Titre : Procédé de caractérisation de la déformabilité de cellules ou d’une partie des cellules d’un échantillon cellulaire

La présente invention concerne un procédé de caractérisation de la déformabilité de cellules ou d’une partie des cellules, notamment des noyaux des cellules, d’un échantillon cellulaire. La présente invention a également trait à une méthode de diagnostic d’un état pathologique chez un individu et à une méthode de criblage d’un composé candidat pour le traitement et/ou la prévention d’un état pathologique.

Domaine technique

De manière générale, les propriétés mécaniques des noyaux des cellules sont considérées aujourd'hui comme des biomarqueurs importants dans de nombreuses pathologies. Les systèmes expérimentaux les plus utilisés aujourd'hui en laboratoire pour tester ces propriétés mécaniques, tels que la microscopie à force atomique, l’aspiration par micropipettes ou la microrhéométrie, sont à faible débit, complexes d'un point de vue technique et/ou coûteux en équipement et temps. De nouveaux systèmes expérimentaux microfluidiques par circulation des cellules dans des canaux ont été développés. Ils permettent de plus hauts débits, mais restent complexe.

H est connu de l’article Antmen E et al, Amplification of nuclear deformation of breast cancer cells by seeding on micropaterned surfaces to better distinguish their malignancies. Colloids Surf B Biointerfaces. 2019 Nov 1 ; 183 : 110402. doi: 10.1016/j.colsurfb.2019.110402. Epub 2019 Jul 30. PMID: 31398621 de déposer des cellules cancéreuses dont les noyaux sont rendus fluorescents sur une plaque présentant des microreliefs en saillie sous forme de piliers parallèles entre eux de tailles inférieures à celle des cellules et de déterminer par analyse d’image de fluorescence de la plaque certains paramètres morphologiques des noyaux liés à leur déformation sur la plaque du fait des piliers pour en déduire si les cellules sont métastatiques ou saines. Une telle analyse d’image de fluorescence est complexe du fait de la diversité des formes que peuvent prendre les noyaux des cellules sur une telle plaque.

Il est connu de l’article Alvarez-Elizondo MB et al. Micropatterned topographies reveal measurable differences between cancer and benign cells. Med Eng Phys. 2020 Jan;75:5-12. doi: 10.1016/j.medengphy.2019.11.004. Epub 2019 Nov 25. PMID: 31780301 de déposer des cellules cancéreuses de noyau fluorescent sur une plaque présentant des microrainures parallèles de taille inférieure à celle des cellules et d’observer la morphologie dans le plan de la plaque et l’orientation des cellules et de leurs noyaux dans la direction des microrainures pour en déduire si les cellules sont métastatiques ou saines. Une telle observation est faite en ajustant une ellipse de contour pour chaque noyau et en déterminant ses axes long et court, son aire, son excentricité et son orientation dans la microrainure pour une topologie de plaque très précise qui doit être déterminée en amont précisément. En revanche, aucune information de déformation dans la profondeur n’est étudiée.

Il existe un besoin pour un procédé simple, robuste et à haut débit pour caractériser les propriétés mécaniques de déformation des noyaux des cellules qui soit à la fois fiable, facile à mettre en œuvre en pratique clinique et peu coûteux, notamment pour permettre la réalisation de test fonctionnel rapide et fiable permettant notamment de détecter un état pathologique ou non d’un échantillon cellulaire, par exemple en vue de l’établissement d’un diagnostic ou du criblage d’un composé d’intérêt.

Exposé de l’invention

L’invention répond à ce besoin par un procédé pour caractériser la déformabilité de cellules ou d’une partie de cellules d’un échantillon cellulaire, lesdites cellules comprenant chacune un corps et un noyau, le procédé comportant : la culture desdites cellules sur une plaque micro structurée présentant en surface une pluralité de microrainures, les microrainures étant de largeur, d’espacement et profondeur prédéterminées de sorte à permettre l’engagement au moins partiel du noyau d’au moins une desdites cellules dans une ou plusieurs des microrainures, au moins une partie de la surface des microrainures étant une surface d’adhésion pour les cellules,

La mesure par microscopie d’un signal de fluorescence du noyau desdites cellules, le noyau desdites cellules étant préalablement traité pour émettre un rayonnement de fluorescence, à partir du signal de fluorescence mesuré pour chaque noyau, la détermination d’un profil d’intensité de fluorescence pour chaque noyau selon au moins un axe dudit noyau et d’au moins un paramètre morphologique dudit noyau, à partir du profil d’intensité de fluorescence et d’au moins un paramètre morphologique déterminé pour chaque noyau, la détermination d’une classe de déformation dudit noyau dans la profondeur d’une ou plusieurs microrainures.

Comme mentionné précédemment, les noyaux des cellules peuvent se déformer sur une surface adhérente micro structurée. La déformation des noyaux dépend de caractéristiques mécaniques et biologiques de la cellule, par exemple sa rigidité, ou sa contractilité. De telles caractéristiques de déformation peuvent être différentes selon l’état physiologique ou pathologique d’un type cellulaire. L’étude des caractéristiques de déformation des noyaux cellulaires d’un échantillon peuvent donc permettre de déterminer un état biologique, notamment pathologique, d’un échantillon cellulaire.

La présence de microrainures sur la plaque micro structurée avec une surface d’adhésion permet de générer sur les cellules une contrainte de déformation particulière contrôlée par les dimensions des microrainures sur la plaque. En effet, l’adhésion des cellules sur les parois des microrainures entraine la déformation des noyaux, selon plusieurs géométries et/ou configurations connues, pouvant aller jusqu’au piégeage complet des noyaux dans la profondeur des microrainures. Cela permet de déterminer différents classes de déformation des noyaux. Déterminer une classe de déformation pour chaque noyau peut permettre de comparer les pourcentages de cellules classées dans les classes de déformation par rapport à un échantillon de référence pour en déduire une caractéristique biologique.

L’étude comparative d’une variable statistique d’intensité ou morphométrique, notamment d’une distribution d’un paramètre du profil d’intensité de fluorescence ou d’une distribution d’un paramètre morphologique, des noyaux des cellules de l’échantillon classées dans au moins une classe de déformation peut permettre d’avoir une plus grande fiabilité dans la détermination d’une caractéristique biologique de l’échantillon que l’étude comparative de ladite variable statistique d’intensité ou morphométrique pour tous les noyaux des cellules de l’échantillon.

