DOMAINE TECHNIQUE GENERAL

L’invention a trait au domaine de l’analyse microbiologique, et en particulier de la caractérisation de microorganismes, notamment la prédiction du caractère sensible ou résistant de levures, de moisissures et de bactéries à un agent antimicrobien.

De manière avantageuse, l’invention s’applique à l’analyse d’une image hyperspectrale d’une ou plusieurs colonies de bactéries, de moisissures ou de levures ayant poussées dans un milieu de culture observable.

ETAT DE L’ART

Dans le domaine du diagnostic in vitro des microorganismes, en particulier pathogènes, la caractérisation d’un microorganisme consiste préférentiellement à identifier son espèce et sa sensibilité à un agent antimicrobien, (ou « antibiogramme »), afin de déterminer un traitement pour le patient infecté par ce microorganisme. Pour ce faire, un processus microbiologique complexe est usuellement mis en œuvre en laboratoire, processus qui nécessite le plus souvent la connaissance préalable d’autres propriétés du microorganisme, notamment son règne (e.g. levure ou bactérie), et dans le cadre bactérien son type de Gram ou son caractère fermentaire ou non. En effet, ces informations permettent notamment de choisir un milieu de culture ou un type d’agents antimicrobien adaptés au microorganisme afin de déterminer, in fine, son espèce ou son antibiogramme. Par exemple, le choix d’une galerie d’identification de microorganismes API® commercialisée par la demanderesse se fonde sur la connaissance du règne du microorganisme (e.g. levure vs bactérie) ou du type de Gram de la souche bactérienne à identifier. De même la détermination de l’antibiogramme d’une souche bactérienne par le système Vitek ® 2 commercialisé par la demanderesse se fonde sur le choix d’une carte en fonction du type de Gram et du caractère fermentant ou non de ladite souche. Il est également possible de citer l’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF employant une matrice différente selon que le microorganisme à identifier est une levure ou une bactérie. Ainsi connaître au plus tôt ces informations permet d’optimiser le processus microbiologique, notamment en accélérant ce dernier ou en réduisant le nombre de consommables employés.

Historiquement, chacune de ces propriétés est déterminée par une technique qui comprend un nombre important d’étapes manuelles (fixation, coloration, mordançage, lavage, sur coloration...), et donc longue à mettre en œuvre. La demande internationale WO 2019/122732 décrit une méthode de détermination du type de Gram et du caractère fermentant d’une souche de bactérie qui soit automatique et qui ne nécessite pas de marquer ou de colorer la bactérie ou son milieu de culture pour déterminer ces caractéristiques. Pour ce faire, on utilise un système d’imagerie dite multispectrale voire hyperspectrale. Il s’agit d’un système avec une forte résolution spectrale permettant de produire une image numérique de la lumière réfléchie par, ou transmise au travers de, la boite de Pétri présentant un grand nombre de canaux. Alors qu’une image RGB standard a trois canaux, une image dite HSI (pour « Hyper Spectral Imaging ») forme un cube de données qui peut présenter plusieurs centaines de canaux spectraux sur une gamme de longueur d’onde de 390 à 900 nm (soit une résolution spectrale de quelques nanomètres). Un algorithme de classification adéquat appliqué à l’image HSI permet alors directement de déterminer le type de Gram et le caractère fermentant ou non de la souche représentée. On peut alors choisir un milieu de culture ou un type d’agents antimicrobien adaptés au microorganisme afin de déterminer, in fine, sa sensibilité à l’antibiotique en fonction de sa pousse dans un échantillon du milieu de culture.

Le document Arrigoni, Turra et Signoroni, Hyperspectral image analysis for rapid and accurate discrimination of bacterial infections: A benchmark study, propose même directement de déterminer, à partir de 1‘image HSI, l’espèce du microorganisme. Comme expliqué, ces informations sont intéressantes, mais ne suffisent pas en soi à déterminer si le microorganisme est résistant à un antimicrobien, et il reste nécessaire de réaliser l’antibiogramme. En effet, pour une même espèce telle que S. aureus, on trouve des souches résistantes et d’autres non. On parle par exemple de MRSA pour « Methicillin-resistant Staphylococcus aureus » et MSSA pour « Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus », i.e. des souches de S. aureus respectivement résistantes ou non à l’antibiotique méticilline.

Le document Park et al., Classification of Salmonella Serotypes with Hyperspectral Microscope Imagery, propose une solution permettant de classifier des microorganismes à une taxonomie inférieure à l’espèce, cependant au prix de manipulations et de matériels complexes. En effet, il est nécessaire d’isoler une colonie, puis d’acquérir une image HSI au microscope dite HMI spécifiquement de cette colonie. L’algorithme observe alors les cellules à l’échelle individuelle et une par une, cette observation individuelle étant utilisée pour la classification.

