Verfahren zum Kalibrieren eines Mikroskops,

Mikroskopanordnung und Verwendung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kalibrieren eines Mikroskops, eine zugehörige Mikroskopanordnung sowie eine zugehörige Verwendung.

Mikroskope, insbesondere hochauflösende Mikroskope, werden für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Beispielsweise können sie für biologische, mikrobiologische und materialwissenschaftliche Fragestellungen eingesetzt werden. Mittels diverser Superresolutionstechniken können mittlerweile Auflösungen erzielt werden, welche erheblich besser sind als die aufgrund von Beugung beschränkte Auflösung.

Um Ergebnisse, welche mittels eines Mikroskops gewonnen wurden, korrekt interpretieren zu können, ist es von Vorteil, wenn eine Referenz für diverse

Eigenschaften eines Mikroskops zur Verfügung steht. Bekannte Referenzen, beispielsweise für ein Längenmaß, basieren beispielsweise darauf, dass Fluorophore bewusst in DNA-Moleküle eingebracht werden. Derartige Proben haben sich jedoch als wenig langlebig erwiesen und sind eher für Größenordnungen von mehreren hundert Nanometern geeignet.

Es ist deshalb eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Kalibrieren eines Mikroskops vorzusehen, welches im Vergleich zu bekannten Lösungen alternativ oder besser ausgeführt ist. Es sind des Weiteren Aufgaben der Erfindung, eine zugehörige Mikroskopanordnung sowie eine zugehörige Verwendung bereitzustellen.

Dies wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren, eine Mikroskopanordnung sowie eine Verwendung gemäß den jeweiligen Hauptansprüchen erreicht. Vorteilhafte

Ausgestaltungen können beispielsweise den jeweiligen Unteransprüchen entnommen werden. Der Inhalt der Ansprüche wird durch ausdrückliche Inbezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kalibrieren eines Mikroskops. Das Mikroskop weist Folgendes auf:

einen Probenhalter zur Aufnahme einer Probe,

eine Anregungsoptik zum Richten eines Anregungslichtstrahls auf die Probe, eine Abfrageoptik zum Aufnehmen von durch die Probe ausgesendetem Licht, und

einen Detektor zum Erfassen von durch die Abfrageoptik aufgenommenem Licht.

Das Verfahren weist folgende Schritte auf:

Einsetzen eines Festkörpers als Probe in den Probenhalter, wobei der

Festkörper zumindest ein erstes optisches Zentrum aufweist, welches nach Anregung Licht aussendet,

Richten eines Anregungslichtstrahls auf die Probe, so dass das erste optische Zentrum angeregt wird,

Erfassen des von der Probe ausgesendeten Lichts mittels der Abfrageoptik und des Detektors, und

Kalibrieren des Mikroskops basierend auf dem vom Detektor erfassten Licht.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Festkörper mit einem optischen Zentrum verwendet. Es hat sich gezeigt, dass derartige Festkörper mit optischem Zentrum erheblich widerstandsfähiger und langlebiger sind als aus dem Stand der Technik bekannte Proben. Dementsprechend kann eine Kalibrierung wesentlich zuverlässiger durchgeführt werden und es können unterschiedliche Vergleiche, beispielsweise zwischen verschiedenen Zeitpunkten und/oder zwischen verschiedenen Mikroskopen, angestellt werden. Außerdem können beispielsweise Vergleiche zwischen unterschiedlichen Mikroskopteilen wie Objektiven oder unterschiedlichen

Auswerteverfahren oder Algorithmen angestellt werden. Beispielhafte Ausführungen dazu werden weiter unten näher beschrieben werden.

Das Verfahren ist insbesondere für die Verwendung mit einem Mikroskop wie

angegeben geeignet. Eine alternative Formulierung des Verfahrens kann wie folgt lauten:

Einsetzen eines Festkörpers als Probe in einen Probenhalter eines Mikroskops, wobei der Festkörper zumindest ein erstes optisches Zentrum aufweist, welches nach Anregung Licht aussendet,

Richten eines Anregungslichtstrahls mittels einer Anregungsoptik des Mikroskops auf die Probe, so dass das erste optische Zentrum angeregt wird,

Erfassen des von der Probe ausgesendeten Lichts mittels einer Abfrageoptik des Mikroskops und eines Detektors des Mikroskops,

Kalibrieren des Mikroskops basierend auf dem vom Detektor erfassten Licht.

Bei dem Festkörper kann es sich um einen durchgehenden bzw. einstückigen

Festkörper handeln. Es kann sich jedoch beispielsweise auch um einen

zusammengesetzten Festkörper handeln. Beispielsweise können mehrere Nano- Partikel oder Nano-Diamanten zu einem Festkörper zusammengesetzt werden.

Besondere Vorteile ergeben sich bei einem kristallinen, insbesondere monokristallinen Festkörper, es können jedoch auch beispielsweise polykristalline, glasartige oder auch zusammengesetzte Festkörper verwendet werden. Eine Herstellung derartiger

Festkörper kann beispielsweise durch Spincoating erfolgen, beispielsweise durch Spincoating von Nanodiamanten in einem Polymer wie Polymethylmethacrylat (PMMA). Nanodiamanten können auch nicht zusammengesetzt an festen Positionen in einem Trägermaterial liegen. Kristalle haben insbesondere Vorteile hinsichtlich fester

Geometrie und bekannter Ausrichtungen anhand von Oberflächen. Begriffe wie Gitter oder Gitterplatz sind aber auch in amorphen Materialien vernünftig anwendbar.

Es sei des Weiteren verstanden, dass unter dem Aussenden von Licht nach Anregung beispielsweise eine Emission verstanden werden kann, wobei in bekannter Weise das optische Zentrum mittels eines Anregungslichts angeregt wird, also in einen

energiereicheren quantenmechanischen Zustand übergeht. Von diesem aus kann es über einen oder mehrere Zerfallspfade wieder in einen Grundzustand übergehen und dabei ein Photon aussenden. Es kann sich jedoch bei dem Aussenden von Licht auch um eine Streuung handeln, welche hier als Aussenden nach Anregung verstanden wird. Anders ausgedrückt wird ein Anregungslichtstrahl auf das optische Zentrum gerichtet und das Licht wird gestreut, so dass es an einer anderen Stelle erfasst werden kann. Auch dies wird hier als Aussenden von Licht nach Anregung verstanden. Der Probenhalter kann beispielsweise dazu ausgebildet sein, die Probe in einer definierten und/oder reproduzierbaren Stellung zu halten. Dies kann beispielsweise mittels des Verfahrens überwacht werden, worauf weiter unten näher eingegangen wird.

Die Anregungsoptik kann beispielsweise dazu ausgebildet sein, einen Laserstrahl auf die Probe zu richten. Hierzu kann beispielsweise ein Laser als Teil der Anregungsoptik vorgesehen sein. Dieser kann durch optische Komponenten wie Spiegel, Linsen, Strahlteiler und andere Komponente so manipuliert werden, wie es für den jeweiligen Zweck erforderlich ist. Beispielsweise kann der Anregungslichtstrahl auf die Probe und/oder auf das optische Zentrum fokussiert werden. Es kann jedoch auch ein nicht fokussierter Lichtstrahl verwendet werden.

Der Detektor kann beispielsweise ein analoger Detektor wie beispielsweise eine

Fotoplatte sein. Es kann sich auch um einen digitalen Detektor handeln. Beispielsweise kann ein CCD-Detektor, eine Kamera, insbesondere eine empfindliche Kamera, eine CCD-Kamera, oder eine CMOS-Kamera oder ein Film, insbesondere ein

photographischer Film oder ein optischer Film, verwendet werden. Der Detektor kann beispielsweise so ausgebildet sein, dass er an nur einem Ort detektieren kann, beispielsweise mit einer Photodiode, Avalanche-Photodiode (APD), oder einem

Photomultiplier. Er kann jedoch beispielsweise auch verfahrbar ausgebildet sein, so dass mittels eines grundsätzlich nur an einem Ort detektierenden Detektors eine größere Fläche abgebildet werden kann. Außerdem kann vorgesehen sein, dass der Detektor aus einer Mehrzahl von Einzeldetektoren an unterschiedlichen Orten

ausgebildet ist. Auch damit kann eine größere Fläche abgedeckt werden. Alternativ können beispielsweise auch die Probe, der Strahl und/oder ein Objektiv relativ zum Detektor bewegt werden.

Unter einem Kalibrieren des Mikroskops kann verstanden werden, dass das gesamte Mikroskop kalibriert wird oder auch dass nur ein Teil des Mikroskops, beispielsweise ein Objektiv, kalibriert wird, oder auch dass ein Mikroskopierverfahren kalibriert wird. Auch dies sei als ein Kalibrieren des Mikroskops verstanden. Beispielsweise können sich Mikroskopierverfahren lediglich oder zumindest in der Auswertung, welche

beispielsweise in Software realisiert sein kann, unterscheiden. Insbesondere kann unter einer Kalibrierung verstanden werden, dass mittels des Mikroskops ein Wert der Probe gemessen wird, beispielsweise ein Abstand zweier optischer Zentren, und dass dieser Wert gegen einen durch eine Messung bzw. eine anderweitige Messung ermittelten Wert kalibriert und/oder mit einem durch eine Messung bzw. eine anderweitige

Messung ermittelten Wert verglichen wird. Beispielsweise kann zu einer solchen Messung das hierin beschriebene Verfahren verwendet werden, welches auf dem Anlegen von Magnet- und Hochfrequenzfeldern basiert. Auch andere Ausführungen sind jedoch möglich. Durch den Vergleich mit einem gemessenen Wert kann

typischerweise eine höhere Genauigkeit erzielt werden, als wenn beispielsweise mit einem durch Simulation oder Schätzung ermittelten Wert verglichen wird. Beispiele einer Kalibrierung werden hierin beschrieben, beispielsweise bezüglich Abstand, Anregungslichtstrahl oder Sammlungseffizienz. Derartige Kalibrierungen können jeweils für das ganze Mikroskop, für einen Teil davon und/oder für ein Kalibrierverfahren ausgeführt werden.

Auch eine Mikroskopiermethode bzw. ein Mikroskopierverfahren kann kalibriert werden, wobei beispielsweise auch weitere Verfahrensaspekte berücksichtigt werden können.

Insbesondere kann im Rahmen einer Kalibrierung ermittelt werden, ob und in wieweit über das Mikroskop gemessene Größen wie beispielsweise Relativabstände, absolute Positionen, Intensitäten oder Orientierungen den wahren Werten entsprechen. Dabei kann insbesondere ein Vergleich zwischen einem Eingangswert und einem

Kalibrierwert erfolgen.

Es kann auch ein Abgleich, eine Justage, ein Justieren oder dergleichen erfolgen.

Dabei können beispielsweise bestimmte Parameter eines Mikroskopieaufbaus verändert werden, um die Einhaltung vorgegebener Eigenschaften zu erreichen.

Eine Kalibrierung kann beispielsweise rückführbar auf das Sl-System oder andere Normen sein. Beispiele werden hierin erläutert. Auch andere Ausführungen sind jedoch möglich.

Auch können mittels einer Kalibrierung andere Normale kalibriert werden, so dass ein Sekundärstandard etabliert werden kann. Im Rahmen einer Kalibrierung kann auch eine Fehlerbestimmung und/oder eine Abweichungsbestimmung durchgeführt werden. Es können auch relevante Geräteparameter überprüft werden, was beispielsweise als „performance test“ bezeichnet werden kann. Im Rahmen der Kalibrierung kann auch die Einhaltung von Spezifikationen überprüft werden.