Le procédé est un procédé ex vivo ou en extemporané.

Le procédé est non thérapeutique en tant que tel.

Plaque microstructurée

De préférence, la plaque microstructurée comporte un support transparent, notamment en verre, et une structure microstructurée en polymère présentant en surface les microrainures, notamment en polydiméthylsiloxane (PDMS).

De préférence, les microrainures sont parallèles entre elles. De préférence, les microrainures sont de largeurs et profondeurs prédéterminées de sorte à entrainer une déformation d’une partie des cellules dans la direction de la profondeur des microrainures.

La largeur, la profondeur et l’espacement des microrainures peuvent être choisies en fonction d’au moins un paramètre physique d’au moins certaines cellules du type cellulaire, notamment la dimension desdites cellules, la dimension du noyau desdites cellules et/ou d’une caractéristique biophysique desdites cellules, notamment la rigidité, la force d’adhésion ou la contractilité desdites cellules. La largeur, la profondeur et l’espacement des microrainures peuvent être choisies pour avoir un pourcentage moyen de noyaux complètement piégés dans les microrainures en fonction du type de cellules de l’échantillon prédéterminé.

Le pourcentage moyen de noyaux de cellules saines ou anormales dudit type cellulaire piégées entièrement dans les microrainures peut être compris entre 5% et 95% mieux entre 10% et 90%.

De préférence, la largeur, l’espacement et la profondeur des microrainures sont compris entre 30 et 60% de la longueur de l’axe moyen mineur du noyau des cellules non déformées.

Par « longueur de l’axe moyen mineur », on comprend la longueur moyenne du petit axe d’une ellipse ajustée à la forme du noyau de cellules non déformées.

La largeur des microrainures est prédéterminée pour un type cellulaire et varie en fonction des caractéristiques biologiques des types cellulaires étudiés. De manière générale, la largeur est supérieure ou égale à 3 pm et/ou inférieure ou égale à 10 pm.

La profondeur des microrainures est prédéterminée pour un type cellulaire et varie en fonction des caractéristiques biologiques des types cellulaires étudiés. De manière générale la profondeur est supérieure ou égale à 4 pm et/ou inférieure ou égale à 10 pm. Pour des cellules musculaires, la profondeur peut être comprise entre 4 et 5 pm afin d’obtenir un taux suffisamment élevé de noyaux dans les micro-rainures. Dans le cas de cellules épithéliales du sein, la profondeur peut être comprise entre 7 et 9 pm, par exemple sensiblement égal à 8 pm. Les microrainures peuvent être toutes de profondeur sensiblement constante sur toute leur longueur.

Les microrainures peuvent présenter un espacement entre elles mesuré entre les bords adjacents supérieure ou égale à 3 pm et/ou inférieure ou égale à 10 pm. Les microrainures peuvent être toutes de largeur sensiblement constante sur toute leur longueur. Les microrainures peuvent être toutes de profondeur sensiblement constante sur toute leur longueur.

Les microrainures peuvent être toutes d’espacement sensiblement constant sur toute leur longueur.

En variante, la plaque micro structurée peut comporter des zones distinctes comportant chacune des microrainures de largeur et/ou d’espacement différentes.

La profondeur peut être fixe ou variable sur une plaque microstructurée et/ou le long d’une microrainure.

Au moins une partie de la surface interne des microrainures, notamment les parois latérales et/ou le fond des microrainures, de préférence toute la surface de la plaque microstructurée, peut être revêtu d’un revêtement d’adhésion, notamment une protéine d’adhésion cellulaire, par exemple de la fibronectine, du collagène, de la laminine ou de la gélatine.

Echantillon cellulaire

Les cellules peuvent être des cellules adhérentes, par exemple des cellules musculaires, des cellules endothéliales, des cellules souches, de préférence non embryonnaire ou non humaines, des cellules épithéliales, des cellules nerveuses, des cellules osseuses, des cellules adipeuses, des podocytes, des cellules cancéreuses ou un mélange de tels cellules.

Le procédé peut comporter une étape de fixation des cellules sur la plaque microstructurée par ajout d’un composé alcool, notamment du méthanol, ou aldéhyde, notamment de paraformaldéhyde. L’étape de fixation des cellules peut s’effectuer au moins une heure après le dépôt de l’échantillon sur la plaque microstructurée. Un tel temps permet de laisser le temps aux cellules de se déformer avant fixation afin d’avoir un résultat significatif de la déformation des cellules de l’échantillon.

Le procédé peut comporter le traitement de l’échantillon cellulaire pour que les noyaux émettent le rayonnement fluorescent mentionné ci-dessus. Cette étape peut avoir lieu avant ou après le placement des cellules de l’échantillon sur la plaque microstructurée, de préférence après le placement des cellules de l’échantillon sur la plaque microstructurée, mieux après la fixation des cellules sur la plaque microstructurée. Le noyau des cellules de l’échantillon peut être marqué avant ou après fixation par un marqueur nucléaire fluorescent, notamment un colorant Hoechst ou le DAPI.

En variante, le traitement des cellules pour que le noyau émette un rayonnement fluorescent peut comporter la transduction des cellules avec un plasmide codant pour une protéine nucléaire fusionnée à une protéine fluorescente.

L’échantillon cellulaire peut être d’origine humaine, animale ou végétale.

De préférence, l'échantillon cellulaire est configuré pour que la densité cellulaire de l’échantillon cellulaire au moment de la mesure par microscopie évite la confluence cellulaire, notamment soit telle que la confluence cellulaire est inférieure ou égale à 60%. Par exemple, pour des cellules musculaires, endothéliales ou épithéliales, la densité cellulaire de l’échantillon déposé sur la plaque micro structurée peut être supérieure ou égale à 10 000 cellules/cm ² et/ou inférieure ou égale à 50 000 cellules/cm ²

Mesure par microscopie

La mesure par microscopie peut comporter l’acquisition d’une image de fluorescence de la surface de la plaque micro structurée. L’image de fluorescence obtenue peut être une vue du dessus ou dessous par transparence de la plaque microstructurée, notamment obtenue par épifluorescence.

