La présente invention concerne essentiellement l'utilisa¬ tion de collagène comme support solide de fixation d'un capteur capable de réagir spécifiquement avec un élément à détecter dans un milieu biologique, réactif et procédé de mise en oeuvre.

Il est déjà connu par le document US YAPEL/3 US-A-4.169.804 la fabrication de microparticules composites à réponse magnétique comprenant un matériau à réponse magnétique et une matrice insoluble dans l'eau solide poreuse choisie parmi des matériaux protêiniques, des polysaccharides et leurs mélanges.

Le matériau à réponse magnétique est dispersé dans la matrice insoluble à l'eau solide perméable (voir l'abrégé et les revendications en colonnes 11 et 12) .

Dans ce document, il est également prévu d'utiliser ces microparticules poreuses pleines comme matrice d'inclusion d'un enzyme insoluble dans l'eau (colonne 1, ligne 66 à colonne 2, ligne 2) ou encore d'un récepteur spécifique tel qu'une protéine ou un anticorps (voir colonne 2, ligne 63 à colonne 3, ligne 26).

Le déposant a déjà décrit dans le document FR-B1- 2 642 329 l'utilisation de solutions d'atélocollagène et de glyco- samiπoglycannes pour la fabrication de microcapsules ainsi que des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques ou alimentaires en con¬ tenant.

Les présents inventeurs ont maintenant découvert que le collagène, et de préférence de l'atélocollagène, et encore mieux un mélange d'atélocollagène et de polyholosides, constitue un support solide remarquable de fixation d'un capteur capable de réagir spécifiquement avec un élément à détecter dans un milieu biologique pour former un complexe spécifique qui peut alors être détecté par tout moyen de détection.

La présente invention a pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un support

solide présentant en surface extérieure un grand nombre de fonctions ou groupements réactifs, afin de permettre la fixation covalente d'un capteur spécifique, de préférence d'un capteur spécifique d'un élément à détecter dans un milieu biologique en particulier dans des buts d'analyse et/ou de dosage qualitatif ou quantitatif.

La présente invention a encore pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un support solide de fixation à sa surface, d'un capteur spécifique qui présente de très bonnes propriétés mécaniques rendant possible une dispersion très aisée dans divers milieux, notamment grâce à une agitation vigoureuse sans détérioration sensible de ses capacités ou propriétés initiales.

La présente invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un support solide de fixation d'un capteur spécifique d'un élément à détecter dans un milieu biologique qui soit capable de permettre un mélange rapide avec le milieu biologique ainsi qu'une séparation aisée de ce milieu biologique, afin d'aboutir à un gain de temps appréciable dans le cadre des analyses médicales en vue d'un diagnostic médical. L'invention résoud ces problèmes techniques pour la première fois, de manière simultanée, simple, aisée, fiable, peu coûteuse, utilisable à l'échelle industrielle et médicale.

L'invention permet avantageusement dans le cadre d'une application biologique, de réaliser des dosages sensibles et reproductibles de substance présente dans les fluides biologiques. L'invention prouve avantageusement également l'application dans le cadre de la détection d'un rotavirus humain ainsi que pour le titrage de l'HCG dans un fluide biologique tel que le sérum. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne l'utilisation de collagène, de préférence l'atélocolla- gène, et encore mieux un mélange d'atélocollagène et de polyholo¬ side comme support solide de fixation d'un capteur, dénommé ligand ou affinant, capable de réagir spécifiquement avec un ëlé-

ment à détecter dans un milieu biologique pour former un complexe spécifique pouvant ensuite être détecté par tout moyen de détec¬ tion.

Selon une caractéristique avantageuse de cette utilisa- tion, le collagène utilisé sous forme de particules, billes, ou capsules, de préférence de diamètre compris entre environ 5 et

500 μm (micromètres) . On préfère les capsules et en particulier des microcapsules.

Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, le collagène comprend de l'atélocollagène, de préférence combiné à un polyholoside, par exemple un glycosaminoglycanne, du dextrane, ou du chitosane.

