Zeile gerichtet und es wird die Position auf der CCD-Zeile bestimmt, an dem das reflektierte Licht ein Maximum hat. Dieses Verfahren ist sehr schnell, hat allerdings

Probleme mit Verunreinigungen auf der Probe oder Probenoberfläche, die zu Intensitätsschwankungen führen können. Auch ist ein sehr großer Justieraufwand bei der Abbildung des Spaltes auf die CCD-Zeile aufzubringen, denn der Spalt muß, um eine hohe Genauigkeit erreichen zu können, sehr schmal sein. Eine Verbesserung der Positionsbestimmung mittels schräggstellter konvokaler Spaltblende ist in der DE 10319182A1 geschildert.

Allen Verfahren ist gemein, daß sie die Fokusebene zwar sehr genau finden können, jedoch die Lage dieser Fokusebene innerhalb der Probe, insbesondere bezüglich weiterer Grenzflächen, nur eingeschränkt zu ermitteln erlauben. Oftmals möchte man in der Laser-Scanning- Mikroskopie jedoch nicht nur die Meßebene exakt finden, sondern auch deren Lage d.h. Abstand zur Referenzebene ermitteln. Ein Bezug auf als Referenzebene dienende Grenzfläche kann entweder dadurch erfolgen, daß eine zweite Autofokuseinrichtung verwendet wird, die auf die Grenzfläche, z.B. eine Glas/Probengrenzfläche, fokussiert wird. Das erhöht natürlich den optischen Aufwand, und meist muß man einen Bereich der Detektions- bzw. Beleuchtungsapertur für diesen zusätzlichen Autofokus reservieren. Alternativ ist es im Stand der Technik bekannt, für kurze Zeit die Messung zu unterbrechen und durch eine z-Verstellung die Autofokuseinrichtung auf die gewünschte Referenzebene (Glas/Zellgrenzfläche) einzustellen. Der Abstand zwischen den beiden z-Einstellungen stellt dann den Abstand der Meßebene zur Referenzebene dar. Nachteilig ist dabei, daß die Messung für die Bestimmung des Abstandes zur Referenzebene unterbrochen werden muß.

Für übliche Mikroskope bekannte Autofokusansätze sind bei Lichtrastermikroskopen oftmals nicht verwendbar. Dies gilt für alle Ansätze, die eine strukturierte Beleuchtung der Probe vornehmen und anhand der Struktur die Fokussierung erreichen. Da bei einem Lichtrastermikroskop zu jedem Zeitpunkt aber nur ein Spot- oder Multispotbereich ohne Auflösung der Struktur des einzelnen Spots abgebildet wird, ist eine strukturierte Beleuchtung nicht möglich, da die Struktur nicht aufgelöst werden könnte. Ansätze wie aus der US 6.545.765 oder US 5.604.344, die für Autofokuszwecke eine strukturierte Probenbeleuchtung bewirken, sind deshalb für Lichtrastermikroskope generell untauglich.

Der Erfindung liegt also die Aufgabe zugrunde, ein Laser-Scanning-Mikroskop anzugeben, mit dem nicht nur die Lage der Meßebene exakt bestimmt werden kann, sondern zugleich auch der Abstand zu einer Referenzebene erfaßt werden kann. Insbesondere sollte für die Bestimmung der Referenzebene ein wiederholtes Verstellen der Probe in z-Richtung vermieden werden. Auch sollte eine genaue Bestimmung der Lage der Fokusebene aufwandsgering möglich sein.

Diese Aufgabe wird durch ein Lichtrastermikroskop der eingangs genannten Art gelöst, das eine Autofokuseinrichtung zum Erfassen einer Lage der Fokusebene des Objektives aufweist, die unterschiedliche Tiefenbereiche am abgebildeten Spot- oder Multispotbereich auf unterschiedliche Orte eines ortsauflösenden Detektors abbildet. Das erfindungsgemäße Lichtrastermikroskop bildet somit an jedem Spot einen Tiefenausschnitt auf den ortsauflösenden Detektor ab, so daß die Lage nicht nur der Fokusebene sondern auch einer Referenzebene, beispielsweise eines übergangsglas/Probenmaterial ermittelt werden kann. Das Lichtrastermikroskop ermittelt damit die Lage der Fokusebene bezogen zur Referenzebene. Der Fokusverstellmechanismus wird dann so angesteuert, daß der Abstand der Fokusebene, die die Meßebene darstellt, von der Referenzebene auf ein bestimmtes Maß konstant gehalten wird, bzw. sich anwendungsspezifischen Vorgaben gemäß verändert.

Die Erfindung setzt also erstmals eine tiefenaufgelöste Abbildung des Spot- oder Multispotbereiches zur Autofokussierung ein. Um die Tiefenauflösung wiederzugeben, genügt ein eindimensionales Detektorelement. Die Koordinate des Detektorelementes skaliert die Tiefeninformation. Die Intensität der abgebildeten Strahlung aus dem Spot- oder Multispotbereich hängt von der einen Ortskoordinate des Detektorelementes ab, welche wiederum unter Berücksichtigung der Abbildungsgegebenheiten der Tiefenkoordinate zugeordnet ist.