En variante ou en combinaison, la mesure par microscopie peut comporter l’acquisition d’images de fluorescence dans un plan ou une pluralité de plans transverses aux microrainures, notamment par microscopie confocale.

La mesure par microscopie peut comporter, sur la ou les images de fluorescence acquises, la détection du signal de fluorescence émise par le noyau de chaque cellule.

Analyse d’images

Le procédé, notamment l’étape de détermination du profil d’intensité de fluorescence et du ou des paramètres morphologiques, peut comporter la détection des noyaux sur l’image ainsi que leur contour à partir du signal de fluorescence émis par le noyau, notamment visible sur la ou les images de fluorescence acquises, et l’analyse morphométrique de ladite forme du noyau.

L’ensemble des étapes de détermination du profil d’intensité de fluorescence et du au moins un paramètre morphologique et la détermination de la classe de déformation peuvent être réalisé automatiquement, notamment par un processeur mettant en œuvre un logiciel de traitement des images de fluorescence obtenues par la mesure par microscopie. Le processeur peut comporter un logiciel d’apprentissage automatique ou profond.

Détermination profil d’intensité de fluorescence

Le profil d’intensité de fluorescence de chaque noyau peut être déterminé à partir du signal de fluorescence, notamment sur l’image de fluorescence acquise, perpendiculairement à l’axe d’extension des microrainures, de préférence dans un plan sensiblement médian dudit noyau.

Détermination paramètre morphologique

Le au moins un paramètre morphologique du noyau de la cellule peut être choisi parmi la circularité, la rondeur, la solidité, le rapport d’aspect et/ou le rapport de coefficients elliptiques de Fourier du noyau et/ou la courbure moyenne négative du contour du noyau.

Par « courbure moyenne négative », on comprend la moyenne des courbures concaves du contour du noyau.

Le ou les paramètres morphologiques peuvent être choisis, notamment par des analyses préalables sur des échantillons de référence, de sorte à être un ou des paramètres pertinents pour discriminer différentes caractéristiques biologiques de l’échantillon, notamment entre une caractéristique pathologique et une caractéristique saine. Le ou les paramètres morphologiques sont choisis de sorte que, pour une distribution du ou de chaque paramètre morphologique, une différence statistique soit établie entre des échantillons ayant différentes caractéristiques biologiques, notamment sain et pathologique,

Détermination de la classe de déformation

De préférence, le procédé comporte, à partir du profil d’intensité de fluorescence et d’au moins un paramètre morphologique pour chaque noyau, la détermination de la classe de déformation dudit noyau dans la profondeur d’une ou plusieurs microrainures parmi au moins trois classes de déformation prédéterminées correspondants respectivement à : a) un noyau libre en suspension, correspondant par exemple à un profil d’intensité de fluorescence sensiblement plat ou dépourvu de pic majeur d’intensité de fluorescence associé à un ou plusieurs paramètres morphologiques caractéristique d’un contour de noyau peu déformé, notamment sensiblement circulaire, et/ou d’une tortuosité du contour du noyau réduite, par exemple une circularité, une rondeur, une solidité et/ou un rapport de coefficients elliptiques de Fourier élevé, notamment supérieur ou égal à une valeur seuil respective prédéterminée, et/ou un rapport d’aspect et/ou une courbure moyenne négative faible, notamment inférieure ou égale à une valeur seuil respective prédéterminée, b) un noyau déformé s’étendant dans au moins deux microrainures adjacentes, correspondant par exemple à un profil d’intensité de fluorescence présentant au moins deux pics principaux associé à au moins un paramètre morphologique caractérisant une tortuosité du contour importante, notamment une solidité faible par rapport à une valeur seuil prédéterminée et/ou un rapport de coefficients elliptiques de Fourier faible par rapport à une valeur seuil prédéterminée et/ou une courbure moyenne négative élevée par rapport à une valeur seuil prédéterminée, et/ou une circularité et/ou rondeur faible par rapport à une valeur seuil prédéterminée, c) un noyau piégé, notamment totalement inséré dans une microrainure, correspondant par exemple à un profil d’intensité de fluorescence présentant un pic principal associé à au moins un paramètre morphologique caractérisant une élongation du noyau, notamment une circularité et/ou rondeur faible par rapport à une valeur seuil prédéterminée, et/ou un rapport d’aspect élevé par rapport à une valeur seuil prédéterminée e

Le procédé peut comporter la comparaison d’au moins une caractéristique statistique d’au moins une classe de déformation des noyaux des cellules de l’échantillon obtenus avec la même caractéristique pour un échantillon de référence. La caractéristique statistique peut être la proportion de cellules de l’échantillon cellulaire dans au moins une classe de déformation et/ou une variable statistique ou morphométrique des noyaux des cellules classés dans au moins une classe de déformation.

Le procédé peut comporter la détermination de la proportion de cellules de l’échantillon cellulaire dans au moins une des classes de déformation, notamment la classe des noyaux piégés et/ou déformés. Le procédé peut comporter la détermination d’une caractéristique biologique de l’échantillon cellulaire par comparaison de la proportion de cellules de l’échantillon cellulaire dans la ou chaque classe de déformation, avec une proportion dans ladite au moins une classe de déformation des cellules d’un échantillon de référence du même type cellulaire et dont la caractéristique biologique est connue. Le procédé peut comporter la détermination d’une distribution statistique du ou d’au moins un des paramètres morphologiques des noyaux des cellules de l’échantillon classés dans au moins une des classes de déformation, notamment pour la classe des noyaux déformés et/ou celle des noyaux piégés. Le procédé comporte alors préférentiellement la comparaison d’une variable de ladite distribution statistique de l’échantillon avec la même variable de la distribution statistique du paramètre morphologique de cellules classées dans la ou lesdites mêmes classes de déformation d’un échantillon de référence dont la caractéristique biologique est connue. Les inventeurs ont démontré que limiter la comparaison morphologique aux cellules d’une classe de déformation particulière de l’échantillon permet d’avoir une caractérisation biologique de l’échantillon plus précise qu’en prenant les cellules de l’échantillon entier.

La caractéristique biologique peut être le caractère pathologique ou non de l’échantillon cellulaire.

