CAMPO TÉCNICO

Esta invención tiene su aplicación en el campo de la biotecnología, específicamente se refiere a un novedoso método para la obtención de sulforafano mediante un proceso de fermentación láctica de plantas cruciferas, especialmente brócoli, que se obtiene de los desechos de la cosecha, así como la identificación y cuantificación del sulforafano por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

ANTECEDENTES Las cruciferas son una familia de plantas extensas y homogéneas qué se compone de más de 2000 especies, incluyendo varias plantas cultivadas importantes. Se consumen como verdura, son una fuente concentrada de nutrientes como vitaminas, minerales y fibra, y de sustancias fotoquímicas no nutritivas como por ejemplo compuestos azufrados. Entre las cruciferas comestibles están la col, el brócoli, las coles de Bruselas, la coliflor, la col rizada, los collares (una variedad de col rizada del sur de los Estados Unidos) y el kohlrabi (colinabo). De las cruciferas se puede comer las hojas, yemas y flores, y se pueden consumir crudas o cocidas, fermentadas y a veces secas. La rutabaga (nabosueco) y el nabo también son cruciferas pero, a diferencia de otras plantas de esta familia, lo que se cosecha y consume es la raíz (Mázza, 1998).

El brócoli es una planta formada por tallos carnosos y gruesos que emergen de axilas foliares formando inflorescencias, generalmente una central de mayor tamaño y otras laterales. La parte comestible, está formada por un conjunto de yemas florales con sus pedúnculos carnosos y a diferencia de la coliflor, puede producir otras pequeñas laterales que salen de las axilas de las hojas del tallo principal (FAO, 2006). Se ha demostrado que los efectos preventivos del cáncer por los vegetales cruciferos se relacionan con su particular contenido de una gran variedad de glucosinolatos, que son glucósidos contenidos en las vacuolas. Cuando los vegetales como el brócoli sufren un rompimiento celular, la enzima mirosinasa (tioglucosido glucohidrolasa), y glucosinolatos entran en contacto. La enzima mirosinasa rompe el enlace β-tioglucósido de las moléculas del glucosinolato, produciendo glucosa, sulfato, y un diverso grupo de productos de la aglicona. Hasta la fecha se han identificado más de cien compuestos de este tipo (Mazza, 2000; Matusheski, 2001 ; Fimognari y Hrelia, 2007). Los vegetales de la familia Brassicacea, en particular del género Brassica, como el brócoli (Brassica olaraceae var. itálica), se han relacionado epidemiológicamente con la reducción de ciertos tipos de cáncer (Zhan y col., 1992). Su póder anticanceroso (brócoli, sobre todo) se debería al contenido de estos vegetales en glucosinolatos.

Los glucosinolatos, también llamados tioglicósidos, son S-glicósidos en los que la glicona es b-D-tioglucosa y la aglicona es una oxima sulfatada. Como se mencionó anteriormente, la ruptura de los enlaces moleculares de los glucosinaltos genera múltiples derivados, el componente Isotiocianato mayormente caracterizado es el sulforafano (Pokorny y cois., 2001 ; Fimognari y Hrelia, 2007). El sulforafano es un producto químico de las plantas encontrado en vegetales cruciferos, incluyendo el brócoíi. Fue descubierto hace más de una década, es un potente inductor de enzimas que proveen defensa contra el cáncer (Jackson, Stngletary,2004).

Una tendencia a nivel mundial es el incremento constante de la producción y consumo del brócoli, lo anterior se atribuye a su alto contenido de nutrientes, vitaminas y antioxidantes (Moreno et al,. 2006). El brócoli es una buena fuente de glucosinolatos, los cuales son precursores de biomoléculas con propiedades antimicrobianas, anticarcinogénicas y quimiopreventivas como el sulforafano (1 - isotiocianato-4-(metilsulfinil)-butano) (Van Eylen et al. 2009). El sulforafano es de gran interés y se están buscando alternativas de conservación, para desarrollar alimentos funcionales, los cuales se definen como aquellos que por virtud de su contenido de compuestos bioactivos proveen un beneficio a la salud superior a la nutrición básica (Delaquis y Mazza, 2000; Arala et al. 2006). La fermentación láctica es ampliamente utilizada para mejorar propiedades organolépticas tales como sabor, olor, textura, así como la composición nutricional. Además, durante este proceso se producen diversos compuestos bioactivos (Tolonen et al. 2002). Los vegetales pueden ser conservados o procesados por salado, acidificación o fermentación. Los géneros de Lactobacillus y Streptococcus son ampliamente utilizados en la fermentación de una gran variedad productos lácticos y vegetales (Battcock y Azam-Ali, 1998). La adición de sal previa a la fermentación tiene efecto en la selección de la microflora predominante, además la sal extrae los jugos del vegetal que son ricos en azúcares fermentables y otros nutrientes. La interacción de la sal, ácido láctico y la ausencia de oxígeno disuelto se oponen a la proliferación de bacterias deteriorativas (ICMSF, 2005). Los vegetales comúnmente fermentados son la col, pepinos, coliflor, rábanos y pimientos, los cuales son consumidos en el Oriente. Los productos fermentados de mayor importancia comercial a nivel mundial son el kimchi, los pepinillos y el sauerkraut (Battcock y Azam-Ali, 1998).

