Elle a aussi pour objet une méthode de criblage de substances inhibitrices ou activatrices de la calpaine 3. La méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 constitue enfin un moyen d'étudier la fonction de la calpaine 3.

Les calpaines sont une famille de protéases à cystéine non lysosomales activables par le calcium [Sorimachi, 1997]. Cette famille comprend à l'heure actuelle 11 membres dont 2 protéines ubiquitaires. Les fonctions physiologiques des calpaines restent encore largement inconnues. En tant que protéases de type régulatrices, elles doivent vraisemblablement réguler des fonctions cellulaires importantes. En particulier, les calpaïnes ubiquitaires ont été impliquées dans l'apoptose [Squier, 1994], la différenciation myogénique [Kwak, 1993], la division et la fusion cellulaires [Yamaguchi, 1994] ; [Schollmeyer, 1986] ; [Balcerzak, 1995].

La calpaine 3, également connue sous la dénomination p94, est une enzyme à cystéine calcium dépendante appartenant à la famille des calpaines s'exprimant spécifiquement dans le muscle squelettique [Sorimachi, 1989]. Elle est impliquée dans une maladie génétique autosomique récessive appelée dystrophie des ceintures de type 2A [Richard, 1995]. Cette myopathie est caractérisée par une atrophie et une faiblesse progressive des muscles des ceintures pelviennes et scapulaires et un aspect de nécrose regénération sur les biopsies musculaires [Fardeau, 1996]. Le gène situé sur le chromosome 15 chez l'homme code pour un transcrit de 3, 5kb, lui-même codant pour

une protéine de 94kDa. Il a été démontré que la calpaïne 3 pouvait se lier à la titine, protéine élastique du sarcomère, par l'intermédiaire de la région IS2 et qu'elle subissait une dégradation autolytique immédatement après traduction lorsqu'elle elle est exprimée dans les cellules Cos7 [Sorimachi, 1993] [Sorimachi, 1995]. Cette région comporte un signal de localisation nucléaire laissant supposer que la calpaine peut être localisée soit dans le cytoplasme, soit dans le noyau. II a par ailleurs été montré que la calpaine 3 était sous-exprimée dans les souris transgéniques surexprimant l'interleukine 6, ces souris présentant une atrophie musculaire. La calpaine 3 semble aussi sous-exprimée dans différentes conditions comportant une composante atrophique du muscle (cachexie, etc...).

Dans l'état actuel des connaissances, on sait donc que la LGMD2A est due à des mutations apparaissant sur le gène de la calpaine 3, mutations conduisant à une inhibition de la protéolyse de la calpaine 3 présente dans le muscle squelettique. Le diagnostic clinique de la LGMD 2A est très difficile puisque les patients présentent des signes cliniques similaires à au moins une dizaine d'autres pathologies. Le diagnostic moléculaire peut, quant à lui, être réalisé selon différentes méthodes.

La première possibilité est de procéder à une recherche de mutation sur le gène de la calpaine. Cependant, une telle technique est très lourde dans la mesure où le gène est relativement grand, qu'il existe donc un grand nombre de mutations différentes et qu'il n'y a pas de mutation préférentielle.

Une autre technique consiste à détecter la présence de la protéine à l'aide d'anticorps spécifiques. Cependant, même si la calpaine 3 est présente dans l'échantillon, cela ne signifie pas pour autant que l'individu n'est pas malade dans la mesure où la mutation sur le gène de la calpaine peut faire que la protéine est présente mais que le phénomène d'autolyse n'existe pas. Au contraire si la calpaine est absente ou diminuée, il peut s'agir d'une calpainopathie secondaire due à des mutations sur un autre gène que celui de la calpaine.

En d'autres termes, le problème que se propose de résoudre l'invention n'est pas tant de détecter la présence de la calpaine 3 dans un échantillon biologique mais plutôt celui de détecter son activité.

Guttman et al. décrivent dans le document Methods in molecular biology vol 144, ch 18, une méthode de mesure de l'activité de calpaine ubiquitaire consistant à mettre une calpaine purifiée au contact d'un peptide non spécifique fluorescent (Succ-LLVY- AMC), puis de mesurer la variation de fluorescence apparaissant lorsque la molécule est clivée. Dans une seconde méthode, on met en contact la calpaine avec la protéine TAU entière, puis on effectue un Western blot. En aucun cas ce document ne concerne spécifiquement la calpaine 3. De plus, les substrats sont, soit non spécifiques (substrat de la m-calpaine et la il-calpaine), soit des protéines entières.

Le problème que se propose de résoudre l'invention est de développer un nouveau substrat spécifique de la calpaine 3 qui puisse être utilisé pour détecter l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique.

Dès lors, l'invention concerne tout d'abord un peptide couplé à au moins une molécule rapportrice fluorogénique ou colorogénique, ledit peptide se caractérisant en ce qu'il contient au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3.

Par"isoforme de la calpaine 3", on désigne toute protéine produite par le gène de la calpaine 3, résultant d'un événement alternatif du type promoteur altematif ou épissage alternatif.

Dans un premier mode de réalisation et compte tenu des propriétés autolytiques de la calpaine 3, le peptide de l'invention contient avantageusement au moins un site d'autolyse de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, dont le nombre d'acides aminés est inférieur à 10.

Dans la suite de la description et dans les revendications, par l'expression "site d'autolyse", on désigne une séquence d'acides aminés contenue dans la calpaine 3 ou un de ses isoformes susceptible d'être clivée par la calpaine 3 ou un de ses isoformes en au moins deux peptides ainsi que toute séquence dérivée.