Gemäß einer Ausführung weist die Probe zumindest ein zweites optisches Zentrum auf. Dadurch können weitere Funktionalitäten bezüglich des Kalibrierens des Mikroskops ermöglicht werden, auf welche weiter unten näher eingegangen wird.

Der Anregungslichtstrahl kann dabei insbesondere auf die Probe gerichtet werden, so dass das erste optische Zentrum und das zweite optische Zentrum angeregt werden. Dies kann insbesondere mittels des gleichen Anregungslichtstrahls, also insbesondere ohne räumliche Variation des Anregungslichtstrahls relativ zur Probe, und/oder gleichzeitig erfolgen. Dadurch können mehrere optische Zentren für die Kalibrierung herangezogen werden.

Das erste optische Zentrum und das zweite optische Zentrum können beispielsweise einen Abstand von mindestens einem Gitterplatz oder von mindestens 1 nm oder von mindestens 3 nm voneinander haben. Derartige Abstände als Mindestabstand haben sich für typische Anwendungen als vorteilhaft erwiesen und sind sowohl messbar wie auch für den Zweck einer Referenz verwendbar. Auch andere Abstände können jedoch verwendet werden.

Bevorzugt haben das erste optische Zentrum und das zweite optische Zentrum einen Abstand von höchstens 100 nm oder von höchstens 50 nm oder von höchstens 20 nm voneinander. Derartige Abstände als obere Grenze haben sich insbesondere deshalb als vorteilhaft erwiesen, weil bis zu derartigen Abständen in typischen Konstellationen eine Kopplung der optischen Zentren möglich ist, welche für unterschiedliche

Funktionalitäten wie beispielsweise eine unabhängige Abstandsbestimmung oder eine emitterselektive Ansteuerung verwendet werden kann. Auch andere Abstände können jedoch verwendet werden.

Gemäß jeweiligen Ausführungen können als optische Zentren spinaktive optische Zentren, magnetisch koppelbare optische Zentren oder anderweitig, also beispielsweise nicht magnetisch bzw. nichtmagnetisch bzw. nicht-magnetisch koppelbare optische Zentren verwendet werden. Nicht-magnetisch koppelbare optische Zentren sind insbesondere optische Zentren, welche koppelbar sind, aber eben nicht-magnetisch koppelbar sind, also beispielsweise anderweitig koppelbar sind. Dies kann

insbesondere dazu benutzt werden, um bei Vorhandensein von mindestens zwei optischen Zentren diese zu koppeln und somit auf quantenmechanische Effekte zurückgreifen zu können, beispielsweise um deren Abstand zu bestimmen oder um sie selektiv anzusprechen. Auch im Fall eines einzelnen optischen Zentrums kann mittels einer solchen Ausführung, beispielsweise mittels der Verwendung eines spinaktiven optischen Zentrums, beispielsweise ein optisches Übergangsdipolmoment des optischen Zentrums erreicht werden, welches für Kalibrieraufgaben verwendet werden kann. Hierauf wird weiter unten näher eingegangen. Ist das optische Zentrum in einem Kristall eingebettet so ergeben sich insbesondere Vorteile hinsichtlich fester

Gitterplatzabstände, fester Kristallachsen, fester Geometrie und an den

Kristalloberflächen vermessbarer Kristallachsen.

Als Festkörper kann insbesondere Diamant oder Siliziumcarbid (SiC) verwendet werden. Derartige Festkörper haben sich als besonders dauerhaft und für die hier verfolgten Zwecke geeignet erwiesen. Es sei jedoch verstanden, dass auch andere Festkörper verwendet werden können. Der Festkörper kann gemäß einer jeweiligen Ausführung einstückig und/oder als Einkristall ausgebildet sein. Er kann auch polykristallin oder amorph sein. Er kann gemäß einer Ausführung aus Nano-Partikeln oder Nano-Diamanten zusammengesetzt sein. Ein Nano-Diamant kann als Beispiel eines Nano-Partikels verstanden werden. Unter einem Nano-Partikel kann

insbesondere ein Körper mit einer Ausdehnung von nur wenigen Nanometern, beispielsweise höchsten 5 nm oder höchstens 10 nm, verstanden werden.

Als optische Zentren können beispielsweise Stickstofffehlstellen verwendet werden. Insbesondere können Stickstofffehlstellen in Diamant verwendet werden. Diese haben sich für typische Kalibrieraufgaben wie beispielsweise solche, welche weiter unten näher beschrieben werden, als vorteilhaft erwiesen und sind im Übrigen bezüglich ihres physikalischen Verhaltens gut bekannt. Es sei jedoch erwähnt, dass auch andere Arten von optischen Zentren, beispielsweise andere Arten von Fehlstellen oder sonstige Ausführungen optischer Zentren bzw. Substitutionsatome im Festkörper, verwendet werden können.

Der Anregungslichtstrahl kann beispielsweise eine Wellenlänge entsprechend einem Anregungsmaximum der optischen Zentren aufweisen. Die Wellenlänge kann beispielsweise im optischen Spektrum, im UV-Spektrum oder im IR-Spektrum liegen. Dadurch kann eine besonders effektive Anregung erreicht werden. Auch die

Verwendung eines Anregungslichts mit einem breiten Spektrum bzw. einem

kontinuierlichen Spektrum oder mit einer Wellenlänge, welche außerhalb eines

Anregungsmaximums der optischen Zentren liegt, ist jedoch möglich, wobei

beispielsweise auf Charakteristika der Anregungsoptik oder auf ein sonstiges Verhalten der optischen Zentren Rücksicht genommen werden kann.

Das Mikroskop kann beispielsweise ein Konfokalmikroskop, ein Nahfeldmikroskop, ein Streumikroskop oder ein Weitfeldmikroskop sein. Für derartige Arten von Mikroskopen hat sich das hierin beschriebene Verfahren als besonders vorteilhaft erwiesen. Auch alle anderen Arten von Mikroskopen oder jedes andere beliebige optische Gerät, welche die eingangs beschriebenen Erfordernisse erfüllen, kann für die Ausführung des Verfahrens verwendet werden.

Das Kalibrieren kann insbesondere ein Kalibrieren des gesamten Mikroskops sein. Dies bedeutet insbesondere, dass das Mikroskop als Gesamtheit betrachtet wird und als Ganzes kalibriert wird.

Das Kalibrieren kann auch ein Kalibrieren eines Teils des Mikroskops sein,

beispielsweise wenn nicht das gesamte Mikroskop kalibriert werden soll, sondern ein Teil beispielsweise schon anderweitig kalibriert ist und ein anderer Teil noch kalibriert werden soll. Das Mikroskop kann jedoch auch ganz kalibriert werden.

Das Kalibrieren kann auch ein Kalibrieren eines Mikroskopierverfahrens sein. Dies kann insbesondere bedeuten, dass bestimmte Abläufe des Verfahrens oder eine dazu verwendete Software kalibriert werden. Das Verfahren kann insbesondere mehrfach wiederholt ausgeführt werden. Dabei können Kalibrierungen, welche bei unterschiedlichen Ausführungen ermittelt werden, zur Feststellung von Änderungen im Zeitverlauf miteinander verglichen werden. Dies erlaubt beispielsweise eine zeitliche Beobachtung des Verhaltens eines Mikroskops, wodurch beispielsweise Langzeiteffekte erkannt und/oder korrigiert werden können. Es können auch Vergleiche zwischen unterschiedlichen Ausführungen angestellt werden. Es kann ein Mikroskop zu unterschiedlichen Zeiten vermessen werden, es können unterschiedliche Mikroskope verglichen werden oder es können unterschiedliche Zustände eines Mikroskops verglichen werden. Beispielsweise kann eine Komponente eines Mikroskops zwischen zwei Messungen verändert werden. Beispielsweise kann eine Schraube des Mikroskops verdreht werden.

Insbesondere kann die Kalibrierung zumindest quer zu einer Ausbreitungsrichtung des Anregungslichtstrahls erfolgen. Dies kann insbesondere bedeuten, dass Messdaten aufgenommen und für die Kalibrierung verwendet werden, welche einen Abstand oder eine sonstige Größe quer zur Ausbreitungsrichtung und/oder parallel zu einer

Oberfläche des Festkörpers, durch welche der Anregungslichtstrahl eindringt, wiedergeben. Dadurch kann die Kalibrierung über eine reine Tiefenkalibrierung hinausgehen und beispielsweise eine Kalibrierung in allen drei Raumrichtungen bieten. Auch eine Kalibrierung in nur einer oder zwei Raumrichtungen ist jedoch möglich. Auch eine Kalibrierung von vektoriellen Komponenten, z.B. Polarisationskomponenten des Anregungslichtstrahls, ist möglich.

Gemäß einer Ausführung ist das Kalibrieren ein Kalibrieren eines Abstands. Die Probe weist dabei bevorzugt zumindest ein zweites optisches Zentrum auf. Dieses zweite optische Zentrum kann beispielsweise zum ersten optischen Zentrum einen Abstand aufweisen, welcher innerhalb der weiter oben bereits als vorteilhaft angegebenen unteren und/oder oberen Grenzen liegt.

Das Verfahren kann dabei bevorzugt einen Schritt des Bestimmens eines Abstands zwischen dem ersten optischen Zentrum und dem zweiten optischen Zentrum mittels einer elektromagnetischen Kopplungsmessung beinhalten. Eine solche

elektromagnetische Kopplungsmessung ist vom Grundsatz her bekannt, beispielsweise aus den folgenden Publikationen: P. Neumann, R. Kolesov, B. Naydenov, J. Beck, F. Rempp, M. Steiner, V. Jacques,

G. Balasubramanian, M. L. Markham, D. J. Twitchen, S. Pezzagna, J. Meijer,

J. Twamley, F. Jelezko, J. Wrachtrup, "Quantum register based on coupled electron spins in a room-temperature solid", Nature Physics, vol. 6, no. 4, pp. 249-253, Apr.

2010. [Online]; http://www.nature.com/articles/nphys1536

H. S. Knowles, D. M. Kara, M. Atatüre, "Demonstration of a coherent electronic spin duster in diamond", Physical Review Leiters, vol. 117, no. 10, Sep. 2016. [Online]; https://doi.Org/10.1103/physrevlett.117.100802

F. Dolde, M. W. Doherty, J. Michl, I. Jakobi, B. Naydenov, S. Pezzagna, J. Meijer, P. Neumann, F. Jelezko, N. B. Manson, J. Wrachtrup,“Nanoscale Detection of a Single Fundamental Charge in Ambient Conditions Using the NV Center in Diamond”, Physical Review Leiters, vol. 112, no. 9, p. 097603, März 2014. [Online];

https://link.aps.0rg/d0i/l 0.1103/PhysRevLett.112.097603

Grob zusammengefasst kann eine solche Kopplungsmessung oder Abstandsmessung beispielsweise folgendermaßen erfolgen:

Anlegen eines Magnetfelds an die Probe,

Anregen der beiden optischen Zentren mittels eines Anregungslichtstrahls, Anlegen eines ersten elektromagnetischen Wechselfelds bevorzugt im

Mikrowellenspektrum, wobei beobachtet wird, dass jedes der beiden optischen Zentren bei beispielsweise jeweils zwei Frequenzen des ersten

elektromagnetischen Wechselfelds das magnetische Moment ändert, was sich beispielsweise bei einer Stickstofffehlstelle in Diamant dadurch äußern kann, dass es dunkel wird,

Anlegen des ersten elektromagnetischen Wechselfelds mit einer dieser

Frequenzen, so dass eines der beiden optischen Zentren dunkel wird, wobei das erste elektromagnetische Wechselfeld ein zeitlich begrenzter Puls ist, so dass das magnetische Moment des ersten optischen Zentrums in einer Überlagerung des hellen und dunklen Zustandes endet und eine Präzession um das angelegte Magnetfeld startet (Larmor-Präzession), Anlegen eines zweiten elektromagnetischen Wechselfeldes mit einer Frequenz, so dass das andere optische Zentrum dunkel wird, wobei das

elektromagnetische Wechselfeld ein zeitlich begrenzter Puls ist, so dass das magnetische Moment des zweiten optischen Zentrums verändert wird, was im Falle einer Wechselwirkung der beiden optischen Zentren zu einer Änderung der Präzessionsfrequenz des ersten optischen Zentrum führt,

Anlegen des ersten elektromagnetischen Wechselfelds mit derselben Frequenz und Pulsdauer, so dass das erste optische Zentrum die Präzession beendet und entsprechend der Phase/des Fortschritts in der Präzession entweder dunkel oder hell wird,

Variieren der Zeitpunkte, zu denen die elektromagnetischen Pulse angelegt werden, so dass der Verlauf der Präzession und somit die Änderung der

Präzessionsfrequenz beobachtet werden kann,

Rückrechnen aus der Änderung der Präzessionsfrequenz auf den Abstand zwischen den beiden optischen Zentren.