Ce support solide, lorsqu'il est préparé à partir de col¬ lagène natif, peut être fabriqué sous forme de particules par coa- gulation de gouttes.

Lorsqu'il s'agit d'atélocollagène, il peut être opéré de la même manière.

Lorsqu'il s'agit d'un mélange d'atélocollagène et d'un polyholoside, les particules solides sont de préférence obtenues par réticulation interfaciale comme décrit dans le brevet précédent du déposant FR-B1-2 643 329.

Dans ce cas, la proportion relative de polyholoside par rapport à l'atélocollagène varie avantageusement entre 15 et 50% en poids. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'inven¬ tion, les particules de collagène contiennent un oxyde magnétique, de préférence un oxyde magnétique de fer.

Avantageusement, la concentration d'oxyde magnétique est comprise entre 0,1 et 10% en poids par rapport au poids total des particules.

Selon une autre caractéristique particulière de l'inven¬ tion, le capteur précité est fixé de manière covalente par un agent chimique sur les particules de collagène formant support solide de fixation. Le support solide selon l'invention présente l'avantage

de présenter des fonctions chimiques de surface telles que les fonction aminées (-NI-L) , carboxyliques (-CO H) ou alcooliques (-0H) , qui permettent de réaliser le couplage du capteur formant ligand ou affinant.

Dans le cas des fonctions aminées (-NH _? ) , on utilisera de préférence comme agent chimique de couplage entre le capteur et le support solide, un réactif de type NHS (N-hydroxysuccinimide) dont l'un peut réagir avec le groupement aminé du support solide et l'autre avec le capteur formant ligand ou affinant. Ce couplage est effectué de préférence en deux étapes, la première étape consistant à fixer le réactif à la surface des particules solides du support, puis, après avoir éliminé l'excès de réactif chimique de couplage, de réaliser le couplage du capteur formant ligand ou affinant avec les particules de support solide obtenues après la première étape ci-dessus.

Les agents chimiques de couplage sont dits homobifonc- tionnels si lé deuxième groupement réactif est également de type NHS ou hêtérobifonctionnels si ce dernier est différent. Un exem¬ ple de deuxième groupement réactif différent est un groupement maléi ide pouvant fixer une molécule par une fonction thiol (-SH) . Dans le cas des fonctions carboxyliques, les réactifs chimiques de couplage utilisent de préférence des agents du type carbodiimide hydrosolubles. Leur utilisation se fait également par un procédé en deux étapes. Les carbodiimides sont des agents hété- robifonctionnels donnant une liaison d'une fonction carboxylique (-C00H) et aminée (-NH ₂ ) .

Dans le cas des fonctions alcooliques, la technique uti¬ lisée de préférence comprend une oxydation de la fonction alcool en μn aldéhyde (CHO) par un agent d'oxydation douce, tel que le pêrio- date de sodium (NalO.) . L'aldéhyde peut ensuite réagir avec une fonction aminée (-NH„) en formant une base de Schiff. Ainsi, ce couplage se fait encore par un procédé en deux étapes, la première étape consistant à réaliser l'oxydation de la fonction alcool en aldéhyde, la deuxième étape consistant à réaliser le couplage pro- prement dit de l'agent formant ligand ou affinant avec les parti¬ cules solides du support obtenu à la fin de la première étape.

Il est à noter que grâce à l'emploi comme support solide de collagène, d'atélocollagène ou de mélange atêlocollagène- polyholoside, on obtient la présence de diverses fonctions de sur¬ face sur les particules du support solide, en quantité importante, ce qui rend aisé un couplage de populations moléculaires différen¬ tes sur la même surface, par exemple un anticorps et une enzyme.

Pour ce faire, on pourra utiliser deux méthodes, à savoir :

- le mélange de populations moléculaires différentes lors de la phase de couplage ce qui donnera lieu à la fixation à la surface des particules du support solide d'une partie variable de ces populations en fonction de la réactivitê propre de chaque population et de leur concentration respective.

Le résultat sera alors une fixation en une quantité déterminée de chaque population et ceci de manière reproductible si les conditions de réaction sont reproduites.