En pratique, la séquence d'acides aminés du site d'autolyse de la calpaine 3 est choisie parmi les séquences suivantes NMTYGTS (SEQ ID1), NMDNSLL (SEQ ID2), PVQYETR (SEQ ID3) dénommées dans la suite de la description respectivement site 1, site 2 et site 3. Ces sites sont identiques dans toutes les espèces pour lesquelles la séquence de la calpaine 3 est connue à ce jour (homme, souris, rat,).

La séquence d'acides aminés du site d'autolyse de la calpaine 3 peut être également choisie parmi les séquences humaines suivantes VAPRTA AEPRSP (SEQ ID4), QSKATE AGGGNP (SEQ ID5), et les séquences murines suivantes VAPRTG AEPRSP (SEQ ID6), QGKTTE AGGGHP (SEQ ID7).

Dans le mode de réalisation selon lequel le peptide de l'invention contient au moins un site d'autolyse d'une isoforme de la calpaine 3, la séquence d'acides aminés du site d'autolyse provient d'une isoforme de la calpaine 3 dénommé Lp82 présent chez le rongeur, rat, souris et est choisi parmi les séquences d'acides aminés suivantes : NPYLLPGFFC (SEQ ID8) et TISVDRPVP (SEQ ID9).

Dans un second mode de réalisation, la séquence d'acides aminés clivable par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3 provient d'une protéine substrat du type par exemple calpastatine, filamine, taline, calpaines ubiquitaires, cristalline, heat shock proteine, etc.

Avantageusement, les protéines substrat ont les séquences suivantes : REVTIPPKYRELL (SEQ ID10) (calpastatine humaine) KEGTIPPEYRKLL (SEQ ID11) (calpastatine souris et rat) PVSREEKPTSAPSS (SEQ ID12) (alpha-A-cristalline humaine)

PVSREEKPSSAPSS (SEQ ID13) (alpha-A-cristalline souris et rat) KSTVLQQQYNR (SEQ ID14) (taline humaine) Séquence publiée sous le numéro d'accession XP 045856 (flamine 2 humaine) Séquence publiée sous le numéro d'accession P 10809 (heat shock proteine 60 humaine) Séquence publiée sous le numéro d'accession NP 004355 (c/EBPbeta humaine) Séquence publiée sous le numéro d'accession P 17655 (m calpaine humaine) Dans un troisième mode de réalisation, le peptide contenant une séquence clivable par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3, est obtenu par criblage d'une banque de peptides par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3.

Pour permettre de détecter ultérieurement l'activité de la calpaine par colorimétrie ou fluorimétrie, le peptide de l'invention, comme déjà dit, est couplé à une molécule rapportrice colorogénique ou fluorogénique.

Lorsque la molécule rapportrice est une molécule colorogénique, le clivage de la séquence d'acides aminés par la calpaine 3 sera détecté au spectrophotomètre par l'apparition d'un composé coloré. En pratique, le composé coloré utilisé est le paranitroanilide. Il peut également s'agir de thioesters.

Lorsque le peptide est couplé à un composé fluorogénique, la coupure est détectée par un changement de l'émission fluorescente. Dans ce cas, et en pratique le composé fluorogénique utilisé est le méthyl 4 coumarilamide 7 (MCA) ou le naphtilamide. Le naphtilamide et l'amino 7 fluorométhylcoumarylamide 3 peuvent être utilisés en tant que substrat colorogénique ou fluorogénique.

Dans un autre mode de réalisation, le peptide clivable par la calpaine 3 est couplé à ses deux extrémités par deux composés fluorogéniques, la coupure étant détectée par un changement de l'émission fluorescente d'un premier composé (molécule donneuse) dû à l'éloignement, secondairement à la coupure, d'un second composé (molécule accepteuse) situé de l'autre côté du peptide et qui absorbe la fluorescence du premier

lorsque ceux-ci sont proches. Cette technique est bien connue sous le nom de FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfer) (Förster, 1948). Plus précisément, le FRET est un phénomène physique qui peut intervenir entre deux molécules fluorescentes dans certaines conditions : les deux molécules doivent être suffisamment proches l'une de l'autre (moins de 100 Å) et le spectre d'émission d'une des molécules (la molécule donneuse) doit recouvrir le spectre d'excitation de la deuxième molécule (la molécule accepteuse). Ainsi, lorsque la molécule donneuse est excitée à sa longueur d'onde d'excitation, elle atteint un niveau d'énergie plus élevé.

En quelques picosecondes, une partie de l'énergie est dispersée dans le milieu sous différentes formes (chaleur...). Si la molécule donneuse est dans une orientation optimale et à proximité d'une molécule accepteuse, son énergie peut être transférée à cette molécule accepteuse sans intervention d'un photon ni nécessité de collision entre les deux molécules. La molécule accepteuse est alors excitée et émet de la lumière à sa propre longueur d'onde d'émission. Lorsque le peptide est clivé, l'énergie n'est plus absorbée et la molécule donneuse émet de la fluorescence. L'augmentation de la fluorescence correspond donc à une activité mesurable de clivage du peptide. La molécule rapporteuse fluorogénique peut être une molécule synthétique obtenue par synthèse chimique ou une protéine permettant l'émission d'un signal fluorescent.

Dans une première forme de réalisation, le peptide présente à chacune de ses extrémités une molécule rapporteuse fluorogénique synthétique respectivement le MCA (molécule donneuse) et le Dnp (molécule accepteuse).

Dans une seconde forme de réalisation, le donneur est l'acide 5- [ (2' aminoéthyl)- amino] naphtalène sulfonique (EDANS) et l'accepteur est l'acide 4- [ [4'- (diméthyl amino] phényl] azo] benzoïque (DABCYL).

Dans tous les cas qui précèdent, le peptide de l'invention couplé à la molécule colorogénique ou fluorogénique est obtenu par synthèse chimique.

