DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention concerne un procédé de détection d'un acide nucléique, ADN ou ARN, par séparation et enrichissement d'acides nucléiques en utilisant un flux électro-hydrodynamique bidirectionnel dans un milieu liquide non-Ne wtonien. ETAT DE LA TECHNIQUE

La détection de séquences d'acides nucléiques est fondamentale dans une large gamme d'applications biologiques telles que le diagnostic in vitro, le diagnostic clinique, la recherche... En particulier, la démonstration de la présence d'une séquence d'acide nucléique spécifique dans un échantillon physiologique constitue la première ligne de développement des méthodes de diagnostic.

On connaît dans l'art antérieur différents procédés et dispositifs permettant de détecter des acides nucléiques, ces techniques s'appuyant sur la détection d'une molécule hybride constituée de la molécule d'acide nucléique cible et d'une sonde marquée spécifique.

On citera par exemple la reconnaissance d'ADN par balise moléculaire, méthode classique et validée qui permet de détecter des mutations ponctuelles sur un fragment de 15 - 20 bases. Toutefois, cette technique est peu sensible, car la balise n'est jamais parfaitement éteinte en l'absence de cible si bien que le bruit de fond peut facilement parasiter un signal dès lors que la proportion cible/balise n'est pas correctement ajustée. En effet, un des aspects crucial dans toute méthode de détection d'acide nucléique est la sensibilité. Les méthodes les plus utilisées pour la détection des acides nucléiques sont basées sur la réaction en chaîne polymérase (PCR). La PCR en temps réel, par exemple, est utilisée pour amplifier et quantifier simultanément une molécule d'ADN ciblée. La PCR peut également être appliquée à l'amplification de l'ARN, un processus appelé PCR de transcriptase inverse (RT-PCR). La RT-PCR est similaire à la PCR régulière, avec l'addition d'une étape initiale dans laquelle l'ADN est synthétisé à partir de la cible d'ARN en utilisant une enzyme appelée transcriptase inverse. Une grande variété de molécules d'ARN ont été utilisées dans la RT-PCR, y compris l'ARN ribosomique, l'ARN messager et l'ARN viral génomique.

L'amplification de la séquence cible dans ces techniques basées sur la PCR prend du temps, augmente la probabilité d'erreurs et est très susceptible de contamination. II existe donc un besoin de mettre au point une méthode de détection d'acides nucléiques à haute sensibilité, simple et rapide à mettre en œuvre.

RESUME DE L'INVENTION Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de détection d'un acide nucléique dans un échantillon par séparation et enrichissement d'acides nucléiques en utilisant un flux électro-hydrodynamique bidirectionnel dans un milieu liquide non-Newtonien, le procédé comprenant en outre l'introduction de sondes destinées à s'hybrider à un acide nucléique cible de manière à introduire une modification du poids moléculaire de l'acide nucléique cible lors de l'hybridation avec les sondes afin de permettre la séparation des complexes acide nucléique/sondes, de l'acide nucléique seul ou des sondes seules, lorsque l'échantillon est soumis à un actionnement hydrodynamique et électrique pour permettre la détection de l'acide nucléique cible. La technologie de séparation et d'enrichissement d'acides nucléiques utilisant un flux électro-hydrodynamique bidirectionnel dans un milieu liquide non-Newtonien est décrite notamment dans l'article de Ranchon et al. : « DNA séparation and enrichment using electro-hydrodynamic bidirectional flows in viscoelastic liquids ».

Les auteurs ont en effet démontré que les opérations de séparation et d'enrichissement d'acides nucléiques peuvent être menées en utilisant simultanément des modulations spatiales des champs électrique et d'écoulement via une constriction dans un canal micro-fluidique ou un capillaire.

La technologie implique l'application d'un champ électrique et d'un flux hydrodynamique dans un milieu liquide non-newtonien contenu dans un canal. Ces forces augmentent le poids moléculaire des acides nucléiques et ainsi induisent une réduction progressive de la vitesse de migration des acides nucléiques, entraînant une séparation en fonction de la taille dans un canal. Le canal comprend une constriction ou entonnoir, permettant de moduler spatialement les champs hydrostatique et électrique de manière à stopper le déplacement des acides nucléiques à un endroit prédéterminé et à concentrer les acides nucléiques à cette position déterminée où elles s'accumulent de manière dépendante de leurs poids moléculaires.

Ce procédé de concentration et de séparation par la taille est également décrit dans la demande de brevet WO 2016/016470.

Ainsi, on entend par « constriction » au sens de l'invention toute variation de section permettant de moduler spatialement les champs hydrostatique et électrique de manière à stopper et à concentrer les acides nucléiques.

Pour un capillaire, la constriction consiste en une réduction du diamètre et s'entend du rapport des rayons avant et après la zone de jonction. De telles constrictions sont décrites sur le site suivant : https://picometrics.com/piOduct/biabooster/. Pour un système micro fluidique planaire à profondeur constante, c'est le rapport des largeurs au début et à la fin de la constriction. De telles constrictions sont décrites dans l'article de Ranchon et al., ainsi que dans la demande WO2016/016470. Des exemples de constrictions sont représentés à la Figure 2 et son intégration dans un système micro fluidique est représentée à la Figure 6. Ces exemples sont détaillés ci-après.

D'autres exemples de constrictions, où la largeur et la hauteur d'une canalisation sont modulées simultanément, sont également décrits dans l'article de Lettieri et al. : « A novel microfluidic concept for bioanalysis using freely moving beads trapped in recirculating flows ».

Les profils souhaités de flux hydrodynamique (caractérisés notamment par des valeurs de débit et de vitesse moyenne données), sont obtenus en actionnant des moyens de contrôle de pression, de sorte à générer une différence de pression entre l'entrée et la sortie du canal. Conjointement, un champ électrique est généré dans le canal au moyen d'électrodes. Ce champ électrique est adapté pour appliquer une force électrostatique sur les acides nucléiques qui tend à les déplacer dans la direction opposée au flux hydrodynamique appliqué.