Le procédé peut comporter une étape préalable de détermination de la classe de déformation dont la proportion de cellules classées dans ladite classe de déformation mesurée pour des échantillons de référence permet la meilleure discrimination possible d’au moins deux populations de caractéristiques biologiques différentes,

En variante ou de façon complémentaire, le procédé peut comporter une étape préalable de détermination d’une combinaison d’un ou des paramètres morphologiques des noyaux et d’une ou plusieurs classes de déformation pour lesquels une variable de la distribution statistique du ou des paramètres morphologiques des noyaux classés dans la ou les classes de déformation permet la meilleure discrimination possible de deux populations de référence de caractéristique biologique différentes,

Cette ou ces étapes préalables de détermination peuvent comporter un ou plusieurs tests statistiques de comparaison des échantillons.

Méthode de diagnostic

L’invention répond également à ce besoin par une méthode de diagnostic d’un état pathologique chez un individu, la méthode comprenant au moins les étapes suivantes : a) La culture d’un échantillon d’un type de cellules isolées dudit individu, les cellules de l’échantillon comprenant un corps et un noyau et étant cultivées sur une plaque micro structurée présentant en surface une pluralité de microrainures, au moins une partie de la surface des microrainures étant une surface d’adhésion pour les cellules, les microrainures étant de largeur et profondeur prédéterminées de sorte à permettre l’engagement au moins partiel du noyau d’au moins une desdites cellules dans une ou plusieurs des microrainures, b) La mesure par microscopie d’un signal de fluorescence des noyaux des cellules de l’échantillon, les noyaux des cellules étant préalablement configurés pour émettre un rayonnement de fluorescence, c) à partir du signal de fluorescence mesuré pour chaque noyau, la détermination d’un profil d’intensité de fluorescence pour chaque noyau selon au moins un axe dudit noyau et d’au moins un paramètre morphologique dudit noyau, d) à partir du profil d’intensité de fluorescence et d’au moins un paramètre morphologique déterminé pour chaque noyau, la détermination d’une classe de déformation dudit noyau dans la profondeur d’une ou plusieurs microrainures, e) La comparaison d’au moins une caractéristique d’au moins une classe de déformation des noyaux des cellules de l’échantillon obtenus à l’étape d) avec la même caractéristique pour un échantillon de référence pour en conclure sur l’état pathologique de l’individu.

Les caractéristiques décrites précédemment en relation avec le procédé de caractérisation de la déformabilité d’une cellule ou d’une partie de cellule s’appliquent à cette méthode de diagnostic en combinaison ou indépendamment les unes des autres et indépendamment du procédé de caractérisation de la déformabilité d’une cellule ou d’une partie de cellule.

Méthode de criblage

L’invention répond également à ce besoin par une méthode de criblage d’un composé candidat pour le traitement et/ou la prévention d’un état pathologique, la méthode comprenant au moins les étapes suivantes : a) La culture in vitro d’un premier échantillon d’un type cellulaire représentatives d’une pathologie en absence du composé candidat, b) La culture in vitro d’un second échantillon dudit type cellulaire représentatives de ladite pathologie en présence du composé candidat, les cellules du premier et second échantillons comprenant un corps et un noyau et étant cultivées sur une première et une seconde plaque micro structurée identiques présentant chacune en surface une pluralité de microrainures, au moins une partie de la surface des microrainures étant une surface d’adhésion desdites cellules, les microrainures étant de largeur et profondeur prédéterminée de sorte à permettre l’engagement au moins partiel du noyau d’au moins une desdites cellules dans une ou plusieurs des microrainures, c) La mesure par microscopie d’un signal de fluorescence des noyaux des cellules des premier et second échantillons, les noyaux des cellules des premier et second échantillons étant préalablement configurés pour émettre un rayonnement de fluorescence, d) La détermination de profils d’intensité de fluorescence selon au moins un axe du noyau et d’au moins un paramètre morphologique du noyau de chaque cellule des premier et second échantillons à partir des signaux de fluorescence respectifs mesurés, e) La détermination de classes de déformation du noyau de chaque cellule des premier et second échantillons dans la direction de la profondeur des microrainures à partir du profil d’intensité de fluorescence déterminé et d’au moins un paramètre morphologique déterminé, et f) La comparaison d’au moins une caractéristique du premier échantillon dans au moins une classe de déformation des noyaux des cellules du premier échantillon avec la même caractéristique pour le second échantillon, l’observation d’une différence entre les dites caractéristiques du premier et second échantillon étant indicatrice d’une efficacité du composé candidat à l’égard de ladite pathologie.

Le procédé peut comporter la culture d’un troisième échantillon dudit type cellulaire considéré comme sain en l’absence du composé candidat, la mesure par microscopie d’un signal de fluorescence des noyaux des cellules du troisième échantillon, les noyaux des cellules du troisième échantillon étant préalablement configurés pour émettre un rayonnement de fluorescence, la détermination du profil d’intensité de fluorescence selon au moins un axe du noyau et d’au moins un paramètre morphologique du noyau de chaque cellule du troisième échantillon à partir des signaux de fluorescence respectifs mesurés, la détermination de classes de déformation du noyau de chaque cellule du troisième échantillon dans la direction de la profondeur des microrainures à partir du profil d’intensité de fluorescence déterminé et d’au moins un paramètre morphologique déterminé, et la comparaison d’au moins une caractéristique du premier échantillon et/ou du deuxième échantillon dans au moins une classe de déformation des noyaux des cellules du premier échantillon et/ou du deuxième échantillon avec la même caractéristique pour le troisième échantillon, l’observation d’une différence entre les dites caractéristiques du premier et troisième échantillon et/ou d’une similitude entre les dites caractéristiques du deuxième et troisième échantillon étant indicatrice d’une efficacité du composé candidat à l’égard de ladite pathologie.

Les caractéristiques décrites précédemment en relation avec le procédé de caractérisation de la déformabilité d’une cellule ou d’une partie de cellule s’appliquent à cette méthode de criblage en combinaison ou indépendamment les unes des autres et indépendamment du procédé de caractérisation de la déformabilité d’une cellule ou d’une partie de cellule.