Comme déjà dit, la molécule rapporteuse peut être également une protéine permettant l'émission d'un signal de fluorescence. Dès lors et dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités une GFP mutée.

La GFP ( « Green Fluorescent Protein ») est une protéine de 27 kDa qui est synthétisée par une méduse du Pacifique (Aeqora Victoria) et qui émet une fluorescence verte lorsque l'animal est soumis à un stress [Prasher, 1992]. Cette protéine a pu être purifiée et son gène identifié. La séquence codant pour la GFP peut être clonée en phase avec des séquences codant pour des protéines très diverses. La GFP garde ses propriétés de fluorescence lorsqu'elle est liée à d'autres protéines, ce qui permet une étude aisée de nombreux phénomènes dus aux protéines auxquelles la GFP est liée, comme par exemple l'étude de la migration cellulaire ou de la migration d'une protéine à l'intérieur des différents compartiments cellulaires. Certaines mutations de la GFP au niveau des acides aminés formant le fluorophore ou interagissant avec ce fluorophore ont permis d'identifier des mutants ayant des caractéristiques de fluorescence propres [Ellenberg, 1999 ; Pollock, 1999]. En particulier, les protéines CFP, pour Cyan Fluorescent Protein (excitation 440 nm ; émission 480 nm) et YFP, pour Yellow Fluorescent Protein (excitation 514 nm ; émission 530 nm) ont été isolées. Ces deux protéines peuvent être en théorie reliées par un phénomène de FRET. Effectivement, il existe un recouvrement entre le spectre d'émission de CFP (la molécule donneuse) et le spectre d'excitation de YFP (la molécule accepteuse).

Lorsque ces deux protéines sont assez proches l'une de l'autre et lorsque CFP est excitée à sa longueur d'onde d'excitation, CFP peut transférer son énergie d'activation à YFP qui peut ensuite émettre une lumière à 535 nm. Les séquences correspondant aux sites d'autolyse de la calpaine 3 précédemment mentionnées seront donc clonées entre les séquences CFP et YFP. Ce système sera utilisé pour détecter la calpaine 3 en produisant en cellules vivantes des protéines chimères au sein desquelles CFP sera reliée à YFP par un peptide clivable par la calpaine 3.

L'invention a également pour objet une séquence d'ADN codant pour un peptide couplé à au moins une protéine fluorescente, ledit peptide contenant au moins une

séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3. Dans une forme de réalisation préférée, la séquence d'ADN code pour les peptides suivants : <BR> <BR> <BR> <BR> CFP-site l-YFP ;<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> CFP-site 2-YFP ; CFP-site 3-YFP L'invention concerne également un vecteur contenant ladite séquence d'ADN et un promoteur permettant d'induire l'expression de la séquence d'ADN dans une cellule hôte. Un tel vecteur est par exemple le plasmide pTOM développé par le Demandeur, directement dérivé du plasmide décrit dans [Vanderklish 2000]. Elle se rapporte également à une cellule hôte transformée par ledit vecteur.

L'invention concerne également une méthode de détection in vitro de l'activité de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3 dans un échantillon biologique selon lequel : dans une première étape, on met en contact ledit échantillon biologique avec le peptide précédemment décrit, dans une seconde étape, on détecte la présence ou l'absence de clivage dudit peptide par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3 par mesure de l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorimétrique.

La première étape peut revêtir différentes formes selon que la détection est effectuée sur un échantillon biologique constitué de soit cellules vivantes, soit d'un extrait cellulaire, les cellules étant d'origine animale ou humaine, soit d'un tissu.

Lorsque l'échantillon est constitué de cellules vivantes, le contact avec le peptide peut se faire de deux manières. Dans un premier mode de réalisation, le peptide est mis directement au contact de la cellule de sorte qu'il doit présenter des propriétés de perméabilité suffisante pour pénétrer dans la cellule. La perméabilité du peptide sera déterminée en fonction de la nature de la molécule rapporteuse. Dans un second mode de réalisation, l'échantillon biologique correspond à des cellules hôtes transfectées par

un vecteur codant pour la séquence d'ADN correspondant au peptide de l'invention, les molécules rapporteuses correspondant alors à des protéines permettant l'émission d'un signal fluorescent.

Lorsque l'échantillon se présente sous forme d'un extrait cellulaire, le peptide est simplement mis au contact dudit extrait.

La détection de l'activité peut aussi se faire, comme déjà dit, directement sur coupes de tissus. En pratique l'échantillon biologique (organe, partie d'organe par exemple biopsies musculaires) est alors prélevé puis congelé rapidement dans de l'isopentane refroidi à l'azote liquide. Il est conservé à-80°C jusqu'à utilisation. Des coupes de 5 àl5 gm sont réalisées à l'aide d'un cryostat et déposées sur une lame de verre. Les coupes sont conservées aussi à-80°C si elles ne sont pas utilisées immédiatement. La détection de l'activité de la calpaine peut être réalisée en déposant directement le peptide sur la lame.

Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET. Ainsi, si la calpaine n'est pas active dans les cellules, un phénomène de FRET se produit. En revanche, si la calpaine est active, elle clive le peptide et le phénomène de FRET est alors diminué.

La méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3 trouve une application avantageuse pour le diagnostic in vitro de la LGMD2A. En conséquence, l'invention concerne également l'utilisation de la méthode de détection ci-avant décrite pour le diagnostic in vitro de LGMD2A.

L'invention concerne également une méthode de criblage de substances inhibitrices ou activatrices de la calpaine 3 ou d'une isofonne de la calpaine 3. Ladite méthode peut revêtir deux modes de réalisation différents.

Selon un premier mode de réalisation, la méthode consiste : - à préparer un échantillon biologique traité avec ladite substance, - puis à mettre en contact ledit échantillon ainsi traité avec le peptide de l'invention, - et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3.