Il reste ainsi souhaitable de pouvoir disposer d’une solution rapide et efficace permettant de déterminer la susceptibilité, i.e. la résistance ou la sensibilité, d’un microorganisme à un agent antimicrobien. Une telle solution s’intégre par exemple dans un processus clinique consistant à prélever l’échantillon sur un patient susceptible d’être infecté par un microorganisme pathogène, à préparer l’échantillon en vue son analyse par la solution d’invention, à appliquer cette dernière, à réaliser un choix d’antimicrobien en fonction du résultat de susceptibilité délivré par la solution puis à appliquer l’ antimicrobien choisi au patient. De manière avantageuse, l’invention s’applique à l’analyse d’une image hyperspectrale d’une ou plusieurs colonies de bactéries, de moisissures ou de levures ayant poussées dans un milieu de culture et observables sans utilisation de marqueurs ou de coloration, sans observation des cellules à l’échelle individuelle ou sans utilisation de système optique à fort grossissement tel qu’un microscope, et sans procéder à la destruction des bactéries ou des colonies.

De manière avantageuse, l’invention s’applique dès qu’une colonie occupe quelques pixels dans l’image hyperspectrale acquise, notamment à partir de 10 pixels.

PRESENTATION DE L’INVENTION

Le but de la présente invention est de prédire la susceptibilité d’un microorganisme à un agent antimicrobien à l’aide d’une imagerie hyperspectrale d’une colonie microbienne ayant poussée sur un milieu de culture sans la présence dudit antimicrobien.

A cet effet l’invention a pour objet un procédé de prédiction de la susceptibilité d’une souche microbienne à un agent antimicrobien, le procédé étant caractérisé en ce qu’il comprend la mise en œuvre, par des moyens de traitement de données, d’étapes de :

(a) Obtention d’une image hyperspectrale entre 390nm et 900 nm représentant au moins une colonie de ladite souche dans un échantillon dépourvu d'agent antimicrobien ;

(b) Détermination d’un spectre de la colonie à partir des pixels de ladite image hyperspectrale correspondant à ladite colonie, ci-après "spectre de test" ;

(c) Comparaison dudit spectre de test avec des classes microbiennes d'une base de données prédéterminées, ci-après "classe microbienne de référence", lesdites classes correspondant à un niveau taxonomique inférieur à l’espèce et étant apprises sur au moins un spectre hyperspectral d’une souche microbienne, la base de données comprenant, pour chaque classe microbienne de référence, la susceptibilité à l’agent antimicrobien de la classe microbienne de référence;

(d) Détermination de la susceptibilité de la souche microbienne à l’agent microbien comme étant celle associée à la classe microbienne de référence la plus proche du spectre hyperspectral de test.

En d’autres termes, les inventeurs ont découvert que l’imagerie hyperspectrale entre 390nm et 900nm contient suffisamment d’informations pour prédire que deux souches microbiennes sont clonales ou issues d’une même lignée et partagent ainsi la même susceptibilité à l’agent antimicrobien. En connaissant la susceptibilité d’une classe, en prédisant qu’un nouveau microorganisme appartient à ladite classe, le nouveau microorganisme se voit prédire la susceptibilité de ladite classe.

Par « classe microbienne », on entend ici tout objet numérique caractérisant l’identité microbienne à un niveau taxonomique inférieur à l’espèce, et notamment à un niveau souche, objet avec lequel on peut comparer le spectre hypespectral d’une colonie à l’aide d’une métrique appropriée afin de déterminer l’appartenance ou de ladite colonie à ladite classe. Les classes microbiennes peuvent être des classes apprises par des algorithmes d’apprentissage automatisé, supervisé ou non, ou des spectres hyperspectraux de référence par exemple.

Selon un mode de réalisation préféré, les étapes de comparaison et de détermination sont réalisées au moyen d'un prédicteur basé sur une classification supervisée ayant pour classes microbiennes de référence l'identité des souches microbiennes de la base de données, la phase d’entrainement de la classification comprenant:

(cl) l'acquisition pour chaque souche microbienne de la base de données, de spectres hyperspectraux de colonies différentes;

(c2) l'entrainement de la classification sur les spectres hyperspectraux de colonies différentes.

En d’autres termes, plutôt que de déterminer un spectre représentatif d’une souche microbienne que l’on comparerait avec le spectre d’une colonie en cours de test, ce mode de réalisation apprend les classes sur des spectres hypespectraux issue de colonies différentes de la souche microbienne ce qui permet de tenir compte de variation dans l’acquisition de spectres, tels que l’erreur de mesure, la variabilité de l’éclairage ou encore la variabilité du spectre de nature biologique (épaisseur variable des colonies modifiant le spectres, couleurs variables...).

De manière plus spécifique, le prédicteur est un réseau de neurones artificiels convolutif. De manière préférentielle, la base de données est mise à jour de manière fréquente pour tenir compte de nouvelles souches encore non répertoriée, de variabilité intra-souche des spectres hyperspectraux ou pour incorporer des données issues de préparation d’échantillons et d’éclairage différente. L’emploi d’un tel prédicteur permet une agilité de traitement car le prétraitment qu’il incorpore (e.g. extraction de caractéristiques par réduction de la taille des variables par la ou les couches convolutives) n’est pas figé a priori.

