[0001] 本发明属于基因药物技术， 具体涉及基于长链非编码 RNA的 BCL2基因抑制剂 背景技术

[0002] BCL2是一个抑制凋亡的基因。 在急性髓系白血病、 急性淋系白血病等肿瘤的 恶性细胞中异常表达， 从而使这些肿瘤细胞能够获得生长优势， 并对抗机体的 防御系统及一些抗癌药物的作用。 越来越多的研究报道抑制 BCL2基因的表达可 以抑制肿瘤的生长和转移， 使病人在肿瘤的治疗过程中获益； 但是相反的， 能 够抑制肿瘤的药物几乎对 BCL2基因抑制无效。 因此需要研发新的药物以抑制 BC L2基因的表达。

发明概述

技术问题

问题的解决方案

技术解决方案

[0003] 本发明公开了一种新的 BCL2基因的表达抑制剂， 能够有效的抑制其表达， 从 而可以抑制肿瘤的生长和转移， 使病人在肿瘤的治疗过程中获益。

[0004] 本发明采用如下技术方案：

[0005] 长链非编码 RNA在制备 BCL2基因抑制剂或者抑制 BCL2基因中的应用； 所述长 链非编码 RNA的序列为 SEQ ID NO: l。

[0006] 长链非编码 RNA在制备抗肿瘤药物中的应用； 所述长链非编码 RNA的序列为 S

EQ ID NO: l。

[0007] 一种 BCL2基因抑制剂， 为长链非编码 RNA， 所述长链非编码 RNA的序列为 SE

Q ID NO: l。

[0008] 一种抗肿瘤药物及其制备方法， 将长链非编码 RNA转入质粒载体， 得到抗肿瘤 药物； 所述长链非编码 RNA的序列为 SEQ ID NO: l。 [0009] 本发明中， SEQ ID NO:l序列如下：

[0010] GGTGATGGGAAATTTCAGACTTTGATTTGGGCCTTGGAAAACAGGTTCAG TTTCAGTAGATGGAGGTAAAAGGAGGCAAAGAGCGACCTTACGTAAATCC AAGGCTGAAGGAAGGAGGCTCTAAGGGGTGTGTGGGTGATTAGGAGTAAA GTATCTTGTCTGAAATGAAGAGTTTCTATACAGCATGCTTATTTGGAGTCAT GCCTAACAAGATTACTTTGGGTCTAATTTTGGAAGCTTGGTACTCCAGGGA GCTTGGACATGAATTTAAAGACAATGGGAACTCACATTTAAGTTTCTGAAA CAGCCAGGCGTGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTCGGGAGGCTGA GGCAGGTGGATCACCTGAGATCAGGAGTTTGAGACCAGTCTAACCAACAT GGAGAAACCCCATCTCTACTTAAAAG。

发明的有益效果

有益效果

[0011] 本发明鉴定出一个能抑制 BCL2基因表达的新的长链非编码 RNA， 具有 SEQ ID NO:l的序列， 可以与 BCL2相互作用， 能够有效的抑制 BCL2基因表达， 从而可 以抑制肿瘤的生长和转移， 使病人在肿瘤的治疗过程中获益。