L'échantillon biologique peut se présenter sous forme de cellules, d'extraits cellulaires ou encore de tissus. La préparation de l'échantillon biologique contenant le peptide est ensuite effectuée par mélange de l'échantillon traité (cellule, extrait cellulaire ou tissulaire) avec le peptide. En pratique, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.

Selon un second mode de réalisation, la méthode consiste : - à préparer un échantillon biologique contenant le peptide de l'invention, - puis à mettre en contact ledit échantillon avec la substance à identifier, - et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3.

Dans ce cas, l'échantillon biologique est constitué de cellules ou de lignées cellulaires transfectées avec un vecteur comprenant la séquence d'ADN codant pour le peptide de l'invention, dans l'hypothèse où la molécule rapporteuse est d'origine protéique.

Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse et la méthode consiste à : a/préparer un échantillon biologique contenant ledit peptide, b/mesurer le taux de FRET en l'absence de la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3,

c/mettre en contact l'échantillon biologique contenant le peptide avec la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, d/mesurer le taux de FRET en présence de la substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, e/conclure à la présence : d'une substance activatrice si le taux de FRET mesuré en b/est supérieur au taux de FRET mesuré en d/ d'une substance inhibitrice si le taux de FRET mesuré en b/est égal au taux de FRET mesuré en d/ L'invention a également pour objet une méthode d'analyse de l'efficacité du transfert de gène de la calpaine 3 consistant : - tout d'abord à transfecter des cellules animales ou humaines avec un plasmide codant pour la calpaine 3, - puis à mettre les cellules transfectées au contact du peptide de l'invention soit in vitro, soit in vivo, - puis à mesurer l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorométrique.

Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET.

Le gène de la calpaine 3 est parfaitement identifié et les techniques de transfection précisément décrites dans le document EP 717110 de sorte qu'ils ne seront pas d'avantage détaillés.

L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants à l'appui des figures annexées.

Figure 1 : Séquence partielle de la calpaïne 3 ; la position des sites d'autolyse est indiquée par les flèches ; les séquences utilisées dans les peptides sont soulignées et sont identiques chez toutes les espèces pour lesquelles la séquence de la calpaïne 3 est connue à ce jour (homme, souris, singe, rat, boeuf).

Figure 2 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides correspondant au site d'autolyse 1,2 et 3 de la calpaïne 3 (courbes A, B et C, respectivement) par les calpaines 1 (colonne de gauche) et 2 (colonne de droite) recombinantes Figure 3 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de cellules C2C12 transfectées ou non avec un plasmide codant pour la calpaïne 3.

Figure 4 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myoblastes de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-).

Figure 5 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage du peptide correspondant au site 3 d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myotubes de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-) Figure 6 : Mesure pendant 6 heures de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myoblastes de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-) Figure 7 : Mesure pendant 6 heures de l'activité de clivage des peptides correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de quadriceps de souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-) Figure 8 : portion de séquence du plasmide pTOM. Les acides aminés en italique font partie de la séquence de EYFP. Les acides aminés en gras font partie de celle de ECFP. Le codon STOP de EYFP a été éliminé dans le vecteur pTOM. Les bases en italique et en gras montrent les phases des séquences de EYFP et ECFP, respectivement. Les bases en soulignées correspondent au fragment qui a été éliminé pour construire le vecteur pTOMp. Les séquences protéiques A et B correspondent à la traduction du vecteur pTOM à partir de l'ATG de la séquence codante de EYFP, respectivement avant et après élimination du fragment double-brin situé entre les sites

de restriction Ec1136II et SmaI. Dans la séquence A, les séquences codant pour EYFP et ECFP ne sont pas en phase. Elles le sont dans la séquence B.

Figure 9 : A : Migration sur gel d'agarose des produits de PCR sur colonies repiquées après transformation avec pTOMp. Les PCR ont été effectuées avec les oligonucléotides midEYFP. a et midECFP. m. B : Migration de ces produits de PCR après digestion par EcoRI ; Puits n°l : échelle lkb ; n°2 : pTOM ; n°3 : pTOM après digestion par EcoRI ; n°4 à n°9 : migration des produits de PCR du gel A après digestion par EcoRI ; leur taille est toujours de 800pb.

Figure 10 : site de clonage sur le vecteur pTOM (lOa) et séquence des oligonucléotides codant pour les sites d'autolyse de la calpaïne 3 (lOb, 10c, 10d).

Chaque couple d'oligonucléotides complémentaires est composé d'un oligonucléotide dont le nom se termine par «. a » et d'un oligonucléotide dont le nom se termine par «. m ».

Figure 11 : Migration sur gel d'agarose de produits de PCR sur colonies repiquées après transformation avec pTOM et l'insert codant pour le site 2 d'autolyse ; la PCR a été réalisée avec les oligonucléotides SGp94S2. a et midECFP. m.

Figure 12 : carte de restriction du plasmide pTOM Figure 13 : carte de restriction du plasmide pTOMsl, pTOMs2, TOMs3 I/TEST D'ACTIVITÉ DE LA CALPAÏNE 3 À PARTIR D'EXTRAITS PROTÉIQUES : Le clivage de peptides synthétiques correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 (Figure 1) permet la détection de son activité à l'aide d'une technique faisant intervenir le FRET.

A/Matériel et méthode 1/Fluorimètre : SpectraMax Gemini XS Microplate fluorometer (Molecular Devices).