Le champ électrique appliqué vaut de 10 V/m à 10000 V/m, de préférence de 100 V/m à 5000 V/m, et de manière plus particulièrement préférée de 200 V/m à 1000 V/m ; et / ou, le flux hydrodynamique est caractérisé par une vitesse moyenne de 1 à 10 000 μητ/s, de préférence de 5 à 5 000 μιη/s et de manière plus particulièrement préférée de 10 à 1 000 μιη/s.

Le liquide est préférentiellement non newtonien. On entend dans la présente description par "fluide newtonien", un fluide pour lequel il existe une relation linéaire entre la contrainte mécanique imposée (force exercée sur le fluide par unité de surface) et le cisaillement du fluide (c'est-à-dire gradient de vitesse du fluide). Un " fluide non-newtonien " est donc un fluide qui n'est pas un fluide newtonien.

Par exemple, un fluide non-newtonien selon l'invention peut avoir un coefficient de viscosité dépendant du cisaillement ; ou il peut avoir un comportement élastique. Selon un mode de réalisation, le fluide est viscoélastique.

Avantageusement, et dans le procédé selon l'invention, l'hybridation de la sonde à l'acide nucléique cible introduit une modification du poids moléculaire, en augmentant le poids moléculaire de l'acide nucléique cible. Cette augmentation de poids moléculaire permet de discriminer le complexe acide nucléique cible/sonde de la sonde libre ou des acides nucléiques cibles libres soumis à un actionnement hydrodynamique et électrique. La modification du poids moléculaire de la sonde lors de l'hybridation avec la cible permet l'enrichissement sélectif du signal par rapport au bruit de fond de la solution.

En effet, le complexe acide nucléique / sonde, selon son poids moléculaire, présente une réponse dans l'écoulement tel qu'il existe un point d'arrêt où sa vitesse hydrodynamique est compensée par sa vitesse électrophorétique.

Ainsi, la sonde, lorsqu'elle n'est pas complexée n'est pas arrêtée au même niveau que le complexe acide/nucléique sonde, permettant alors de détecter l'acide nucléique d'intérêt et s'affranchir du bruit de fond. La présente invention offre donc la possibilité d'enrichir sélectivement l'acide nucléique cible et d'éliminer le bruit de fond associé à la sonde, ainsi que les autres acides nucléiques non spécifiques afin de détecter des acides nucléiques sans étapes de fixation ni de lavage. Ainsi, le procédé selon la présente invention permet d'atteindre des niveaux de sensibilité pour la détection d'acides nucléiques plus importants. DESCRIPTION DES FIGURES

D'autres avantages, buts et caractéristiques particulières de la présente invention ressortiront de la description qui va suivre, faite, dans un but explicatif et nullement limitatif, en regard des dessins annexés, dans lesquels :

Figure 1 : Représentation schématique des champs de force hydrodynamique et électrophorétique dans le canal comprenant une constriction permettant la détection d'un acide nucléique cible

Figure 2 : Représentation schématique de deux constrictions

Figure 2A : Constriction ayant une géométrie linéaire

Figure 2B : Constriction ayant une géométrie exponentielle

Figure 3 : Représentation schématique vue de dessus, de la géométrie de deux canaux comprenant chacun une constriction, l'une à géométrie linéaire, l'une à géométrie exponentielle, ces deux constriction étant en vis-à-vis Figure 4 : Représentation graphique de données de viscosités en fonction de la concentration en Poly vinyl pyrrolidone (PVP)

Figure 5: Représentation graphique de données de viscosités en fonction de la concentration en Poly vinyl pyrrolidone PVP ou en polyéthylène glycol (PEG)

Figure 6 : Représentation schématique d'une puce micro-fluidique présentant deux canaux, chaque canaux comprenant deux constrictions en vis-à-vis

Figure 7A : Séquence de l'acide nucléique cible KRAS

Figure 7B : Structure de l'acide nucléique cible KRAS Figure 8A : séquence de la balise moléculaire destinée à s'hybrider à l'acide nucléique KRAS

Figure 8B : Structure de la balise moléculaire destinée à s'hybrider à l'acide nucléique KRAS

Figure 9A : Séquence de l'acide nucléique cible miR21

Figure 9B : Structure de l'acide nucléique cible miR21

Figure 10A : séquence de la balise moléculaire destinée à s'hybrider à l'acide nucléique miR21

Figure 10B : Structure de la balise moléculaire destinée à s'hybrider à l'acide nucléique miR21

Figure 11 : Représentation de la constriction de la puce micro-fluidique 2.5D.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE

Ainsi, la présente invention a pour objet de proposer un procédé de détection d'un acide nucléique dans un échantillon, par séparation et enrichissement d'acides nucléiques en utilisant un flux électro-hydrodynamique bidirectionnel dans un milieu liquide non-Newtonien, ledit procédé comprenant :

l'introduction dans un canal dudit échantillon et d'une sonde destinée à s'hybrider à un acide nucléique pour former un complexe acide nucléique/sonde, ledit canal comprenant un axe d'écoulement et au moins une constriction;

l'application d'un flux hydrodynamique dans le canal conjointement avec l'application d'un champ électrique dans le canal permettant de déplacer les acides nucléiques dans le canal selon l'axe d'écoulement et de stopper et concentrer dans une zone en amont de ladite constriction le complexe acide nucléique/sonde afin de détecter ledit complexe. Alternativement, un mélange comprenant un échantillon et une sonde sera réalisé et introduit dans le canal.

La Figure 1 est une représentation schématique des champs de force hydrodynamique et électrophorétique dans le canal 1 comprenant une constriction 2.

L'axe principal du cylindre est l'axe d'écoulement 3 dans le canal 1.