De préférence, la caractéristique étant la proportion de cellules des échantillons dans au moins une des classes de déformation, notamment la classe des noyaux piégés, l’observation d’une différence statistique entre le premier et le second échantillon, et/ou l’observation d’une différence statistique non significative entre l’échantillon sain et l’échantillon en présence du composé candidat et significative entre l’échantillon sain et l’échantillon sans composé candidat, étant indicatrice d’une efficacité du composé candidat à l’égard de ladite pathologie.

La caractéristique étant, dans une des classes de déformation, notamment dans la classe des noyaux déformés ou préférentiellement dans la classe des noyaux piégés, la distribution statistique du ou d’au moins un des paramètres morphologiques des cellules du premier et du second échantillon. Le procédé comporte alors préférentiellement la comparaison de ladite distribution statistique du premier échantillon avec un profil de distribution statistique du second échantillon, l’observation d’une différence statistique entre le premier et le second échantillon, et/ou l’observation d’une différence statistique non significative entre l’échantillon sain et l’échantillon en présence du composé candidat et significative entre l’échantillon sain et l’échantillon sans composé candidat, étant indicatrice d’une efficacité du composé candidat à l’égard de ladite pathologie.

Brève description des dessins

[Fig 1] représente schématiquement le procédé global de caractérisation de la déformabilité de cellules ou d’une partie d’une cellule d’un échantillon cellulaire

[Fig 2A] représente un détail de plaque microstructurée en coupe portant des cellules dont les noyaux sont piégés dans les microrainures,

[Fig 2B] représente une plaque microstructurée portant des cellules dont les noyaux sont visibles en fluorescence en perspective et en coupe selon A-A, [Fig 2C] représente une plaque micro structurée portant des cellules dont les corps sont visibles en fluorescence en perspective et en coupe selon A-A,

[Fig 3] représente des images de fluorescence de noyaux acquise pour des échantillons de différents types cellulaires,

[Fig 4] est un graphique représentant le pourcentage de noyaux piégés identifiés en fonction du volume nucléaire moyen pour certains des types cellulaires de la figure 3,

[Fig 5] représente les classes de déformation et un exemple de profil d’intensité de fluorescence correspondant à chaque classe de déformation,

[Fig 6] est une image de fluorescence acquise sur laquelle les noyaux de chaque classe de déformation ont été identifiés de différentes couleurs,

[Fig 7] représente des images de fluorescence de noyaux de myoblastes acquises pour des microrainures de largeurs différentes,

[Fig 8] est un graphique sous forme de boite à moustache représentant le pourcentage de noyaux piégés en fonction des largeurs de la figure 7,

[Fig 9] est un graphique sous forme de boite à moustache représentant le pourcentage de noyaux déformés en fonction des largeurs de la figure 7,

[Fig 10] représente des images de fluorescence acquise pour des plaques de profondeurs différentes,

[Fig 11] est un graphique sous forme de boite à moustache représentant le pourcentage de noyaux piégés en fonction des profondeurs de la figure 10,

[Fig 12] est un graphique sous forme de boite à moustache représentant le pourcentage de noyaux déformés en fonction des profondeurs de la figure 10,

[Fig 13] est un graphique sous forme de boite à moustache représentant le pourcentage de noyaux piégés pour un échantillon sain (WT) et un échantillon pathologique (MU Lamin A) de myoblastes,

[Fig 14] est un graphique sous forme de boite à moustache représentant le pourcentage de noyaux déformés pour un échantillon sain (WT) et un échantillon pathologique (MU Lamin A) de myoblastes,

[Fig 15] est un graphique sous forme de boite à moustache représentant le pourcentage de noyaux piégés pour un échantillon sain (MCF10A) et un échantillon pathologique (MCF7) de cellules épithéliales du sein, [Fig 16] représente les distributions statistiques de la circularité déterminés sur l’ensemble des cellules de l’échantillon (a), les cellules dont les noyaux sont piégés (b) et les cellules dont les noyaux sont déformés (c) pour un échantillon sain (WT) et un échantillon pathologique (MU) de myoblastes, et

[Fig 17] représente les distributions statistiques du rapport des coefficients elliptiques de Fourier déterminés sur l’ensemble des cellules de l’échantillon (a), les cellules dont les noyaux sont piégés (b) et les cellules dont les noyaux sont déformés (c) pour un échantillon sain (WT) et un échantillon pathologique (MU) de myoblastes.

Description détaillée

On a illustré à la figure 1 l’ensemble du procédé pour caractériser la déformabilité de cellules ou d’une partie d’une cellule d’un échantillon cellulaire.

L’échantillon cellulaire peut être un échantillon de cellules adhérentes comportant des cellules musculaires, des cellules endothéliales, des cellules épithéliales, des cellules nerveuses, des cellules osseuses, des cellules adipeuses, des podocytes, des cellules cancéreuses ou un mélange desdites cellules. Les cellules peuvent être humaines, animales ou végétales.

A l’étape 10, l’échantillon cellulaire est déposé à la surface d’une plaque micro structurée 12, illustrée sur les figures 2A à 2C, et est cultivé sur la surface de la plaque 12 dans un milieu adapté pendant une durée d’au moins Ih.

La plaque 12 comporte un support transparent 14, notamment en verre, et une structure micro structurée 16 en polymère, notamment en polydiméthylsiloxane (PDMS), solidaire du support. La structure microstructurée 16 présente en surface une pluralité de microrainures 18, de préférence de largeur l et profondeur p constante sur toute leur longueur et identiques, parallèles et régulièrement espacées entre elles. Mais il pourrait en être autrement, les microrainures pourraient comporter au moins deux parties longitudinales distinctes chacune de largeur et profondeur constante mais qui diffèrent entre elles par leur profondeur et/ou leur largeur, et/ou la plaque microstructurée pourrait comporter au moins deux zones distinctes comportant chacune des microrainures identiques dans ladite zone et qui diffèrent entre les deux zones par la largeur, la profondeur et/ou l’espacement des microrainures.