Selon des modes de réalisation de l’invention :

- l’étape (b) comprend la segmentation de ladite image hyperspectrale de sorte à détecter ladite colonie dans l’échantillon ; - l’étape (a) comprend l’acquisition de ladite image hyperspectrale par un dispositif d’observation connecté audit client.

- le procédé comprend une étape (aO) d’apprentissage, par des moyens de traitement de données d’un serveur, des paramètres dudit modèle de classification automatique à partir d’une base d’apprentissage d’images hyperspectrales ou de spectres de colonies déjà classifiés.

- la souche microbienne est une souche de Staphylococcus aureus et l’agent antimicrobien est la méticilline.

L’invention a également pour objet un système de détermination de la susceptibilité d’un microorganisme à un agent antimicrobien, comprenant au moins un client comprenant des moyens de traitement de données, lesdits moyens de traitement de données étant configurés pour implémenter :

- l’obtention d’une image hyperspectrale représentant au moins une colonie dudit microorganisme dans un échantillon ;

- la détermination d’un spectre de la colonie à partir des pixels de ladite image hyperspectrale correspondant à ladite colonie ;

- la comparaison dudit spectre de test avec des classes microbiennes d'une base de données prédéterminées, ci-après "classe microbienne de référence", lesdites classes correspondant à un niveau taxonomique inférieur à l’espèce et étant apprises sur au moins un spectre hyperspectral d’une souche microbienne, la base de données comprenant, pour chaque classe microbienne de référence, la susceptibilité à l’agent antimicrobien de la classe microbienne de référence;

- la détermination de la susceptibilité de la souche microbienne à l’agent microbien comme étant celle associée à la classe microbienne de référence la plus proche du spectre hyperspectral de test.

Selon un mode de réalisation, le système comprend en outre un dispositif d’observation (10) pour l’acquisition de ladite images hyperspectrale.

L’invention a également pour objet un produit programme d’ordinateur comprenant des instructions de code pour l’exécution d’un procédé tel que décrit précédemment de détermination de la susceptibilité d’un microorganisme à un agent antimicrobien, lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur.

L’invention a également pour objet un moyen de stockage lisible par un équipement informatique sur lequel un produit programme d’ordinateur comprend des instructions de code pour l’exécution d’un procédé tel que décrit précédemment de détermination de la susceptibilité d’un microorganisme à un agent antimicrobien

PRESENTATION DES FIGURES

D’autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre d’un mode de réalisation préférentiel. Cette description sera donnée en référence aux dessins annexés dans lesquels : la figure 1 est un schéma d’une architecture pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention ; la figure 2a représente un premier mode de réalisation de dispositif d’observation de microorganismes dans un échantillon utilisé dans un mode de réalisation du procédé selon l’invention ; la figure 2b représente un deuxième mode de réalisation de dispositif d’observation de microorganismes dans un échantillon utilisé dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l’invention ; la figure 3a représente un exemple de spectre de colonie d’une classe de résistance à un agent antimicrobien ; la figure 3b représente un exemple de spectre de colonie d’une classe de sensibilité à un agent antimicrobien ; la figure 4 représente les étapes d’un mode de réalisation préféré du procédé selon l’invention ; la figure 5 représente un exemple d’architecture de réseau de neurones à convolution utilisé dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l’invention ; la figure 6 représente une matrice de confusion d’un prédicteur à base de réseau neuronal convolutif selon l’invention.

DESCRIPTION DETAILLEE

Architecture

L’invention concerne un procédé de détermination de la susceptibilité d’un microorganisme d’une espèce donnée à un agent antimicrobien. Ledit microorganisme est typiquement une bactérie, une moisissure ou une levure (on prendra l’exemple dans la suite de la description de S. aureus, mais ce pourrait être E. coli, C. difficile, etc.), et ledit agent microbien un antibiotique (en particulier la méticilline était alors l'antibiotique de choix pour S. aureus, mais également la vancomycine par exemple) ou un antifongique concernant les levures et les moisissures. Comme l’on verra, ce procédé peut comprendre une composante d’apprentissage automatique, et notamment un modèle de classification choisi parmi une machine à vecteur de support, SVM, ou un réseau de neurones à convolution, CNN.

Le procédé est plus précisément un procédé de classification d’une image dite hyperspectrale du microorganisme, de sorte que les données d’entrée ou d’apprentissage sont de type image, et représentent au moins une colonie dudit microorganisme dans un échantillon 22 (en d’autres termes il s’agit d’images de l’échantillon dans lequel au moins une colonie - généralement une pluralité - est visible, c’est-à-dire détectable à l’œil nu par un technicien de laboratoire ou détectable dans l’image au moyen d’un algorithme de segmentation connu en soi. A titre d’exemple, une colonie est détectable dès qu’elle atteint une taille supérieure à 10 pixels dans l’image). L’échantillon 22 est adapté à la culture dudit microorganisme, typiquement une gélose coulée dans une boite de Pétri, même s’il peut s’agir de tout milieu de culture ou milieu réactif. On reviendra plus loin sur la notion d’image hyperspectrale, notée image HSI.