Le complexe acide nucléique/sonde, selon son poids moléculaire présente une réponse dans l'écoulement électro-hydrodynamique telle que pour chaque vitesse d'écoulement 20, Vo, il existe une vitesse électrophorétique, 10, VE pour induire son arrêt. Autrement dit, si on applique le couple (Vo, VE) la vitesse du complexe est nulle. En effet, avec une constriction, on balaye une gamme de vitesse hydrodynamique et électrophorétique spatialement : le flux des deux grandeurs est conservé. Cette configuration permet de définir une zone 4 où la vitesse du complexe est nulle. Les acides nucléiques avancent vers la constriction en amont et reculent en aval, tel que représenté à la Figure 1. L'hybridation de la sonde à l'acide nucléique cible introduit une modification du poids moléculaire de l'acide nucléique cible et permet donc de discriminer le complexe acide nucléique cible/sonde de la sonde libre ou des acides nucléiques libres permettant sa détection.

Par « détection d'un acide nucléique », on entend ici la détermination, directe ou indirecte de la présence ou l'absence d'une séquence d'acide nucléique spécifique, y compris mais sans s'y limiter, la détection d'une séquence particulière dans une molécule d'acide nucléique ou la détection d'une différence entre les séquences de deux molécules d'acides nucléiques différentes, ou la détection d'une mutation sur un acide nucléique. On entend par « acide nucléique » au sens de la présente invention les molécules d'ADN simple ou double brin ou d'ARN.

Typiquement, la sonde est une sonde oligonucléotidique, destinée à s'hybrider de manière spécifique à l'acide nucléique à détecter.

Alternativement, la sonde peut être choisie parmi une sonde à base d'acides nucléiques synthétiques de type LNA (locked nucleic acid) ou PNA (peptid nucleic acid).

Avantageusement, ces sondes ont la propriété d'augmenter l'énergie d'hybridation et peuvent le cas échéant améliorer la sélectivité de la détection.

Typiquement, la sonde comprend une séquence ADN ou ARN monobrin, complémentaire et antiparallèle du fragment à détecter, préférentiellement marquée.

Le marquage pourra se faire avec un radioisotope ou par fluorescence. Alternativement, la sonde pourra comprendre une sonde électrochimique. De manière préférée, un fluorophore sera greffé sur la sonde oligonucléotidique.

Typiquement, le fluorophore pourra être choisi parmi le FAM 6-carboxy- fluoresceine, HEX™, JOE™, VIC®, CAL Fluor® Orange 560, Cy3, TetramethylRhodamine, Texas Red®, Cy5, séries Alexa, séries Atto.

Avantageusement, le procédé selon l'invention permet la détection d'acides nucléiques cibles grâce à des sondes linéaires marquées, inadaptées jusque alors pour une détection en solution à cause du bruit de fond. Alternativement, la sonde pourra être une balise moléculaire ou molecular beacon. On entend par balise moléculaire, une sonde formée d'un brin d'ADN en épingle à cheveu, chacune des extrémités portant un fluophore. L'un est dit reporter et l'autre quencher (extincteur).

Typiquement, le quencher ou extincteur pourra être choisi parmi les Black Hole Quencher®, tels que BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, QXL® quenchers, DDQ-I, Dabcyl, Iowa Black® (FQ ou RQ), QSY® 21 .

Typiquement, le fluorophore pourra être choisi parmi le FAM 6-carboxy- fluoresceine, HEX™, JOE™, VIC®, CAL Fluor® Orange 560, Cy3, TetramethylRhodamine, Texas Red®, Cy5, séries Alexa, séries Atto.

La séquence comprise dans la sonde oligonucléotidique sera déterminée en fonction de l'acide nucléique cible à détecter. Dans un mode de réalisation, la sonde oligonucléotidique comprend une séquence de taille comprise entre 30 et 120 bases.

Ces sondes seront utilisées lorsque la détection de l'acide nucléique doit être spécifique.

Dans un autre mode de réalisation, la sonde oligonucléotidique comprend une séquence de taille comprise entre 15 et 30 bases.

Dans ce mode de réalisation, les sondes seront utilisées pour la détection d'une mutation. Préférentiellement, la sonde oligonucléotidique aura une taille de 15 bases.

Selon un autre mode de réalisation, et pour la détection d'une mutation, le système micro fluidique, au niveau de la constriction pourra en outre être chauffé à une température comprise entre 40 et 70°C et ce afin de renforcer la détection d'une mutation. En effet, une mutation induit une diminution de la température d'hybridation T,

De la même façon, l'ADN méthylé pourra être détecté par le chauffage du système micro fluidique au niveau de la constriction.

En effet, l'ADN contenant des cytosines méthylées présentent des caractéristiques structurelles et thermodynamiques différentes (Karberg et al. « A method for quantifying DNA methylation percentage without chemical modification » ). Selon un autre mode de réalisation, la sonde comprend en outre des polymères et/ou des nanoparticules, lesdits polymères et/ou nanoparticules étant greffés sur ladite sonde.

Le greffage de chaînes de polymères ou de nanoparticules permet d'augmenter le poids moléculaire de la sonde et ce afin d'amplifier la différence de poids moléculaire du complexe cible/sonde, et d'augmenter la détection.

Typiquement, le polymère pourra être un polyéthylène glycol (PEG). Dans un mode de réalisation, les nanoparticules pourront être des nanoparticules d'or greffées à la sonde par un greffage thiol ou des nanoparticules en polymère de type poly-styrène, greffées à la sonde par une liaison biotine-streptavidine.

Alternativement, le poids moléculaire de la sonde pourra être augmenté par l'ajout d'une molécule biologique choisie parmi une protéine, un anticorps.

A titre illustratif, des anticorps spécifiques d'un ADN double brin pourraient s'ajouter après l'hybridation de manière à augmenter significativement le poids moléculaire de la sonde. Dans un autre mode de réalisation, les sondes pourront être désignées par ingénierie ADN de manière à induire une réaction en chaîne associée à la formation d'un complexe acide nucléique/sonde : le complexe induit le recrutement d'un autre ADN sonde, qui permet d'amplifier la différence de poids moléculaire avec un complexe à 3 corps.