In der einfachsten Bauweise genügt folglich eine Detektorzeile, auf die die tiefenabhängige ortsaufgelöste Abbildung so erfolgt, daß unterschiedliche Tiefenbereiche auf unterschiedliche Bereiche der Detektorzeile zur Abbildung gebracht sind. Die Mitte der Detektorzeile befindet sich in einer zur Fokalebene konjugierten Ebene, anstatt der sonst üblichen konfokalen Blende.

Die tiefenauflösende Abbildung kann mittels einer der Detektorzeile vorgeschalteten anamorphotischen Optik realisiert werden, die auf die Detektorzeile einen Linienfokus bündelt, der mit der Detektorzeile in einer Ebene liegt und die Detektorzeile schneidet. Eine Verkippung der anamorphotischen Optik oder der Detektorzeile realisiert diese geometrische Anordnung besonders einfach. Die anamorphotische Optik kann beispielsweise als Zylinderlinse, als torische Linse oder als Kombination eines eindimensionalen holographischen Diffusors mit einer sphärischen Linse realisiert werden.

Beim Lichtrastermikroskop kommen prinzipiell der Anregungs- oder der Detektionsstrahlengang in Frage, um die Strahlung für die Autofokuseinrichtung auszukoppeln. Vorteilhafterweise erfolgt die Einbindung in den Beleuchtungsstrahlengang. Dann wird Beleuchtungslicht, das aus der Fokusebene des Objektes bzw. von der Referenzebene zurückreflektiert wird, in der Autofokuseinrichtung verwendet. Eine Erhöhung der Strahlungsleistung, mit der

Beleuchtungslicht auf das Objekt gerichtet ist, ist nicht nötig, da die Autofokuseinrichtung sich auf die Strahlungsintensität im Detektionsstrahlengang in keiner Weise auswirkt. Aus baulichen Gründen kann es natürlich auch angezeigt sein, die Autofokuseinrichtung in den Detektionsstrahlengang einzubinden. Da das Autofokusverfahren auf reflektiertes Licht von einer Referenzebene angewiesen ist, sollte dafür Sorge getroffen werden, daß der Spektralbereich des Anregungslichtes zur Autofokuseinrichtung in den Detektionsstrahlengang gelangen kann. Bei einem Laserscanningmikroskop, dessen Detektoren entsprechende Anregungsfilter vorgeschaltet sind, die Anregungslicht abblocken, ist im Detektionsstrahlengang bis zu diesen Anregungsfiltern diese Bedingung üblicherweise erfüllt. Durch das konfokale Prinzip wird zurückgestreutes Licht aus anderen als der Probenebene unterdrückt. Durch reflektierende Grenzflächen Glas/Luft, Glas/Wasser oder auch Glas/Probe werden aber Geisterbilder erzeugt, die nicht konfokal unterdrückt werden, wenn sie auf die schräge Zeile abgedrückt werden. Diese dienen nun zur Autofokussierung. Die Referenzebene ist stets eine reflektierende Grenzfläche.

Die Auskopplung der Strahlung für die Autofokuseinrichtung im Strahlengang zwischen Detektormodul bzw. Anregungsmodul und dem Scanner, also bei ruhendem Strahl, bewirkt vorteilhafterweise, daß die Tiefeninformation über die gesamte abgebildete Fläche des Objektes gemittelt wird. Einzelne Objektbereiche in der Fokusebene, die keine Strahlung rückstreuen, wirken sich dann nicht störend aus.

Die Autofokuseinrichtung erlaubt es dem Lichtrastermikroskop nun, den Fokusverstellmechanismus wunschgemäß anzusteuern. Es ist deshalb eine Weiterbildung bevorzugt, bei der eine Steuereinheit vorgesehen ist, die Signale der Autofokuseinrichtung ausliest und den Fokusverstellmechanismus ansteuert.

Zweckmäßigerweise wird die Steuereinheit aus den Signalen die Lage der Fokusebene im Bezug auf eine Referenzebene ermitteln. Es ist deshalb bevorzugt, daß die Steuereinheit aus den Signalen ein Maß für einen Abstand zwischen der Fokusebene des Objektives und einer Referenzebene am Objekt feststellt und gegebenenfalls bei der Ansteuerung des Fokusverstellmechanismus berücksichtigt.

Die Signale der Autofokuseinrichtung können in den genannten Ausführungsformen das Signal der Detektorzeile sein. Das Signal wird üblicherweise mindestens zwei Intensitätsmaxima aufweisen: das erste Maximum entspricht der Lage der aktuellen Meßposition, d.h. der Lage der Fokusebene, das zweite Maximum ist der Lage der Referenzebene, beispielsweise einer Glas-/Probenmaterialgrenzfläche zuzuordnen.