Les microrainures 18 sont de largeur / et profondeur p prédéterminées de sorte à permettre l’engagement au moins partiel du noyau 23 d’au moins une desdites cellules dans une ou plusieurs des microrainures. Elles sont également dimensionnées, de préférence, pour empêcher l’engagement entier du corps desdites cellules 22 dans une microrainure 18. Pour ce faire, la largeur l et la profondeur p des microrainures 18 peuvent être choisies en fonction d’au moins un paramètre physique de cellules du type de celles de l’échantillon, notamment leur dimension moyenne ou la dimension moyenne de leur noyau, et/ou d’une caractéristique biophysique de ces cellules, notamment leur rigidité moyenne, la force d’adhésion moyenne ou la contractilité moyenne. La largeur l et la profondeur p des microrainures 18 peuvent être choisies de sorte que le pourcentage de noyaux complètement piégés dans les microrainures 18 soit un paramètre significatif d’une caractéristique biologique des cellules du type cellulaire que l’on cherche à déterminer, notamment du caractère pathologique ou non des cellules. Par exemple, le pourcentage moyen de noyaux de cellules saines ou maligne dudit type cellulaire, notamment dans le cas de cellules endothéliales ou musculaires, piégées entièrement dans les microrainures peut être compris entre 10% et 90%. La largeur /, l’espacement e et la profondeur p des microrainures 18 peuvent être compris entre 30 et 60% de la longueur de l’axe moyen mineur du noyau des cellules non déformées. La largeur / des microrainures peut être comprise entre 3 et 10 pm, la profondeur p des microrainures peut être comprise entre 4 et 10 pm et l’espacement e entre elles mesuré entre les bords adjacents des microrainures peut être compris entre 3 et 10 pm.

La surface de la structure micro structurée 16 est au moins en partie traitée par un agent d’adhésion des cellules, tel que la fibronectine 20. Un tel traitement peut se faire par passage au plasma puis incubation dans un solution contenant de la fibronectine. Le traitement se fait de préférence sur toute la surface de la plaque 12 mais il pourrait en être autrement. Elle pourrait se faire uniquement dans le fond des microrainures 18 et/ou sur les parois latérales.

Lors de la culture des cellules 22, ces dernières se déforment ou non du fait des reliefs de la plaque 12 et les noyaux 23 des cellules s’engagent plus ou moins dans les microrainures de la plaque 12.

Les cellules 22 sont fixées par ajout d’un composé de fixation, par exemple un composé aldéhyde, notamment de paraformaldéhyde et les noyaux des cellules sont marqués avec un marqueur fluorescent tel que le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) après perméabilisation des cellules avec un agent de perméabilisation tel que le Triton X-100. Elle pourrait être marqué différemment, notamment par transduction des cellules avec un plasmide codant pour une protéine nucléaire fusionnée à une protéine fluorescente, ou par l’ajout d’un marqueur nucléaire fluorescent avant fixation, tel que les colorants Hoechst. La fixation des cellules permet de s’affranchir de leur dynamique car le confinement des noyaux dans les microrainures est statistiquement réversible au cours du temps.

De préférence, l'échantillon cellulaire est configuré pour que la densité cellulaire de l’échantillon cellulaire au moment de leur fixation évite la confluence cellulaire. La densité cellulaire au moment de la fixation des cellules peut être est comprise entre 10 000 et 50000 cellules/cm ² .

Des images de fluorescence de la surface de la plaque 12 sont ensuite prise à l’étape 30 à l’aide d’un microscope à fluorescence. Comme cela est illustré sur la figure 3, les noyaux des cellules et leurs formes sont identifiables par la fluorescence qu’ils émettent. Il apparait clairement de la figure 3 que cela est applicable aux différents types cellulaires précités.

L’analyse, de préférence automatique, des images obtenues à l’étape 40 permet de déterminer pour chaque noyau 23 de cellules identifiable un profil d’intensité de fluorescence selon un axe, de préférence perpendiculaire à l’axe longitudinal X des microrainures et sensiblement médian au noyau.

Cela permet également de déterminer pour chaque noyau 23 un contour, notamment par ajustement d’un modèle de forme, par exemple d’un modèle d’ellipse, pour en déduire différents paramètres de forme des noyaux, notamment les paramètres suivants :

La rondeur définit par le rapport de l’aire du noyau sur l’aire d’un cercle yj circonscrit au noyau, ce qui donne la formule suivante : 4 * A étant l’aire du noyau et M étant la plus grande longueur du noyau

La circularité définit par le rapport de l’aire du noyau sur l’aire d’un cercle dont le rayon est défini par la longueur du contour du noyau, ce qui donne la formule yj suivante : 4TT * — C étant la longueur du contour du noyau,

Le rapport d’aspect définit par le rapport de la longueur du plus grand axe sur la longueur du plus petit axe d’un modèle d’ellipse,

La solidité définit comme le rapport de l’aire du noyau sur l’aire de l’enveloppe convexe du noyau,

Le rapport des coefficients elliptiques de Fourier définit par la formule suivante : étant la longueur du grand axe du modèle d’ellipse d’harmonique n et m _n étant la longueur du petit axe du modèle d’ellipse d’harmonique n, et/ou

La courbure moyenne négative définit comme la moyenne des courbures concaves du contour du noyau.