Les présents procédés sont mis en œuvre au sein d’une architecture telle que représentée par la figure 1, grâce à un serveur 1 et un client 2. Le serveur 1 est l’équipement d’apprentissage (mettant en œuvre le procédé d’apprentissage) et le client 2 est un équipement d’utilisation (mettant en œuvre le procédé de détermination de la susceptibilité d’un microorganisme à un agent antimicrobien), par exemple un terminal d’un médecin, d’un hôpital ou d’un laboratoire de microbiologie.

Il est tout à fait possible que les deux équipements 1 , 2 soient confondus, mais de façon préférée le serveur 1 est un équipement distant, et le client 2 un équipement grand public, notamment un ordinateur du bureau, un portable, etc. L’équipement client 2 est avantageusement connecté à un dispositif d’observation 10, de sorte à pouvoir directement acquérir ladite image d’entrée, typiquement pour la traiter en direct, alternativement on chargera l’image d’entrée sur l’équipement client 2.

Dans tous les cas, chaque équipement 1, 2 est typiquement un équipement informatique distant relié à un réseau local ou un réseau étendu tel que le réseau internet pour l’échange des données. Chacun comprend des moyens de traitement de données 3, 4 de type processeur, et des moyens de stockage de données 5, 6 telle qu’une mémoire informatique, notamment permanente, par exemple une mémoire flash ou un disque dur, mémorisant l’ensemble des instructions informatiques pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention. Le client 2 comprend typiquement une interface utilisateur 7 telle qu’un écran pour interagir. Le serveur 1 stocke avantageusement une base de données pour l’espèce considérée, comprenant une liste de souches microbiennes appartenant à l’espèce, et pour chacune desdites souches :

- de spectres hyperspectraux d’apprentissage de colonies de la souche, i.e. un ensemble d’objets déjà classifiés

- des données concernant le caractère sensible ou résistant de la souche à l’agent microbien ;

- optionnellement des donnée concernant les conditions de test.

Acquisition

Même si comme expliqué le présent procédé peut directement prendre en entrée toute image hyperspectrale représentant au moins une colonie dudit microorganisme dans l’échantillon 22, en particulier une boite de Pétri dans laquelle est coulée une gélose constituant un milieu nutritif permettant la croissance de colonies microbiennes suite à l’étalage d’un prélèvement liquide contenant une ou plusieurs souches microbiennes, obtenue d’une manière quelconque, de manière préférée le présent procédé commence par une étape (a) d’obtention de l’image d’entrée à partir de données fournies par un dispositif d’observation 10.

De manière connue, l’homme du métier pourra utiliser des techniques d’imagerie hyperspectrale, en particulier telles que décrites dans la demande internationale WO2019/122732.

Par image hyperspectrale, on entend une image comprenant un grand nombre de canaux spectraux, en particulier au moins sept, avantageusement au moins vingt, et potentiellement plus de deux cents (on prendra l’exemple de 223 canaux), par contraste avec une image RGB classique à trois canaux. De manière générale, le dispositif 10 est « simple » par rapport à celui notamment du document Park et al., Classification of Salmonella Serotypes with Hyperspectral Microscope Imagery, en ce qu’il a juste besoin de pouvoir acquérir une image HSI de l’échantillon 22, et ne nécessite donc pas un microscope dont le fort grossissement rend difficile la mise au point.

On va à présent décrire deux modes de réalisation possible du dispositif 10, correspondant aux figures 2a et 2b.

En se référant à la figure 2a, le dispositif 10 est par exemple un système d’imagerie hyperspectrale de référence « Pika II » de la société Resonon, Montana USA. Il comporte avantageusement : une caméra dite hyperspectrale 18, constituée d’un capteur numérique comprenant un réseau de capteurs élémentaires, par exemple un capteur numérique de type CCD ou CMOS, sensible dans une gamme de longueurs d’onde par exemple [Amin ; Amax] = [390 nm; 900 nm] ; et d’un élément dispersif de lumière ou d’un spectrographe pour sélectionner une longueur d’onde à acquérir par le capteur; un objectif 20 pour focaliser sur le capteur numérique de la caméra 18, l’image optique de l’échantillon 22 dont on cherche à acquérir une image hyperspectrale. ; un éclairage avant 24, par exemple constitué d’une ou plusieurs lampes allogènes, e.g. 2 ou 4 lampes, apte à émettre de la lumière dans la gamme [Amin ; Amax] et pour réaliser un éclairage avant uniforme de l’échantillon 22. Par exemple, les éclairages sont des lampes à lumière blanche ; un éclairage arrière 26, par exemple constitué d’une matrice de LED à lumière blanche, pour réaliser un éclairage arrière uniforme de l’échantillon 22 dans la gamme un chariot 28 sur lequel repose l’échantillon 22 et permettant à ce dernier de défiler devant l’objectif 20 afin d’en obtenir une image entière par balayage.