Der Abstand der beiden Maxima liefert den Abstand zwischen Fokusebene und Referenzebene, wobei die Funktion, mit der die Tiefenauflösung auf die Ortsauflösung des Detektors übertragen wird, zu berücksichtigen ist. Je nach Ausführungsform kann hierbei der Winkel zwischen Linienfokus und Längsachse der Detektorzeile, die Schärfentiefe des Objektives und der Abbildungsmaßstab eingehen, um den Abstand zwischen den Maxima in den Abstand zwischen Fokusebene und Referenzebene umzurechen. Die Breite der Maxima wird dabei in der Regel von der Schärfentiefe des Objektivs bestimmt.

Die anamorphotische Optik erzeugt den erwähnten Linienfokus. Die Intensitätsverteilung längs des Linienfokus ist dabei nur selten konstant, bzw. nur wenn erheblicher Aufwand getrieben wird. Einfacher ist es, bei der Bestimmung der Maxima die Intensitätsverteilung längs des Linienfokuses zu berücksichtigen. Im Falle einer Zylinderoptik entspricht die Intensitätsverteilung längs der Linie dabei der Intensitätsverteilung der Spotbeleuchtung mit Anregungslicht.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß ebenfalls gelöst durch ein Laser-Scanning-Mikroskop, das Beleuchtungsstrahlung durch einen Beleuchtungsstrahlengang auf eine Probe richtet und an der Probe emittierte Strahlung in einem Detektionsstrahlengang detektiert, wobei das Mikroskop aufweist einen in den Beleuchtungs- oder Detektionsstrahlengang derart einsetzbaren Strahlteiler, daß der Strahlteiler im eingesetzten Zustand an der Probe reflektierte Beleuchtungsstrahlung aus dem Beleuchtungs- bzw. Detektionsstrahlengang längs einer optischen Achse der Autofokusvorrichtung auskoppelt, einem dem Strahlteiler in Bezug auf die ausgekoppelte Beleuchtungsstrahlung nachgeordneten, anamorphotischen Optikelement, das die ausgekoppelte Beleuchtungsstrahlung in einen Linienfokus bündelt und einem dem Optikelement nachgeordneten Zeilen- oder Flächen-Detektor der einen für Beleuchtungsstrahlung empfindlichen Bereich hat, der in einer Ebene liegt, welche von dem Linienfokus und der optischen Achse aufgespannt ist, wobei das Optikelement und der Detektor zueinander so angeordnet und gegeneinander so verkippt sind, daß der Linienfokus mit dem empfindlichen Bereich einen Winkel größer 0° und kleiner 90° einschließt.

Vorzugsweise nutzt die Autofokuseinrichtung des Mikroskopes, welche entweder als eigenständiges Modul oder fest eingebaut in dem Laser-Scanning-Mikroskop vorgesehen sein kann, an der Probe reflektierte bzw. zurückgestreute Beleuchtungsstrahlung für die Fokussierung. Bei der Fluoreszenzmikroskopie ist diese Beleuchtungsstrahlung Anregungsstrahlung, weshalb diese Begriffe nachfolgend auch austauschbar verwendet werden. Verwendung der Beleuchtungsstrahlung hat den Vorteil, daß bei einer strahlungsempfindlichen Probe keine zusätzliche Belastung durch Einstrahlung von Strahlung erfolgt, die lediglich für den Autofokus benötigt wird. Wollte man im Stand der Technik diese

Belastung vermeiden, müßte Beleuchtungsstrahlung für die Autofokusvorrichtung spektral so gewählt werden, daß sie die Probe nicht schädigt. Dies hätte aber zur Folge, daß die chromatischen Anforderungen an das Mikroskop deutlich steigen. Beide Probleme vermeidet die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Mikroskop durch die Verwendung der ohnehin zur Mikroskopie eingestrahlten Beleuchtungsstrahlung.

Die erfindungsgemäße Autofokuseinrichtung koppelt von der Probe zurückkehrende Beleuchtungsstrahlung entweder im Beleuchtungsstrahlengang oder im Detektionsstrahlengang aus und leitet sie auf eine Detektorzeile. Dabei kommt ein anamorphotisches Optikelement zum Einsatz, das die ausgekoppelte Strahlung in eine Brennlinie bündelt. Ein Detektor detektiert die Strahlung, wobei das anamorphotische Element und der Detektor auf eine bestimmte Art und Weise derart zueinander ausgerichtet sind, daß ein strahlungsempfindlicher Bereich des Detektors schräg zur Längserstreckung der Brennlinie liegt. Der Detektor weist einen empfindlichen Bereich auf, der Zeilen- oder linienförmig ist. Dies kann durch Verwendung eines Zeilen-Detektors realisiert werden. Alternativ kommt natürlich auch ein Flächen-Detektor in Frage, der im entsprechenden Zeilen- oder linienförmigen Abschnitt ausgelesen wird. Weiter erlaubt der Detektor eine Ortsauflösung längs des zeilenförmigen, empfindlichen Bereiches.