Dans un mode de réalisation, cette ingénierie pourra utiliser la technique de l'origami d'ADN par laquelle l'interaction de la cible et de la sonde libère quelques bases libres, qui permettent de déclencher l'accrochage d'un ADNsb additionnel (effet amplificateur).

L'origami d'ADN est par exemple décrit dans l'article de Wang et al. : « The beauty and Utility of DNA Origami ». Selon un autre mode de réalisation préféré, le poids du complexe acide nucléique cible/sonde aura un poids compris entre lOkDa et 10 ⁶ kDa, préférentiellement entre 20kDa et 10 ⁴ kDa et de manière encore plus préférée, entre 50kDa et 10 ³ kDa.

Dans un autre mode de réalisation, le poids du complexe acide nucléique/sonde est supérieur ou égal à 1.5 fois le poids moléculaire de la sonde, préférentiellement supérieur ou égal à 2 fois le poids moléculaire de la sonde, et de manière encore plus préférée, supérieur ou égal à 4 fois le poids moléculaire de la sonde.

Dans un mode de réalisation, le canal comprend au moins une constriction, ladite constriction étant formée par une première section du canal d'une largeur 1 et une deuxième section du canal d'une largeur , la largeur de ladite deuxième section du canal étant strictement inférieure à la large 1 de ladite première section du canal et correspond à la largeur de la constriction. Dans un mode de réalisation, le rapport de la largeur 1 de la première section du canal sur la largeur de la deuxième section du canal est supérieur à 5, préférentiellement supérieur à 10, ou au moins supérieur à 20, ou au moins supérieur à 50 et encore plus préférentiellement supérieur à 80.

Typiquement, la largeur 1 de la première section du canal sera comprise entre 200 μιη et 5000 μιη, de manière préférée, entre 600μιη et 2000μιη.

Préférentiellement, la largeur 1 de la première section du canal sera d'environ de 800μπι. Typiquement, la largeur de la seconde section du canal sera comprise entre 2μιη et ΙΟΟμιη, préférentiellement, entre 5 et 50μιη, et de manière encore plus préférée, entre 5 et ΙΟμιη.

Les parois du canal au niveau de la constriction formeront un angle par rapport à l'axe d'écoulement compris entre 20 et 90°, préférentiellement 30 à 60°, pour un canal présentant une géométrie linéaire.

La longueur de chaque constriction peut varier entre 500 et 2000μιη. La section de l'embouchure de la constriction est comprise entre 10 et 3000 μιη2, préférentiellement, 12 et 500 μιη2, et de manière préférée, entre 2 et 100 μιη ² .

La forme de la constriction peut être linéaire ou de forme plus complexe, par exemple parabolique ou exponentielle.

Selon un mode de réalisation, la hauteur du canal de détection de la constriction est comprise entre 1 et 6μιη, préférentiellement entre 2 et 4μιη.

La Figure 2 représente de manière schématique deux canaux, chacun présentant une constriction, l'une à géométrie linéaire (Figure 2A), l'autre à géométrie exponentielle (Figure 2B). Dans la Figure 2A, le canal 1 présente la forme d'un cylindre creux de section rectangulaire. L'axe principal du cylindre est l'axe d'écoulement 3 dans le canal 1. Perpendiculairement à cet axe d'écoulement 3, une première section transversale la du canal 1 est définie par une largeur d'environ ΙΟΟΟμιη et une seconde section transversale lb du canal 1, d'une une largeur d'environ 5μιη et formant la constriction 2. La constriction présente une longueur le de 550 μιη.

Ainsi, le rapport entre la grande section et la petite section définissant la constriction du canal permet de designer un facteur de concentration d'environ 200. La Figure 2B représente une constriction ayant une géométrie exponentielle. Les éléments représentés sur la Figure 2B portant les mêmes références que ceux des Figures 1 et 2A représentent les mêmes objets, lesquels ne sont pas décrits de nouveau ci-dessous. Le canal représenté à la Figure 2B possède une première section transversale la d'une largeur d'environ 800μιη, et une seconde section transversale lb d'environ 20μιη. La longueur de la constriction le est d'environ 800μιη.

Ainsi, le rapport entre la grande section et la petite section définissant la constriction du canal permet de designer un facteur de concentration d'environ 40.

La constriction permet donc un effet « vanne » permettant de laisser passer les objets de faibles poids moléculaires. Elle permet ainsi d'arrêter les molécules dans un petit volume pour obtenir un facteur de concentration important, sans être trop astringente au risque d'arrêter les sondes non hybridées dans les mêmes conditions. La hauteur du canal au niveau de la constriction est de 2μηι.

La hauteur du canal au niveau de la constriction joue un rôle clé pour le rapport signal sur bruit : les complexes accumulés à la paroi deviennent détectables si le signal qu'ils génèrent est plus important que le signal volumique lié aux sondes présentes en volume. Autrement dit, comme les molécules à l'arrêt sont plaquées contre les parois, augmenter la hauteur du canal n'augmente pas forcément le signal, alors que cela augmente le bruit de fond. Avantageusement, le complexe acide nucléique/cible est stoppé en amont de la constriction pour éviter les fuites associées à un piégeage incomplet.

La Figure 3 représente de façon générale deux canaux 1 comprenant chacun une constriction 2 ayant une forme géométrique différente, les constrictions étant en vis- à-vis. Typiquement, les deux constrictions différentes permettent de comparer leur performance vis-à-vis de la séparation, la concentration et la détection des acides nucléiques pour une même condition expérimentale.

Le canal comprenant la constriction peut être intégré dans une puce micro-fluidique.

Différents types de puces micro-fluidiques pourront être utilisées telles que des puces micro-fluidiques à géométrie linéaire (x shape), des puces micro-fluidiques power- law geometries (x 1 ^' 5 , x 2 , x 2 5 , et x 3 ) ainsi que des puces micro-fluidiques « exponential-law geometries » (exp(3x), exp(4x), exp(5x) exp(6x) et exp(7x).