El brócoli es la principal fuente natural del isotiocianato sulforafano, su precursor glucorafanina constituye del 50 al 80 % de los glucosinolatos totales presentes en este vegetal (Borowski et al. 2008; Van Eylen et al. 2009). Las prácticas de cultivo, condiciones de almacenamiento y la preparación del alimento tienen un impacto potencial en el contenido de glucosinolatos (Rangkadilok et al. 2002, Vallejo et al. 2003). Adicionalmente, el sulforafano es altamente reactivo e inestable, por ello es importante evaluar el efecto de la fermentación láctica en su contenido.

Después de realizar una búsqueda de la información tecnológica para conocer el estado del arte en esta materia, no se obtuvieron resultados relevántes relacionados con la presente invención.

Por mencionar algunos ejemplos, el documento US 2008/031 276 A1 describe un proceso para la producción de glucosinolatos particularmente glucorafanina de plantas cruciferas, donde el contenido de la mezcla, material de la planta y en los líquidos se calienta para inactivar las enzimas y se extrae con una membrana de intercambio anionico. La patente CN2009 037363 describe un método para extraer sulforafano multifuncional del brócoli, el cual consiste en tomar brócoli crecido durante 6-10 días y picarlo, congelarlo y secarlo, posteriormente se toman 100 partes por peso y se le agrega agua desionizada, dicloruro de metileno, 0.001 -003 partes por peso de VC y 0.1 -0.3 partes por peso de Na2S, el valor del pH es ajustado a 4-6, entonces la solución es hidrolizada por 6-1 Oh a 5-35 DEG C, finalmente el sulforafano es obtenido después de filtrar, lavar y purificar.

Otro documento, el KR20080025000, propone un método para amplificar el contenido de sulforafano de brócoli a través de un proceso de extra alto voltaje para producir alimentos que contienen sulforafano como un componente activo. Por su parte, el documento FR20050007280 revela un método para la extracción de sulforafano a partir de un extracto de semillas de brócoli el cual contiene glucorafanina.

Por lo anterior, se considera que no existen antecedentes relevantes que hayan revelado el novedoso procedimiento que se describe a continuación.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

A nivel mundial se producen alrededor de 19,107,751 toneladas de brócoli y coliflor, donde China e India son los principales productores, generan el 70% de la producción total. Estados Unidos y México ocupan el sexto y séptimo lugar y son los principales productores del mercado latinoamericano (FAO, 2009). Asimismo, se estima que del total de la producción se obtiene un remanente de aproximadamente 38,000,000 toneladas de inflorescencias además de hojas y tallos. Por lo tanto, la gran cantidad de residuos agrícolas producidos cada año constituye un problemática para los agricultores, ya que se genera una inversión por disposición de residuos así como contaminación ambiental.

En México en el año 2007 se obtuvo una producción anual de brócoli de 266, 018

toneladas, para las cuales se calcula que se generaron 960 toneladas de residuos.

Por lo anterior, este método innovador proporciona una alternativa para el tratamiento de los residuos agrícolas de brócoli de manera integral para obtener derivados alimenticios con propiedades beneficiosas para la salud y de alto valor agregado, como suplementos con alto contenido de fibra y/o proteína, mejoradores de textura o extractos activos ricos en sulforafano.

Actualmente existe un gran interés por el glucosinolato, glucorafanina, que es el compuesto precursor del isotiocianato sulforafano. Este último se ha comprobado que posee actividad anticarcinogénica, además presenta propiedades específicas contra la formación de tumores sólidos (Zhang y col. ,1992; Talalay & Fahey, 2001 ). De igual forma, se ha demostrado el importante papel dé la incorporación del brócoli en la dieta con el propósito de prevenir un gran número de tumores e inhibir la ocurrencia de cáncer gracias a la presencia de sulforafano procedente de la glucorafanina presente en germinados de brócoli. El sulforafano [1 -isotiocianato-4-(metilsulfinil) butano], actúa estimulando las defensas anticancerígenas previniendo la aparición de tumores.