Das anamorphotische Element und der Strahlteiler sind hinsichtlich der Anordnung im Beleuchtungs- bzw. Detektionsstrahlengang so justiert, daß unterschiedliche Ebenen in der

Probe auf unterschiedliche Brennlinien abgebildet werden, die hinsichtlich ihrer

Längserstreckung zueinander parallel liegend die optische Achse des Autofokusstrahlengangs in unterschiedlichen Abständen zum Strahlteiler schneiden. Somit liegt der Schnittpunkt zweier

Brennlinien, die beabstandeten Ebenen in der Probe zugeordnet sind, an unterschiedlicher Längsposition des empfindlichen Detektorbereichs und ein Auswerten der Detektorsignale liefert bei Berücksichtigung der verwendeten Geometrie und Abbildungsverhältnisse eine direkte Aussage über den Abstand der Ebenen in oder an der Probe. In einer besonders einfachen Ausgestaltung wird man den Detektor so ausrichten, daß der empfindliche Bereich in der aus Längsrichtung der Brennlinie und optischer Achse des Autofokusstrahlengangs aufgespannten Ebene und schräg zur optischen Achse liegt. Diese Bauweise, bei der der

Detektor mit seinem zeilenförmigen empfindlichen Bereich schräg zur optischen Achse steht, ist besonders einfach zu realisieren.

Natürlich kann auch umgekehrt die Brennlinie schräg zur optischen Achse verlaufen und der empfindliche Bereich steht beispielsweise senkrecht auf der optischen Achse. In beiden Fällen, für die es natürlich Zwischenstufen mit sowohl schräg gestellter Brennlinie als auch schräg gestelltem empfindlichen Bereich des Detektors gibt, ist erreicht, daß zumindest für einige Fokuslagen des Mikroskopobjektives die Brennlinie den empfindlichen Detektorbereich

schneidet und beide im wesentlichen in derselben Ebene liegen, in der sich auch die optische Achse befindet. Der Schnittpunkt zwischen Brennlinie und empfindlichen Detektorbereich hängt bezüglich seiner Lage längs des empfindlichen Detektorbereichs von der Lage der Brennlinie auf der optischen Achse und damit von der Lage der zugeordneten Ebene in der Probe ab.

Wesentlich für das anamorphotische Optikelement ist, daß es die erwähnte Brennlinie erzeugt, also einen Linienfokus aufweist. Beispielshalber kann dies durch Verwendung einer Zylinderlinse, einer torischen Linse oder eines eindimensionalen, holografischen Diffusors erreicht werden.

Zur Ermittlung der Abstände mehrerer Ebenen in der Probe, insbesondere zur Ermittlung des Abstandes zwischen Fokusebene des Objektives und einer Referenzebene ist es zweckmäßig, daß eine Steuereinrichtung vorgesehen ist, die diese Signale des Detektors ausliest und die Lagen von Intensitätsmaxima längs des empfindlichen Bereiches ermittelt. Intensitätsmaxima sind mit Schnittpunkten von Brennlinien verknüpft, so daß unter Berücksichtigung des Winkels, um den Linienfokus und empfindlicher Bereich gegeneinander verkippt sind, sehr einfach der Abstand der Brennlinien längs der optischen Achse der Autofokusvorrichtung bestimmt werden kann. Unter Berücksichtigung des Abbildungsmaßstabes des Mikroskops berechnet die Steuereinrichtung damit den Abstand der Fokusebene von einer Referenzebene.

Das anamorphotische Optikelement erzeugt die Brennlinie in der Regel mit einer bestimmten Intensitätsverteilung längs der Linie. Diese Intensitätsverteilung führt natürlich dazu, daß die Intensitätsmaxima unterschiedlich ausfallen, je nach dem welcher Abschnitt der Brennlinie den empfindlichen Bereich des Detektors schneidet. Die Inhomogenität der Brennlinie wird deshalb zweckmäßigerweise von der Steuereinrichtung bei der Ermittlung der Lagen der Intensitätsmaxima berücksichtigt, beispielsweise in dem eine Korrekturfunktion angewendet wird.

Die Autofokuseinrichtung kann in den Beleuchtungs- oder Detektionsstrahlengang eines Laser- Scanning-Mikroskops als Modul eingesetzt werden oder bereits im Mikroskop dort vorgesehen sein. Bei der Anordnung im Detektionsstrahlengang darf natürlich zwischen der Probe und dem Strahlteiler keine Abblockung von Beleuchtungsstrahlung erfolgen, d.h. es muß ein farbneutraler Strahlteiler vorgesehen sein und eventuelle Blockfilter müssen bezogen auf die Probe dem Strahlteiler nachgeordnet sein.

Bei Laser-Scanning-Mikroskopen ist üblicherweise ein Abrastern der Probe vorgesehen. Günstigerweise wird man den Strahlteiler der Autofokusvorrichtung im ruhenden Teil des Strahlenganges des Beleuchtungs- oder Detektionsstrahlenganges anordnen. Dies hat den

Vorteil, daß die Autofokusvorrichtung über ein Bild gemittelte Strahlung auswertet, wenn der Detektor über einen Zeitraum integriert, der länger ist, als die Abrasterung zumindest eines Schnittes der Probe dauert.