Die Vorgehensweise kann auch als Ramsey-Sequenz bezeichnet werden und kann leicht zu einer erweiterten Pulssequenz, beispielsweise als Flahn-Echo-Sequenz, erweitert werden.

Es hat sich gezeigt, dass mittels einer solchen elektromagnetischen

Kopplungsmessung der Abstand zwischen zwei optischen Zentren sehr genau bestimmt werden kann, so dass eine Auflösung bezüglich einzelner Gitterpositionen möglich ist. Eine Zeitgebung der Pulse kann dabei bestimmen, wann das jeweilige Feld anliegt und wann nicht.

Bevorzugt wird bei der Kopplungsmessung eine auf ein Standardmaß zurückgeführte Zeitgebung von Pulsen verwendet. Dabei kann es sich beispielsweise um die bereits erwähnten ersten und/oder zweiten elektromagnetischen Wechselfelder handeln. Eine Rückführung auf ein Standardmaß bedeutet dabei, dass die Zeitgebung oder die Frequenz dieser elektromagnetischen Welle auf die SI-Einheit Sekunde kalibriert wird. Flierzu kann beispielsweise eine Atomuhr oder eine andere entsprechend genau gehende Uhr, beispielsweise aus einem Satellitennavigationssignal, verwendet werden. Diese kann insbesondere auf das entsprechende Sl-Standardmaß kalibriert sein. Beispielsweise kann eine solche Atomuhr von einer Standardisierungsorganisation zur Verfügung gestellt werden. Insbesondere kann das Standardmaß auf einem

Frequenznormal und/oder auf einer Atomuhr basieren.

Durch das Rückführen der Zeitgebung bei einer Kopplungsmessung auf ein

Standardmaß kann eine Probe erreicht werden, in welcher zwei optische Zentren mit einem Abstand vorhanden sind, welcher auf ein Standardmaß bzw. auf ein Sl- Standardmaß kalibriert ist. Somit wird eine Probe bereitgestellt, welche als Referenz im Nanometer-Bereich dienen kann und Sl-kalibriert ist.

Es sei verstanden, dass das Rückführen auf ein Standardmaß bzw. das Bereitstellen einer entsprechend kalibrierten Probe, eine solche Probe an sich und ein zugehöriges Verfahren sowie eine Verwendung einer solchen Probe für die hierin genannten Zwecke einen jeweiligen eigenständigen Erfindungsaspekt darstellen können.

Bevorzugt wird ein mittels eines Detektors ermittelter Abstand kalibriert. Dies kann beispielsweise bedeuten, dass mittels des Detektors ein Abstand ermittelt wird, welcher beispielsweise in Pixeln des Detektors, in einer vom Detektor verfahrenen Strecke oder einer sonstigen vom Detektor verwendeten Maßeinheit angegeben wird. Es können beispielsweise auch Objektiv- oder Beamscanner oder Weitfeldkameras verwendet werden. Der Abstand der beiden optischen Zentren in der Probe ist dabei

typischerweise bekannt, beispielsweise mittels der weiter oben bereits beschriebenen Kopplungsmessung. Dies ermöglicht es, ein im Detektor verwendetes Maß oder Koordinatensystem auf den tatsächlichen Abstand zu kalibrieren. Dies erlaubt eine sehr genaue Kalibration des Detektors, des mikroskopischen Aufbaus und/oder des eingesetzten Auswerteverfahrens, so dass man sicher sein kann, exakte Abstände zu messen, insbesondere im Nanometer-Bereich.

Insbesondere kann der mittels des Detektors ermittelte Abstand gegen einen bekannten Abstand in dem Festkörper kalibriert werden. Dabei kann beispielsweise der Abstand im Festkörper wie hierin beschrieben ermittelt werden. Unter einem Kalibrieren kann insbesondere in diesem Fall insbesondere verstanden werden, dass ein vom Detektor ermittelter Abstand skaliert oder anderweitig korrigiert wird, so dass ein Endergebnis dem tatsächlichen Abstand entspricht. Insbesondere kann der mittels des Detektors ermittelte Abstand gegen einen durch eine anderweitige Messung gemessenen Abstand in dem Festkörper kalibriert werden. Unter einer anderweitigen Messung kann dabei insbesondere eine Messung des Abstands verstanden werden, welche nicht durch Beobachtung mit dem Detektor erfolgt. Eine solche anderweitige Messung kann beispielsweise durch das Anlagen von

Magnetfeldern und elektromagnetischen Wechselfeldern erfolgen, beispielsweise wie hierin beschrieben. Unter einem Kalibrieren kann insbesondere in diesem Fall insbesondere verstanden werden, dass ein vom Detektor ermittelter Abstand skaliert oder anderweitig korrigiert wird, so dass ein Endergebnis dem tatsächlichen Abstand entspricht.

Der Abstand kann beispielsweise mittels emitterselektiver Aktivierung der optischen Zentren und/oder mittels Superresolutionsmethoden, Korrelationsauswertung oder Kreuzkorrelationsauswertung von durch den Detektor basierend auf dem erfassten Licht aufgenommenen Signalen ermittelt werden.

Dies kann beispielsweise bedeuten, dass, wie weiter oben bereits beschrieben, durch das Anlegen einer elektromagnetischen Welle aus dem Mikrowellenspektrum die optischen Zentren, welche als Emitter bezeichnet werden können, selektiv aktiviert bzw. deaktiviert werden und entsprechendes Licht vom Detektor erfasst wird. Basierend darauf erzeugte Signale können ausgewertet werden, beispielsweise indem eine jeweilige Gauß-Funktion auf ein Signal angefittet wird und das Maximum der Gauß- Funktion als Position des jeweiligen optischen Zentrums im Koordinatensystem des Detektors verwendet wird. Dementsprechend kann auch eine

Kreuzkorrelationsauswertung vorgenommen werden. Entsprechende Techniken sind beispielsweise als Superresolutionsmethoden oder Superresolutionsmikroskopie bekannt, welche allgemein durch die Betrachtung gewisser Bereiche im

mikroskopischen Aufbau, beispielsweise im Detektor oder Detektorsystem eine

Auflösung ermöglichen, welche besser ist als die aufgrund des Beugungslimits begrenzte Auflösung des Mikroskops.

Gemäß einer Ausführung wird eine Mehrzahl von Abständen zwischen dem ersten optischen Zentrum und dem zweiten optischen Zentrum zu unterschiedlichen Zeitpunkten jeweils vektoriell ermittelt. Dies kann insbesondere bedeuten, dass nicht nur eine Länge, sondern auch die Orientierung des Abstands in einem

dreidimensionalen Koordinatensystem ermittelt wird. Aus den vektoriellen Abständen kann dann beispielsweise eine Rotation ermittelt werden.

Gemäß einer Ausführung wird eine Mehrzahl von Abständen zwischen dem ersten optischen Zentrum und dem zweiten optischen Zentrum zu unterschiedlichen

Zeitpunkten jeweils mittels des vom Detektor erfassten Lichts bestimmt. Dabei kann der Abstand in drei Dimensionen oder in zwei Dimensionen, insbesondere quer zur

Ausbreitungsrichtung des Anregungslichtstrahls und/oder einer optischen Achse des Mikroskops, bestimmt werden. Dies kann insbesondere bedeuten, dass nicht nur eine Länge, sondern auch die Orientierung des Abstandes in einem dreidimensionalen Koordinatensystem oder als Projektion in einem zweidimensionalen Koordinatensystem ermittelt wird. Aus den dreidimensionalen vektoriellen Abständen oder aus den zweidimensionalen Projektionen der Abstände kann dann beispielsweise eine Rotation der Probe ermittelt werden. Mit Wissen des dreidimensionalen vektoriellen Abstandes aus der magnetischen Abstandsbestimmung, beispielsweise wie weiter oben

beschrieben, kann beispielsweise eine genauere Aussage über diese Rotation ermittelt werden.

Insbesondere kann eine Rotation eines Vektors zwischen zwei optischen Zentren ermittelt werden, d.h. der Vektor erstreckt sich zwischen den zwei optischen Zentren und ein optisches Zentrum oder die optischen Zentren variieren ihre Lage im Raum. Dies grenzt sich insbesondere zur Ermittlung der relativen Lage von Abstandsvektoren zwischen jeweils zwei optischen Zentren zum gleichen Zeitpunkt ab. Es grenzt sich auch gegenüber einer Ermittlung einer Rotationskorrektur ab.

Beispielhafte Vorgehensweisen sind in folgenden Veröffentlichungen beschrieben:

Travis J. Gould, Daniel Burke, Joerg Bewersdorf, Martin J. Booth,

„Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens“,

Optics Express 20, 19, 20998-21009 (2012) B. Huang, W. Wang, M. Bates, X. Zhuang,“Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy”, Science 319,

810-813 (2008)

Durch eine solche Ausführung können beispielsweise Rotationen der Probe aufgrund von langfristigen Veränderungen des Probenhalters oder sonstiger Komponenten des Mikroskops ermittelt werden. Dadurch kann eine langfristige Überwachung des

Mikroskops erfolgen. Insbesondere kann dabei immer die gleiche Probe verwendet werden.

Gemäß einer Ausführung ist das Kalibrieren ein Vermessen des Anregungslichtstrahls. Das erste optische Zentrum weist dabei bevorzugt zumindest ein optisches

Übergangsdipolmoment auf. Dieses ist bevorzugt unveränderlich.

Mittels eines solchen Verfahrens kann der Anregungslichtstrahl sehr genau vermessen werden, so dass Daten wie Intensität, elektrischer Feldvektor oder Polarisation des Anregungslichtstrahls mit einer hohen Ortsauflösung erfasst werden können. Dadurch können beispielsweise Ergebnisse, welche mittels des Mikroskops gewonnen werden, wesentlich genauer und besser interpretiert werden. Es sei erwähnt, dass unter dem Begriff einer Polarisation des Anregungslichtstrahls insbesondere ein Zustand vor Durchgang durch eine vor der Probe befindlichen Optik verstanden werden kann, wobei eine solche Polarisation gezielt eingestellt werden kann. Für die Wechselwirkung mit einem optischen Zentrum ist grundsätzlich das vektorielle elektrische Feld am Ort des optischen Zentrums relevant, welches von der Polarisation, aber auch von anderen Faktoren abhängen kann.