2/Séquence des peptides fluorescents : Mca-NMTYGTS-Dnp (site 1) Mca-NMDNSLL-Dnp (site 2) Mca-PVQYETR-Dnp (site 3)

3/Références des enzymes commerciales et des inhibiteurs utilisés : calpaïne 1 : Human erylitrocytes (Calbiochem) calpaïne 2 : Rat, recombinant, E. coli (Calbiochem) caspase 3 : Human, recombinant, E. coli (Calbiochem) 4/Conditions de réaction : Volume final de 200ut ; calcium (CaCl2) 10mM final ; peptides fluorescents 1, 9uM final.

5/Détection de la fluorescence : La réaction se fait à 37°C, soit sur une heure (avec dans ce cas une mesure de fluorescence toutes les 50 secondes) ou sur 6 heures (mesure toutes les 2 minutes).

Le milieu est agité entre chaque mesure. Les longueurs d'onde utilisées pour la détection de la fluorescence des peptides sont : Longueur d'onde d'excitation de Mca : 325inn.

- Longueur d'onde d'émission de Dnp : 392nm.

6/Mise au point des tampons Dans un premier temps, les conditions de réaction ont été mises au point, et en particulier la composition du tampon de réaction. Effectivement, la détection de la fluorescence s'est révélée y être très sensible. Les premiers tests ont consisté à faire varier les différents composants du tampon et leur concentration. Différentes concentrations en NaCI ont été testées. L'importance d'une faible concentration en DMSO, dans lequel sont resuspendus les peptides, a été démontrée. Il a également été montré que la présence du CHAPS dans le milieu de réaction, ainsi que de la BSA permettait une détection optimale de la fluorescence. Pour être certain d'activer la calpaïne 3, les réactions se font à 37°C, en présence de lOmM de calcium.

Effectivement, la calpaine 3 est active lorsqu'elle est en présence de concentrations en calcium de l'ordre du nanomolaire.

Composition des tampons : Tampon de resuspension des calpaines commerciales : NaCI 100mM, EDTA 5mM, TrisHCl 50mM, Bmercaptoéthanol 5mM, glycérol 40%, pH=7,8. Conservation à température ambiante.

Tampon de resuspension des peptides fluorescents : Les peptides sont resuspendus à lmg/ml dans du DMSO 100%. Conservation à 4°C, à l'abri de la lumière.

Tampon de réaction : NaCl 100mM, HEPES 50mM, DTT 10nM, EDTA lmM, glycérol 10%, CHAPS 0,1%, BSA 100ng/gl, pH=7, 4, filtration. Conservation à température ambiante.

7/Culture des cellules eucaryotes : Lignées cellulaires utilisées : C2C12 : Myoblastes murins ; Milieux utilisés : DMEM : Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Gibco BRL) MEM : Solution d'acides aminés non essentiels (Gibco BRL) SVF : Sérum de veau foetal (Gibco BRL) Milieu utilisé pour C2C12 : DMEM + 10% SVF Activation des calpaines : Du chlorure de calcium à 6mM final et de la ionomycine (Calbiochem) à 0, 5uM final sont ajoutés dans le milieu de culture.

8/Protocole de transfections des vecteurs d'expression dans des cellules eucaryotes : Matériel : L'ADN des différents plasmides est préparé selon le protocole QIAGEN Endofree (ref. 12362) Plasmides utilisés : pECFP-Nl (Clontech) ; pEYFP-C1 (Clontech).

Méthodes : 1 j our : Faire une trypsination des cellules souhaitées puis ensemencer les puits de façon à ce que les cellules soient à 50-80% de confluence le lendemain.

2ème jour : Dans un premier tube stérile en polystyrène (T1), déposer 94 ul de milieu sans sérum de veau foetal.

Ajouter à chaque tube T1 6 ul de tampon FUGENE 6 (Boeringher Mannheim) Incuber 5 min. à température ambiante.

Dans un second tube stérile en polystyrène (T2), déposer dans le fond du tube 1 à 2 ug de plasmide EndoFree.

Une fois les 5 min d'incubation passées, mettre goutte à goutte le tampon FUGENE 6 (Tl) +milieu dans le tube T2 contenant le vecteur.

Incuber 30 min à température ambiante sans aucune agitation.

Changer le milieu des puits.

Après les 30 min, ajouter goutte à goutte le mélange de transfection dans chaque puits, en répartissant les gouttes sur toute la surface du puits.

Laisser pousser à 37°C/7% C02.

Remarque : Pour chaque transfection, un puits n'ayant pas été en contact avec le FUGENE 6 est à prévoir (témoin cellulaire), ainsi qu'un puits dans lequel les cellules auront été en contact avec le FUGENE 6 uniquement (témoin de toxicité du FUGENE 6).

9/Protocole de lyse cellulaire : Principe : Les cellules animales, transfectées ou non, sont lysées dans le but de préparer des extraits protéiques les propriétés pourront être étudiées.

Méthode : Éliminer le milieu de culture des puits et laver les puits au PBS (Solution de Dulbecco tamponnée au phosphate (sans calcium, ni magnésium, ni bicarbonate de sodium)- Gibco BRL) Récolter les cellules et les centrifuger à 500g pendant 10 min à 4°C.

Éliminer le surnageant et reprendre les cellules dans le tampon de lyse (50mM HEPES, 1mM DTT, 0, ImM EDTA, 0,1% CHAPS, pH=7,4) à raison de 700ul de tampon de lyse par puits.

Laisser agir à 4°C pendant 5 minutes.

Centrifuger à 10000g/10 minutes/4°C.

Récupérer le surnageant et conserver à-20°C.

10-Protocole de lyse tissulaire : Principe : Les muscles sont broyés dans le but de préparer des extraits protéiques dont on pourra ensuite étudier les propriétés.

Matériel : Quadriceps de souris normales et de souris déficientes en calpaïne 3.

Méthode : Broyer les muscles dans l'azote liquide.