Wie bereits erwähnt, setzt die erfindungsgemäße Autofokuseinrichtung bzw. das erfindungsgemäße Mikroskop eine in der Probe liegende Ebene in eine Brennlinie um, wobei beabstandete Ebenen in der Probe beabstandeten Brennlinien entsprechen, die wiederum gemäß dem Abbildungsmaßstab auf der optischen Achse der Autofokusvorrichtungen beabstandet sind. Einen besonders großen Meßbereich erhält man, wenn man den Strahlteiler sowie das anamorphotische Optikelement so einjustiert, daß die Fokusebene des Objektives zu einer Brennlinie konjugiert ist, die die optische Achse im empfindlichen Bereich des Detektors schneidet. Der empfindliche Bereich des Detektors, die optische Achse und die der Fokusebene des Objektivs zugeordneter Brennlinie schneiden sich also idealerweise möglichst in einem Punkt. Dann ist ein symmetrischer Bereich vor und nach der Objektivfokusebene gegeben, in dem Referenzebenen liegen können. Möchte man einen möglichst großen Suchbereich hinsichtlich der Referenzebene in einer Richtung realisieren, wird man die Justierung dahingehend einstellen, daß die der Fokusebene des Objektivs zugeordnete Brennlinie den empfindlichen Bereich des Detektors nahe dessen linken oder rechten Rand schneidet.

Die erfindungsgemäße Autofokuseinrichtung bzw. das erfindungsgemäße Mikroskop eignet sich besonders, wie erwähnt, um den Abstand zwischen der aktuellen Fokusebene und einer Referenzebene zu bestimmen. Als Referenzebene kommt beispielsweise ein Glas/Probenübergang in Frage, der bei herkömmlichen Proben entweder an der Unterseite der Probe (d. h. am Objektträger) oder an der Oberseite der Probe (am Deckglas) vorliegt. Zweckmäßigerweise wird die Steuereinrichtung die Lagen der Intensitätsmaxima solchen Grenzflächen in oder an der Probe zuordnen.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung beispielhalber noch näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Lichtrastermikroskops mit einer

Autofokuseinrichtung;

Fig. 2a - c unterschiedliche Bauweisen für die Autofokuseinrichtung der Figur 1 ,

Fig. 3 eine vereinfachte Schnittdarstellung eines mit dem Lichtrastermikroskop der Figur 1 erfaßten Objektes,

Fig. 4 eine vereinfachte Darstellung eines Signalverlaufes, wie er mit der

Autofokuseinrichtung des Lichtrastermikroskops der Figur 1 anfällt,

Fig. 5 eine Schemadarstellung des Objektives zusammen mit der Autofokusvorrichtung der Fig. 1 und Fig. 6 eine Schemadarstellung zur Erläuterung geometrischer Beziehung innerhalb der

Autofokusvorrichtung und der daraus resultierenden Detektionssignale.

Figur 1 zeigt schematisch ein als Laserscanningmikroskop (LSM) 1 ausgebildetes Lichtrastermikroskop. Mit dem Laserscanningmikroskop 1 wird ein Objekt 2 auf noch zu erläuternde Art vermessen. Das Laserscanningmikroskop 1 ist im wesentlichen in ein Beleuchtungs- oder Anregungsmodul 3, ein Detektionsmodul 4 sowie ein Mikroskopmodul 5 unterteilbar. Das Anregungsmodul 3 stellt Anregungsstrahlung bereit und speist diese in das Mikroskopmodul 5 ein, so daß sie als spotförmige Beleuchtung auf das Objekt 2 gerichtet wird. Die spotförmige Beleuchtung wird vom Mikroskopmodul 5 rasternd über das Objekt 2 geführt. Der am Objekt 2 dabei mit Anregungsstrahlung aus dem Anregungsmodul 3 beleuchtete Spotbereich wird über das Mikroskopmodul 5 vom Detektionsmodul 4 konfokal detektiert, z.B. in Form einer Fluoreszenzanalyse.

Das Mikroskopmodul 5 weist ein Objektiv 6 auf, das mittels eines Antriebes A in einer Fokusverstellung FV hinsichtlich der Lage der Fokusebene im Objekt 2 verändert werden kann. Diese Fokusverstellung ist beispielsweise in der DE 197 02 753 A1 näher erläutert.

Dem Objektiv 6 ist eine Tubuslinse 7 vorgeschaltet. Die vom Anregungsmodul 3 kommende Strahlung wird mittels einer Scanoptik 8 sowie eines Scanners 9 durch die Tubuslinse 7 und das Objektiv 6 als rasternder Spot über das Objektiv 2 geführt. Gleichzeitig bewirkt der Scanner 9 in ungekehrter Strahlrichtung zum Detektionsmodul 4 hin ein sogenanntes de-scannen, so daß nach dem Scanner 9 im Detektionsmodul 4 wieder ein ruhender Strahl vorliegt.

Der Anregungsstrahlengang des Anregungsmoduls 3 und der Detektionsstrahlengang des Detektionsmoduls 4 sind über einen Hauptfarbteiler HFT vereinigt.

