Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen in der Medizin und der Biologie.

Stand der Technik

Agglutinationsreaktionen werden im großen Umfang traditionsgemäß in der Blutgruppenserologie durchgeführt. Zunehmend sind Agglutinationsteste für eine Reihe von Proteinen und anderen Liganden bekannt geworden. Für diese Teste werden in der Regel Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz an speziell präparierte Erythrozyten oder definierte Partikel, sehr häufig Latexpartikel, gebunden. Es gibt eine Vielfalt von Variations¬ möglichkeiten beim Einsatz solcher Teste. Die Auswertung der Agglutinationsreaktion erfolgt überwiegend semiguantitativ durch visuelle Beobachtung oder nach Verdünnung wenigstens eines der Reaktanden in Titerstufen.

Versuche zur guantitativen Auswertung von Agglutinations¬ reaktionen unter Nutzung von Bildauswerteverfahren, von speziellen Verfahren zur Messung der Verteilung von freien Reaktanden und Agglutinaten in Mikrotiterplatten sind aufwendig und bedürfen einer großen Zahl von Kontrolluntersuchungen, da besonders im Falle von schwach ausgebildeten Agglutinaten die Differenzierung zur Nichtagglutination schwierig ist. Spezielle Automaten zur BlutgruppenbeStimmung sind aufwendig und sehr teuer. Hinzu kommt, daß besonders in der Blutgruppenserologie spezielle Erythrozyteneigenschaften, beispielsweise im Coombs-Test, erst nach mehrfacher Waschung der Erythrozyten bestimmbar sind. Diese Waschschritte sind zeitaufwendig und umständlich und erlauben keine einheitliche Probenhandhabung im Gesamtprozeß der Analyse.

Es ist seit langem bekannt, daß Erythrozyten und andere Zellen in geeigneten Medien durch Molekularsiebgele von niedermolekularen Begleitstoffen getrennt werden können. Darüberhinaus ist bekannt, daß Agglutinate von Erythrozyten bestimmte Agarosegele nur schwer passieren können. Durch visuelle Besichtigung solcher Gelanordnungen, die als geschlossene Zentrifugenröhrchen ausgebildet sind, lassen sich Agglutinationsreaktionen mit Erythrozyten semiguantitativ beurteilen.

Darstellung der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein kostengünstiges, praktikables, breit einsetzbares und automatisierbares Analysesystem für

Agglutinationsreaktionen zu schaffen, welches die sichere Analyse von Agglutinationen auch nach der essentiellen Entfernung von störenden Begleitstoffen semiguantitativ und guantitativ erlaubt.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die

Reaktionspartner in eine Mikrosäule eingebracht werden, daß die Agglutinationsreaktion in der Mikrosäule erfolgt, daß nach der Agglutinationsreaktion eine Trennung von

Agglutinaten und nicht verbrauchten Reaktionspartnern durch

Stofftrennung nach Partikelgröße unter Krafteinwirkung erfolgt, daß die nichtagglutinierten Partner unter der

Mikrosäule aufgefangen werden, und daß der Verbrauch von

Reaktionspartnern im Durchlauf bestimmt wird.

Die Reaktionspartner werden in eine Mikrosäule gegeben. Die

Agglutinationsreaktion erfolgt in der Mikrosäule, vorzugsweise vor Durchlauf der Reaktionspartner durch den filternden Stoff. Agglutinierte und nichtagglutinierte

Partikel werden vorzugsweise mittels durch Krafteinwirkung beschleunigter Filtration getrennt.

Das nichtagglutinierte Partikel enthaltende Eluat wird nach

Verlassen der Mikrosäule unter dieser aufgefangen und einer guantitativen Analyse unterzogen.

Die Stofftrennung nach Partikelgröße kann entweder durch Molekularsiebgele oder durch Filtration, entweder über speziellen Filtern oder durch Filterhilfen erfolgen. Zur Bewegung des zu trennenden Stoffgutes können die Gravitationskraft, Zentrifugalkraft, hydrostatischer Druck oder Luftdruck eingesetzt werden. Ebenso kann ein elektrisches oder magnetisches Feld zur Trennung eingesetzt werden.