对附图的简要说明

附图说明

[0012] 图 1为稳定高表达 H22954的白血病细胞株 K562中 BCL2蛋白的表达；

[0013] 图 2为小鼠 K562细胞移植瘤中 BCL2蛋白的表达；

[0014] 图 3为荧光素酶报告基因的测定；

[0015] 图 4为 RNA反义纯化 （RAP） 测定。

发明实施例

本发明的实施方式

[0016] 实施例一

[0017] 本发明公开了一个能抑制 BCL2基因表达的新的长链非编码 RNA （称为 H22954 ） ， 具有 SEQ ID NO:l的序列， 如下：

[0018] GGTGATGGGAAATTTCAGACTTTGATTTGGGCCTTGGAAAACAGGTTCAG TTTCAGTAGATGGAGGTAAAAGGAGGCAAAGAGCGACCTTACGTAAATCC

AAGGCTGAAGGAAGGAGGCTCTAAGGGGTGTGTGGGTGATTAGGAGTAAA GTATCTTGTCTGAAATGAAGAGTTTCTATACAGCATGCTTATTTGGAGTCAT GCCTAACAAGATTACTTTGGGTCTAATTTTGGAAGCTTGGTACTCCAGGGA GCTTGGACATGAATTTAAAGACAATGGGAACTCACATTTAAGTTTCTGAAA CAGCCAGGCGTGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTCGGGAGGCTGA GGCAGGTGGATCACCTGAGATCAGGAGTTTGAGACCAGTCTAACCAACAT GGAGAAACCCCATCTCTACTTAAAAG

[0019] 实施例二

[0020] 细胞转染和蛋白质印迹。 使用 Lipofectamine

2000 (Invitrogen) 用长链非编码 RNA (SEQ ID NO:l) 质粒转染 K562细胞。 将 细胞培养 24-48小时， 并在含有 50mmol/L Tris-HCl (pH8.0) ， 150mmol/L NaCl, 1% (v/v) Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物 (1:100稀释， Sigma) 。 通 过 SDS-PAGE和 Western印迹分析蛋白质。 使用 ECL试剂 (Denville Scientific) 使 膜显影并暴露于 X射线胶片。

[0021] 培养的稳定高表达 H22954的白血病细胞株 K562， 裂解后进行蛋白电泳分析， 与非高表的细胞比， BCL2明显下降， 见附图 1。 1,2,3为空载体 (Vector) 为 3个 稳定株对照， 4,5,6

为 3株高表达 H22954的 K562稳定株。 GAPDH为上样对照。 在 GAPDH表达相似的 条件下， H22954高表达的稳定株中， BCL2表达量明显低于空载体对照组。

[0022] 小鼠皮下移植瘤动物模型中， 高表达 H22954的移植瘤， BCL2下降， 见附图 2。

Vector

为空载体组， H22954为高表达 H22954的 K562稳定株形成的移植瘤。 GAPDH为 上样对照。 在 GAPDH表达相似的条件下， H22954高表达的稳定株形成的移植瘤 中， BCL2表达量明显低于空载体对照组。

[0023] 实施例三

[0024] 萤光素酶测定。 293细胞用 Lipofectamine 2000试剂 (Invitrogen) 和 l[ig长链非 编码 RNA (SEQ ID NO:!) 表达质粒或对照载体 (空载体 PGL3及与 H22954无相 互作用的基因 PGL3-Cont _r0 l) 与: l^ig荧光素酶报道基因载体一起转染。 为了使每 次转染中的转染效率标准化， 在每个孔中使用 50ng的 pRLTK质粒 (Promega) 。 通过双荧光素酶报告基因检测系统 (Promega) 测量萤光素酶活性。

[0025] lug携带有长链非编码 RNA (SEQ ID NO: l) 质粒或对照空载体质粒通过脂质 体转入 293细胞中， 并同时转入携带有 BCL2的荧光素报告基因质粒， 24-48小时 后， 观测荧光强度， 转长链非编码 RNA (SEQ ID NO: l) 质粒组荧光明显减弱， 见附图 3。 293细胞用 Lipofectamine 2000试剂 (Invitrogen) 和 l[ig长链非编码 RNA (SEQ ID NO: l) 表达质粒或对照载体 (空载体 PGL3及与 H22954无相互作用的 基因 PGL3-Control) 与 l[ig変光素酶报道基因载体一起转染。 24-48小时后， 观测 荧光强度， 与空载体及 H22954无相互作用的基因比较， 转长链非编码 RNA (SE Q ID NO: l) 质粒组荧光明显减弱。