Le dispositif 10 est par exemple configuré pour acquérir l’image d’une région de 90 millimètres par 90 millimètres avec un pas d’échantillonnage de 160 micromètres (résolution spatiale estimée à 300 micromètres) et avec une résolution spectrale de quelques nanomètres sur la gamme [Amin ; Amax], On peut dépasser 200 canaux sur une gamme d’environ 500 nm. En particulier, le champ de vision et la profondeur de champ de l’objectif 20 sont choisis pour l’obtention d’images pouvant comprendre des colonies complètes ayant un rayon pouvant atteindre 1 cm, de préférence pouvant atteindre 0,9 cm, et de manière encore plus préférentielle 0,5 cm.

Le dispositif 10 produit ainsi une image numérique HSI de la lumière réfléchie par l’échantillon 22, improprement appelée « hypercube » car en fait tridimensionnelle : deux dimensions spatiales et une dimension spectrale, chaque pixel (ou plutôt voxel du fait du caractère tridimensionnel de l’image HSI) représentant la radiance mesurée en un point de l’échantillon 22 pour un canal spectral.

La radiance d’un pixel, communément appelée « intensité lumineuse », correspond ici à la quantité de lumière incidente sur la surface du site sensible élémentaire correspondant du capteur de la caméra 18 pendant la durée d’exposition, comme cela est connu en soi du domaine de la photographie numérique par exemple. Le dispositif 10 peut comprendre des moyens de traitement de données embarqués configurés pour mettre en œuvre un traitement des images HSI produites par la caméra 18 et/ou tout déléguer à l’équipement client 2.

Ces moyens de traitement sont dans tous les cas pourvus de l’ensemble des mémoires (RAM, ROM, cache, mémoire de masse, etc.) pour la mémorisation des images produites par le dispositif 10, d’instructions informatiques pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention, de paramètres utiles à cette mise en œuvre et pour la mémorisation des résultats des calculs intermédiaires et finaux. Le client 2 comporte optionnellement comme expliqué un écran d’affichage 7 pour la visualisation du résultat final du procédé. Bien qu’une seule unité de traitement soit décrite, l’invention s’applique évidemment à un traitement réalisé par plusieurs unités de traitement (e.g. une unité embarquée dans la caméra 18 pour mettre en œuvre un prétraitement de images HSI et l’unité 4 du client 2 pour la mise en œuvre du reste du traitement). Par ailleurs, l’interface 7 du client 2 peut permettre d’entrer des données relatives à l’échantillon 22, notamment le type de milieu de culture utilisé lorsque la prédiction dépend du milieu, par exemple au moyen d’un clavier/souris et d’un menu déroulant à disposition de l’opérateur, un lecteur de code barre/QR code lisant un code barre/QR code présent sur la boite de Pétri et comprenant des informations sur l’échantillon 22, etc.

En se référant à la figure 2b, selon le deuxième modèle réalisation, le dispositif 10 peut comprendre alternativement une caméra 34, avantageusement une caméra CMOS ou CCD de haute résolution spatiale, couplée à un ensemble de filtres spectraux 36, par exemple disposé devant l’objectif 20 entre l’objectif 20 et le capteur de la caméra 32. L’ensemble de filtres 36 est constitué d’un nombre NF de filtres passe-bandes distincts, chacun configuré pour transmettre uniquement la lumière dans une partie de la gamme [Xmin ; Xmax], avec une largeur spectrale à mi-hauteur du maximum (ou FWHM pour « full width half maximum ») inférieure ou égale à 50nm, et de préférence inférieure ou égale à 20nm. E’ensemble 36 est par exemple une roue à filtres pouvant accueillir typiquement jusqu’à vingt-quatre filtres différents, roue pilotée par l’unité de traitement de données qui l’actionne pour faire défiler devant la caméra lesdits filtres et commander une prise d’image pour chacun d’entre eux.

Procédé

Fa « classification » d’une image HSI d’entrée consiste en la détermination d’au moins une classe parmi un ensemble de classes possibles descriptives des images. Ee présent procédé propose d’utiliser un modèle de classification automatique pour déterminer l’appartenance du microorganisme à tester à l’une des souches déjà listées dans la base de données et non pas pour déterminer directement la susceptibilité du microorganisme à l’agent antimicrobien ou encore l’appartenance du microorganisme à des stéréotypes particuliers par exemple.

En particulier, au regard des figures 3a et 3b qui représentent chacune une pluralité d’exemples de spectres respectivement pour des colonies de S. aureus résistantes à la méticilline (MRSA) et sensibles à la méticilline (MSSA), on remarque que les deux spectres n’ont pas exactement le même aspect, d’où l’éventualité d’une classification discriminante directe du caractère sensible ou résistant d’une nouvelle colonie de S. aureus. Les inventeurs ont cependant constaté que les performances d’un tel prédicteur de susceptibilité ne sont pas suffisantes dans le domaine de la microbiologie clinique ou industrielle. Par exemple un prédicteur SVM à noyau gaussien voit ses sesperformances plafonner à 70% en BCR.