Der Einsatz des Verfahrens wird erweitert dadurch, daß zu¬ mindest ein Reaktionspartner mit einer Markersubstanz fest verbunden wird. Solche Markersubstanzen können radioaktive Isotope, Enzyme, Lumineszensmarker, Fluoreszensmarker oder biospezifische Liganden mit hoher Affinität zu Substanzen sein, die sich leicht analytisch nachweisen lassen. Markierung mit magnetischen Partikeln führt zu einer weiteren Möglichkeit der Erweiterung des Einsatzes des Systems. Die Kopplung von Reaktionspartnern an Latex- oder andere Partikel erschließt den Einsatz der bekannten Partikelagglutinationstechniken. Die Messung der natürlichen Eigenschaften von Teilnehmern, beispielsweise der Trübung der Lösung von Erythrozytensuspensionen, sichert den Einsatz in der Blutgruppenserologie und bildet die Grundlage für universelle Blutgruppenautomaten. Werden vor der eigentlichen Agglutinationsreaktion in der Säule Abtrennungsschritte, die die Prinzipien der Chromatographie nutzen, vorgesehen, so kann die Spezifität der Technik stark erweitert werden. Mit Molekularsiebgelen können niedermolekulare Begleitstoffe abgetrennt werden. Der Einsatz von spezifischen Immunoliganden erlaubt hochspezifisch nahezu jeden beliebigen Begleitstoff zu entfernen. Auch andere Affinitätsgele und unspezifische Chromatographiegele können zur Entfernung von Begleitstoffen vor der Agglutination genutzt werden. Die zur Durchführung des Verfahrens vorgesehene Anordnung trennt in einer Mikrosäule einen eingangsseitigen Teil von einem ausgangsseitigen Teil durch ein Filterelement. Paßfähig zur Mikrosäule ist ein lösbares Auffanggefäß vorgesehen, in dem der Durchlauf aufgenommen wird. In

diesem Auf anggefäß kann die Analyse der Agglutinationsreaktion entweder direkt durch optische Messungen der Eigenschaften der markierten oder unmarkierten Reaktanten, oder nach Zwischenschaltung eines Hilfsschrittes erfolgen. Die schichtweise Anordnung verschiedener Chromatographiematerialien in der Mikrosäule erlaubt die Realisierung der Vorabtrennung verschiedener Begleitstoffe. Eine Erweiterung des Eingangsteils der Mikrosäule gestattet das Mischen der Reaktanden. Die Anordnung der Einzelsäulen und Auffanggefäße in bestimmten Reihen und Matrixanordnungen erlaubt einen hohen Probendurchsatz und die Automatisierung des Verfahrens. Besonders günstig ist die paßfähige Anordnung der Mikrosäulen zu Mikrotiterplatten, da für viele analytische Fragen sofort kommerziell erhältliche Mikrotiterplatten- Reader eingesetzt werden können.

Die gesamte Anordnung kann in Zentrifugenrotoren eingesetzt werden, wenn die Stofftrennung durch Zentrifugalkraft erfolgt. Durch die Anbringung geeigneter Verbindungsstücke zu Pipetten und Multipipetten kann die Stofftrennung vorteilhaft auch durch Flüssigkeitsdruck oder Luftdruck erfolgen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung wird durch 9 Ausführungsbeispiele erläutert.

Es zeigen:

Figur 1: Mikrosäulen und Auffanggefäße

Figur la: Mikrosäule mit Filter

Figur lb: Mikrosäule mit Filterelement und

Chromatographiematerial Figur 1c: Mikrosäule mit Filterelement und zwei verschiedenen Chromatographiematerialien Figur ld: Mikrosäule mit Filter und einem

Chromatographiematerial

Figur 2: Pluralität von Mikrosäulen (Mikrosäulenkammer) , Auffanggefäßen (Mikrotiterplatte) und Pipetten (Mehrkanalpipetten)

Bester Weg zur Ausführung der Erfindung Anwendunσsbeispiel 1 - Mikrosäule zur Filtration

Die Fig. la zeigt die Anordnung zur Analyse von Agglutinationsreaktionen bestehend aus einer Mikrosäule (1), die aus einem eingangsseitige Teil (2) und einem ausgangsseitigem Teil (3), getrennt durch ein Filter (4), zusammengesetzt ist. Der eingangsseitige Teil enthält eine Erweiterung (5) zum Einbringen und Mischen der Reaktanden und einen Säulenteil (6). Der Säulendurchlauf (7) wird in einem Auffanggefäß (8) aufgefangen.