Alternativement, des puces en silicone fabriquées par lithographie utilisant des masques à niveaux de gris pourront être utilisées (puce 2.5D). Cette technique de fabrication est décrite dans l'article « Grayscale lithography to fabricate varying- depth nanochannels in a single step » de Naillon, Antoine & Massadi, Hajar & Courson, Rémi & Calmon, Pierre-François & Séveno, Lucie & Prat, Marc & Joseph, Pierre (2016). A titre d'exemple, la longueur du canal de concentration de la puce est de 1,7 mm et possède un gradient de hauteur de 5 μιη à 2 μιη, et la largeur de constriction est de 25 μιη. La géométrie de la puce est représentée à la Figure 11.

Alternativement, le canal peut être une lumière d'un tube capillaire. Dans ce cas, la constriction correspond à la jonction de deux capillaires de diamètres différents.

L'utilisation de tubes capillaires peut permettre un multiplexage aisé des canaux selon l'invention, sous forme de fuseaux de tubes capillaires, par exemple tels que ceux décrits dans l'article « Bundled capillary electrophoresis using micro structured fibres » de Rogers et al., Electrophoresis, 32(2):223-229 (201 1 ). Dans ce cas, les moyens d'application du flux hydrodynamique et les moyens d'application du champ électrique peuvent être communs pour l'ensemble des tubes capillaires, ou au contraire être distincts pour tous les tubes capillaires.

Selon un mode de réalisation, le milieu liquide présente une viscosité à cisaillement nul comprise entre 3cP et 40cP, préférentiellement entre 10 et 25cP (centipoise) à température ambiante.

Typiquement, deux méthodes pourront être utilisées pour mesurer la viscosité à cisaillement nul. Elle pourra être mesurée par diffusion de lumière dynamique (DLS), qui permet de mesurer le rayon hydrodynamique de solutions colloïdales. La mesure de DLS peut être effectuée avec un appareil de type Malvern ZetaSizer. Il s'agit d'utiliser des nanoparticules de taille donnée R ₀ et de mesurer leur taille hydrodynamique apparente R _a dans la solution de viscosité indéterminée. La viscosité est donnée par le rapport R _a /Ro _. Les paramètres d'élasticité pourront être mesurés par l'utilisation de nanoparticules fluorescentes de taille calibrée Ro de l'ordre de 200 nm et la mesure de leurs fluctuations spatiales à température ambiante par vidéomicroscopie de fluorescence. Le déplacement quadratique moyen (MSD) est mesuré en fonction du temps τ . Ces données sont adaptées selon le modèle décrit dans (Zanten, PRE, 2000). L'expression analytique est la suivante : t > x

où kT est l'énergie d'agitation thermique, m la masse de la particule, avec μ la viscosité du fluide, λ le temps de relaxation du fluide qui vaut μ/Ε où E est l'élasticité du fluide.

Selon un mode de réalisation, le milieu liquide comprend des polymères non chargés.

L'utilisation d'une matrice de polymères dissouts adaptée permet l'arrêt spécifique de complexes acide nucléique/sondes d'intérêt, et particulièrement ceux de petits poids moléculaires pour conception de canalisation donnée et des paramètres d'actionnement limités par les matériaux utilisés.

Le terme "non chargé" signifie que les polymères en question ont une charge électrostatique globale essentiellement nulle dans le milieu liquide susmentionné. La présence de tels polymères par exemple dans une solution aqueuse permet de rendre le milieu liquide non newtonien (par exemple viscoélastique).

Selon un mode de réalisation, le milieu liquide comprend des polymères non chargés, de préférence choisis parmi la polyvinylpyrrolidone (PVP), le poly-(éthylène glycol) le polyacrylamide et/ou leurs mélanges.

A titre illustratif, le milieu liquide comprend un mélange de PVP et de PEG. De manière préférée, les polymères non chargés seront choisis parmi le polyvinylpyrrolidone 1.3MDa (PVP 1.3MDa), le polyvinylpyrrolidone 360 KDa (PVP 360 Kda), le polyvinylpyrrolidone 40kDa (PVP 40kDa), le polyvinylpyrrolidone lOkDa (PVP lOKDa) et le poly-(éthylène glycol) 10 KDa (PEG 10 KDa).

De manière générale, de fortes concentrations de PVP sont favorables pour arrêter les petites molécules, mais la viscosité devient importante, ce qui nécessite d'imposer des pressions très importantes pas forcément accessibles aux appareils commerciaux. Le champ électrique de la même manière ne peut pas être modulé infiniment, car les risques de claquage sont forts avec tout type de dispositif.

Selon un mode de réalisation, les polymères non chargés sont présents dans une concentration massique de 0.5 à 30%, de manière préférée de 2 à 25%, et de manière encore plus préférée de 3 à 20%

Les Figures 3 et 4 représentent les données de viscosités en fonction de la concentration en PVP ou en PEG.

Typiquement, pour la détection d'acides nucléiques de faible poids moléculaire (inférieur à 100 paires de base), des solutions ayant une forte viscosité seront utilisée.

Par exemple, le milieu liquide comprend le PVP 40kDa dans une concentration massique de l'ordre de 18%, ou le PVP 1.3MDa dans une concentration massique de l'ordre de 3%.

La séparation est plus facile pour des ADN dans la gamme 100-1000 paires de bases où des bonnes performances sont obtenues pour toutes les conditions. Les conditions de séparation pour des acides nucléiques de haut poids moléculaire, de l'ordre 10 000 paires de bases ou plus sont obtenues avec des solutions plus diluées. A titre illustratif, on pourra utiliser un milieu liquide comprenant le PVP 2.5 kDa dans une concentration massique de l'ordre de 2%.

L'Homme du métier saura avantageusement sélectionner le polymère et sa concentration en fonction de la cible à détecter.