Resuspendre dans le tampon de lyse (cf. composition dans le protocole de lyse cellulaire plus haut) à raison de 19gl de tampon de lyse par milligramme de tissu broyé.

Laisser agir pendant 10 minutes dans la glace.

Centrifuger à 10000g pendant 10 minutes à 4°C.

Récupérer le surnageant et conserver à-20°C B/Test de la spécificité du clivage des peptides"sites d'autolyse"par la calpaïne 3 Avant de vérifier si la calpaïne 3 peut cliver les peptides correspondant à ses sites d'autolyse, un premier test a consisté à vérifier que ces peptides (site 1, site 2, site 3) ne pouvaient pas être clivés par d'autres protéases, en particulier par les calpaïnes ubiquitaires (voir figure 2). Les calpaines 1 et 2 n'ont pas d'activité de clivage sur chacun des sites d'autolyse puisque les courbes contrôles"peptide sans enzyme"se superposent aux courbes"peptide + enzyme"Des résultats analogues ont été obtenus avec une autre protéase, la caspase 3.

On sait que la calpaïne 3 a une stabilité plus importante dans les cellules musculaires en raison de la présence de la titine. Dans le but de prouver que la calpaïne 3 pouvait cliver ses propres sites d'autolyse, on la surexprime donc dans des cellules C2C12 en transfectant ces cellules avec un plasmide codant pour la calpaïne 3. Une transfection témoin avec pECFP a été réalisée en même temps que la transfection avec le plasmide codant pour la calpaïne 3. L'efficacité de transfection sur les C2C12 est inférieure à 10%. Les protéines sont ensuite extraites et leur activité est testée sur les sites d'autolyse (Figure 3).

Les courbes représentant l'activité d'extraits de C2C12 transfectées ou non transfectées sur les sites 1 et 2 montrent une légère augmentation de fluorescence, ce qui pourrait vouloir dire que la calpaïne 3 peut cliver ces sites. La calpaïne 3 est une protéine exprimée dans le muscle donc l'activité basale observée pour les extraits de cellules non transfectées est normale. Cependant, aucune différence ne peut être détectée entre cellules transfectées ou non transfectées pour les sites 1 et 2. En revanche, sur le site 3, l'activité de clivage est plus importante chez les cellules transfectées. La différence est minime mais elle est cohérente avec le faible pourcentage de cellules transfectées.

On teste ensuite le système sur des extraits de cultures cellulaires déficientes ou non en calpaïne 3. Pour ce faire, on part de souris déficientes pour le gène de la calpaïne 3 pour lesquelles des cultures de cellules myogéniques ont été dérivées [Richard, 2000].

Des extraits de cultures de cellules musculaires déficientes en calpaine 3 (cellules-/-) peuvent donc être comparées à des extraits de cultures de cellules musculaires normales (cellules +/+). Dans un premier temps, le test a été effectué sur des cellules non différenciées (myoblastes) (Figure 4).

Ces expériences ont permis de montrer qu'une faible activité de clivage pouvait être détectée sur le site 1. La différence d'activité entre les cellules +/+ et-/-est cependant très faible. Aucune activité de clivage n'a pu être détectée sur le site 2. Une activité de clivage est détectée sur le site 3 mais aucune différence d'activité n'est visible entre cellules +/+ et cellules-/-.

Pour essayer de mettre en évidence une différence d'activité plus importante entre des extraits +/+ et des extraits-/-, les mêmes tests ont été réalisés sur des extraits de cellules musculaires différenciées en myotubes (Figure 5). La calpaïne 3 est en effet théoriquement plus exprimée dans les myotubes que dans les myoblastes.

Cette expérience permet de montrer que l'activité de clivage du site 3 dans les extraits de cellules-/-est plus important que dans les extraits de cellules +/+, ce qui est étonnant puisque la déficience en calpaïne 3 est la seule différence entre les cellules +/+ et les cellules-/-. Une diminution d'activité dans les cellules déficientes en calpaïne 3 serait donc plus vraisemblable.

Pour essayer de mettre en évidence une plus forte différence d'activité entre extraits de cellules +/+ et de cellules-/-, la même réaction a été réalisée sur 6h au lieu de lh (Figure 6) L'activité de clivage sur les sites 1 et 2 est plus importante dans des extraits de cellules +/+ que dans des extraits de cellules-/-. L'augmentation d'activité sur le site 3 est ici confirmée lorsque la réaction se fait sur 6h. L'activité est plus importante dans des extraits de cellules-/-que dans des extraits de cellules +/+. Ces expériences permettent de montrer que, lorsque le test se fait sur six heures, l'activité de clivage sur les 3 sites permet de différencier les types cellulaires +/+ et-/-.

Des tests d'activité ont également été réalisés sur des lysats de muscles de souris déficientes ou non en calpaïne 3. Les tests ont été faits à partir de lysats de quadriceps (Figure 7).

L'activité de clivage des sites 1 et 2 par les extraits de tissus +/+ est plus importante que celle des extraits de tissus-/-. L'activité de clivage du site 3 par les extraits de tissus-/-est plus importante que celle des extraits de tissus +/+. Ces expériences ont permis de montrer que les résultats obtenus à partir d'extraits tissulaires sont similaires à ceux obtenus à partir d'extraits cellulaires. En particulier, une plus forte activité sur le site 3 par des extraits où la calpaïne 3 n'est pas présente est confirmée.

Cette activité serait donc vraisemblablement due à une autre protéase dont l'activité est activée en absence de calpaïne 3.

II/TEST D'ACTIVITE DE LA CALPAINE 3 EN CELLULES Matériel et méthode Clonage d'oligonucléotides dans le vecteur d'expression pTOM Principe : Deux oligonucléotides complémentaires sont mis en présence de manière à former des séquences double-brin correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3.