Anwendunσsbeispiel 2. - Mikrosäule zur Chromatographie

Die Fig. lb zeigt die Anordnung mit einem Filterelement (9) und die Füllung der Säule mit einem Chromatographiematerial (10).

Anwendunσsbeispiel 3 - Mikrosäule zur Chromatographie mit verschiedenen Chromatographiematerialien.

Die Fig. lc zeigt die Anordnung mit einem Filterelement und zwei verschiedenen Chromatographiematerialien (11 und 12).

Anwendunσsbeispiel 4 - Mikrosäule zur Chromatographie und Filtration.

Die Fig. Id zeigt die Anordung mit einem Filter (4) und einem Chromatographiematerial (10).

Anwendungsbeispiel 5 - Pluralität von Mikrosäulen

Fig. 2 zeigt die Pluralität der Anordung der Mikrosäulen (1) in Mikrosäulenkammern (13), der Auffanggefäße (8) in

Mikrotiterplatten (14) und der Pipettenspitzen in Mehrkanalpipetten (15) .

Anwendunσsbeispiel 6 - Blutgruppenbestimmung im ABO-System mittels Abtrennung der agglutinierten Partikel durch Filtration

Jeder Säulenteil (6) der Säulen der Mikrosäulenkammer (13), der mit einem Filter (4) mit einer Porengröße von 10 μm vom ausgangsseitigen Teil getrennt ist, wird mit 20 μl - Antiserum (Anti-A, Anti-B oder Anti-A+B) gefüllt. In das Antiserum werden 5 μl einer 5%igen Erythrozytensuspension in 0,9% NaCl pipettiert und durch Heben und Senken des Pipettenkolbens gemischt. Die Mikrosäulenkammer wird 10-20 min bei Raumtemperatur inkubiert und danach 30 min bei 250 U/min über einer Mikrotiterplatte (14), die in jedem Loch 100 μl 0,9% NaCl enhält, zentrifugiert. Die Agglutinate verbleiben auf der Filteroberfläche, die niσhtagglutinierten Erythrozyten sedimentieren aus dem ausgangsseitigen Teil in die Mikrotiterplatte. Die Mikrotiterplatte wird auf einem horizontal rotierenden Schüttler geschüttelt und in einem Reader bei 405 nm ausgewertet.

Die in der Mikrotiterplatte suspendierten nicht- agglutinierten Erythrozyten weisen die folgenden Extinktionen auf:

Reaktion von A-Erythrozyten

Antiserum Verdünnung Erythrozyten Extinktion

20 μl 5 μl 5 %

Anti-B 1:4 A 0,8 (=E)

Anti-A unv. A 0,03 x E

1:4 A 0,08 x E

1:8 A 0,2 x E

1:16 A 0,5 x E

1:32 A 0,8 X E

Anwendungsbeispiel 7 - Blutgruppenbestimmung im ABO-System mittels Partikeltrennung durch Chromatographie

Jeder Säulenteil (6) der Säulen der Mikrosäulenkammer (13) wird mit 30 μl in 0,9 % NaCl geguollenem Sephadex G 200 als Chromatographiematerial (10) gefüllt, indem 150 μl einer 20 %igen Gelsuspension in die Säulen gefüllt werden und bei 500 U/min für 5 min zentrifugiert werden. Danach werden 20 μl einer Antiserumverdünnung auf die Geloberfläche pipettiert. Dazu werden 5 μl der 5%igen Erythrozytensuspension pipettiert. Alle Pipettierschritte (Gelsuspension, Antiserumverdünnung,

Erythrozytensuspension) werden mit Mehrkanalpipetten (8-, 12- oder 96-fach)(15) vorgenommen.

Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur werden die Säulenkammern bei 250 U/min für 10 min über einer Mikrotiterplatte zentrifugiert und damit der Säulenauslauf jeder Säule in einem Loch der Mikrotiterplatte, die 100 μl 0,9 %iges NaCl pro Loch enthält, aufgefangen. Die Erytrozytenagglutinate befinden sich nach Zentrifugation auf dem Gel bzw. in den oberen Gelanteilen. Die nichtagglutinierten Erythrozyten sedimentieren in die Mikrotiterplatte.