Le profil d’intensité de fluorescence et le ou les paramètres morphologiques permettent, à l’étape 50, de classer chaque cellule dont le noyau 23 est identifiable dans une classe de déformation parmi plusieurs classes de déformation préétablies. Les classes de déformation peuvent en particulier être fonction du pourcentage de pénétration du noyau dans les microrainures. Le classement se fait par exemple parmi trois classes correspondantes respectivement à : i) un noyau libre en suspension, correspondant par exemple à un profil d’intensité de fluorescence sensiblement plat ou dépourvu de pic majeur d’intensité de fluorescence associé à un ou plusieurs paramètres morphologiques caractéristique d’un contour de noyau peu déformé, notamment sensiblement circulaire, et/ou d’une tortuosité du contour du noyau réduite, par exemple une circularité, une rondeur, une solidité et/ou un rapport de coefficients elliptiques de Fourier élevé, notamment proche de 1, et/ou un rapport d’aspect et/ou une courbure moyenne négative faible, notamment inférieure ou égale à une valeur seuil respective prédéterminée, ii) un noyau déformé s’étendant dans au moins deux microrainures adjacentes, correspondant par exemple à un profil d’intensité de fluorescence présentant au moins deux pics principaux associé à au moins un paramètre morphologique caractérisant une tortuosité du contour importante, notamment une solidité faible par rapport à une valeur seuil prédéterminée et/ou un rapport de coefficients elliptiques de Fourier faible par rapport à une valeur seuil prédéterminée et/ou une courbure moyenne négative élevée par rapport à une valeur seuil prédéterminée, et/ou une circularité et/ou rondeur faible par rapport à une valeur seuil prédéterminée, iii) un noyau piégé, notamment totalement inséré dans une microrainure, correspondant par exemple à un profil d’intensité de fluorescence présentant un pic principal associé à au moins un paramètre morphologique caractérisant une élongation du noyau, notamment une circularité et/ou rondeur faible par rapport à une valeur seuil prédéterminée, et/ou un rapport d’aspect élevé par rapport à une valeur seuil prédéterminée . La figure 5 représente pour chacune des 3 classes ci-dessus un exemple de profil d’intensité de fluorescence. Comme cela est visible en figure 5, il est possible aussi pour aider à la classification de faire une mesure confocale pour chaque noyau, notamment dans un plan médian du noyau transversal à la plaque et perpendiculaire aux rainures. Une telle mesure permet la visualisation claire de la profondeur de pénétration du noyau, ce qui peut permettre d’affiner la classification, notamment lors d’une étude préalable des paramètres pertinents. Cependant, une telle mesure n’est pas indispensable.

La classe de chaque noyau peut être reportée sur l’image de fluorescence par un code couleur afin de permettre l’identification rapide directement sur l’image, comme cela est illustré sur la figure 6.

Il y a alors plusieurs possibilités pour déterminer une caractéristique biologique de l’échantillon cellulaire, notamment son caractère pathologique ou sain, à l’étape 60. On peut comparer le pourcentage de cellules de l’échantillon dans une des classes, notamment la classe des noyaux piégées ou des noyaux déformés, avec celui d’un autre échantillon de référence dont la caractéristique biologique est connue, notamment un échantillon sain, comme cela est visible sur les figures 13 à 15. On peut également comparer, dans une des classes de déformation, notamment la classe des noyaux piégées ou celle des noyaux déformés, une distribution statistique d’un des paramètres morphologiques avec celle d’un échantillon test de cellules dont la caractéristique biologique est connue, notamment un échantillon sain, comme cela est visible sur les figures 16 ou 17. Ces différentes méthodes peuvent être combinées entre elles si cela est nécessaire. La méthode de détermination de la caractéristique biologique dépend notamment de la plaque utilisée, du type cellulaire et de la caractéristique cellulaire à déterminer. La meilleure méthode de discrimination peut être déterminée préalablement par des tests statistiques, Ces tests statistiques se passent dans les mêmes conditions générales (même type de plaque, même procédé de culture et même méthode d’imagerie) sur des échantillons de caractéristiques biologiques connues différentes, notamment pathologique et sain Ces tests statistiques préalables se font préférentiellement sur plusieurs panels d’échantillons de référence afin de vérifier la stabilité de la méthode d’identification.

Puis selon la comparaison obtenue entre l’échantillon à tester et l’échantillon de référence, soit on identifie que la caractéristique biologique est identique à celle de population de référence à l’étape 70, soit on identifie que la caractéristique biologique est différente de celle d’ une population de référence à l’étape 80.

Une telle étude a plusieurs applications possibles. Par exemple, elle peut permettre de déterminer le caractère pathologique ou non d’un échantillon d’un patient en le comparant à un ou plusieurs populations de référence sains ou pathologiques afin d’en déduire un diagnostic. Elle peut également permettre de cribler un composé candidat en comparant le résultat sur un échantillon ayant reçu le composé candidat avec celui pour un échantillon témoin ne l’ayant pas reçu et optionnellement en comparant le résultat de l’échantillon ayant reçu le composé candidat et de l’échantillon témoin ne l’ayant pas reçu à celui d’une population de référence, notamment une population considéré sain.

Exemple 1

On a illustré sur les figures 3 et 4 une étude de différents types cellulaires.

La figure 3 représente les images obtenues en imagerie par épifluorescence en haut et par imagerie confocale selon la coupe Z en bas pour les types cellulaires suivants : a) myoblastes, b) cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVECs) c) cellules COS-7, d) cellules HeLa, e) cellules épithéliales pariétales (PECs), f) cellules épithéliales de sein (MCF-10A), g) cellules cancéreuses de sein (MDA-MB-231), h) cellules cancéreuses de sein (MCF7), et i) podocytes.

Les cellules sont cultivées sur une plaque micro structurée ayant des microrainures parallèles de 5 pm de large et de profondeur, régulièrement espacées entre elles de 5 pm.

On voit sur ces images que toutes les cellules étudiées sont capables de se déformer sur la plaque. Le degré de déformation des noyaux dépend du type cellulaire.

En figure 4 est représenté pour certaines de ces cellules le pourcentage de noyaux de l’échantillon cellulaire appartenant à la classe des noyaux piégées P _p en fonction du volume nucléaire moyen V _m des cellules (mesuré sur une surface plane en pm) pour quatre des types cellulaires précités. On constate que le pourcentage de noyaux piégés dans les échantillons P _p n’est pas directement dépendant du volume nucléaire moyen V _m . Ce qui explique qu’il n’y ait pas de lien simple entre le volume des noyaux et leur déformation.

Exemple 2

On a illustré sur les figures 7 à 12 une étude de l’influence des dimensions des microrainures sur la déformation des noyaux pour des échantillons de myoblastes.

Dans cet exemple, les plaques sont en PDMS micro structuré sur support de verre. Elles sont recouvertes sur toute leur surface d’un revêtement en fibronectine. Les échantillons cellulaires de type myoblastes sont cultivés sur la plaque dans un milieu pendant 8 h. A la fin de la culture les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde 4% pendant 15 min. Après une étape de perméabilisation avec Triton, les noyaux sont marqués avec un marqueur fluorescent DAPI pendant Ih. Des images des noyaux sont ensuite prises grâce à un microscope à fluorescence (objectif x20).