Das erste optische Zentrum kann dabei beispielsweise relativ zum Anregungslichtstrahl verfahren werden, was beispielsweise durch Verfahren des Probenhalters erfolgen kann oder durch entsprechende Mechanismen im Probenhalter erfolgen kann. Dabei können insbesondere Änderungen des ausgesendeten Lichts ermittelt werden.

Bei solchen Änderungen kann es sich beispielsweise um Intensitätsänderungen oder um Farbänderungen handeln. Diese können beispielsweise mittels des Detektors des Mikroskops erfasst werden. Dadurch kann ermittelt werden, wie sich das von der Probe ausgesendete Licht verändert, wenn sich das optische Zentrum an unterschiedlichen Stellen relativ zum Anregungslichtstrahl befindet. Es sei erwähnt, dass dies mittels aus dem Stand der Technik bekannter Proben, welche beispielsweise auf DNA-Molekülen basieren, nicht möglich ist, da diese sich beispielsweise drehen, wackeln oder ausbleichen können.

Insbesondere kann das optische Übergangsdipolmoment in dem Festkörper und/oder relativ zum Probenhalter eine konstante oder zumindest nur eingeschränkt bewegliche Orientierung haben. Unter einer konstanten Orientierung wird dabei insbesondere eine Orientierung verstanden, welche sich relativ zum Bezugssystem zeitlich nicht verändert, insbesondere während der Durchführung des Verfahrens. Unter einer nur eingeschränkt beweglichen Orientierung wird insbesondere eine Orientierung verstanden, welche sich nur in vorgegebenen Grenzen, beispielsweise innerhalb eines vorgegebenen

einschränkenden Raumwinkelbereichs, beweglich ist. Ebenso kann insbesondere ein elektrisches Feld des Anregungslichtstrahls relativ zum Festkörper eine konstante Orientierung haben. Dies kann insbesondere für einen Zeitraum gelten, in welchem für die Kalibrierung relevante Messdaten gesammelt werden. Dadurch kann die

Messgenauigkeit verbessert werden. Das Vermessen kann insbesondere vektoriell sein, also insbesondere abhängig von der Orientierung des optischen

Übergangsdipolmoments und des elektrischen Felds des Anregungslichtstrahls.

Das Verfahren der Probe kann beispielsweise in einer Ebene quer zum

Anregungslichtstrahl erfolgen. Es kann jedoch auch andersartig erfolgen, beispielsweise kann alternativ oder zusätzlich eine Bewegung parallel zum Anregungslichtstrahl erfolgen. Es können auch Ebenen definiert werden, welche quer zum

Anregungslichtstrahl stehen und in welchen das Verfahren erfolgt. Grundsätzlich kann eine beliebige Überlagerung der beschriebenen Bewegungen je nach Anwendungsfall erfolgen.

Gemäß einer Ausführung ist der Anregungslichtstrahl polarisiert. Die Polarisation kann dabei beispielsweise linear, zirkular, trivial oder hochkomplex sein, wobei unter einer trivialen Polarisation eine örtlich unveränderliche Polarisation verstanden wird und unter einer hochkomplexen Polarisation verstanden wird, dass sie an verschiedenen Orten verschieden ist. Während des Kalibrierens kann die Polarisation relativ zur Probe gedreht werden und die Probe kann relativ zum Anregungslichtstrahl örtlich unverändert belassen werden. Dabei können polarisationsabhängige Änderungen des ausgesendeten Lichts ermittelt werden. Dies ermöglicht es, die Reaktion der Probe bzw. des optischen Zentrums auf Änderungen in der Polarisation zu ermitteln. Dadurch kann wesentlich genauer als bei bisherigen Ausführungen ermittelt werden, wie sich eine Probe bei Änderungen, insbesondere bei Drehungen der Polarisation, verhält, und es kann der

Anregungslichtstrahl sehr genau charakterisiert werden, da dessen Polarisation oder elektrische Feldvektoren auf diese Weise vermessen werden können.

Die Vermessung ist dreidimensional vektoriell möglich. Hierzu kann beispielsweise das bereits erwähnte, bevorzugt invariante, optische Übergangsdipolmoment des optischen Zentrums verwendet werden. Beispielsweise kann das optische

Übergangsdipolmoment derart ausgebildet sein, dass eine maximale Emission erfolgt, wenn das optische Übergangsdipolmoment parallel zum elektrischen Feld des

Anregungslichtstrahls steht, und dass eine minimale Emission oder auch gar keine Emission erfolgt, wenn das optische Übergangsdipolmoment quer zum elektrischen Feld des Anregungslichtstrahls steht. Dies kann beispielsweise dadurch ausgenutzt werden, dass die Probe und damit auch das optische Übergangsdipolmoment relativ zum Anregungslichtstrahl gedreht wird, wobei Probe oder optisches Zentrum dabei beispielsweise am gleichen Ort bleiben können. Dadurch kann beispielsweise ebenfalls der Anregungslichtstrahl vermessen werden. Es sei verstanden, dass eine Änderung einer Intensität beispielsweise ausgehend von einer maximalen Intensität, also beispielsweise bei parallel zum elektrischen Feld des Anregungslichtstrahls liegendem optischem Übergangsdipolmoment, gemessen werden kann, jedoch auch ausgehend von einer nicht vorhandenen Emission, also beispielsweise bei quer zum elektrischen Feld des Anregungslichtstrahls liegendem optischem Übergangsdipolmoment gemessen werden kann. Im letzteren Fall kann die Detektion in bestimmten Situationen einfacher sein, da von einem Nullsignal aus eine Veränderung festgestellt werden kann.

Es sei verstanden, dass mittels des hierin beschriebenen Verfahrens jedes optische Feld charakterisiert werden kann. Beispielsweise kann es sich dabei um eine ebene Welle, um einen Fokus oder eine fokussierte Welle, um evaneszente Felder oder um jede Mode wie beispielsweise eine TEMOO-Mode handeln. Insbesondere kann mittels des eben beschriebenen Verfahrens die Polarisation oder ein vektorielles elektrisches Feld charakterisiert werden.

Der Anregungslichtstrahl kann polarisiert sein, beispielsweise so wie weiter oben bereits beschrieben. Während des Kalibrierens kann die Polarisation relativ zur Probe unverändert belassen werden und die Probe kann relativ zum Anregungslichtstrahl örtlich unverändert belassen werden, wobei das ausgesendete Licht jeweils zu unterschiedlichen Zeitpunkten ermittelt wird. Änderungen des ausgesendeten Lichts können dann zwischen den Zeitpunkten ermittelt werden. Durch eine solche

Vorgehensweise kann eine Überwachung des Mikroskops zu unterschiedlichen

Zeitpunkten erfolgen, wobei vorzugsweise immer die gleiche Probe verwendet werden kann. Aufgrund der hohen Stabilität der Probe, welche durch einen Festkörper gebildet wird, sind Vergleiche zwischen unterschiedlichen, auch länger voneinander entfernten Zeitpunkten möglich. Dies ermöglicht eine laufende Überwachung der Stabilität des Mikroskops über einen längeren Zeitraum.

Der Anregungslichtstrahl kann polarisiert sein, beispielsweise wie weiter oben bereits beschrieben. Während des Kalibrierens kann die Polarisation gedreht und das erste optische Zentrum relativ zum Anregungslichtstrahl verfahren werden, um

polarisationsabhängige Intensitätsmaxima zu ermitteln, wobei hierbei die gemessene Intensität gemeint ist. Insbesondere kann zu jeder angelegten Polarisation ein zugehöriges Intensitätsmaximum oder eine zugehörige Intensitätsverteilung ermittelt werden. Die gemessene Intensität hängt typischerweise vom Skalarprodukt zwischen elektrischem Feld am Ort des optischen Zentrums mit dem optischen

Übergangsdipolmoment des optischen Zentrums ab. Das elektrische Feld kann dabei beispielsweise durch einen Astigmatismus in einer Anregungsoptik verzerrt sein.

Dadurch kann ermittelt werden, an welchen Stellen die Probe eine besonders hohe Emission von Licht zeigt, wodurch ebenfalls die Polarisation oder das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls kalibriert werden können. Anders ausgedrückt ist es durch die eben beschriebene Vorgehensweise bekannt, an welchen Stellen die Wirkung des Anregungslichtstrahls auf eine bestimmte Probe oder auf ein bestimmtes optisches Zentrum besonders hoch oder eben auch geringer ist. Gemäß einer Ausführung ist das Kalibrieren ein Kalibrieren einer absoluten Intensität oder einer Sammlungseffizienz des Mikroskops. Dadurch kann beispielsweise erfasst werden, wie viele Photonen von einem Mikroskop detektiert werden und/oder welcher Anteil von Photonen, welche von einer Probe ausgesendet werden, vom Mikroskop bzw. von dessen Detektor tatsächlich erfasst wird. Dies erlaubt eine Charakterisierung des optischen Systems des Mikroskops. Insbesondere können in einer solchen

Kalibrierung nicht nur der Detektor, sondern auch die gesamte davor geschaltete Optik und/oder weitere Komponenten, ein Verfahren oder eine Software kalibriert werden.

Der Anregungslichtstrahl kann beispielsweise eine Intensität aufweisen, bei welcher das erste optische Zentrum mit einer Rate entsprechend dem Inversen der Lebensdauer seines angeregten Zustands emittiert. Die Intensität kann auch so hoch sein, dass das erste optische Zentrum mit maximaler Photonenemissionsrate emittiert.

Durch eine solche Ausführung kann erreicht werden, dass die Anzahl der in einem bestimmten Zeitraum, beispielsweise innerhalb einer Sekunde, ausgesendeten, beispielsweise emittierten Photonen bekannt ist und somit anhand der vom Detektor erfassten Photonen leicht zurückgerechnet werden kann, welcher Anteil der

ausgesendeten Photonen durch die Abfrageoptik bis zum Detektor gelangt und von diesem detektiert wird.

Gemäß einer Ausführung weist der Anregungslichtstrahl eine Intensität auf, mit welcher das erste optische Zentrum mit einer Rate von höchsten 90 %, höchstens 80 %, höchstens 50 %, höchstens 30 %, höchstens 20 %, höchstens 10 %, höchstens 1 %, höchstens 0,1 % oder höchstens 0,01 % des Inversen der Lebensdauer seines angeregten Zustands emittiert und/oder mit höchsten 90 %, höchstens 80 %, höchstens 50 %, höchstens 30 %, höchstens 20 %, höchstens 10 %, höchstens 1 %, höchstens 0,1 % oder höchstens 0,01 % seiner maximalen Photonenemissionsrate emittiert.

Dadurch kann ebenfalls eine definierte Emission erreicht werden, so dass auf eine Sättigung verzichtet werden kann. Dadurch kann beispielsweise die Belastung des optischen Zentrums und/oder des Mikroskops verringert werden.