Die Mikrotiterplatte wird nun mittels eines Schüttlers geschüttelt und danach bei 405 nm in einem Mikrotiterplattenreader oder einem äguivalenten Photometer gemessen.

Die in der Mikrotiterplatte suspendierten nicht¬ agglutinierten Erythrozyten weisen die folgenden Extinktionen auf:

Reaktion von A-Erythrozyten

Antiserum

Anti-B Anti-A

Anwendungsbeispiel 8 - Coombs-Test nach Abtrennung von störenden Begleitstoffen mittels Chromatographie

Jeder Säulenteil (6) der Säulen der Mikrosäulenkammer (13) wird mit 30 μl in 0,9 % NaCl geguollenem Biogel 200 gefüllt, wie in Anwendungsbeispiel 7 beschrieben. Es werden 20 μl Coombs-Serum (Anti-Human-Globulin) auf die Geloberfläche pipettiert. 5 μl der ungewaschenen sensibilisierten Erythrozyten aus Vollblut werden aus einer 5 % igen Suspension ebenfalls auf die Geloberfläche pipettiert. Die Säulenkammern werden 15-30 min bei Raumtemperatur inkubiert und danach wie in Anwendungsbeispiel 7 zentrifugiert und photometrisch gemessen.

Die mit Coombs-Serum agglutinierten Erythrozyten befinden sich nach der Zentrifugation als scharfe Bande auf der Geloberfläche oder in der oberen Hälfte des Geles. Die nichtagglutinierten Erythrozyten sedimentieren in die Mikrotiterplatte.

Die in der Mikrotiterplatte suspendierten nicht¬ agglutinierten Erythrozyten weisen die folgenden Extinktionen auf:

Reaktion von Coombs-positiven O-Erythrozyten

Antiserum Verdünnung Erythrozyten Extiktion 20 μl 5 μl 5

AHG-Serum unverdünnt Coombs +++ 0-0,01 AHG-Serum unverdünnt Coombs - 0,16

Anwendunσsbeispiel 9 - Bestimmung von Antistreptolysin- Antikörpern mittels Latexagglutination und Partikeltrennung durch Chromatographie.

Jeder Säulenteil (6) der Säulen der Mikrosäulenkammer (13) wird mit 30 μl geguollenem Sephadex G200 superfine, wie in Anwendungsbeispiel 7 beschrieben, gefüllt. Auf die Geloberfläche werden 20 μl der zu untersuchenden Serumprobe pipettiert. Dazu werden 5 μl Streptolysin-O-markierte Latexpartikel (1:2 in 0,9% NaCl verdünnt, aus rheumajet ASO, biokit) pipettiert. Nach Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur werden die Mikrosäulenkammern wie in Anwendungsbeispiel 6 über einer Mikrotiterplatte zentrifugiert. Die agglutinierten Latexpartikel bleiben auf der Geloberfläche oder in den oberen Gelteilen liegen, die nichtagglutinierten Partikel sedimentieren in die Mikrotiterplatte. Die Mikrotiterplatte wird geschüttelt und in einem Reader bei 380 nm ausgewertet.

Die in der Mikrotiterplatte suspendierten nichtagglutinierten Latexpartikel weisen die folgenden Extinktionen auf:

20 μl Serum 5 μl 1:2 verdünnte Partikel Extinktion

ASO-negativ Streptolysin-beschichtet 0,6 ASO-poεitiv Streptolysin-beschichtet 0,005

Bezugszeichen

1 Mikrosäule

2 eingangsseitiger Teil der Mikrosäule

3 ausgangsseitiger Teil der Mikrosäule

4 Filter

5 Erweiterung im emgangsseitigen Teil

6 Säulenteil der Mikrosäule Säulendurchlauf Auffanggefäß Filterelement 0 Chromatographiematerial a 1 Chromatographiematerial b 2 Chromatographiematerial c 3 Mikrosäulenkammer 4 Mikrotiterplatte 5 Mehrkanalpipette