Die Wirkung des Hauptfarbteilers HFT ist ebenfalls der bereits genannten DE 197 02 753 A1 zu entnehmen. Anstelle eines dichroitischen Hauptfarbteilers kann auch ein farbneutraler Teiler verwendet werden, wie er beispielsweise in der DE 102 57 237 A1 geschildert ist.

Im Detektionsstrahlengang des Detektionsmoduls 4 wird die Strahlung über weitere, nicht näher bezeichnete Farbteiler in einzelne Detektionskanäle aufgeteilt, die jeweils aus einem Photomultiplier 14 mit vorgeschaltetem Pinhole 15 sowie Pinholeoptik 16 aufgebaut sind. Das Pinhole 15 engt den Detektionsbereich nahezu vollständig auf die theoretische Fokalebene ein; außerhalb dieser Fokalebene erzeugte Strahlung kann das Pinhole 15 nicht passieren.

Der Hauptstrahlteiler HFT transmittiert also die Detektionsstrahlung, beispielsweise aufgrund geeigneter spektraler Filtereigenschaften oder durch geeignete geometrische Ausbildung in Form von Teilverspiegelung, wie es im Stand der Technik bekannt ist. Im Detektionsstrahlengang wird die Strahlung über Nebenteiler sowie die Pinholeoptiken 16 und die Pinholeblenden 15 zu den PMT-Detektoren geleitet. Insgesamt findet eine konfokale Abbildung des beleuchteten Probenspots auf der Probe 2 auf die PMT-Detektoren 14 statt. Die unterschiedlichen Detektionszweige unterscheiden sich in ihrer spektraler Analysefähigkeit, so daß das hier exemplarisch dargestellte LSM 1 mehrere Spektralkanäle haben kann. Wie die strichpunktierte Linie bei 30 andeutet, können auch noch weitere Detektionsmodule verwendet werden. Insgesamt handelt es sich beim LSM 1 um ein Laser-Scanning-Mikroskop bekannter Bauart.

Das Anregungsmodul 3 bewirkt eine Beleuchtung des Spots mit Strahlung verschiedener Wellenlängen. Dazu sind verschiedene Beleuchtungskanäle vorgesehen, die im Ausführungsbeispiel jeweils aus einem Laseranschluß 10 bzw. 12 zum Einkoppeln der Strahlung eines Lasers sowie Einkoppeloptik 11 bzw. 13 aufgebaut sind und welche über eine nicht näher bezeichnete Spiegeltreppe vereinigt werden. Zur Einstellung des Spotdurchmessers ist ein Teleskop 17 vorgesehen, das für die Einkopplung entsprechend konditionierter Strahlung am Hauptfarbteiler HFT sorgt.

Das LSM 1 verfügt jedoch zusätzlich über eine Autofokusvorrichtung 22, die in der dargestellten Ausführungsform in dem Beleuchtungsstrahlengang eingebaut ist. Dazu sitzt ein Strahlteiler als Auskoppler 18 im Beleuchtungsstrahlengang 2, der am Anregungsmodul 3 vom Objekt 2 in den Anregungsstrahlengang des Anregungsmoduls 3 rückgestreute Strahlung auskoppelt und über hier als Anamorphot ausgebildete Optik 19 in einen Linienfokus LF bündelt. Im Falle eines Laserscanningmikroskops 1 mit Punktrasterung handelt es sich bei der Optik 19 um einen Anamorphot. Bei einem linienscannenden Mikroskop kann eine sphärische Optik 19 verwendet werden, da diese dann schon einen Liniefokus liefert. Der Linienfokus LF ist auf eine Detektorzeile 20 gerichtet, die mit der optischen Achse OA einen Winkel α einschließt und vom Linienfokus LF geschnitten wird. Der Linienfokus LF und die Detektorzeile 20 liegen also in einer Ebene. Der Anamorphot 19 und die Detektorzeile 20 bilden eine Autofokuseinrichtung 22, deren Funktionsweise anhand der Figuren 3 und 4 noch erläutert wird. Die dabei vorliegende Geometrie wird nachfolgend noch anhand der Figuren 5 und 6 näher beschrieben. Wesentlich ist hier insoweit, daß der Anamorphot 28 einen linienförmigen Fokus erzeugt.

Eine mögliche Ausgestaltung für die Optik 19 zeigen die Figuren 2a - c. Zusätzlich ist exemplarisch in Figur 2b noch der Linienfokus LF bzw. in Figur 2c die Längsachse L der Detektorzeile 20 dargestellt. Die Optik 19 kann als Kombination aus eindimensionalem

holographischen Diffusor 26 mit vorgeschalteter sphärischer Optik 25 (Figur 2a), als torische Linse 24 (Figur 2b) oder als Zylinderlinse 23 (Figur 2c) ausgebildet sein, wenn das Laserscanningmikroskop einen Punktspot zum Scannen verwendet.