D'autre part, l'activation successive des différentes fonctions disponibles sur la surface des particules solides, suivie du couplage séquence des différentes populations moléculaires, ce qui permet alors d'obtenir un support solide à spécificité multi¬ ple.

On observera par ailleurs que dans le cadre de l'inven¬ tion, le support solide est fabriqué à partir de substances natu¬ relles extraites de tissus animaux. Ceci est le cas du collagène et de l'atélocollagène, qui sont des protéines à longue chaîne ex¬ traites du tissu dermique, ainsi que du polyholoside, en particu¬ lier un glycosaminoglycanne.

Grâce à l'utilisation selon l'invention de collagène, de préférence d'atélocollagène et encore mieux d'un mélange d'atélo- collagène-polyholoside, par fixation d'un capteur formant liant ou affinant, on obtient ainsi un réactif de détection qualitative et de mesure quantitative d'un élément quelconque d'un milieu d'ori¬ gine biologique. La notion d'élément recouvre ici dans le cas de la présente description et des revendications toute espèce d'anticorps ou d'antigènes, sous forme soluble ou particulaire, ainsi que toutes les espèces moléculaires pouvant donner lieu à des corn-

plexes spécifiques pour lesquels la constante d'affinité est suf¬ fisamment forte pour déplacer la réaction dans le sens de la formation du complexe.

Ce réactif peut être utilisé de manière classique dans le cadre des procédés de détection qualitative et de mesure quantita¬ tive d'élément d'un milieu d'origine biologique, dans le cadre des analyses médicales en vue d'un diagnostic médical. La manipulation est aisée et aboutit à un gain de temps appréciable grâce à un mélange rapide avec le milieu biologique et une séparation aisée des particules solides de ce milieu biologique.

Ce réactif permet de mettre en oeuvre des procédés clas¬ siquement dénommés "immuno-essais" en phase hétérogène.

Le réactif selon l'invention permet de détecter des élé¬ ments présents en quantité infinitésimale dans un milieu complexe d'origine biologique grâce à la capacité d'extraction et de sépa¬ ration de l'élément recherché par le capteur formant ligand ou affinant fixé sur la phase solide.

Le milieu d'origine biologique est habituellement une phase liquide constituée par un liquide d'origine biologique tel que sang, urine, liquide céphalo-rachidien, etc. ; ou un extrait de tissu nécessitant la mise en oeuvre d'un moyen tf'extraction de nature physique tel que chaleur, rayonnement, etc. ; ou chimique tel qu'enzyme, détergent, acide, base, etc.

Le capteur formant agent, liant ou affinant fixé sur la phase solide ou support solide selon l'invention est spécifique de l'élément recherché et de tels capteurs sont bien connus de l'homme de l'art. Ces capteurs peuvent donner lieu dans des conditions physico-chimiques adéquates à la formation de complexe stable notamment par des réactions de type immunitaire, qui sont fixés à la surface de la phase solide, complexe que l'on peut ainsi isoler des autres populations moléculaires en présence par un procédé quelconque aboutissant à la séparation de la phase solide compor¬ tant le complexe lié à celle-ci.

La révélation de la présence du complexe peut être en- suite effectuée par mesure de la consommation par exemple par une technique de compétition, ou de la quantité proportionnellement

fixé d'un traceur marqué qui donnera un signal spécifique mesurable à l'aide d'un procédé chimique ou physique tel que comptage isoto¬ pique, spectrophoto étrie, luminométrie, ampérométrie, etc. Toutes ces techniques sont bien connues à l'homme de l'art. Selon un deuxième aspect, l'invention couvre ainsi à titre de produits nouveaux, un réactif biologique caractérisé en ce qu'il comprend comme support ou phase solide, des particules de collagène, de préférence atélocollagène, et encore mieux un mélange d'atélocollagène et de polyholoside. Diverses variantes de réalisation de ce réactif résultent de la description précédente faite en relation au premier aspect de l'invention, et résulteront également de la description qui va suivre en référence à divers exemples non limitatifs de l'inven¬ tion. Selon un troisième aspect, la présente invention couvre encore un procédé de détection dans un milieu biologique d'un élément à détecter.

Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé de détection caractérisé en ce qu'on utilise, comme réactif biologique, un réactif biologique dont le capteur comprend un anticorps anti-rotavirus humain, et en ce que le procédé est un procédé de détection du rotavirus humain.

Selon un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de détection caractérisé en ce qu'on utilise comme réactif biologique, un réactif biologique dont le capteur est un anticorps anti-HCG, et en ce que le procédé est un procédé de titrage de l'HCG dans le sérum.

Des variantes de réalisation de ce procédé sont également apparentes de la description précédente, ainsi que de la descrip- tion suivante faite en référence aux exemples ci-après donnés sim¬ plement à titre d'illustration.

Comme polyholosides, on utilise en particulier des gly- cosaminoglycannes qui sont avantageusement des glycosaminoglycannes de structure en particulier choisis parmi le groupe consistant de chondroïtine-4-sulfate, de chondroïtine-6-sulfate, de dermatane-

sulfate, d'héparane-sulfate et de ératane-sulfate, ainsi que de l'héparine ainsi que ses dérivés, en particulier les dérivés de bas poids moléculaire dont le poids moléculaire peut varier entre 2000 et 10000. Comme polyholosides, on peut également citer le chitosan et le dextrane.

Le polyholoside est en particulier utilisé sous forme de solution aqueuse à 0,5 à 4% et de préférence 0,5 à 2% et encore de préférence environ 1%, en poids, par rapport à la solution de poly¬ holoside. Le collagène, ou de préférence l'atélocollagène est de préférence utilisé en solution aqueuse ayant une concentration en

collagène ou en atêlocollagène comprise entre 0,5 et 2% en poids. Cette solution de collagène ou d'atélocollagène peut être obtenue en dissolvant des fibres de collagène ou d'atélocollagène dans une solution aqueuse légèrement acide. Cette solution aqueuse légère¬ ment acide peut être de préférence une solution d'acide aqueuse d'acide acétique 0,1 M. L'atélocollagène peut être obtenu par di¬ gestion enzymatique de collagène bien connu à l'homme de l'art. Pour la préparation du mélange collagène, de préférence atêlocollagène, polyholoside, la solution de polyholoside est avan¬ tageusement introduite dans la solution de collagène, de préférence d'atélocollagène. Ensuite, pour la préparation de particules solides, en particulier des microcapsules, on utilise un procédé de fabrication par reticulation iπterfaciale tel que décrit dans le document FR-B1-2642329.

Selon ce procédé, après avoir mélangé la solution de col¬ lagène, de préférence d'atélocollagène, avec la solution de poly¬ holoside, de manière homogène, on disperse une phase huileuse con- tenant un agent de reticulation sous forme de phase dispersée dans la phase continue formée par la solution d'un mélange de collagène, de préférence atêlocollagène, et de polyholoside, sous agitation pendant le temps nécessaire pour réaliser un degré approprié de reticulation interfaciale, ce qui permet de produire des icro- capsules dont la paroi est une paroi mixte de collagène, de préfê-

rence atêlocollagène, et de polyholoside réticulé.

Les microcapsules sont séparées de manière appropriée par une décantation naturelle après un ou plusieurs lavages éventuels. On peut également procéder par une extrusion laminaire au travers d'une buse d'extrusion, l'écoulement laminaire étant soumis à des vibrations de manière à former des gouttelettes individuelles qui tombent ensuite dans un bain de reticulation contenant l'agent réticulant.

Comme agent de reticulation, on utilise avantageusement du chlorure d'acide, un anhydride d'acide, ou un acide carboxylique dibasique ou polybasique. Un agent de reticulation préféré est choisi parmi le groupe consistant de chlorure de téréphtaloyle, un chlorure de phtaloyle, un chlorure de sêbacoyle, un chlorure de succinyle, un chlorure d'un acide tricarboxylique tel que l'acide citrique ou un anhydride d'acide tel que l'anhydride succiπique.