En référence à la figure 4, le procédé comprend, après l’étape (a) d’obtention de l’image hyperspectrale, une étape (b) de détermination d’un spectre de la colonie à partir des pixels de ladite image hyperspectrale correspondant à ladite colonie.

Par spectre de la colonie, on entend une courbe représentant l’intensité lumineuse mesurée à l’échelle de la colonie en fonction de la fréquence. Mathématiquement, il s’agit d’un vecteur de taille le nombre de canaux de l’image HSI (i.e. 223 dans notre exemple).

De manière préférée, ce spectre est déterminé comme le spectre moyen sur les pixels de ladite image hyperspectrale correspondant à ladite colonie. En effet, on rappelle que l’image HSI comprend pour chaque pixel spatial une pluralité de valeurs d’intensité correspondantes.

A ce titre, l’étape (b) comprend avantageusement la segmentation de ladite image hyperspectrale de sorte à détecter ladite colonie dans l’échantillon 22, puis la détermination du spectre, comme expliqué typiquement en moyennant l’intensité canal par canal sur les pixels segmentés. Par exemple l’étape (b) comprend la détection automatique des colonies (e.g. par application d’un filtre sélectionnant les objets ronds dans l’image, par exemple une transformation de Hough) et/ou une étape manuelle de sélection de colonies par un technicien de laboratoire par exemple. Pour reformuler, on a un vecteur de taille n=223 par pixel de la colonie, et on fait la moyenne de ces vecteurs en un vecteur représentatif de la colonie. En pratique, une colonie s’étend en général sur une zone de l’image HSI de taille 11x11 au maximum, de sorte qu’il n’y a qu’une centaine de vecteurs à moyenner.

Dans le cas où l’image hyperspectrale représente une pluralité de colonies dudit microorganisme, on peut appliquer le procédé selon l’invention à chaque colonie ou à un ensemble de colonies choisies selon des critères de taille ou de position dans le milieu de culture par exemple.

En général, la segmentation permet de détecter toutes les colonies d’intérêt, en supprimant les artefacts tels que des filaments ou des poussières. La segmentation pourra être mise en œuvre de toute manière connue.

L’étape (b) comprend avantageusement un traitement du spectre, en particulier son lissage et/ou sa normalisation : le lissage, ou « smoothing » consiste à supprimer les pics qui sont probablement des artefacts, par exemple en faisant la moyenne mobile ; la normalisation vise à rendre les spectres comparables notamment par une technique dite de standard normal variable (SNV) consistant à soustraire au spectre sa moyenne et le diviser par son écart type.

A noter que si la base d’apprentissage stocke directement des spectres de référence, ils doivent préférentiellement avoir subi le cas échéant les mêmes lissage et/ou normalisation.

Classification

Dans une étape (c), ledit spectre de la colonie (le cas échéant lissé et/ou normalisé) est comme expliqué directement classifié au moyen d’un modèle de classification automatique parmi une classe microbienne consistant en l’identité des souches listées dans la base de données. Si une pluralité de spectres a été déterminée, on peut classifier chaque spectre, et agréger les résultats.

Le modèle de classification automatique peut être comme expliqué une machine à vecteur de support, SVM, ou un réseau de neurones à convolution (« CNN »). Dans le cas d’un SVM, on choisit par exemple un SVM à noyau RBE (Radial Basis Eunction).

Dans le cas d’un CNN, on choisit par exemple une architecture du type de celle représentée par la figure 5 qui est particulièrement adapté à la mise en œuvre du présent procédé. De manière classique, cette architecture comprend avantageusement une succession de blocs dit de convolution composés d’une ou plusieurs couches de convolution ID (car l’entrée n’est pas une image mais le spectre, i.e. un objet mono-dimensionnel), d’une couche d’activation (par exemple la fonction ReLU) pour augmenter la profondeur des cartes de caractéristiques, et une couche de mise en commun ID (pooling - ici MaxPooling) permettant de diminuer la taille de la carte de caractéristiques (généralement d’un facteur 2). Ce qui est remarquable est que deux blocs de convolution peuvent suffire, de sorte que très préférentiellement le présent CNN ne comprend que deux blocs de convolution.

Ainsi dans l’exemple de la figure 5, le CNN commence comme expliqué par 12 couches réparties en 3 blocs. Le premier prend en entrée le spectre (formant ainsi un objet de taille 223), et comprend un enchainement double convolution+activation montant la profondeur à 16 puis une couche de max pooling (on peut aussi utiliser du global average pooling), avec en sortie une carte de caractéristiques de taille 111x16 (on divise par deux la taille selon la dimension spectrale).

Le deuxième bloc a une architecture identique au premier bloc et génère en sortie d’un nouvel ensemble double convolution+activation une carte de caractéristiques de taille 111x32 (profondeur doublée) et en sortie de la couche de max pooling une carte de caractéristiques de taille 55x32 (à nouveau réduction de taille spectrale d’un facteur deux).