En consideración a lo anteriormente expuesto, la presente invención propone un método para la obtención de sulforafano mediante un proceso de fermentación láctica de los residuos de la cosecha de brócoli, que además incluye la identificación y cuantificación del sulforafano por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y el desarrollo de un alimento fermentado de brócoli. A diferencia de los procedimientos ya conocidos, el método característico de esta invención utiliza un proceso de fermentación láctica para la obtención de sulforfano así como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en plantas cruciferas, por lo que no son similares en ninguna manera.

De igual forma, este método se distingue porque utiliza el procedimiento HPLC para la cuantificación de sulforafano, no en semillas sino en distintas partes (hojas, tallos e inflorescencias) de vegetales cruciferos frescos y liofilizados.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

Los detalles característicos de este novedoso método se muestran claramente en la siguiente descripción y en los dibujos que se acompañan, así como una ilustración de aquélla y siguiendo los mismos signos de referencia para indicar las partes y las figuras mostradas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS 1 . La Figura 1 muestra las variaciones de pH durante la fermentación de brócoli.

2. La Figura 2 muestra el monitoreo de la acidez total titulable (% ATT) en la fermentación de brócoli.

3. En la Figura 3 se aprecia el contenido de sulforafano (pg/g materia seca) durante el proceso de fermentación láctica del brócoli.

4. La Figura 4 muestra los cromatogramas HPLC obtenidos a las 0, 12, 24 y 96 horas de fermentación de los preparados de brócoli.

Para el desarrollo de la presente invención, se procede con la siguiente metodología:

Estándar y reactivos

- El estándar de sulforafano y acetonitrjlo grado HPLC fueron de Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA).

- El diclorometano (CH2CI2) y metanol grado HPLC fueron de EMD Chemicals Inc. (Darmstadt, Germany).

- El acetato de etilo y las columnas de 3 mi Bakerbond SPE silica gel (SiOH) se adquirieron en J.T, Baker S.A. (Xalostoc, México).

- El ácido clorhídrico, ácido bórico, hidróxido de sodio fueron obtenidos de Productos Químicos Monterrey (Monterrey, Nuevo León México).

- La mezcla reactiva de selenio fue de Merck (Darmstadt, Germany).

- El pH del agua ácida se ajustó utilizando una solución de ácido clorhídrico 0.1 N Material vegetal

- Se utilizaron muestras frescas de brócoli (Brassica olerácea L. var. itálica).

- Las inflorescencias se lavaron con agua corriente para eliminar las partículas de tierra, se eliminó el exceso de humedad, se procedió a su trituración y homogenización utilizando una batidora de inmersión (Oster, modelo 2616, Sunbeam Mexicana).

- Un lote de brócoli se escaldó a 60°C durante 5 minutos antes de la homogenización.

Activación del inoculo

El inoculo utilizado fue un probiótico comercial de células inmovilizadas, éste fue activado utilizando 50 mi del probiótico, 350 mi de agua destilada y 50 g de sacarosa comercial, se homogenizó y se incubó a 37°C (Fisher Scientific, modelo 500) hasta una absorbancia de 1.7 medido a una longitud de onda de 535 nm con espectrofotómetro 20 Genesys (Spectronic Intruments, USA).

Preparación de los fermentados

Se probaron tres tratamientos para realizar la fermentación, en todos los casos se adicionó 1 % de NaCI en polvo la cual se incorporo al brócoli triturado y esta mezcla se dejó reposar durante 20 minutos. Posteriormente, al tratamiento 1 (T1 ) se le adiciono 33 % de agua (fermentación espontánea), al tratamiento 2 (T2) un 33 % de inoculo de bacterias ácido lácticas activado, y para el tratamiento 3 (T3) se utilizó el brócoli escaldado adicionado con 33 % de inoculo activado. Para la fermentación todos los materiales fueron incubados a 30°C por 96 horas. Durante el proceso de fermentación se determinaron el pH, acidez total titulable y contenido de sulforafano a las 0, 4, 8, 12, 16, 24, 48, 72 y 96 horas.

Determinación de pH y acidez total titulable (ATT) El pH y la acidez se determinaron de acuerdo a los métodos establecidos por la AOAC (1984).