Eine Rate entsprechend dem Inversen der Lebensdauer des angeregten Zustands kann insbesondere dann erreicht werden, wenn das erste optische Zentrum ein reines Zwei- Niveau-System ist bzw. einem idealisierten Zwei-Niveau-System möglichst weitgehend entspricht, was beispielsweise bedeuten kann, dass keine konkurrierenden

Zerfallswege vorhanden sind. Das System wird in diesem Fall typischerweise aus einem Grundzustand angeregt, verbleibt im Schnitt mit der Lebensdauer des

angeregten Zustands im angeregten Zustand, gelangt durch Emission eines Photons in den Grundzustand zurück und wird aufgrund der dafür ausreichenden Intensität des Anregungslichtstrahls sofort wieder in den angeregten Zustand gebracht. Eine

maximale Photonenemissionsrate ist allgemeiner gefasst und umfasst nicht nur den eben beschriebenen Fall eines entsprechend angeregten Zwei-Niveau-Systems, sondern berücksichtigt auch den Fall, dass konkurrierende Zerfallsprozesse vorhanden sind. Beispielsweise kann aus einem angeregten Zustand nicht nur eine Relaxation unmittelbar in den Grundzustand möglich sein, sondern es kann auch ein

Zwischenzustand vorhanden sein, welcher energetisch zwischen Grundzustand und angeregtem Zustand angeordnet ist und in welchen ein Zerfall vom angeregten Zustand aus stattfinden kann. Dies erfolgt typischerweise ohne Photonenemission oder zumindest mit einer Photonenemission in einer anderen Wellenlänge. Der

Zwischenzustand kann beispielsweise eine andere, beispielsweise deutlich längere Lebensdauer als der angeregte Zustand haben. Derartige Zustände können auch als Dunkelzustände bezeichnet werden. Sie können beispielsweise durch Trapping, hervorgerufen beispielsweise durch Fehlstellen, Verunreinigungen oder andere

Merkmale, entstehen. Dies kann dazu führen, dass die Photonenemissionsrate auch bei hoher Anregung geringer, beispielsweise auch deutlich geringer, sein kann als das Inverse der Lebensdauer des angeregten Zustands. Trotzdem sind bei typischen optischen Zentren die entsprechenden Lebensdauern der Zustände bekannt, so dass die Photonenemissionsrate berechnet werden kann, oder sie ist aus anderweitigen Messungen bekannt. Die hier beschriebene Anregung eines optischen Zentrums kann auch als Sättigung bezeichnet werden.

Der Anregungslichtstrahl kann beispielsweise bei mehrfacher Durchführung des

Verfahrens zu unterschiedlichen Zeitpunkten und/oder mit unterschiedlichen

Mikroskopen und/oder mit unterschiedlichen Teilen von Mikroskopen und/oder mit unterschiedlichen Konfigurationen und/oder mit unterschiedlichen Auswerteverfahren, jedoch mit gleicher Probe, eine jeweils gleiche Intensität aufweisen. Dies ermöglicht einen Vergleich der detektierten Photonen pro Zeiteinheit zu unterschiedlichen Zeitpunkten und/oder zwischen unterschiedlichen Mikroskopen. Derartige Vergleiche sind mit den hierin beschriebenen Proben in Form von Festkörpern möglich, da diese über längere Zeiträume konstant und unverändert bleiben und ein konstantes Verhalten zeigen. Entsprechende Proben können beispielsweise aufgrund ihrer Robustheit auch über längere Strecken ungekühlt und ohne sonstigen großen Aufwand und ohne Beschädigung transportiert werden, um auf diese Weise Mikroskope an

unterschiedlichen Standorten miteinander zu vergleichen. Insbesondere kann

dementsprechend das Verfahren mehrfach wiederholt ausgeführt werden,

beispielsweise um Vergleiche zwischen den Ausführungen anzustellen.

Unter einer definierten Anregungsleistung wird beispielsweise eine vorgegebene Leistung des Anregungslichtstrahls oder eine vorgegebene Intensität des

Anregungslichtstrahls verstanden, welche beispielsweise so hoch sein kann, dass wie weiter oben bereits beschrieben eine maximale Photonenemissionsrate und/oder eine Photonenemissionsrate entsprechend dem Inversen der Lebensdauer des angeregten Zustands erreicht wird, es kann jedoch auch eine definierte Anregungsleistung verwendet werden, welche kleiner ist. Aufgrund der ansonsten unveränderten und definierten Verhältnisse führt eine solche definierte Anregungsleistung zu

unterschiedlichen Zeitpunkten und/oder bei unterschiedlichen Mikroskopen

typischerweise zu einer gleichen Aussendung von Licht, wobei aus Änderungen in einer solchen Aussendung von Licht ebenfalls auf Veränderungen eines Mikroskops zwischen den Zeitpunkten und/oder auf Unterschiede zwischen unterschiedlichen Mikroskopen geschlossen werden kann.

Mit den hier beschriebenen Maßnahmen kann insbesondere auch die Detektion oder ein Verhalten des Detektors und/oder einer Abfrageoptik kalibriert werden. Sie sind dafür entsprechend anwendbar. Eine Probe kann dabei beispielsweise auch relativ zum Detektor rotiert oder bewegt werden.

Die Sammlungseffizienz des Mikroskops kann beispielsweise als Quotient aus erfassten Photonen in einem Zeitintervall geteilt durch emittierte Photonen in dem Zeitintervall berechnet werden. Dies ermöglicht eine einfache und zweckmäßige

Berechnung der Sammlungseffizienz. Sie gibt an, wie viele der emittierten Photonen tatsächlich vom Detektor erfasst werden. Das Verfahren kann beispielsweise mittels einer Mehrzahl von Mikroskopen unter Verwendung derselben Probe durchgeführt werden. Ergebnisse beim jeweiligen

Kalibrieren der Mikroskope können miteinander verglichen werden. Dies ermöglicht einen Vergleich unterschiedlicher Mikroskope, welche sich beispielsweise auch an unterschiedlichen Standorten befinden können. Auch Vergleiche zwischen

unterschiedlichen Teilen von Mikroskopen oder Auswerteverfahren sind möglich. Dabei wird in vorteilhafter Weise die Tatsache ausgenutzt, dass bei den hierin beschriebenen Proben in Form von Festkörpern ein Transport auch über längere Strecken und längere Zeiträume möglich ist, ohne dass hierfür ein besonderer Aufwand wie beispielsweise Kühlung erforderlich wäre. Dies ist mit aus dem Stand der Technik bekannten Proben nicht möglich. Es sei verstanden, dass ein entsprechender Vergleich zwischen

Mikroskopen einen eigenständigen Erfindungsaspekt darstellen kann. Dabei kann das Verfahren in allen hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten verwendet werden.

Die Erfindung betrifft des Weiteren eine Mikroskopanordnung. Die Mikroskopanordnung weist ein Mikroskop auf. Das Mikroskop weist Folgendes auf:

einen Probenhalter zur Aufnahme einer Probe,

eine Anregungsoptik zum Richten eines Anregungslichtstrahls auf die Probe, eine Abfrageoptik zum Aufnehmen von durch die Probe ausgesendetem Licht, einen Detektor zum Erfassen von durch die Abfrageoptik aufgenommenem Licht, eine elektronische Steuerungsvorrichtung, welche dazu konfiguriert ist, ein Verfahren wie hierin beschrieben auszuführen.

Die Mikroskopanordnung weist ferner eine Probe in Form eines Festkörpers auf, wobei der Festkörper zumindest ein erstes optisches Zentrum aufweist, welches nach

Anregung Licht aussendet.

Mittels der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung können die bereits weiter oben mit Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren in all seinen Varianten beschriebenen Vorteile erreicht werden. Bezüglich des Verfahrens kann auf alle hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten zurückgegriffen werden. Es sei verstanden, dass die Mikroskopanordnung eine Kombination eines Mikroskops einschließlich seiner Steuerungsvorrichtung mit einer Probe in Form eines Festkörpers ist. Diese können beispielsweise räumlich benachbart zueinander angeordnet sein. Die Probe kann insbesondere auch in den Probenhalter eingesetzt sein.

Die Steuerungsvorrichtung kann beispielsweise ein Computer oder eine andere programmierbare Vorrichtung sein, welche sich benachbart zu den sonstigen

Komponenten des Mikroskops oder auch an einem davon entfernten Ort befinden kann. Es sei verstanden, dass bei einem Mikroskop Datengewinnung und Datenauswertung grundsätzlich auch räumlich voneinander getrennt stattfinden können, so dass beispielsweise die Durchführung des Verfahrens auch auf ein Rechenzentrum

ausgelagert werden kann. Es sei außerdem verstanden, dass die

Steuerungsvorrichtung typischerweise nur insofern zur Ausführung des Verfahrens konfiguriert ist, als dies technisch möglich ist. So können beispielsweise Schritte wie das Einsetzen der Probe und/oder gewisse Justageaufgaben anderweitig,

beispielsweise manuell, ausgeführt werden.

Die Erfindung betrifft des Weiteren ein nichtflüchtiges computerlesbares

Speichermedium, auf welchem ein Programmcode gespeichert ist, bei dessen

Ausführung ein Prozessor ein hierin beschriebenes Verfahren ausführt. Bezüglich des Verfahrens kann auf alle hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten

zurückgegriffen werden.

Die Erfindung betrifft des Weiteren eine Verwendung einer Probe zum Kalibrieren eines Mikroskops. Die Probe ist dabei ein Festkörper mit zumindest einem ersten optischen Zentrum, welches nach Anregung Licht aussendet. Mittels einer solchen Verwendung können die bereits weiter oben mit Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren beschriebenen Vorteile erreicht werden. Es kann bezüglich aller Varianten der

Verwendung auf die mit Bezug auf das Verfahren beschriebenen Varianten

zurückgegriffen werden.

Insbesondere kann das Mikroskop bei der Verwendung folgendes aufweisen:

einen Probenhalter zur Aufnahme einer Probe,

eine Anregungsoptik zum Richten eines Anregungslichtstrahls auf die Probe, eine Abfrageoptik zum Aufnehmen von durch die Probe ausgesendetem Licht, einen Detektor zum Erfassen von durch die Abfrageoptik aufgenommenem Licht.

Die Probe kann beispielsweise nur ein optisches Zentrum oder ein erstes und ein zweites optisches Zentrum aufweisen.

Das erste optische Zentrum und das zweite optische Zentrum können einen Abstand von mindestens einem Gitterplatz oder von mindestens 1 nm oder von mindestens 3 nm voneinander haben. Das erste optische Zentrum und das zweite optische Zentrum können auch einen Abstand von höchstens 100 nm oder von höchstens 50 nm oder von höchstens 20 nm voneinander haben.

Als optische Zentren können spinaktive optische Zentren, magnetisch koppelbare optische Zentren oder anderweitig koppelbare optische Zentren, insbesondere nicht magnetisch koppelbare optische Zentren, verwendet werden.

Als Festkörper kann beispielsweise Diamant oder Siliziumcarbid verwendet werden. Auch andere Arten von Festkörpern können jedoch verwendet werden. Als optische Zentren können insbesondere Stickstofffehlstellen verwendet werden, wobei auch andere Arten von optischen Zentren verwendet werden können.

Auch ansonsten sei verstanden, dass auf alle mit Bezug auf das Verfahren

beschriebenen Ausführungen und Varianten bezüglich der Verwendung zurückgegriffen werden kann.

Das Kalibrieren kann insbesondere gemäß dem Verfahren erfolgen. Bezüglich des Verfahrens kann auf alle hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten

zurückgegriffen werden.

Das Kalibrieren kann insbesondere auch mittels einer hierin beschriebenen

Mikroskopanordnung erfolgen. Auch diesbezüglich kann auf alle hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten zurückgegriffen werden.

Die Erfindung betrifft des Weiteren eine Probe in Form eines Festkörpers mit zumindest einem optischen Zentrum, welches nach Anregung Licht aussendet. Die Probe ist dabei zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren, in einer erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung oder in einer erfindungsgemäßen Verwendung vorgesehen und/oder konfiguriert. Bezüglich des Verfahrens, der Mikroskopanordnung und der Verwendung kann auf alle hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten zurückgegriffen werden.

Allgemein kann mittels der hierin beschriebenen Maßnahmen, beispielsweise des Verfahrens, der Verwendung und der Mikroskopanordnung, eine Mehrzahl von

Aufgaben ausgeführt werden, welche mit bisher aus dem Stand der Technik bekannten Ausführungen nicht möglich waren.