Die Figuren 1 und 2 zeigen durchgängig eine Schrägstellung der Detektorzeile 20, um zu erreichen, daß der Linienfokus LF schräg zur Längsachse L der Detektorzeile 20 liegt. Diese gegenseitige Schräglage kann natürlich auch ohne Verkippung der Detektorzeile 20 gegenüber der optischen Achse OA erreicht werden, beispielsweise durch ein geeignetes holographisches Element oder eine schräg gestellte Zylinderoptik. Wesentlich ist also, wie nachfolgend noch erläutert wird, eine Verkippung von Längsrichtung der Brennlinie zur Längsrichtung der Detektorzeile 20. Dies könnte auch erreicht werden, indem beispielsweise der Anamorphot 19 verkippt ist.

Auch kann anstelle der Auskopplung der reflektierten Strahlung aus dem Anregungsstrahlengang des Anregungsmoduls 3 auch eine Auskopplung am Detektionsmodul 4 erfolgen, wenn der Hauptfarbteiler HFT rückgestreute Anregungsstrahlung passieren läßt. Eine mögliche Anbaustelle für die Autofokuseinrichtung 22 ist in Figur 1 mit 30 bezeichnet und durch eine gestrichelte Linie angedeutet.

Figur 3 zeigt eine schematische Schnittdarstellung durch das Objekt 2, das mit dem Laserscanningmikroskop 1 der Figur 1 erfaßt wird. Das Objekt 2 weist einen Objektträger 27 auf, auf dem abgedeckt durch ein Deckglas 28 eine zu mikroskopierende Zellschicht 29 angeordnet ist. Weiter ist exemplarisch die Lage der Fokusebene F dargestellt, die derjenigen Ebene entspricht, die durch die Konfokalitätsbedingung des Detektionsmoduls 4, d.h. durch die auswählende Wirkung des Pinholes 15 festgelegt ist. Oberhalb der Zellschicht 29 befindet sich ein übergang zum Deckglas 28. Ein solcher Glas/Zellschicht-übergang weist einen Brechzahlsprung auf. Bekanntermaßen wird an einem Brechzahlsprung Strahlung grundsätzlich reflektiert. Der Brechzahlsprung des übergangs zwischen Deckglas 28 und Zellschicht 29 kann somit als Referenzebene R verwendet werden.

Die Abbildung des Linienfokuses LF in der Autofokuseinrichtung 22 auf die Detektorzeile 20 bewirkt, daß Strahlung, die aus unterschiedlichen Bereichen entlang der optischen Achse OA, auf der der Spot beleuchtet bzw. abgetastet wird, entlang der Detektorzeile 20 aufgefächert wird. Das Ergebnis dieser Auffächerung im Signal der Detektorzeile 20 zeigt Figur 4.

Der Reflex am Brechzahlsprung der Referenzebene R führt zu einer gesteigerten Strahlungsintensität an einer bestimmten Stelle der Detektorzeile 20. Im Signal S der Detektorzeile 20 findet sich ein entsprechender Peak, der in Figur 4 als Referenzebenen-Peak

PR bezeichnet ist. Die in der Meßebene, d.h. der Fokusebene gemessene Struktur der Zellschicht führt ebenfalls zu einem Reflex, der an anderer Stelle auf der Detektorzeile 20 auftritt, d.h. bei anderer x-Koordinate in Figur 4 und ebenfalls zu einer Erhöhung der Intensität I führt (in Figur 4 als Fokusebenen-Peak PF bezeichnet).

Entlang der Detektorzeile 20, deren entsprechende x-Koordinate üblicherweise durch die Pixelnummer gegeben ist, finden sich also zwei Intensitätsmaxima als Peaks, nämlich Fokusebenenpeak PF und Referenzebenenpeak PR, die um einen Pixelabstand d beabstandet sind. Der Pixelabstand d kann auf einfache Weise in den Abstand D zwischen der Fokusebene F und der Referenzebene R umgerechnet werden. Dazu ist zum einen der Abbildungsmaßstab der optischen Abbildung zu berücksichtigen. Zum anderen spielt die Schrägstellung der Detektorzeile 20, d.h. der Winkel α zwischen Linienfokus LF und Längsebene L der Detektorzeile 20, eine Rolle.

Die Breite jedes Peak wird durch den Schärfentiefebereich des Objektivs 6 bestimmt. Sie kann bei der Ermittlung des Schwerpunktes des Fokusebenen-Peaks PF sowie des Referenzebenen- Peaks PR eingehen. Weiter kann bei der Peak- bzw. Schwerpunktsbestimmung ein Grundverlauf des Signals S berücksichtigt werden, der von der Intensitätsverteilung herrührt, die im Linienfokus LF grundsätzlich gegeben ist. Bei einem Gauß-förmig beleuchteten Spot wird man z.B. diese Gaußverteilung auch im Linienfokus LF wiederfinden. Analoges gilt natürlich für andere Intensitätsverteilungen im beleuchteten Spot.

Die Ermittlung des Abstandes D wird im Ausführungsbeispiel der Figur 1 von einem Steuergerät 21 vorgenommen, das sowohl das Signal der Detektorzeile 20 ausliest, als auch den Antrieb A zur Fokusverstellung des Objektivs 6 entsprechend ansteuert. Das Steuergerät ermittelt weiter die Peak-Schwerpunkte, den Peak-Abstand d und steuert die Einstellung des Abstandes D auf ein bestimmtes Maß.