Composición química

Las muestras obtenidas de los tres tratamientos al tiempo 0 y a las 96 horas de fermentación se secaron en horno (Felisa, Modelo FE291 D) a 60°C por 5 horas, y a los residuos secos se les determinó el contenido de humedad, cenizas, proteína y fibra cruda de acuerdo a los métodos oficiales de la AOAC (1984). Para evaluar el contenido de lípidos totales se utilizó una mezcla de cloroformo metanol 2:1 según el método de Sánchez-Machado et al. (2004).

Cuantificación de sulforafano

Conversión de glucorafanina a sulforafano. La muestra se homogeniza (1 g), y se adicionan 4 mi de agua ácida (pH=6.0), luego se incuba a 45 ± 2°C en baño de agua durante 2.5 horas. Al final de la incubación se observa que se ha evaporado aproximadamente el 70 % del peso inicial de la muestra-agua ácida. Extracción de sulforafano con diclorometano. El sulforafano se extrae del residuo con 20 mi de diclorometano por sonificación durante 1 minuto; después se reposa 1 hora a 25 °C. El extracto se filtra en papel Whatman Nú.41 , realizando 2 lavados con 3 mi de diclorometano cada uno de ellos.

Purificación en columna SPE. El extracto orgánico obtenido se purifica en un cartucho de 3 mi SPE (SiOH) de acuerdo al método de Bertelli et al. (1998). Primero el cartucho se activa pasando 3 mi de diclorometano, luego se pasa todo el extracto orgánico. A continuación se enjuaga el cartucho con 3 mi de acetato de etilo para eliminar las impurezas. Para eluir el sulforafano se pasan 3 mi de metanol. La solución colectada se seca en estufa de vacío a 45°C. El residuo se disuelve con 2 mi de acetonitrilo, se sonifica por 30 segundos, y el extracto se filtra a través de una membrana de celulosa de 0.45 pm. Finalmente, se inyectan 20 μΙ en el sistema HPLC.

Equipo y condiciones cromatográficas. Se utiliza un sistema HPLC (GBC, Dandenog, Australia) equipado con autoinyector LC1650, desgasificadór de solventes en línea LC1460, software para el análisis de los datos WinChrom, bomba LC1 150, termostato para columna LC1150, detector de arreglo de diodos LC5100 y una columna analítica (250 mm X4,6 mm d.i.) SS-Exil ODS C18 con un tamaño de partícula de 5 pm (SGE, Dandenong, Victoria, Australia). Las condiciones HPLC son las siguientes: fase móvil acetonitrilo:agua en proporción 30:70 (v/v); la velocidad del flujo es constante a 0.6 ml/min y la temperatura de la columna de 36°C. La detección se realiza por ultravioleta a 202 nm.

Monitoreo de pH y acidez total titulable (ATT)

Las Figuras 1 y 2 muestran los valores de pH y acidez total titulable monitoreados durante la fermentación láctica de brócoli, respectivamente.

Se puede observar que a medida que la fermentación avanza el pH disminuye debido a la producción de ácidos orgánicos (Figura 1 ), y se incrementa el %ATT expresado como ácido láctico (Figura 2). Se observaron cambios significativos en los valores de pH y ATT durante las primeras 24 horas de fermentación, sin presentarse variación significativa a las 96 horas. Estos parámetros son importantes para verificar que la fermentación se está llevando a cabo adecuadamente. El rango de pH en los tratamientos al inicio de la fermentación fue de 5 (T2, T3) a 6.3 (T1 ), y disminuyó entre 3.68 (T2, T3) a 4.2 (T1 ) al final de la fermentación (96 horas). En el caso de la ATT el valor varia de 0.73 (T1 ) a 1 .2 % (T2, T3). Los valores de pH y ATT se encuentran entre los rangos reportados por diversos autores durante la fermentación de diversos vegetales (Kim et al. 1999, Gardner et al. 2001 , Tolonen et al. 2002). Los fermentados T1 a las 96 horas mostró signos de deterioro (espuma, licuefacción y olores desagradables). En el caso del T2 presentó olores fuertes y desagradables comparados con el T3.

Composición química

La composición química de los tres fermentados (tiempo=0) está en el rango de 20.9 a 21.5 % para proteína, de 11.4 a 15.6 para cenizas, de 1 .6 a 2.6 para lípidos y 13.3 % de fibra cruda. Estos valores son similares a los reportados por Campas-Baypoli et al. (2009) en harinas de brócoli. Sin embargo, el contenido de cenizas es mayor, lo anterior se atribuye a la adición de NaCI para el tratamiento de los substratos. En ia Tabla 1 se presenta la composición química de los fermentados (96 h) y sin fermentar (0 h), se observa que el contenido de proteína de los fermentados está en el rango de 21 .4 a 24.5 %, las cenizas mostraron un rango de 14.5 a 17.9 %, los lípidos se encontraron de 3.7 a 5.0 %. En todos los fermentados se observó un incremento significativo del contenido de proteína, lípidos y cenizas para los tratamientos inoculados con bacterias lácticas respecto a los tratamientos sin fermentar (tiempo 0 horas).

