Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 14α-Hydroxy-4-androsten- 3,17-dion durch Fermentation von 4-Androsten-3,17-dion mit einer Kultur von Curvularia lunata, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das 4-Androsten-3,17- dion in Wasser suspendiert und die erhaltene Suspension fermentiert.

In der SU-Patentschrift 801 517 (ref. CA. 110, 133697u) wird ein Verfahren zur Her¬ stellung von 14α-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion durch Fermentation von 4- Androsten-3,17-dion mit einer Kultur von Curvularia lunata beschrieben. In diesem Patent ist aber kein Hinweis enthalten, aus welcher öffentlichen Stammsammlung und unter welcher Nummer dieser Mikroorgnismus bezogen werden kann, so daß eine Nacharbeitung des beschriebenen Verfahrens nicht möglich ist. Nach der Lehre dieser Patentschrift löst man das 4-Androsten-3,17-dion in Ethanol oder Dimethyl.formamid, fermentiert 0,5 bis 1,5 g/1 Substrat 40 bis 66 Stunden lang und erhält 35 bis 70 % offensichtlich sehr stark verunreinigtes 14α-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion- Rohprodukt. (Das dem so ist, erkennt man an der Art der Aufarbeitung: Der Fermentationsansatz wird mit Chloroform extrahiert, die Chloroformphase eingeengt und der Rückstand mit Hexan ausgekocht. Das erhaltene Produkt muß also alle extrahierbaren, in Hexan unlöslichen Stoffe enthalten, dies sind nicht nur alle im Fermentationsansatz enthaltenen Steroide sondern auch die entsprechenden Curvularia- Inhaltsstoffe und Medienbestandteile.)

Demgegenüber kann man mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens mehr als 5 g 4-Androsten-3,17-dion pro Liter innerhalb von etwa 12 Stunden reproduzierbar in 14α-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion umzuwandeln. Die Ausbeute an Verfahrensprodukt beträgt etwa 60 % Reinprodukt.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter den Fermentationsbedingungen durchgeführt, welche man auch bei den bekannten mikrobiologischen Umwandlungen von Substraten mit Curvularia lunata Kulturen anwendet.

Unter den für diesen Mikroorganismus üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man der Kultur eine wässrige Suspension des 4-Androsten-3,17-dion zu und fementiert bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist. Die wässrige Suspension des 4-Androsten-3,17-dions läßt sich in einfacher Weise herstellen, indem man beispielsweise dieser Substanz mit der zweifachen bei fünffachen Menge Wasser unter Zusatz eines nichtiomschen Tensids in einer Kugelmühle mahlt bis sie eine Korngröße von ca. 1 bis 5 μ besitzt. Geeignete Tenside sind beispielsweise Ethylenoxidaddukte oder Fettsäureester von Polyglykolen. Als geeignete Tenside seien beispielsweise die handelsüblichen Netzmittel wie Tegin ® , Tween® , oder Span® genannt.

Nach erfolgter Fermentation wird die Kultur in üblicher Weise aufbereitet, beispielsweise indem man sie mit einem in Wasser schwer löslichen Alkohol, Keton oder Ester extrahiert, den Extrakt einengt und den erhaltenen Rückstand durch Chromatographie und/oder Kristallisation auf reinigt.

Die Weiterverarbeitung des erhaltenen 14α-Hydroxy-4-androsten-3,17-dions zu pharmakologisch wirksamen Steroiden ist bekannt oder erfolgt nach an sich bekannten Verfahren (J. Amer. Chem. Soc, 91, 1969, 1228 ff; EP-A 0300062 und weitere).

Das nachfolgende Ausführungsbeispiel dient zur näheren Erläuterung des erfindungs¬ gemäßen Verfahrens.

Beispiel:

a) Ein 21 Erlenmeyer mit 11 sterilem Nährmedium enthaltend

1 9/6 Cornsteep liqour

1,25 % Sojapuder

-eingestellt auf pH 6,2- wird mit 5 ml einer Suspension einer Curvularia lunata NRRL 2380 - Kultur beimpft und 60 Stunden bei 30 °C mit 180 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.

b) Ein 501-Fermenter mit 301 steriler Nährlösung wie unter a) angegeben wird mit 1 1 der Curvularia lunata-Anzuchtkultur beimpft und 18 Stunden bei 30 °C unter Belüftung von 2 m^ pro Stunde und Rühren mit 220 Umdrehungen pro Minute inkubiert.

c) Ein 501-Fermenter mit 401 steriler Nährlösung enthaltend

1 % Cornsteep liqour

1,25 % Sojapuder

0,3 % ß-Cyclodextrin

-eingestellt auf pH 6,2- wird mit 41 der Curvularia lunata- Vorkultur beimpft und unter Belüftung von 2,4 m3 pro Stunde und Rühren mit 150 Umdrehungen pro Minute bei 30 °C 7 Stunden inkubiert.

Dann setzt man der Kultur 250 g 4-Androstaen-3,17-dion als Mahlung in 1000 ml Wasser mit 25 g Tween®80 zu und fermentiert weitere 12 Stunden lang unter Rühren mit 220 Umdrehungen pro Minute und einer Belüftung von 2,4 m^ pro Stunde.

d) Nach erfolgter Fermentation wird die Kulturbrühe dreimal mit je 201 Methylisobutylketon extrahiert, der Extrakt im Rotationsverdampfer bei max. 50 °C unter Vakuum eingeengt. Anschließend erfolgt eine Reinigung durch Chromatographie über eine Kieselgelsäule mittels Hexan-Aceton-Gradienten.

Man erhält 150 g 14α-Hydroxy-androsta-4-en-3,17-dion vom Schmelzpunkt 257- 259 °C.