Les oligonucléotides sont choisis de telle façon que leur appariement forme à chaque extrémité des sites de restriction. Ces fragments sont clonés dans le vecteur d'expression pTOM digéré au préalable par des enzymes de restriction.

Matériel : Oligonucléotides : site 1, site 2, site 3 Enzymes de restriction : Ba7nHl, BspEl, SmaI (BioLabs) ; Ec1136II (Fermentas).

Souches bactériennes utilisées : SCS110 : bactéries dam-StrR (Stratagene) ; XLl-Blue (Stratagene).

Vecteur plasmidique : pTOM (Généthon) (figure 12).

Méthodes : Hybridation des deux oligonucléotides complémentaires : Les oligonucléotides simple-brin complémentaires sont mis en présence l'un de l'autre à raison d'une concentration de 20ng/l final chacun dans le tampon SYBR Green PCR Buffer (Applied Biosystems). L'hybridation se fait dans l'appareil ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) selon les conditions suivantes : 95°C/lmin-> 90°C/30sec <BR> <BR> <BR> <BR> -> 85°C/30sec-> 80°C/30sec-> 75°C/30sec-> 70°C/30sec-> 65°C/30sec-> 60°C/30sec-> 55°C/30sec. L'évolution de l'appariement est suivie au cours du temps grâce au logiciel Sequence Detector 1.6. 3.

Digestion du vecteur pTOM : Le vecteur pTOM est digéré par les deux enzymes BamHlet BspEl à 37°C pendant 2h pour chaque enzyme.

Ligation des oligonucléotides dans pTOM : Dans le mélange de ligation, le rapport entre la quantité d'insert et la quantité de vecteur est de 3 (en moles). La réaction de ligation se fait en présence de la T4 DNA ligase (BioLabs) sur la nuit à 16°C.

Protocole de préparation des bactéries électrocompétentes : Ensemencer 15ml de LB+agent de sélection avec 10gl de bactéries conservées à- 80°C dans 20% de glycérol. Incuber 8 heures à 37°C sous agitation (300tpm environ) Ensemencer avec 2ml de préculture 200ml de LB+agent de sélection éventuel. Laisser pousser jusqu'à DO (600nm) =0,5.

Tout le matériel à utiliser doit avoir été refroidi à 4°C au préalable.

Laisser reposer la culture dans la glace pendant 15 minutes puis la répartir à raison de 25ml par tube (8 tubes) Centrifuger à 4000tpm pendant 20 minutes à 4°C.

Éliminer les surnageants et reprendre doucement les culots dans 200 ml d'eau glacée (25ml par tube-8 tubes), centrifuger comme précédemment.

Éliminer les surnageants et reprendre les culots dans 100 ml d'eau glacée (en regroupant les tubes 2 à 2 ; 4 tubes), centrifuger comme précédemment.

Éliminer les surnageants avec précaution et reprendre chaque culot dans 5 ml de glycérol 10% (autoclavé et conservé à-20°C) et regrouper les 4 volumes dans un seul tube ; centrifuger comme précédemment.

Éliminer les surnageants, reprendre le culot dans 400 Ill de glycérol 10%, Aliquoter par 40 ul en eppendorf, congeler à-80°C.

Contrôle des bactéries compétentes : Les transformer avec un plasmide témoin selon le protocole décrit ci-après. Le titre doit être supérieur à 108 colonies par microgramme de vecteur transformé.

Plotocc) transformation Ajouter 1 ul d'ADN ligué (#0, 1 ng) à 401l1 de bactéries électrocompétentes, laisser en contact pendant 4 min. dans la glace.

Déposer dans la cuve d'électroporation (Biorad gene pulser cuvette ; 0,2 cm) Conditions d'électroporation : 2500 V, 200 ohm, 25 µF.

Mettre 1 ml de SOC immédiatement et laisser reposer de 30 minutes à une heure à 37°C pour permettre l'expression du gène de résistance à l'antibiotique.

Étaler zu et 200µl sur des boîtes de Pétri LB + kanamycin 10pg/ml final Laisser pousser sur la nuit à 37°C.

Analyse des colonies' Les colonies sont comptées et repiquées dans une plaque 96 puits dans 100gel LB + kanamycine à 10g/ml final. Pour vérifier la présence du plasmide dans les colonies. une PCR est effectuée sur ces colonies avec soit le couple midEYFP. a et ... et l'oligonucléotide reverse midECFP. m.

Les produits de PCR sont déposés sur gel d'agarose 0,8% + Bromure d'éthidium 0, 5gg/ml final. Pour vérifier la présence d'un insert dans les plasmides, un certain nombre de produits de PCR de clones positifs sont séquencés avec l'oligonucléotide midECFP. m.

2-Culture des cellules eucaryotes : Lignées cellulaires utilisées : C2C12 : Myoblastes murins Milieux utilisés : DMEM : Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Gibco BRL) MEM : Solution d'acides aminés non essentiels (Gibco BRL) SVF : Sérum de veau foetal (Gibco BRL) Milieu utilisé pour la lignée 911 : DMEM + 10% SVF + 1% MEM Milieu utilisé pour les lignées Cos7 et C2C12 : DMEM + 10% SVF Activation des calpaines : Du chlorure de calcium à 6mM final et de la ionomycine (Calbiochem) à 0, 5uM final sont ajoutés dans le milieu de culture.

3-Protocole de transfections des vecteurs d'expression dans des cellules eucaryotes : Matériel : L'ADN des différents plasmides est préparé selon le protocole QIAGEN Endofree (ref. 12362) Plasmides utilisés : pECFP-N1 (Clontech) ; pEYFP-C1 (Clontech).

Méthodes : 1 j our : Faire une trypsination des cellules souhaitées puis ensemencer les puits de façon à ce que les cellules soient à 50-0% de confluence le lendemain.