Dies sind beispielsweise:

1. Kalibrierung des genauen Abstands zweier Fluorophore, beispielsweise für die Konfokalmikroskopie oder für Konfokalmikroskope,

2. Verwendung zweier Fluorophore als rückführbares Standardmaß (Normal) für Nanometerabstände,

3. Kalibrierung der genauen Verteilung der Lichtintensität und der Polarisation bzw. elektrischem Feld am Ort des Fokus,

4. Kalibrierung der absoluten Intensität und der Sammlungseffizienz des

mikroskopischen Aufbaus,

5. Vergleich von Mikroskopen unter Verwendung der gleichen Probe.

Es sei verstanden, dass diese Aufzählung lediglich beispielhaft und keineswegs einschränkend zu verstehen ist. Die genannten Punkte können jedoch als jeweils eigenständige Erfindungsaspekte aufgefasst werden.

Im Stand der Technik sind beispielsweise zu Untersuchungen an der Quanteneffizienz von Emittern gewisse Standards bekannt. Für die Kolokalisation sind beispielsweise DNA-Origamiproben bekannt. Diese können beispielsweise zwei oder mehr

Fluorophore enthalten, die abgebildet werden können. Derartige Proben haben sich jedoch als nicht langlebig erwiesen, was deren Verwendung als Referenz für

unterschiedliche Zeitpunkte und/oder für an unterschiedlichen Orten befindliche

Mikroskope oder Mikroskopteile ausschließt. Es hat sich des Weiteren gezeigt, dass es bei DNA-Molekülen, die zwei oder mehr Fluorophore enthalten, zum Bleichen von Fluorophoren kommen kann, wobei diese ihre Fluoreszenzeigenschaften verlieren. Dies kann als ein Flauptproblem derartiger Proben betrachtet werden. Passiert dies bei einem Molekül, so ist dieses nicht mehr zur Eichung verwendbar. Die Proben sind temperaturempfindlich und müssen häufig gekühlt werden, was einen erheblichen Aufwand verursacht. Selbst bei guter Lagerung sind die Moleküle nur für wenige Monate verwendbar. Es ist auch bekannt, dass der Abstand zwischen den Fluorophoren bei DNA-Origami bei einem Molekül nur auf einige Nanometer genau angegeben werden kann. Messungen damit erlauben keine Aussage über die Polarisation bzw. die vektorielle Zusammensetzung des angelegten Lichtfelds. Als Resultat aus dem Bleichen der Fluorophore ist auch ein Vergleich verschiedener Mikroskope am selben Emitterpaar nur bedingt oder nicht möglich. Für eine

Verwendung als Standardmaß müssten Abstandsmessungen an Molekülen mit einem geeichten Mikroskop vollzogen werden, wofür geeichte Messschrauben verwendet werden müssten. Diese sind jedoch bei Weitem nicht so genau wie die weiter oben beschriebene Zeitreferenz.

Es hat sich gezeigt, dass insbesondere bei der Anwendung von Techniken zur

Messung unterhalb des Brechungslimits (Superresolution) eine genaue Bestimmung des Felds im Fokus von Bedeutung sein kann. Außerdem ist es von Vorteil, wenn Mikroskope vergleichbar und akkurat sind. Die Kolokalisation kann von besonderer Bedeutung sein, da Drift oder sonstige Positionsänderungen, zum Beispiel Neuauflegen der Probe, hierbei die Präzision der Messung nicht verändern.

Die hierin beschriebene Probe kann beispielsweise auf fluoreszierenden oder lumineszenten Defektzentren in Festkörpern wie beispielsweise Stickstofffehlstellen in Diamant basieren. Diese bleichen nicht und lassen sich mit alternativen

Elektronenspinresonanz (ESR)-Methoden lokalisieren. Außerdem besteht die

Möglichkeit, die Anzahl der Emitter über ihre Photonenstatistik zu bestimmen. Da der Abstand zweier Emitter in einem Festkörper aufgrund der niedrigen

Diffusionswahrscheinlichkeit solcher Defekte über lange Zeiträume konstant ist, ermöglicht eine solche Probe eine lang haltbare Probe zur Mikroskopeichung. Insbesondere können fluoreszierende Defektzentren in Festkörpern zur Untersuchung von Mikroskopen verwendet werden. Beispielsweise können Stickstofffehlstellen in Diamant verwendet werden, deren Fluoreszenzeigenschaften sehr gut untersucht sind und denen von in der Mikroskopie relevanten biologischen Proben entsprechen können. Die Lokalisation der einzelnen Emitter kann bei Defektzentren auch unabhängig von optischer Mikroskopie über Elektronenspinresonanzmethoden ermittelt werden, wie zum Beispiel durch Anlegen eines Gradientenfelds oder im Falle einer Kolokalisation über magnetische dipolare Kopplung oder elektrische Feldmessungen zwischen zwei Emittern. Hiermit lassen sich beispielsweise Abstände von ca. 3 nm bis 100 nm abdecken.

Fluoreszierende Defektzentren oder andere optische Zentren in Festkörpern sind üblicherweise photostabil, das heißt sie bleichen und diffundieren nicht. Das bedeutet, dass die Proben über lange Zeit stabil und nutzbar sind. Da die Emitter in einem

Festkörper sind, sind Handhabung, Lagerung und Transport der Proben einfach. Sie sind zudem temperaturbeständig. In Hinsicht auf die Kolokalisation ist zudem von Vorteil, dass der Abstand auf die Größe des Fluorophors genau festgelegt ist und sich nicht mehr verändert. Das heißt: Ist der Relativabstand eines Emitterpaars einmal bestimmt, so kann die Probe wiederholt zum Justieren und Charakterisieren von

Mikroskopen eingesetzt werden. Da der Abstand genau festgelegt ist, muss auch keine Statistik über ein Ensemble aus Emitterpaaren durchgeführt werden. Durch eine

Rückführung der Abstandsbestimmung auf das Sl-Einheitensystem lassen sich

Emitterpaare als Nanometerstandardmaß (Normal) verwenden. Die

Abstandsbestimmung erfolgt im Falle der magnetischen dipolaren Kopplung

beispielsweise über eine Zeitmessung der Elektronenspinresonanz. Die optischen dipolaren Übergangsmomente sind zudem fest und rotieren nicht. Dies ermöglicht nicht nur die Messung der Intensität des Fokus, sondern auch der vektoriellen

Zusammensetzung des elektrischen Felds. Sind die Fluorophore in einem Kristallgitter eingebettet, wie dies bei Stickstofffehlstellen in Diamant der Fall ist, so können die optischen Übergangsdipolmomente aus den Kristallachsen abgeleitet werden.

Verfahren zur Herstellung von Festkörperproben mit einzelnen Fluorophoren und Fluorophorpaaren sind bekannt, wie zum Beispiel bei Stickstofffehlstellen durch

Ionenimplantation durch nanoskopische Masken. Derartige Verfahren sind

beispielsweise in der folgenden Veröffentlichung beschrieben: I. Jakobi, S. A. Momenzadeh, F. F. De Oliveira, J. Michl, F. Ziem, M. Schreck, P.

Neumann, A. Denisenko, J. Wrachtrup,“Efficient creation of dipolar coupled nitrogen- vacancy spin qubits in diamond", Journal of Physics: Conference Series, vol. 752, no. 1 , 2016

Eine Ausführung ohne Masken ist beispielsweise in der folgenden Veröffentlichung beschrieben:

M. Flaruyama, S. Onoda, T. Higuchi, W. Kada, A. Chiba, Y. Flirano, T. Teraji,

R. Igarashi, S. Kawai, H. Kawarada, Y. Ishii, R. Fukuda, T. Tanii, J. Isoya,

T. Ohshima, 0. Hanaizumi,“Triple nitrogen-vacancy centre fabrication by C5N4Hn ion Implantation", Nature Communications, vol. 10, no. 1 , p. 2664, 2019. [Online];

http://www.nature.com/articles/s41467-019-10529-x

Dabei können die Streuung, Tiefe und Konzentration der Fluorophore maßgeschneidert werden. Beispielsweise können sich entsprechende optische Zentren in einer einheitlichen Tiefe von etwa 30 nm mit einer Abweichung von beispielsweise +/- 1 nm befinden.

Weitere Merkmale und Vorteile wird der Fachmann den nachfolgend mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung beschriebenen Ausführungsbeispielen entnehmen. Dabei zeigen:

Fig. 1 : eine Mikroskopanordnung,

Fig. 2: Details einer Probe,

Fig. 3: Details eines optischen Zentrums,

Fig. 4: einen Verlauf eines Anregungslichtstrahls,

Fig. 5: einen zu Fig. 4 korrespondierenden Verlauf eines elektrischen Feldes des

Anregungslichtstrahls,

Fig. 6: Verläufe von Anregungseffizienzen,

Fig. 7: eine Probe,

Fig. 8: eine Probe und deren Abbildung,

Fig. 9: eine Probe zur Vermessung des Anregungslichtstrahls,

Fig. 10: eine Intensitätsverteilung in einer Ebene, Fig. 11 : Schwerpunkte von Intensitäten in Abhängigkeit von einer Polarisation,

Fig. 12: polarisationsabhängige Intensitätsverteilungen,

Fig. 13: polarisationsabhängige Intensitätsverteilungen mit Astigmatismus,

Fig. 14: eine Legende für die vorhergehenden Fig. 10 bis 13.

Fig. 1 zeigt schematisch eine Mikroskopanordnung 1 gemäß einem

Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die Mikroskopanordnung 1 weist ein Mikroskop 5 sowie eine Probe 100 auf. Auf diese Bestandteile wird nachfolgend näher eingegangen werden.

Das Mikroskop 5 weist eine Anregungsoptik 10 sowie eine Abfrageoptik 30 auf. Die Anregungsoptik 10 weist vorliegend eine Lichtquelle 12 in Form eines Lasers, einen Spiegel 14 und eine rein schematisch dargestellte Korrekturoptik 16 auf. Es sei verstanden, dass die beschriebenen Komponenten der Anregungsoptik hier lediglich beispielhaft genannt sind und dass auch völlig andere Komponenten verwendet werden können. Die Anregungsoptik 10 erzeugt einen Anregungslichtstrahl 20, welcher in noch zu beschreibender Weise auf die Probe 100 geleitet werden kann.

Die Abfrageoptik 30 ist dazu ausgebildet, von der Probe 100 ausgesendetes Licht 40 aufzunehmen und zu verarbeiten. Hierzu weist die Abfrageoptik 30 beispielhaft zwei Linsen 32, 36 sowie eine dazwischen angeordnete Blende 34 auf. Die Blende 34 kann beispielsweise im Rahmen einer Konfokalmikroskopie zur Auswahl eines sichtbaren Bereichs verwendet werden.

Das Mikroskop 5 weist einen Detektor 60 auf. Auf diesen richtet die Abfrageoptik 30 das ausgesendete Licht 40.

Das Mikroskop 5 weist ferner eine elektronische Steuerungsvorrichtung 70 auf, welche dazu konfiguriert ist, ein erfindungsgemäßes Verfahren auszuführen. Hierauf wird weiter unten näher eingegangen werden. Die elektronische Steuerungsvorrichtung 70 ist wie gezeigt mit dem Detektor 60 verbunden und kann somit Signale empfangen, welche der Detektor 60 basierend auf erfasstem Licht 40 erzeugt. Das Mikroskop 5 weist eine weitere Optik in Form einer Strahlteilerplatte 50 auf, welche optisch die Anregungsoptik 10 und die Abfrageoptik 30 voneinander trennt. Der

Anregungslichtstrahl 20 wird von der Strahlteilerplatte 50 in Richtung auf die Probe 100 zu geleitet. Zwischen der Strahlteilerplatte 50 und der Probe 100 befindet sich noch eine rein schematisch dargestellte Probenoptik 80. Diese sorgt dafür, dass der

Anregungslichtstrahl 20 wie gewünscht auf die Probe 100 trifft, wobei der

Anregungslichtstrahl 20 vorliegend fokussiert wird.