Comme solvant de l'agent de reticulation, on utilise un liquide hydrophobe dans lequel le collagène, de préférence l'atélo¬ collagène et/ou le polyholoside, sont insolubles. On utilise encore de préférence du cyclohexane ou du chloroforme. Grâce à l'emploi d'un procédé de reticulation inter¬ faciale, on peut ainsi préparer des microcapsules qui peuvent encapsuler un principe actif quelconque. En particulier, il est avantageux d'encapsuler dans les microcapsules une particule magné¬ tique telle qu'un oxyde de fer, ce qui permet de faciliter la séparation du support solide des solutions dont on veut réaliser l'analyse, ce qui constitue un avantage technique important de l'invention. En effet, on obtient un temps de séparation inférieur à 5 s sur 1 cm de distance en présence d'un simple aimant perma¬ nent. Ceci est dû à leur masse relativement importante liée à une densité voisine de 1 ne nécessitant qu'une faible charge en oxyde magnétique de l'ordre de 1% en poids, pour obtenir ce résultat. L'agitation magnétique devient alors possible. Le support solide selon l'invention présente un volume relativement important ce qui lui apporte une insensibilité aux forces d'agrégation qu'elles soient hydrophobes ou ioniques. Cela permet encore la séparation

rapide en cours de fabrication par ceπtrifugatioπ à basse vitesse, par exemple de l'ordre de 800 g pendant 2 min, et une remise en suspension sous forme non agrégée par simple agitation.

Les particules de support solide selon l'invention peu- vent être obtenues en détail intermédiaire par exemple de l'ordre de 50 μm, grâce au procédé de fabrication utilisé, en particulier la reticulation iπterfaciale, ce qui permet d'obtenir des surfaces

2 réactives suffisantes lors d'un immuno-essai (par exemple 625 mm pour 50 μl de particules de support solide en suspension à 10% en poids) . Cette surface extérieure est en permanence en contact avec le liquide réactionnel. C'est donc une surface extrêment efficace.

Les particules du support solide selon l'invention sont par nature hydrophiles en raison de sa constitution chimique. On sait que les polyholosides sont des enchaînements de sucres possé- dant dans leur structure de nombreuses fonctions hydrophiles. Par ailleurs, on peut également incorporer, comme polyholoside, du chitosane, ce qui permet d'obtenir des particules solides ionique- ment peu chargées.

Par ailleurs, le couplage chimique covalent selon l'in- vent permet aussi d'obtenir des greffages fortement liés stables et fixés dans un sens choisi, par exemple et avantageusement pour la fixation de peptides, ce qui permet d'obtenir une efficacité de réaction maximale.

D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'inven- tion apparaîtront clairement à la lumière de la description expli¬ cative qui va suivre faite en référence à plusieurs exemples de réalisation de l'invention donnés simplement à titre d'illustration et qui ne saurait donc en aucune façon limiter la portée de l'in¬ vention. Dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids sauf indication contraire.

Exemple 1 selon l'invention

Couplage d'anticorps polyclonaux à des particules solides magnétiques par l'EDC (l-êthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbo-

diimide) : application à la détection du rotavirus humain dans les selles.

1. Préparation des particules solides (sous forme de microcapsules) Principe :

Des particules solides de taille moyenne de 50 |m environ ont été préparées et réticulées après émulsion d'une solution aqueuse d'atélocollagène et de chitosane dans une phase huileuse.

Cette préparation a été effectuée selon le procédé décrit dans l'exemple 1 de FR-B1-2 642 329 (89-01221). L'incorporation d'oxyde de fer magnétique (FE304) permet l'obtention d'une phase solide séparable par action d'un champ magnétique.

Mode opératoire : A une solution d'atélocollagène à 1,6% est ajoutée d'une solution de KITAN à 3% dans l'acide lactique. L'atélocolla¬ gène est préparé selon la méthode décrite dans le brevet français n° 8901221.

Le KITAf-T est fourni par la Société ABER TECHNOLOGIES, Prat Menau 29880 Plouguerneau France. Le KITAN est un chitosane de masse moléculaire 1 200 000 daltons, possédant un taux de désacê- tylation de 2,4%.