[0026] 实施例四

[0027] RNA反义纯化 (RAP) 测定。 简言之， 将与靶 RNA (SEQ ID NO: l) 和 5'-生物 素互补的热变性生物素化 DNA寡核苷酸探针与预先处理的片段在 GuSCN杂交缓 冲液 (20mM Tris-HCl (pH 7.5) , 7 mM EDTA, 3mM EGTA， 150mM LiCl, 1 %NP-40, 0.2%N-月桂酰肌氨酸， 0.1%脱氧胞酸钠， 3M硫氰酸胍和 2.5mM TCEP ) 中于 37°C孵育 2小时， 间歇振荡， 预先洗涤的链霉抗生物素蛋白磁珠被添加并 且在 37°C孵育 30分钟， 然后摇动并洗涤。 将磁珠磁分离并用 RNase H洗脱缓冲液 (50mM Tris-HCl (pH 7.5) , 75mM NaCl， 3mM MgCl ₂ ， 0.125%N-月桂酰肌氨 酸， 0.025%脱氧胆酸钠和 2.5mM TCEP) 洗涂。 RNA复合物被洗脱并进行 qPCR 测定 (95° 10分钟后， 40个循环， 95°30”、 60T ) 以定量 RNA产量和富集。

[0028] 杂交液中分别加入长链非编码 RNA (SEQ ID NO: l) 片段、 BCL2片段， 并加入 生物素标记的探针， 37度反应 2小时后， 加入链霉素标记的磁珠， 37度 30分钟， 放入磁场分选， 洗涤后行 qPCR (95° 10分钟后， 40个循环， 95°30”、 60°1，) 。 可 见 H22954的探针在与 H22954结合的同时也能与 BCL2结合， BCL2的探针亦能与 H22954结合， 见附图 4。 左图为 H22954定量 PCR的结果， 其中第一柱为反应体系 阳性对照， 反应体系中加入 H22954及 BCL2的 3’UTR片段后， 再加入能结合 H229 54的探针。 纯化后行定量 PCR。 第二柱为实验组， 反应体系中加入 H22954及 BC L2的 3’UTR片段后， 再加入能结合 BCL2的探针。 纯化后行定量 PCR。 第三四柱 为 PCR体系对照， 直接在最终洗脱液中加入相应片段， 进行定量 PCR。 右图为 H 22954定量 PCR的结果， 其中第一柱为实验组， 反应体系中加入 H22954及 BCL2 的 3’UTR片段后， 再加入能结合 H22954的探针。 纯化后行定量 PCR。 第二柱为反 应体系阳性对照， 反应体系中加入 H22954及 BCL2的 3’UTR片段后， 再加入能结 合 BCL2的探针。 纯化后行定量 PCR。 第三四柱为 PCR体系对照， 直接在最终洗 脱液中加入相应片段， 进行定量 PCR。 结果可见， H22954探针在纯化自身的同 时能将 BCL2纯化， BCL2的探针亦能将 H22954片段纯化。 说明 H22954及 BCL2是 能相互结合的。

序列表自由内容

[0029] 序列表

[0030]

[0031] <110> 苏州大学张家港工业技术研究院

[0032] <110> 苏州大学

[0033]

[0034] <120>基于长链非编码 RNA的 BCL2基因抑制剂

[0035]

[0036] <160 ñ 1

[0037]

[0038] <170> SIPOSequenceListing 1.0

[0039]

[0040] <210> 1

[0041] <211> 431

[0042] <212 ñ DNA

[0043] <213>人工序列 (Artificial)

[0044]

[0045] <400 ñ 1

[0046] ggtgatggga aatttcagac tttgatttgg gccttggaaa acaggttcag tttcagtaga 60 [0047] tggaggtaaa aggaggcaaa gagcgacctt acgtaaatcc aaggctgaag gaaggaggct 120 [0048] ctaaggggtg tgtgggtgat taggagtaaa gtatcttgtc tgaaatgaag agtttctata 180 [0049] cagcatgctt atttggagtc atgcctaaca agattacttt gggtctaatt ttggaagctt 240

[0050] ggtactccag ggagcttgga catgaattta aagacaatgg gaactcacat ttaagtttct 300 [0051] gaaacagcca ggcgtggtgg ctcatgcctg taatcccagc acttcgggag gctgaggcag 360

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