Das Mikroskop 5 weist ferner einen Probenhalter 90 auf, in welchem die Probe 100 gelagert ist. Die Probe 100 kann somit in definierter Weise von dem

Anregungslichtstrahl 20 beleuchtet werden. Es sei erwähnt, dass beispielsweise ein sample-scanner, ein beam-scanner oder ein objective-scanner als Ausführung verwendet werden können.

Tritt Licht von der Probe 100 aus, beispielsweise aufgrund von Emission oder aufgrund von Streuung des Anregungslichtstrahls 20, so entsteht dabei das bereits erwähnte ausgesendete Licht 40, welches ebenfalls von der Probenoptik 80 aufgenommen und durch die Strahlteilerplatte 50 in die Abfrageoptik 30 geleitet wird. Dort wird es wie bereits beschrieben dem Detektor 60 zugeführt. Es sei jedoch erwähnt, dass für

Anregung und Abfrage grundsätzlich auch komplett unterschiedliche optische Pfade verwendet werden können.

Bei der Probe 100 handelt es sich vorliegend um eine Probe in Form eines Festkörpers, in welchem mindestens ein optisches Zentrum vorhanden ist. Ein solches optisches Zentrum kann basierend auf dem Anregungslichtstrahl 20 ausgesendetes Licht 40 erzeugen. Dies kann durch Streuung oder auch durch Anregung eines Systems mit zumindest zwei Niveaus in einen angeregten Zustand und anschließender Relaxation unter Photonenaussendung in einen Grundzustand erfolgen. Möglichkeiten, die sich hieraus ergeben, werden weiter unten näher beschrieben werden.

Fig. 2 zeigt ein typisches Inneres einer Probe 100 vorliegend mit zwei optischen

Zentren, nämlich einem ersten optischen Zentrum 110 und einem zweiten optischen Zentrum 120. Derartige optische Zentren 110, 120 können beispielsweise als

Stickstofffehlstellen in Diamant als Festkörper realisiert werden. Ein Abstand d derartiger optischer Zentren 110, 120 beträgt beispielsweise zwischen 3 nm und 20 nm, in welchem sich die bereits weiter oben und nachfolgend beschriebenen Effekte besonders vorteilhaft beobachten und nutzen lassen. Auch andere Abstände sind jedoch möglich.

Das erste optische Zentrum 110 weist eine erste Orientierung 115 auf. Das zweite optische Zentrum 120 weist eine zweite Orientierung 125 auf. Bei diesen

Orientierungen 115, 125 handelt es sich um eine jeweilige Hauptsymmetrieachse, welche für die magnetische Kopplung relevant ist. Es ist bekannt, dass

Stickstofffehlstellen in Diamant relativ zum Kristallgitter vier mögliche Orientierungen haben, welche jeweils einen Winkel von 54,7° zu einer (OOI )-Oberfläche haben. Unter anderem durch die gezeigten Orientierungen 115, 125 wird eine magnetische Kopplung zwischen den beiden optischen Zentren 110, 120 definiert, welche durch in Fig. 2 dargestellte Feldlinien schematisch gezeigt ist.

Wie bereits weiter oben erwähnt wurde, kann die magnetische Kopplung zwischen zwei optischen Zentren 110, 120 dazu verwendet werden, um deren Abstand unabhängig von optischen Messungen zu bestimmen. Anders ausgedrückt steht eine vom in Fig. 1 dargestellten Mikroskop 5 unabhängige Vorgehensweise zur Verfügung, um den Abstand d zwischen den beiden optischen Zentren 110, 120 sehr genau zu vermessen. Hierzu kann insbesondere das weiter oben bereits beschriebene Verfahren verwendet werden. Eine räumliche Kalibrierung des Detektors 60 ist hierzu nicht erforderlich.

Die bereits weiter oben erwähnte Zeitgebung lässt sich, wie in den weiter oben bereits zitierten Referenzen beschrieben, Abständen zuordnen. Diese Zeitgebung kann dabei sehr genau gemessen werden und kann insbesondere auch auf ein Standardmaß des Sl-Einheitensystems, nämlich die Sekunde, zurückgeführt werden. Beispielsweise kann hierzu eine Atomuhr verwendet werden, welche entsprechend geeicht ist. Auf diese Weise kann nicht nur der Abstand d, welcher in Fig. 2 dargestellt ist, sehr genau bestimmt werden, sondern dieser kann auch auf eine Sl-Norm zurückgeführt werden. Hierbei kann auch ausgenutzt werden, dass der Abstand d grundsätzlich nur diskrete Werte haben kann, welche durch das Gitter vorgegeben sind. Fig. 3 zeigt das erste optische Zentrum 110 in einer räumlichen Orientierung mit einem angegeben Koordinatensystem und dessen Achsen x, y und z. Dabei sind auch jeweilige Projektionen auf die (x, y)-Ebene, die (y, z)-Ebene und die (x, z)-Ebene gezeigt. Die Orientierung 115 ist ebenfalls eingezeichnet.

Wie mit Pfeilen, welche in einer Ebene quer zur Orientierung 115 liegen, angezeigt ist, weist das erste optische Zentrum 110, welches vorliegend in Form einer

Stickstofffehlstelle ausgebildet ist, zwei optische Übergangsdipolmomente 117, 118 auf, welche in einer Ebene quer zur Orientierung 115 liegen. Die beiden optischen

Übergangsdipolmomente 117, 118 sind als Vorzugsorientierungen zu verstehen, in welchen eine Anregung des ersten optischen Zentrums 110 bei parallelem elektrischem Feld eines Anregungslichts besonders effizient ist. Dies gilt im Übrigen gleichermaßen für die durch die beiden optischen Übergangsdipolmomente 117, 118 aufgespannte Ebene, wobei eine Drehung des elektrischen Felds in dieser Ebene keinen Effekt hat.

Ist das elektrische Feld des Anregungslichts jedoch aus der durch die optischen

Übergangsdipolmomente 117, 118 aufgespannten Ebene heraus verdreht, so bewirkt dies, dass die Anregung weniger effizient ist.

Das eben beschriebene Phänomen kann zur Vermessung eines Anregungslichtstrahls 20 verwendet werden. Dies ist in Fig. 4 sowie den zugehörigen Fig. 5 und 6 näher dargestellt, wobei hier zur Vereinfachung nur Komponenten in einer Ebene dargestellt sind. Die z-Achse liegt dabei in Richtung der Ausbreitungsrichtung des

Anregungslichtstrahls 20. Fig. 4 zeigt den Anregungslichtstrahl 20 insbesondere vor und nach Austritt aus der Probenoptik 80, wobei der Anregungslichtstrahl 20 auf eine Fokusebene 25 fokussiert ist. Aufgrund der Fokussierung ändert sich das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20, wobei dieses vor der Probenoptik 80 quer zur Ausbreitungsrichtung ausgerichtet ist, wie durch die unten liegenden nicht ausgefüllten Pfeile angezeigt, sich dann jedoch verändert und lediglich in der Fokusebene 25 wieder quer zur Ausbreitungsrichtung steht. In einer Ebene 27 hinter der Fokusebene 25 ist das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20 vom Ort quer zur

Ausbreitungsrichtung abhängig. Dies ist in Fig. 5 näher dargestellt, wobei die nicht ausgefüllten Pfeile das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20 in Abhängigkeit vom Ort zeigen. In Fig. 4 und in Fig. 5 sind zwei Stellen eingezeichnet, an welchen sich beispielhaft optische Zentren befinden können. Diese können grundsätzlich vom

Anregungslichtstrahl 20 angeregt werden. Die Positionen sind durch senkrechte gestrichelte Linien dargestellt. Außerdem sind sie durch die gezeigten Kreise

dargestellt. Es sei erwähnt, dass ein Vorsehen zweier optischer Zentren äquivalent dazu ist, dass ein optisches Zentrum zwischen zwei Orten verschoben wird.

Zugehörige optische Übergangsdipolmomente der beiden optischen Zentren sind in Fig. 5 dargestellt, und zwar mit ausgefüllten Pfeilen. Wie zu sehen ist, sind die beiden optischen Übergangsdipolmomente gleich ausgerichtet. Das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20 ist jedoch an den beiden Orten deutlich unterschiedlich, wobei bei der linken Position das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20 nahezu quer zum optischen Übergangsdipolmoment steht, wohingegen das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20 bei der rechten Position nur einen kleinen Winkel zum optischen Übergangsdipolmoment einnimmt.

Dies führt zu dem in Fig. 6 dargestellten Verlauf der Anregungseffizienz. Gäbe es das bereits beschriebene Phänomen der Polarisationsabhängigkeit bzw. Feldabhängigkeit der Anregung nicht, so hätte eine Anregungseffizienz den in Fig. 6 gestrichelt

dargestellten Verlauf, welcher durch die Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls 20 bestimmt wird. Aufgrund des eben beschriebenen Phänomens der Feldabhängigkeit hat die Anregungseffizienz jedoch den durchgezogen dargestellten Verlauf, wobei aufgrund der besseren Ausrichtung des Felds das rechte optische Zentrum wesentlich stärker angeregt wird als das linke optische Zentrum, trotz eines gleichen Abstands von einer durchgezogenen senkrechten Mittellinie. Dies ist auch durch den größeren

Leuchtpunkt in Fig. 6 dargestellt.

Das eben beschriebene Phänomen der Feldabhängigkeit der Anregung kann dazu verwendet werden, einen Anregungslichtstrahl 20 zu vermessen. Hierzu kann

beispielsweise eine entsprechende Probe 100 mit einem solchen optischen Zentrum 110 in den Probenhalter 90 eingesetzt werden und gezielt verfahren werden. Dadurch können Intensitätsänderungen ermittelt werden, wobei ein Skalarprodukt zwischen optischem Übergangsdipolmoment des optischen Zentrums und elektrischem Feld des Anregungslichtstrahls 20 umso größer ist, je höher die an einem bestimmten Ort detektierte Helligkeit ist. Auch ist es möglich, die Polarisation des Anregungslichtstrahls 20 aktiv zu drehen, um entsprechende Helligkeitsänderungen zu detektieren.

Fig. 7 zeigt eine beispielhafte Probe 100 in Form eines Festkörpers 105, in dem sich die bereits erwähnten optischen Zentren 110, 120 mit einem Abstand d voneinander befinden. Dabei sind typische elektrische Felder E und/oder magnetische Felder B eingezeichnet, welche hier beispielhaft durch die Probe 100 hindurchgehen und mit den beiden optischen Zentren 110, 120 interagieren können.

Fig. 8 zeigt die bereits in Fig. 7 dargestellte Probe 100 und ihre Wirkung auf den

Detektor 60, wobei die dazwischen befindlichen Optiken 30, 50, 80 lediglich rein schematisch dargestellt sind. Die beiden optischen Zentren 110, 120 werden durch die dazwischenliegenden Optiken 30, 50, 80 auf den Detektor 60 als erster Punkt 62 und zweiter Punkt 64 abgebildet, welche auf dem Detektor 60 einen Abstand d‘ voneinander haben. Dieser Abstand d‘ kann leicht ermittelt werden und bezieht sich zunächst einmal auf das Koordinatensystem des Detektors 60. Beispielsweise kann der Abstand d‘ durch eine Anzahl von zwischen den beiden Punkten 62, 64 liegenden Pixeln oder durch einen Abstand, um welchen der Detektor 60 als Ganzes verfahren wurde, angegeben werden.