Selon une variante préférentielle du procédé selon l'invention, le champ électrique appliqué vaut de 0.1 kV/m à 10 kV/m, de préférence 1 kV/m à 500 kV/m et de manière encore plus préférée, de 100 kV/m à 200 kV/m et/ou le flux hydrodynamique est caractérisé par une vitesse moyenne de 0.1 à 10 mm/s, de préférence, 1 à 100 mm/s, et de manière encore plus préférée 5 à 10 mm/s. Les profils souhaités de flux hydrodynamique (caractérisés notamment par des valeurs de débit et de vitesse moyenne données), sont obtenus en actionnant des moyens de contrôle de pression, de sorte à générer une différence de pression entre l'entrée et la sortie du canal. Par exemple, une différence de tension inférieure à 12 bars, de préférence comprise entre 50mbar à 10 bars, préférentiellement entre 2 et 6 bars et de manière plus particulièrement préférée entre 0.1 à 3 bars, permet d'obtenir les profils de flux hydrodynamique souhaités.

Conjointement, un champ électrique est généré dans le canal au moyen d'électrodes. Ce champs électrique est adapté pour appliquer une force électrostatique sur les objets électriquement chargés qui tend à les déplacer dans la direction opposée au flux hydrodynamique appliqué.

Typiquement, la tension sera inférieure à 400 V, et de préférence comprise entre 10 à 300 V, et de manière plus particulièrement préférée de 100 à 200 V. Dans un mode de réalisation, l'introduction de l'échantillon est effectuée dans une zone d'introduction du canal et le déplacement des objets électriquement chargés est effectué de la zone d'introduction vers une zone de détection du canal, le procédé comprenant en outre ;

la détection du complexe acide nucléique/sonde arrivant dans une zone de détection.

Typiquement, la détection pourra être réalisée au niveau de la constriction. Dans un autre mode de réalisation, la détection se fera en aval de la constriction.

Le facteur de concentration dépend du temps, ainsi, le temps de détection est compris entre 10 et 5000 secondes, préférentiellement entre 50 et 1000 secondes, et de manière préférée entre 100 et 500 secondes, et ce afin d'atteindre un enrichissement suffisant.

L'homme du métier saura déterminer le temps d'analyse, tout en tenant compte de la dissociation du complexe acide nucléique/sonde. EXEMPLES :

Dans les exemples 1 à 5 qui suivent les matériaux et méthodes suivants ont été utilisés : - Puce micro-fluidique

Dans les exemples suivants, une puce micro-fluidique avec deux canaux manipulés avec des paramètres d'actionnement identiques a été utilisée. Cette puce micro- fluidique est représentée à la Figure 6 et comprend deux canaux comprenant chacun deux constrictions mises en regard telles que représentées à la Figure 3. Cette puce micro fluidique est également décrite dans Malbec et al.

Cette puce a été utilisée à titre expérimental. Des résultats similaires peuvent être obtenus avec un canal ou un capillaire comprenant une constriction.

Ce système est utilisé pour évaluer simultanément le signal dans un canal ou l'on introduit un échantillon dans le canal en haut de la Figure 6 et un échantillon dans le canal en bas de la Figure 6, le canal du haut servant de contrôle. Les deux canaux sont observés simultanément par vidéo microscopie de fluorescence.

Analyse

Les vidéos sont analysées avec ImageJ, programme permettant de tracer les intensités de fluorescence et ainsi de déterminer les positions des acides nucléiques dans le canal.

Les intensités sont ajustées selon une distribution gaussienne et la résolution est calculée selon le ratio de la distance entre les pics consécutifs en forme de Gauss et la somme de leurs hauteurs.

Exemple 1 : Détection du proto-oncogène KRAS

Dans cet exemple, l'invention est mise en œuvre pour séparer, concentrer et détecter le proto-oncogène KRAS.

Ainsi, l'acide nucléique cible est le proto-oncogène KRAS comprenant 111 bases (SEQ ID N° 1).

Sa séquence est représentée à la Figure 7A et sa structure est telle que représentée à la Figure 7B. La sonde associée est une balise moléculaire et correspond à la sonde KRAS, comprenant 32 bases (SEQ JD N°2) ainsi qu'un fluorophore : 6 FAM, et un extincteur : Black Hole Quencher® : BHQ1. Sa séquence est représentée à la Figure 8A et sa structure est telle que représentée à la Figure 8B.

La zone d'interaction de l'acide nucléique cible KRAS avec la sonde est désignée par le crochet sur la Figure 7B.

Les échantillons sont dilués dans un tampon de séparation comprenant du TBE lx, et du PVP 1.3MDa dans une concentration massique de 5% environ

La viscosité du milieu liquide non-newtonien est d'environ 3cP à température ambiante.

Un échantillon comprenant lOOnM de sonde a été introduit dans le canal du haut et un échantillon comprenant lOOnM de sonde incubée pendant 1 heure environ à 40°C avec ΙμΜ d'acide nucléique cible a été introduit dans le canal du bas.

Une différence de pression globale de 1.7 bar et une différence de tension de 168V ont été mises en œuvre avec des flux hydrodynamique et électrophorétique croisés, c'est-à-dire orientés selon l'axe d'écoulement mais selon des axes opposés. Ce couple pression/tension a permis l'enrichissement et donc la détection du complexe acide nucléique KRAS et de sa sonde.

Ce couple tension/pression implique une vitesse hydrodynamique du fluide de 2cm/s et une valeur de champs électrique régnant au sein de la constriction de 700k V/m. Les paramètres de pression et de tension ont été modulés. Une différence de pression globale de 1.7 bar et une différence de tension de 312V ont été mises en œuvre avec des flux hydrodynamique et électrophorétique croisés. Ce couple pression/tension a permis d'enrichir la sonde et de détecter uniquement celle-ci.