La figure 7 représente les images obtenues en imagerie par épifluorescence pour des échantillons de myoblastes sur des supports présentant des microrainures espacées entre elles de 5pm, de profondeur 4pm et de largeurs différentes. Les largeurs étant les suivantes : a) 1=3 p m, b) l=5pm, et c) l=7pm.

Les figures 8 et 9 représentent respectivement le pourcentage de noyaux classés dans la classe des noyaux piégés P _p et le pourcentage des noyaux classés dans la classe des noyaux déformés P a en fonction de la largeur l des microrainures. On constate que l’augmentation de la largeur des microrainures change la proportion des différentes classes de noyaux (diminution du pourcentage de noyaux déformés et augmentation du pourcentage de noyaux piégés).

La figure 10 représente les images obtenues en imagerie par épifluorescence pour des échantillons de myoblastes sur des supports présentant des microrainures espacées entre elles de 5pm, de largeur 5pm et de profondeurs différentes. Les profondeurs étant les suivantes : a) p=4pm, et b) p=5,4pm, Les figures 11 et 12 représentent respectivement le pourcentage de noyaux classés dans la classe des noyaux piégés P _p et le pourcentage des noyaux classés dans la classe des noyaux déformés P a en fonction de la profondeur p des microrainures. On constate que l’augmentation de la profondeur des microrainures change la proportion des différentes classes de noyaux (diminution du pourcentage de noyaux déformés et augmentation du pourcentage de noyaux piégés).

Ainsi, la dimension des microrainures a une forte influence sur la déformation des cellules sur la plaque micro structurée. Les dimensions des microrainures peuvent donc être adaptées pour chaque type cellulaire en fonction de leur potentiel de déformation, notamment par une étude préalable pour optimiser l’étude de la déformation cellulaire.

Exemple 3

Les figures 13 et 14 représentent respectivement les pourcentages des noyaux piégés P _p et le pourcentage des noyaux déformés P a pour des échantillons de cellules de types myoblaste de patient sain (WT) et pour des échantillons de cellules de types myoblaste de patient malade présentant une mutation du gène codant pour la lamine A, principal composant de l’enveloppe nucléaire (Mu Lamin A Delta K32). Les échantillons cellulaires sont cultivés par la méthode décrite dans l’exemple précédent sur une plaque présentant des microrainures de largeur 1 de 5pm, de profondeur de 4pm et espacées entre elles de 5pm.

On constate que les pourcentages des noyaux piégés P _p et déformés P a entre des échantillons sains WT et des échantillons pathologiques Mu Lamin A avec leur minimum et maximum ne se recoupent pas, ce qui indique qu’une différence significative existent sur ces paramètres entre les échantillons sains WT et les échantillons pathologiques Mu Lamin A. Ce résultat montre que la détermination du pourcentage des noyaux piégés P _p ou déformés Pa permet la discrimination des échantillons WT et Mu Lamin A, et donc la détection de la pathologie.

Exemple 4

La figure 15 représente les pourcentages des noyaux piégés P _p pour un échantillon de cellules du sein épithéliales saines (MCF10A) et pour un échantillon de cellules du sein épithéliales tumorales (MCF7). Les échantillons cellulaires sont cultivés 24h par la méthode décrite dans l’exemple précédent sur une plaque présentant des microrainures de largeur 1 de 5pm, de profondeur de 7.5pm et espacées entre elles de 5pm. On constate clairement une différence significative du pourcentage des noyaux piégés P _p entre l’échantillon de cellules non tumorales MCF10A et l’échantillon de cellules tumorales MCF7. Ce résultat montre que le pourcentage noyaux piégés est également un bon discriminant dans le cas des cellules épithéliales du sein.

Exemple 5

La figure 16 représente les distributions statistiques normalisées de la circularité pour toutes les cellules de l’échantillon (a), les noyaux piégés uniquement (b) et les noyaux déformés uniquement (c) pour un échantillon de cellules de types myoblaste d’un patient sain (WT) et pour un échantillon de cellules de types myoblaste d’un patient malade présentant une mutation Lamine A (Mu). Les échantillons cellulaires sont cultivés par la méthode décrite dans l’exemple précédent sur une plaque présentant des microrainures de largeur 5pm, de profondeur 4pm et espacées entre elles de 5pm.

La différence d entre les maximums des deux distributions WT et Mu est calculée pour déterminer la séparation des distributions et ainsi caractériser le potentiel de discrimination entre les deux échantillons cellulaires. La différence d est égale à 0,06 dans le cas (a) (toutes les cellules), 0,25 dans le cas (b) (noyaux piégés), 0,23 dans le cas (c) (noyaux déformés).

On constate que la différence d est bien plus grande dans les cas (b) et (c), ce qui atteste que le système de classification préalable à l’étude morphologique des noyaux améliore la discrimination entre les deux échantillons cellulaires WT et Mu.

La figure 17 représente la même étude appliquée au rapport des coefficients elliptiques de Fourier. La différence d est égale à 0,12 dans le cas (a) (toutes les cellules), 0,31 dans le cas (b) (noyaux piégés), 0,12 dans le cas (c) (noyaux déformés).

On constate que la différence d est bien plus grande dans les cas (b), ce qui atteste que le système de classification préalable à l’étude morphologique des noyaux améliore la discrimination entre les deux échantillons cellulaires WT et Mu.

Cette fois, en revanche, seule la classe des noyaux piégées permet d’avoir une meilleure discrimination. Ceci atteste qu’une étude préalable peut être utile pour déterminer la bonne combinaison de classes et paramètres morphologiques à étudier pour avoir une discrimination des échantillons de caractéristiques biologiques différentes optimales.

L’invention n’est pas limitée à l’exemple qui vient d’être décrit. Par exemple, la plaque microstructurée peut avoir des microrainures selon une répartition plus complexe que régulièrement espacées. La plaque pourrait comporter plusieurs zones ayant des caractéristiques de microrainures différentes.

En variante, d’autres paramètres morphologiques caractérisant la forme du noyau en trois dimensions sont envisageables s’ils permettent une discrimination efficace de deux échantillons cellulaires de caractéristiques biologiques différentes.

En variante, l’invention n’est pas limitée aux types de cellules et pathologie mentionnés. Le procédé mentionné à un potentiel pour de nombreux types de cellules et de nombreuses pathologies.