Da der Abstand d der beiden optischen Zentren 110, 120 in der Probe wie bereits weiter oben erwähnt sehr genau unabhängig von einer räumlichen Kalibrierung des Detektors 60 gemessen werden kann, ist es nun möglich, den Abstand d‘ im Detektor 60 zu kalibrieren, da davon ausgegangen werden kann, dass der im Koordinatensystem des Detektors 60 gemessene Abstand d‘ dem Abstand d in der Probe 100 entspricht. Die Probe 100 kann somit als Referenz für den gemessenen Abstand verwendet werden. Wird nachfolgend eine andere Probe eingesetzt, in welcher ein unbekannter Abstand vermessen werden soll, so kann diese Kalibrierung dazu verwendet werden, den Abstand in der anderen Probe zu bestimmen. Als Vorteil hat sich dabei insbesondere herausgestellt, dass die Probe 100 mit dem Festkörper 105 sehr photostabil ist, über lange Zeiträume stabil bleibt und einfach zu handhaben ist. Sie bedarf keiner

besonderen Lagerung und kann auch über weite Strecken transportiert werden, ohne ihre Eigenschaften zu verändern. Dies ermöglicht einen Vergleich unterschiedlicher Mikroskope 5, welche an verschiedenen Orten stehen, und ermöglicht auch eine Kontrolle beispielsweise eines einzigen Mikroskops 5, welches zu verschiedenen Zeitpunkten mit der gleichen Probe 100 kalibriert werden kann. Dabei können

Abweichungen, welche im Laufe der Zeit beispielsweise aufgrund von Änderungen an den Komponenten des Mikroskops 5 auftreten können, erkannt werden. Beispielsweise kann auch vor jeweils durchzuführenden Messungen an anderen Proben eine jeweilige Kalibrierung mittels der Probe 100 durchgeführt werden, so dass ein jeweiliger Abstand in der anderen Probe sehr genau bestimmt werden kann. Beispielsweise können damit auch Rotationen erkannt werden, welche beispielsweise aufgrund von langfristigen Veränderungen des Probenhalters 90 auftreten können.

In Fig. 9 ist separat dargestellt, wie eine Probe 100 zur Vermessung des

Anregungslichtstrahls 20 oder zur Ermittlung einer Sammlungseffizienz verwendet werden kann. Der Anregungslichtstrahl 20 wird dabei durch die bereits erwähnten Optiken 10, 50, 80, welche in Fig. 9 lediglich schematisch dargestellt sind, auf die Probe 100 fokussiert und hat somit einen bereits in den Fig. 4, 5 und 6 dargestellten ortsabhängigen Verlauf seines elektrischen Felds. Das elektrische Feld ist dabei schematisch mittels Pfeilen 22 dargestellt.

Bei der in Fig. 9 gezeigten Ausführung mit lediglich einem optischen Zentrum 110 oder auch bei einer Probe 100 mit mehreren optischen Zentren ist es möglich, eine

Sammlungseffizienz des Mikroskops 5 zu kalibrieren. Hierzu kann ein

Anregungslichtstrahl 20 mit definierter Intensität verwendet werden, welcher somit auch zu einer definierten Emission des optischen Zentrums 110 führt. Es kann insbesondere ein Anregungslichtstrahl 20 mit einer Intensität verwendet werden, welche so groß ist, dass das erste optische Zentrum 110 mit seiner maximalen Photonenemissionsrate emittiert. Diese ist für typische optische Zentren 110 wie beispielsweise

Stickstofffehlstellen in Diamant bekannt. Mittels des Detektors 60 kann dann ermittelt werden, wie viele Photonen beim Detektor 60 tatsächlich ankommen. Aus einem Quotienten der in einem bestimmten Zeitintervall tatsächlich ankommenden Photonen geteilt durch die Anzahl der in diesem Zeitintervall emittierten Photonen kann dann die Sammlungseffizienz des Mikroskops 5 ermittelt werden. Diese kann beispielsweise bei einigen Prozent, jedoch auch darunter oder darüber liegen. Das in der Probe 100 enthaltene optische Zentrum 110 weist ein bereits beschriebenes optisches Übergangsdipolmoment 117 auf, wobei die Anregung umso effizienter ist, je paralleler das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20 und das optische

Übergangsdipolmoment 117 sind. Dies ermöglicht ein Vermessen des

Anregungslichtstrahls 20, beispielsweise durch Verfahren der Probe 100 im

Probenhalter 90.

Durch ein solches räumliches Verfahren kann beispielsweise eine in Fig. 10 dargestellte Intensitätsverteilung ermittelt werden. Dabei wird eine Polarisation von 90° des

Anregungslichtstrahls 20 verwendet, welche einer Polarisation parallel zur y-Achse entspricht. Das optische Zentrum befindet sich dabei in einer Ebene 200 nm hinter einer Fokusebene des Anregungslichtstrahls.

Ein Schwerpunkt der gemessenen Helligkeit befindet sich dabei auf der x-Achse, jedoch etwa 66 nm oberhalb der y-Achse. Als Nullpunkt wird dabei die bereits in Fig. 4 eingezeichnete mittige Linie in Richtung der Ausbreitungsrichtung des

Anregungslichtstrahls 20 verwendet. Die umgebenden Linien zeigen an, an welchen Stellen die gemessene Intensität, welche anzeigend ist für die Anregungsstärke, um jeweils zehn Prozentpunkte abfällt. Die unmittelbar umgebende Linie zeigt somit eine Intensität von 90 % der maximalen Intensität bzw. der Intensität am Schwerpunkt an, die mit„0.8“ bezeichnete Linie zeigt eine Intensität von 80 % der maximalen Intensität bzw. der Intensität am Schwerpunkt an, und so weiter. Fig. 10 zeigt somit, dass ein Maximum bzw. ein Schwerpunkt der Anregungseffizienz außerhalb eines eigentlichen Nullpunkts, bei welchem die höchste Anregungseffizienz ohne Berücksichtigung der Polarisationsabhängigkeit bzw. Feldabhängigkeit zu erwarten wäre, auftritt. Dieses Phänomen kann dazu verwendet werden, den Anregungslichtstrahl 20 wie bereits erwähnt zu vermessen.

Fig. 11 zeigt, wie der in Fig. 10 dargestellte Schwerpunkt der Anregung sich in

Abhängigkeit von einer Ausgangspolarisation des Anregungslichtstrahls 20 verhält, wobei auch hier eine Ebene 200 nm hinter einer Fokusebene des Anregungslichtstrahls verwendet wird. Hierzu sei auf die in Fig. 14 dargestellte Legende verwiesen, welche für alle Fig. 10 bis 13 gilt. Bei einer Polarisation von 0°, welche einer Polarisation parallel zur x-Achse entspricht, ist das Anregungsmaximum sehr nah am Nullpunkt, also etwa auf einem Schnittpunkt von y-Achse und x-Achse gelegen. Bei einer Polarisation von +45° liegt das Anregungsmaximum bei einem Wert von etwa (+20 nm, +18 nm). Bei einer Polarisation von -45° liegt das Anregungsmaximum bei einem Wert von etwa (-20 nm, + 18 nm). Die durchgezogene Linie zeigt den elliptischen Verlauf, des

Anregungsmaximums bei kontinuierlicher Drehung der Polarisation. Das

Anregungsmaximum, welches beispielsweise durch Verfahren der Probe 100 im

Probenhalter 90 ermittelt werden kann, ist somit abhängig von der Polarisation des Anregungslichtstrahls 20. Dies kann zum Vermessen des Anregungslichtstrahls 20 als Kalibrierung des Mikroskops 5 verwendet werden.

Fig. 12 zeigt eine dreidimensionale Abhängigkeit der Intensitätsmaxima, wobei die Ausbreitungsrichtung des Anregungslichtstrahls 20 als z-Koordinate dargestellt ist und der Nullpunkt in z-Richtung in die Fokusebene 25 gelegt wird, welche bereits in Fig. 4 dargestellt ist. Es ist des Weiteren eine Ebene E eingezeichnet, welche der in den Fig. 10 und 11 dargestellten (x, y)-Ebene entspricht.

In Fig. 12 sind jeweilige Verläufe von Anregungsmaxima für unterschiedliche

Polarisationen dargestellt. Bezüglich der Polarisationen sei dabei auf Fig. 14 verwiesen. Beispielsweise ist dabei zu erkennen, dass für den Fall einer Polarisation von 0° sich das Anregungsmaximum nicht mit der z-Koordinate verändert. Für andere

Polarisationen verändert sich jedoch das Anregungsmaximum mit der z-Koordinate entlang jeweiliger Geraden oder zumindest entlang von Strecken, welche in erster Ordnung Geraden sind. Dieses Verhalten kann zum Vermessen des

Anregungslichtstrahls 20 verwendet werden.

Fig. 13 zeigt den Verlauf entsprechender Anregungsmaxima für den Fall, dass in der Anregungsoptik 10 ein Astigmatismus vorhanden ist. Dabei sind beispielhaft eine erste Fokusebene FE1 und eine zweite Fokusebene FE2 gezeigt. Bei diesen beiden

Fokusebenen FE1 , FE2 sind die Anregungsmaxima in Abhängigkeit der Polarisation nicht mehr wie beispielsweise in Fig. 11 dargestellt entlang einer Ellipse verlaufend, sondern entlang einer jeweiligen Geraden. Diese Geraden können vermessen werden, wobei ein Schnittpunkt dieser Geraden eine tatsächliche Probenposition angeben kann. Dies kann zur Vermessung des Anregungslichtstrahls 20 und insbesondere auch zum Erkennen etwaiger Astigmatismen in der Anregungsoptik 10 oder in anderen Optiken des Mikroskops 5 verwendet werden. Auch hierdurch ist eine Kalibrierung des

Mikroskops 5 möglich.

Insgesamt hat es sich gezeigt, dass die Verwendung von Proben 100 in Form eines Festkörpers 105 mit optischen Zentren 110, 120 unterschiedliche Kalibrierungen eines Mikroskops 5 ermöglicht, wobei eine solche Kalibrierung im Vergleich zu Kalibrierungen mit bekannten Kalibrierproben wie beispielsweise DNA-Molekülen erhebliche Vorteile mit sich bringt. Insbesondere sind hier die Langlebigkeit der Probe 100, deren einfache Handhabung und Lagerung, eine hohe Resistenz gegenüber Ausbleichen, eine leichte Transportierbarkeit und ein langzeitstabiler Abstand zwischen optischen Zentren 110, 120 zu nennen.

Erwähnte Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens können in der angegebenen Reihenfolge ausgeführt werden. Sie können jedoch auch in einer anderen Reihenfolge ausgeführt werden, soweit dies technisch sinnvoll ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer seiner Ausführungen, beispielsweise mit einer bestimmten

Zusammenstellung von Schritten, in der Weise ausgeführt werden, dass keine weiteren Schritte ausgeführt werden. Es können jedoch grundsätzlich auch weitere Schritte ausgeführt werden, auch solche welche nicht erwähnt sind.

Es sei darauf hingewiesen, dass in den Ansprüchen und in der Beschreibung Merkmale in Kombination beschrieben sein können, beispielsweise um das Verständnis zu erleichtern, obwohl diese auch separat voneinander verwendet werden können. Der Fachmann erkennt, dass solche Merkmale auch unabhängig voneinander mit anderen Merkmalen oder Merkmalskombinationen kombiniert werden können.

Rückbezüge in Unteransprüchen können bevorzugte Kombinationen der jeweiligen Merkmale kennzeichnen, schließen jedoch andere Merkmalskombinationen nicht aus.