Au mélange atêlocollagène - Kitaπ est ajoutée une concen¬ tration de 5% de carbonate de sodium. Le pH est alors ajusté à 8,0 par HC1 N/10. Dans cette préparation, 1% d'oxyde de fer Fe„0. est introduit. 100 g du mélange ainsi obtenu sont émulsionnés dans 300 ml de DRAGOXAT ^* -^vendu par la Société allemande DRAG0C0 et con¬ tenant 5% de SPAN 85^vendu par ICI COMPANY. L'emulsion est obtenue par agitation rapide à l'aide d'un système agitateur Ultra Turax R tournant à 15 000 tr/ in (rpm) pendant 2 min.

400 Ml de DRAGOXAT^renfermant l'agent réticulant, soit 2,5% de chlorure d'acide téréphtalique sont ajoutés à l'emulsion maintenue sous agitation de 15 000 tr/min pendant 30 min.

L'agent réticulant est éliminé grâce à une centrifugation à 1 500 g pendant 10 min et par rejet du surnageant obtenu.

Trois lavages successifs sont effectués avec 400 ml de DRAGOXA - les capsules collagéπiques étant récupérées par ceπtri- guation dans les mêmes conditions que précédemment. Six lavages mettant en oeuvre chaque fois 600 ml d'ethanol sont réalisés afin d'éliminer le DRAG0XAT résiduel. Deux lavages par 60 ml d'une solu¬ tion de soude à pH 9 et trois lavages par de l'eau désionisée per¬ mettent d'éliminer les agrégats de capsules. Un culot de particules solides est ainsi obtenu après centrifugatioπ à 1500 g pendant 10 min. Ce culot est alors dispersé dans un volume égal d'eau désionisée renfermant à 0,01% de ercurothiolate de sodium. Cette dispersion de particules solides sera celle mise en oeuvre lors des détections et dosages décrits ci-dessous.

2. Préparation d'un réactif spécifique pour un dosage par immuno- essai

On utilise des anticorps antirotavirus du type gamma G qui sont purifiés à partir d'un sérum de lapin hyperimmunisé par une suspension de rotavirus bovin. La présence d'anticorps anti- antigène de groupe du virus permet la détection du virus humain. La pureté des gamma globulines est vérifiée par électrophorèse. Le dosage protéique en poids/volume est effectué selon la technique de Lowry.

Le couplage des anticorps sur les particules solides a- gnétiques obtenues à l'étape 1 ci-dessus est effectué en utilisant les fonctions carboxyliques (-C00H) du collagène.

Les particules solides sont au préalable lavées dans un tampon de pH voisin de la neutralité (compris entre 7 et 7,5) de faible force ionique et exempt d'aminé (par exemple : tampon Hepes ιo mM) .

L'activation des particules solides est effectuée par une carbodiimide soluble (par exemple l'EDC (l-éthyl-3-(3-diméthyl- aminopropyl)carbodiimide) à une concentration comprise entre 5 et 100 mM (par exemple 20 M) diluée dans le tampon Hepes 10 M.

La proportion sera de 1 volume de particules solides ma¬ gnétiques pour 1 volume d'EDC. L'activation sera faite sous agita¬ tion modérée (par exemple sur agitateur rotatif) de la suspension pendant 1 h entre 20 et 25 C. L'excès d'EDC est ensuite éliminé par lavage des particules solides en tampon Hepes 10 mM (4 lavages suc¬ cessifs par ajout de 9 volumes de tampon) et récupération des par¬ ticules solides par centrifugation ou par magnétisme.

Le couplage des gamma G de lapin (au préalable dialyse en solution de Na 0,15 M) est effectué en ajoutant au dernier culot de centrifugation 1 volume de tampon carbonate-bicarbonate 0,1 M et 1 mg de gamma G par ml de culot. Le couplage est effectué à tempé¬ rature ambiante sur agitateur rotatif durant une heure.

Le blocage des fonctions résiduelles est effectué par ajout de 10% du volume total d'une solution d'éthanolamine 1 M pH 9,0 et agitation durant 1 h entre 20 et 25°C.