Ce couple tension/pression implique une vitesse hydrodynamique du fluide de 2cm/s et une valeur de champs électrique régnant au sein de la constriction de 1300kV/m.

Le procédé selon l'invention permet ainsi de détecter le complexe acide nucléique/sonde à un couple donné de pression et de tension et d'éliminer le bruit de fond associé à la sonde.

Exemple 2 : Détection de miR 21

Dans cet exemple, l'invention est mise en œuvre pour séparer, concentrer et détecter miR 21.

Ainsi, l'acide nucléique cible est le miR21 de 22 bases (SEQ ID N°3).

Sa séquence est représentée à la Figure 9A et sa structure est telle que représentée à la Figure 9B.

La sonde associée est la sonde miR21, comprenant 32 bases (SEQ ID N°4) ainsi qu'un f uorophore : 6 FAM, et un extincteur : Black Hole Quencher® : BHQ1.

Sa séquence est représentée à la Figure 10A et sa structure est telle que représentée à la Figure 10B.

Les échantillons sont dilués dans un tampon de séparation comprenant du TBE lx, et du PVP 1.3MDa dans une concentration massique de 5% environ La viscosité du milieu liquide non-newtonien est d'environ 3cP à température ambiante. ΙΟΟηΜ de sonde miR21 et 300nM de l'acide nucléique miR21 ont été utilisés.

Un échantillon comprenant la sonde a été introduit dans le canal du haut et un échantillon comprenant la sonde et l'acide nucléique cible a été introduit dans le canal du bas.

Une différence de pression globale de 2 bars et une différence de tension de 235V ont été mises en œuvre avec des flux hydrodynamique et électrophorétique croisés, c'est-à-dire orientés selon l'axe d'écoulement mais selon des axes opposés.

Ce couple pression/tension a permis l'enrichissement et donc la détection du complexe acide nucléique miR21/sonde. Le couple pression/tension a été modulé et une différence de pression globale de 2 bars et une différence de tension de 314V ont été mises en œuvre avec des flux hydrodynamique et électrophorétique croisés. Dans ces conditions, la sonde seule a été concentrée et donc détectée. Le procédé selon l'invention permet ainsi de détecter le complexe acide nucléique/sonde à un couple donné de pression et de tension et d'éliminer le bruit de fond associé à la sonde.

Exemple 3 : Détection d'acide nucléique en utilisant une sonde linéaire droite en excès

Dans cet exemple, l'invention est mise en œuvre pour séparer, concentrer et détecter l'acide nucléique suivant :

5 ' A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A AT AGCTTATC AG AC TGATGTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' (SEQ ID N°5)

La sonde est la suivante : 5 ' -6FAM-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3 ' (SEQ ID N°6)

Les échantillons sont dilués dans le tampon de séparation TBE lx, PVP 5% 1.3MDa

La viscosité du milieu liquide non-newtonien est d'environ 3cP à température ambiante.

Un échantillon comprenant 100 nM de sonde et 1 nM de cible a été injecté dans le canal du haut de la puce micro fluidique. Un échantillon comprenant 100 nM de sonde et 10 nM de cible a été injecté dans le canal du bas.

Une différence de pression de 2 bars et une tension de 230V ont été mise en œuvre avec des flux hydrodynamique et électrophorétique croisés. Le procédé selon l'invention a ainsi permis de détecter les seuls complexes acides nucléiques/cibles pour des paramètres de tension et de pression donnés.

Une différence de pression de 2.5 bars et une tension de 288V ont été mise en œuvre avec des flux hydrodynamique et électrophorétique croisés. Dans ces conditions, seule la sonde a pu être détectée.

Avantageusement, le procédé selon l'invention permet de détecter de faibles concentrations d'acides nucléiques. II est par ailleurs possible de saturer la solution en sonde et de détecter de manière efficace l'acide nucléique cible car le procédé selon l'invention permet l'enrichissement du signal et de diminuer le bruit de fond. Exemple 4 : Détection d'une séquence cible dans un échantillon comprenant de l'ADN circulant

1) Préparation de l'échantillon

4 mL de plasmin sanguin ont été processé avec un kit norgenbiotek Plasma/Serum Circulating DNA Purification Midi Kit.

ADN purifié a été élué dans 50μί de TE IX.

50μΙ. d'ADN purifié ont été dilué avec 450μί de TBE IX et du PVP 1.3M 5%, puis ont été filtré sur un filtre de surface comprenant des pores de 0.22μιη.

2) Préparation des acides nucléiques cibles et des sondes

L'acide nucléique cible est le suivant :

5 ' A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A AT AGCTTATCAG A CTGATGTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' (SEQ ID N°7)

La sonde utilisée comprend 22 bases, le fluorophore : 6 FAM et est la suivante : 5'- 6FAM-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3 ' (SEQ ID N°8).

Un échantillon comprenant 100 nM de sonde a été injecté dans le canal du haut de la puce micro fluidique.

Un échantillon comprenant 10 nM de l'acide nucléique à détecter ainsi que 100 nM de la sonde a été injecté dans le canal du bas. Une différence de pression de 1.5bar et une différence de tension de 280V ont été mises en œuvre avec des flux hydrodynamique et électrophorétique croisés, c'est-à- dire orientés selon l'axe d'écoulement mais selon des axes opposés. Ce couple tension/pression implique une vitesse hydrodynamique du fluide de 1.8cm/s et une valeur de champs électrique régnant au sein de la constriction de 1170kV/m.

A ces différences de pression et de tension, les sondes seules ont été arrêtées dans une zone en amont de la constriction.

La différence de pression a été modifiée et une différence de pression de 1.75 bar et une différence de 280V ont été mise en œuvre avec des flux hydrodynamiques et électrophorétiques croisés tels que précédemment mentionnés.

Ce couple tension/pression implique une vitesse hydrodynamique du fluide de 2.1 cm/s et une valeur de champs électrique régnant au sein de la constriction de 1170kV/m. Ce couple de pression et de tension permet d'arrêter le complexe acide nucléique cible/sonde à détecter et de s'affranchir du bruit de fond constitué par les sondes seules, celles-ci n'étant pas arrêtées à ces paramètres.