2ème jour: Dans un premier tube stérile en polystyrène (T1), déposer 94 Ill de milieu sans sérum de veau foetal.

Ajouter à chaque tube T1 6 il de tampon FUGENE 6 (Boeringher Mannheim) Incuber 5 min. à température ambiante.

Dans un second tube stérile en polystyrène (T2), déposer dans le fond du tube 1 à 2 zig de plasmide EndoFree.

Une fois les 5 min d'incubation passées, mettre goutte à goutte le tampon FUGENE 6 (Tl) +milieu dans le tube T2 contenant le vecteur.

Incuber 30 min à température ambiante sans aucune agitation.

Changer le milieu des puits.

Après les 30 min, ajouter goutte à goutte le mélange de transfection dans chaque puits, en répartissant les gouttes sur toute la surface du puits.

Laisser pousser à 37°C/7% CO2.

Remarque : Pour chaque transfection, un puits n'ayant pas été en contact avec le FUGENE 6 est à prévoir (témoin cellulaire), ainsi qu'un puits dans lequel les cellules auront été en contact avec le FUGENE 6 uniquement (témoin de toxicité du FUGENE 6).

B/Résultats Pour détecter l'activité protéolytique de la calpaïne 3 en cellules vivantes, on étudie le clivage de ses trois sites d'autolyse3 par phénomène de FRET.

Dans le but d'avoir un témoin « FRET positif », c'est-à-dire un plasmide codant pour une protéine chimère ECFP-EYFP ne pouvant pas être clivée par les calpaïnes et au sein de laquelle peut se produire un phénomène de FRET, on a dans un premier temps modifié le vecteur pTOM de façon à ce que les séquences codantes pour les deux protéines fluorescentes Enhanced-CFP (ECFP) et EWanced-YFP (EYFP) qui se trouvent sur ce vecteur soient en phase. On a ensuite inséré entre ces séquences des fragments d'ADN codant pour les trois sites d'autolyse de la calpaïne 3. Nous avons ensuite vérifié que la protéine chimère produite pouvait réellement être clivée in vitro par les calpaines ubiquitaires. Enfin, ce clivage a été étudié en cellules par l'analyse d'images de fluorescence. Trois méthodes distinctes ont été utilisées pour cette analyse et, en particulier, pour celle du FRET.

1-Clonage d'un vecteur témoin et des vecteurs portant les fragments d'ADN codant pour les sites de clivage : Construction d'un vecteur codant pour deux protéines fluorescentes en phase : La stratégie de construction du vecteur portant les deux séquences codant pour ECFP et EYFP en phase (appelé pTOMp) a consisté à digérer le plasmide pTOM par deux enzymes de restriction aux sites uniques sur pTOM et générant des extrémités à bouts francs, Ec1136II et SmaI (Figure 8). Le vecteur linéarisé a été purifié et une réaction de ligation du vecteur sur lui-même a été réalisée. Après transformation et repiquage de colonies positives, une réaction de PCR a permis de confirmer la présence du plasmide dans ces colonies (Figure 9). Environ un tiers des colonies repiquées ont pu ainsi être amplifiées et devaient donc contenir le vecteur pTOMp. La digestion de ces produits de PCR par EcoRI, dont le site de restriction a disparu avec l'élimination du fragment Ecll 36II-SmaI, a permis de confirmer que les colonies repiquées contenaient bien le plasmide pTOMp et non le plasmide d'origine. Le séquençage des produits de PCR a permis de vérifier que les deux séquences étaient bien en phase l'une avec l'autre.

2-Clonage d'oligonucléotides codant pour des sites de clivage par la calpaïne 3 dans le vecteur d'expression pTOM : Pour faciliter le phénomène de FRET entre les deux protéines EYFP et ECFP, des acides aminés glycine et sérine ont été ajoutés de part et d'autre du site de clivage de façon à faciliter le rapprochement des deux protéines, les glycines facilitant la souplesse de la protéine chimère et les sérines augmentant sa solublité dans un milieu aqueux (Figure 10). La séquence des oligonucléotides est telle qu'ils forment des sites de restriction pour BspEl et BamHI à chaque extrémité lorsqu'ils sont appariés.

Les bases marquées en gras souligné dans les séquences des oligonucléotides sont des bases qui ne modifient pas la séquence protéique mais qui sont différentes de la séquence génomique. Ces bases ont été modifiées de façon à limiter la formation de duplex de primers homologues, qui pourrait entraver la formation d'oligonucléotides double-brin. La modification des bases a également été faite en fonction de la fréquence d'utilisation des codons chez la souris.

Les sites de restriction utilisés pour le clonage sont des sites uniques. L'enzyme BspEl est inactive si le site de clonage est méthylé. Le clonage du vecteur pTOM destiné à recevoir les oligonucléotides double-brin a donc été fait dans des bactéries dont le gène codant pour la méthylase Dam est muté. Après digestion du vecteur par les enzymes Repel et BamHI, ligation des oligonucléotides et électroporation, certaines colonies résistantes sont prélevées. La présence du plasmide est vérifiée par PCR avec midECFP. m et un oligonucléotide spécifique du site de restriction (figure 11).

Le séquençage sur certains clones positifs obtenus en PCR a permis de vérifier la présence des inserts dans pTOM, que ces inserts étaient bien en phase avec les séquences codant pour les protéines ECFP et EYFP et qu'il ne comportaient pas de mutations. Trois colonies contenant les trois plasmides clonés sont conservées. Les trois plasmides correspondent aux trois fragments d'ADN insérés : les trois sites de clivage de la calpaïne 3 (plasmides pTOMsl, pTOMs2 et pTOMs3) (figurel3).

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