Une série de 4 lavages avec un tampon Tris 50 mM en final permet d'éliminer l'excès d'anticorps n'ayant pas réagi et la remise en suspension à 10% dans ce tampon permet d'obtenir la sus¬ pension définitive du réactif spécifique recherché.

3. Détection d'un élément spécifique (formant réactif obtenu à l'étape 2 ci-dessus)

Cette préparation a pu être testée vis-à-vis des selles humaines étiquetées positives et négatives pour la recherche du rotavirus. Cette classification préalable a pu être réalisée à l'aide d'un coffret réactif de type ELISA classique disponible sur le marché. Le protocole de la réaction immunologique avec le réac¬ tif de particules solides magnétiques ci-dessus est le suivant :

- dilution des selles au 3/30 en tampon Tris 50 M - pH 7,4. Homogénéisation par agitation puis centrifugation 5 min pour décanter la matière fécale ;

- mise en présence de 400 μl de surnageant et 40 γl de réactif de particules solides magnétiques à 10% ;

- agitation 20 min sur agitateur oscillant ; - lavages rapides par 1 ml de tampon PBS (Phosphate

Buffer Saline) - Tween et séparation de la phase solide par aiman¬ tation ;

- mise en contact du réactif de particules solides récu¬ péré avec 500 pi d'un anticorps monoclonal ainsi rotavirus dit "révélateur" car conjugué à la peroxydase ;

- agitation 20 min sur agitateur oscillant ;

- lavages rapides par 1 ml de tampon PBS - Tween, sépara¬ tion des phases par aimantation ;

- révélation de l'activité enzymatique par un substrat chromogène : HpO„/orthophénylènediamine.

La lecture est effectuée visuellement, l'intensité de la coloration appréciée en +, cf. le tableau I ci-dessous.

Tableau I

Selle Coloration Interprétation

A 0 négative β ++++ positive

C ++++ positive

D 0 négative

Exemple 2 selon l'invention

Couplage d'anticorps polyclonaux à des particules solides magnétiques par l'EDC : application au titrage de l'HCG (Human Cho- rionic Gonadotrophin) dans le sérum.

Les anticorps anti HCG utilisés sont du type gamma G et sont purifiés à partir de sérum de lapin hyperimmunise par l'HCG

purifiée totale. Cet antisérum comporte donc des anticorps de spé¬ cificité α et J, . Le couplage a été effectué selon le même protocole que dans l'exemple 1,1 et 1,2. La préparation formant réactif a pu être testée vis-à-vis

de sérums humains de femmes enceintes classés au préalable à l'aide d'un coffret ELISA classique du commerce. Deux sérums de donneurs masculins servent de témoin négatif.

Le protocole de la réaction immunologique avec les parti- cules solides magnétiques sensibilisées est le suivant

- mise en présence de 50 μl de sérum non dilué et 40 μl de réactif de particules solides magnétique à 10% ;

- agitation 15 min sur agitateur oscillant ;

- ajout de 100 fJl d'un anticorps monoclonal anti HCG (spécificité J_) conjugué à la peroxydase ;

- agitation 15 min sur agitateur oscillant

- lavages rapides par 1 ml de tampon PBS - Tween, sépa¬ ration des phases par aimantation ;

- révélation de l'activité enzymatique par l'H^O /ortho- phénylènediamine.

La lecture est effectuée sur un spectrophotomètre à 492 nm après blocage de la réaction enzymatique par 1 ml d'acide sulfurique, cf. tableau II ci-dessous :

Tableau II Dosage de l'HCG dans les sérums humains II-A

Sérums de femmes enceintes DO (492 nm)

1 0,544

2 0,900

3 1,454 4 0,139

5 0,443

H-B

Sérums de donneurs masculins

a ,096 b 0,106

* Sérums étalon 5 mUI (seuil de positivité) 0,153

* mUI = milli unité internationale

Conclusion

La D0 des 5 sérums positifs est proportionnelle à la concentration de l'HCG présente.

Les sérums de donneurs masculins sont bien négatifs (< seuil). Les particules solides magnétiques sont utilisables dans le cadre d'une détermination quantitative.