Le procédé selon l'invention permet ainsi de détecter des acides nucléiques cibles dans des échantillons complexes à de faibles concentrations.

Ainsi, et dans les exemples précédents, pour une pression donnée, il est possible d'imposer un champ électrique faible tel que seuls les complexes acides nucléiques/sondes soient arrêtés, alors que les sondes circulent librement à travers la constriction. En augmentant le champ électrique, le complexe acides nucléiques/sondes migrent en arrière. Il est ainsi possible, à un seuil donné d'observer une accumulation du signal témoignant de la détection du complexe acides nucléiques/sondes, et ainsi, isoler les complexes acides nucléiques/cibles de manière indépendante. Ainsi, et en ajustant correctement les paramètres de tension et de pression, et la constriction, il est possible d'enrichir sélectivement le complexe acides nucléiques/sondes et d'éliminer le bruit de fond associé à la sonde.

Le procédé selon l'invention permet donc d'atteindre des niveaux de sensibilité plus importants que ceux obtenus en mesure de volume.

Exemple 5 : Enrichissement sélectif du complexe sonde/acide nucléique cible vs. sonde libre L'acide nucléique cible est une séquence ssDNA de 22 bases, et la sonde, une sonde ayant une séquence complémentaire, marquée par un fluorophore 6-FAM.

Un échantillon comprenant ΙμΜ de sonde et ΙμΜ d'acide nucléique cible a été utilisée.

Le couple tension/pression a été ajusté afin de permettre la formation du complexe acide nucléique/cible.

Le complexe acide nucléique cible a pu être détecté après 1 seconde. Après 10 secondes d'enrichissement selon les paramètres tension/pression, tous les complexes acides nucléiques/cibles sont stoppés en amont de la construction.

L'expérimentation a été menée en utilisant lnM de sonde et lnM d'acide nucléique cible. Bien que le signal soit plus faible, il est possible de détecter, grâce au procédé selon l'invention le complexe acide nucléique cible/sonde après 10 secondes d'enrichissement selon les paramètres pression/tension. Le facteur d'enrichissement a été calculé en mesurant l'intensité de la fluorescence au niveau de la constriction en fonction du temps appliqué pour l'enrichissement.

Des facteurs d'enrichissement similaires ont été obtenus pour chacune des expériences après 9 secondes. Avantageusement, un facteur d'enrichissement de 160 a été obtenu pour l'expérience menée sur des échantillons comprenant ΙμΜ de sonde et ΙμΜ d'acide nucléique cible, et un facteur d'enrichissement de 143 pour l'expérience menée sur des échantillons comprenant lnM de sonde et lnM d'acide nucléique cible. Ainsi, le procédé selon l'invention permet avantageusement d'enrichir de manière sélective des acides nucléiques à faible concentration, afin de permettre leur détection.

Exemple 6 : Seuil de détection

L'acide nucléique cible est une séquence ssDNA de 99 bases, et la sonde, une sonde ayant une séquence complémentaire de 34 bases, marquée par un fluorophore 6- FAM (6-carboxyfluorescéine) (Eurogentec, Liège, Belgique).

Ainsi, l'acide nucléique cible est le suivant :

5'-

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATGCTGGGCGATAAGAGG TTCCGTGTAGTCAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'

(SEQ ID N°9) La sonde utilisée est la suivante 5'- 6FAM-

TTGACTACACGGAACCTCTAATCGCCCAGCATTT -3' (SEQ ID N°10).

Dans cet exemple, 2μΜ de sonde ont été mélangés avec différentes concentrations d'acide nucléique cible de 2pM à 2μΜ dans du PBS 0.2x.

Les solutions ainsi obtenues ont été chauffées à 92°C pendant deux minutes puis refroidies lentement à température ambiante. 20μ1 du mélange sonde/acide nucléique cible ont été dilués dans 980μί de tampon fraîchement préparé et filtré à 0,2 μιη contenant 5% de PVP 1,3 MDa dans du PBS 0,2x.

Les solutions finales obtenues contiennent des concentrations constantes de sondes (20nM) et des concentrations variables d'acides nucléiques cibles (de 20fM à 20nM).

Pour l'enrichissement et la détection du complexe acide nucléique/sonde, des puces en silicone fabriquées par lithographie utilisant des masques à niveaux de gris ont été utilisées.

La longueur du canal de concentration de la puce est de 1,7 mm et possède un gradient de hauteur de 5 μιη à 2 μιη.

La largeur de constriction a été fixée à 25 μιη. La géométrie de la puce est représentée à la Figure 11

Le canal a d'abord été rempli d'éthanol pour éliminer les bulles d'air. Il a ensuite été soigneusement rincé avec un tampon de travail avant d'introduire 40 μΐ _^ de solution contenant différents rapports de concentration entre les acides nucléique cibles et les sondes (concentration constante de sonde (20nM) et concentrations variables d'acides nucléiques cibles (de 20fM à 20nM).

La viscosité du milieu liquide non-newtonien est d'environ 31cP à température ambiante.

Une différence de pression globale de 5 bars et une différence de tension de 190V ont été mises en œuvre avec des flux hydrodynamique et électrophorétique croisés. Ce couple pression/tension a permis d'enrichir sélectivement le complexe acides nucléiques/sondes et donc sa détection.

Ce couple tension/pression implique une vitesse hydrodynamique du fluide de 10.18 cm/s et une valeur de champs électrique régnant au sein de la constriction de 100 kV/m.

Le procédé selon l'invention permet ainsi de détecter le complexe acide nucléique/sonde à un couple donné de pression et de tension et d'éliminer le bruit de fond associé à la sonde et présente également une grande sensibilité en ce que le procédé selon l'invention a permis avantageusement de détecter l'acide nucléique cible à une concentration de 20fM.