Le troisième bloc a une architecture identique aux deux premiers blocs et génère en sortie d’un nouvel ensemble double convolution+activation une carte de caractéristiques de taille 55x32 (profondeur inchangée) et en sortie de la couche de max pooling une carte de caractéristiques de taille 27x32 (à nouveau réduction de taille spectrale d’un facteur deux).

En sortie du dernier bloc de convolution (en l’espèce le troisième), le CNN comprend avantageusement une couche « d’aplatissement » transformant la carte de caractéristiques « finale » (contenant l’information la plus « profonde ») en sortie de ce bloc en un vecteur (objet de dimension 1). Ainsi on passe par exemple de la carte de caractéristiques de taille 27x32 à un vecteur de taille 27*32=864. On comprendra qu’on est limité à aucunes tailles de carte/fïltre à quelque niveau que ce soit, et que les tailles citées-ci avant ne sont que des exemples.

Enfin de manière classique on termine par une ou plusieurs couches entièrement connectées (FC, ou couches « dense » comme indiqué dans la figure 5) et éventuellement une couche d’activation finale, par exemple softmax. Dans l’exemple représenté, une première couche dense transforme le vecteur de taille 864 en un vecteur réduit de taille 256 (ce qui nécessite (864+l)*256=221440 paramètres, soit 90% de tous les paramètres du CNN), et une deuxième couche FC transforme le vecteur de taille 864 en un vecteur final de taille C, C étant le nombre total de classes souhaité, soit 2, 5 ou 11 dans les exemples mentionnés avant (ce qui nécessite (256+1 )*C paramètres). De manière préférée, le CNN est composé de (i.e. comprend exactement) une séquence de blocs de convolution, puis une couche d’aplatissement, et enfin une ou plusieurs couches entièrement connectées.

On voit donc qu’on a un nombre total de paramètres de l’ordre de 200000, ce qui est remarquablement faible pour un CNN (on a couramment plusieurs dizaines de millions de paramètres). Le présent CNN peut donc être utilisé par de nombreux clients 2, y compris ayant des ressources informatiques modérées.

On répète qu’on a une classification directe, ou « end-to-end », on entend sans pré-classification ni extraction séparée d’au moins une carte de caractéristiques de ladite colonie : on comprend que le CNN a naturellement des états internes sous la forme de cartes de caractéristiques, mais ces dernières ne sont jamais renvoyées à l’extérieur du CNN, celui-ci ayant pour seule sortie le résultat de la classification.

Apprentissage

De manière préférée, le procédé peut comprendre une étape (aO) d’apprentissage, par les moyens de traitement de données 3 du serveur 1, à partir d’une base d’apprentissage, des paramètres du modèle de classification automatique. Cette étape est en effet typiquement mise en œuvre très en amont, en particulier par le serveur 1 distant. Comme expliqué, la base d’apprentissage peut comprendre un certain nombre de données d’apprentissage, en particulier des images hyperspectrales de colonies ou bien directement des spectres, dans tous les cas associés à leur classe (i.e. l’identité des souches microbiennes).

L’apprentissage du modèle peut être réalisé de n’importe quelle façon connue de l’homme du métier adaptée au modèle choisi.

Dans tous les modes de réalisation, les paramètres du modèle appris peuvent être stockés le cas échéant sur des moyens de stockage de données 21 du client 2 pour utilisation en classification. A noter que le même modèle peut être embarqué sur de nombreux clients 2, un seul apprentissage est nécessaire.

De manière privilégiée, la base de données d’apprentissage pour l’espèce microbienne considérée est constituée comme suit. Pour chaque souche de ladite espèce, il est procédé à :

- la réalisation de plusieurs échantillons, e.g. plusieurs boites de Petri dans lesquelles a été coulée une gélose nutritive ne comprenant ni l’agent antimicrobien ni d’agent de marquage ou de coloration, gélose sur laquelle ont poussée des colonies de ladite souche, de préférence au moins 3 échantillons ;

- l’acquisition et la mémorisation de spectres hyperspectraux d’au moins une colonie de chaque échantillon à l’aide d’un dispositif tel que décrit à la figure 2, de préférence de plusieurs colonies par boite de Pétri et disposées à différentes distances du centre des boites de Pétri, et le traitement desdits spectres tels que décrit précédemment. Les spectres des deux premiers échantillons sont utilisés pour l’apprentissage des classes microbiennes de souches, les spectres des autres échantillons (e.g. du troisième échantillon dans le cas d’une production de tréplicats) étant utilisés pour tester les performances de l’apprentissage. Optionnellement, l’acquisition est réalisée également sur plusieurs échantillons à l’aide de différents dispositifs de capture afin de capter la variabilité des spectres provoquées par des différences dans les caractéristiques des dispositifs (e.g. la variabilité des sources de lumières entre dispositifs. ..) ;

- la mesure phénotypique de la susceptibilité de la souche à l’agent antimicrobien, par exemple au moyen d’un Vitek®2 commercialisé par la Demanderesse ou l’emploi d’e- test ou de disque de diffusion comme cela est bien connu en soi de l’état de la technique, et sa mémorisation ;

- la caractérisation génomique de la souche, par exemple à l’aide d’un séquençage complet de son génome et l’établissement d’un profil wgMLST tel que décrit dans le document « MLST revisited: the gene-by-gene approach to bacterial genomics» de Martin C.J. Maiden, Nature Reviews Microbiology, 2013, et la mémorisation de cette caractérisation.