Fig. 5 zeigt schematisch die Funktionsweise der Autofokusvorrichtung 22. In Fig. 5 sind der einfachheithalber lediglich die optische Achse OA und die darauf liegenden Elemente Probe 2, Objektiv 6, Anamorphot 19 sowie Detektorzeile 20 dargestellt. Faltungen der optischen Achse OA, wie sie insbesondere am Strahlteiler 18 in Fig. 1 auftreten, sind nicht eingezeichnet, um die Figur übersichtlich zu halten. Wie zu sehen ist, bildet das Objektiv 6 zusammen mit dem Anamorphoten 19 beabstandete Ebenen in der Probe 2 in beabstandete Brennlinien ab. Die Objektfokalebene 37 wird beispielsweise in eine Brennlinie 38 abgebildet und eine tiefer im Objekt 2, d. h. weiter vom Objektiv 6 entfernt liegende Ebene 36 wird in eine Brennlinie 39 abgebildet, die entlang der optischen Achse OA in Abbildungsrichtung gesehen vor der Brennlinie 38, d. h. näher am Anamorphoten 19 liegt. Durch die Schrägstellung der

Detektorzeile 20 gegenüber der optischen Achse OA schneiden die Brennlinien 38 und 39 den empfindlichen Bereich der Detektorzeile 20 an verschiedenen Schnittpunkten 40, 41 , die längs der Detektorzeile beabstandet sind. Es bilden sich also an den den Schnittpunkten 40, 41 zugeordneten Stellen der in Längsrichtung des empfindlichen Bereichs ortsauflösenden Detektorzeile 29 die bereits genannten Intensitätsmaxima aus. Dies ist in Fig. 6 verdeutlicht.

Fig. 6 zeigt in ihrer oberen Hälfte die Detektorzeile 20 sowie die in einem Winkel α schräg dazu liegende optische Achse OA und die Brennlinien 38, 39, die die Detektorzeile 20 schneiden. Durch die unterschiedlichen Schnittpunkte ergibt sich im Signal I der Detektorzeile 20 als Funktion der Pixelnummer n der Detektorzeile die bereits erwähnte Intensitätskurve S, die Peak als Maxima 43 und 44 hat, welche den Schnittpunkten 40 bzw. 41 der Brennlinie 38 bzw. 39 mit der Detektorzeile 29 zuzuordnen sind. Durch die entsprechenden Koordinaten 45 und 46 der Maxima läßt sich, wie anhand Fig. 4 beschrieben, unter Berücksichtigung des Winkels α der Abstand der Brennlinien 39 und 38 längs der optischen Achse OA einfach berechnen, indem der Abstand d zwischen den Koordinaten 45 und 46 mit dem Kosinus des Winkels α multipliziert wird. Zusammen mit dem Abbildungsverhältnis, das im Mikroskopmodul und insbesondere unter Berücksichtigung des Objektivs 6 erreicht ist, erhält man damit den Abstand D zwischen den Ebenen 37 und 38 in der Probe 17.

Die zwei auf der Detektorzeile 29 auftretenden Intensitätsmaxima sind so ausgezeichneten Ebenen in der Probe 17 zugeordnet. Das Maximum 43 entspricht der Fokalebene des Objektivs 16, d. h. der aktuellen Meßposition bzw. Ebene, aus der die konfokale Abbildung in der Probe 17 erfolgt. Das zweite Maximum 44 kann als Referenzebene einer Grenzfläche in der Probe zwischen Probenmaterial und Substrat zugeordnet werden (zur einfacheren Darstellung ist die Probe 17 in den Figuren 1 , 4 und 5 nicht strukturiert dargestellt, so daß die Grenzfläche nicht eingezeichnet ist, die z.B. exakt auf der gestrichelten Linie 36 läge).

Nach Errechnung des Abstandes zwischen den Ebenen kann die Steuereinheit den Abstand der Meßebene von der Grenzfläche, die als Referenzebene dient, einstellen bzw. konstant halten. Auch kann einfach eine Kalibrierung der Probentischverstellmechanik erfolgen, wenn diese vorhanden ist.

Die Brennlinien 38 bzw. 39 sind entlang ihrer Längsrichtung hinsichtlich der Intensität meist nicht homogen, da ein üblicher Anamorphot das Licht vermehrt achsennah auf der Brennlinie bündelt. Die dadurch bewirkte Nullkurve 47 ist in Fig. 6 für die Intensität eingezeichnet. Bei der Bestimmung der Intensitätsmaxima ist es zweckmäßig, wenn diese Nullkurve 47 berücksichtigt, beispielsweise aus dem Signal der Intensitätskurve S abgezogen wird.

Die dargestellte Bauweise zeigt ein Laserscanningmikroskop 1 mit punktförmiger Rasterung. Das Autofokusverfahren ist jedoch auch bei linienförmiger Rasterung einsetzbar, wobei dann da die Linienform der Strahlung ohne anamorphotische Abbildung bereits gegeben ist.