Mise à jour de la base de données et du prédicteur

Lorsqu’une souche n’est pas répertoriée dans la base de données, tel que par exemple déterminé par le prédicteur selon l’invention qui renvoie une classification incertaine dans les classes microbiennes de souche pré-apprises, il est avantageusement procédé à une caractérisation de ladite souche tel que décrit précédemment. Le profil génomique de la souche est avantageusement comparé aux profils génomiques mémorisés pour déterminer si elle est effectivement une souche différente de celles mémorisées dans la base. Dans un tel cas, les données collectées pour la souche sont mémorisées dans la base de données et un nouvel apprentissage est réalisé comme décrit précédemment pour incorporer une nouvelle classe microbienne correspondant à la souche non répertoriée.

Produit programme d’ordinateur

Selon un deuxième et un troisième aspects, l’invention concerne un produit programme d’ordinateur comprenant des instructions de code pour l’exécution (en particulier sur les moyens de traitement de données 3, 5 du serveur 1 et/ou du client 2) d’un procédé de détermination de la susceptibilité d’un microorganisme à un agent antimicrobien, ainsi que des moyens de stockage lisibles par un équipement informatique (une mémoire 4, 6 du serveur 1 et/ou du client 2) sur lequel on trouve ce produit programme d’ordinateur.

Applications privilégiées de l’invention

L’invention est avantageusement incorporée dans :

- dans un procédé de suivi épidémiologique des souches d’intérêt dans un environnement clinique ou industriel (e.g. un service hospitalier, un hôpital dans son ensemble, un groupement d’hôpitaux, une usine agroalimentaire, une installation de distribution d’eau potable. ..) définissant une zone géographique donnée, la base de données étant constituée des souches prélevées dans ladite zone. L’invention délivre ainsi deux informations importantes dans la lutte des maladies nosocomiales ou des contaminations microbiennes non conforme à des normes alimentaires, environnementales ou de fabrication: l’identité ou non d’une souche nouvellement prélevée avec une souche déjà vue dans la zone géographique de prélèvement et sa susceptibilité à l’agent antimicrobien. Ces données associées aux zones de prélèvement (ex : chambre d’hôpital, zone de production) permettant, par exemple de mener une investigations sur le mode de dissémination de ces germes au sein de l’hôpital ou au sein de l’usine de production. A noter que dans le cadre d’un suivi épidémiologique hospitalier, l’ensemble des cultures peuvent être mises à profit pour alimenter la base de connaissance, celles mise en œuvre dans le cadre d’un processus de diagnostic microbiologique qu’il intègre ou non un test de susceptibilité ainsi que celles mise en œuvre dans un processus de screening en entrée d’hôpital sur milieux gammes de prévention. On acquiert ainsi via cette invention la possibilité de réaliser un suivi épidémiologique des différents clones de résistance présents dans l’hôpital ;

- dans un procédé d’antibiothérapie d’un patient suspecté d’être infecté par un agent pathogène. Comme cela est connu en soi, lorsqu’un patient est soupçonné d’être victime d’une infection, un cocktail d’antibiotique à large spectre lui est généralement administré avant de connaître l’identité et l’antibiogramme de la souche qui l’infecte, l’antibiothérapie étant par lui suite éventuellement modifiée une fois l’antibiogramme de la souche réalisé. La caractérisation d’une souche microbienne passe usuellement par plusieurs étapes successives de pousse de colonies sur boite de Pétri. Grâce à l’invention, dès la première pousse, une prédiction de l’identité de la souche et de sa susceptibilité à un ou plusieurs antimicrobiens est disponible de sorte que le clinicien peut adapter sa thérapie sans attendre le résultat d’un antibiogramme. Exemple

L’invention a été appliquée à la prédiction de la susceptibilité de 50 souches de Staphylocus aureus à la méticilline de manière à définir un prédicteur à base de CNN identifiant les souches MRS A et MS SA. Le tableau ci-dessous détaille pour chacune des souches, listées dans la base de données d’apprentissage, le nombre de colonies pour lesquelles des spectres hyperspectraux ont été acquis et la susceptibilité à la méticilline.

La figure 6 illustre la matrice de confusion d’un prédicteur de souches microbiennes de souches selon le réseau de neurones de la figure 5. La précision globale de ce dernier (« global accuracy ») est de 88% et la précision moyenne par classe (« balanced accuracy ») et de 87%.