El contenido de fibra cruda no presentó variaciones. En general los productos fermentados obtenidos en el presente estudios mejoraron su composición nutrimental, lo cual es atribuido a los cambios enzimáticos que ejercen las

Tabla 1

Tratamiento Proteína Ceniza Lípidos Carbohidratos" Fibra cruda

T1-0 horas 20.86 ± 0.14 ^a 15.59 ± 0.34 ^a 2.64 ± 0.01 ^a 60.90 ± 0.36 13.33 ± 0.24 ^a

T1-96 horas 21.38 ± 0.29 ^a 17.91 ± 0.14 ^b 4.62 ± 0.41 ^b 56.09 ± 0.52 13.30 ± 0.15 ^a

T2-0 horas 21.40 ± 0.12 ^a 12.23 ± 0.21 ^a 1.69 ± 0.19 ^a 64.68 ± 0.30 13.30 ± 0.28 ^a

T2-96 horas 24.16 ± 0.26 ^b 17.64 ± 0.14 ^b 5.09 ± 0.36 ^b 53.11± 0.46 13.22 ± 0.34 ^a

T3-0 horas 21.46 ± 0.25 ^a 11.42 ± 0.20 ^a 1.59 ± 0.30 ^a 65.53 ± 0.44 13,28 ± 0.20 ^a

T3-96 horas 24.54 ± 0.13 ^b 14.98 ± 0.25 ^b 3.65 ± 0.29° 56.83± 0.40 13.24 ± 0.22 ^{a a} Los datos expresan la media ± la desviación estándar por triplicado

bLos carbohidratos totales =100 -∑ (proteína + lípidos + cenizas)

cPor columna letras diferentes por tratamiento significa diferencias significativas (P≥0.05) bacterias ácido lácticas en el substrato, además del incremento en su biomasa.

Los resultados anteriores son similares a los obtenidos durante la fermentación de col, caupi, coliflor entre otros (Kim et al. 1999, Kasangi et al. 2010).

Identificación y cuantificación de sulforafano

La identificación del sulforafano se realizó comparando los tiempos de retención del pico del estándar de sulforafano, con el de la muestra, así como a su espectro UV obtenido de un barrido de longitudes de onda (λ) de 190 a 300 nm, considerándose la λ de 202 nm la óptima para registrar las áreas de los picos. La curva de calibración se generó a partir de seis concentraciones diferéntes del estándar de sulforafano en el rango de 4 a 80 g/ml. La ecuación obtenida al graficar la concentración (pg/ml) y el área de los picos (y = 100773x - 87954) presenta una adecuada relación entre las variables de la curva expresada como coeficiente de correlación (r ² = 0.9999). Durante el análisis de las muestras simultáneamente se analizó un estándar de sulforafano.

Contenido de sulforafano en los fermentados

En la Figura 3 se presenta el contenido de sulforafano en las muestras obtenidas a las 0, 4, 8, 12, 16, 24, 48 y 96 horas de fermentación para los tres tratamientos aplicados. El tratamiento sin inoculo (T1 ) presentó un contenido de sulforafano en el rango de 100 a 207 pg/g de materia seca, el tratamiento 2 con inoculo (T2) los valores variaron de 43 a 109 pg/g de materia seca y por último el tratamiento escaldado y con inoculo (T3) mostró un rango de 109 a 376 ug/g materia seca. Bajo las condiciones de fermentación aplicadas el sulforafano se degradó en un tiempo de 24 horas en los tratamientos T1 y T2, en el caso dé T3 se detectó su presencia hasta las 48 horas de fermentación. Por otro lado, los resultados muestran que el T3 donde se realizó el escaldado (60°C por 5 minutos) de la materia prima antes de la fermentación se observó un incrementó en el contenido de sulforafano respecto a los tratamientos sin escaldar. Lo anterior se puede atribuir a que durante el proceso de conversión de glucorafanina a sulforafano las proporciones obtenidas de los productos de la hidrólisis enzimática pueden variar de acuerdo a las condiciones de reacción. En el caso del escaldado existen reportes de la inactivación de un cofactor de la enzima mirosinasa, conocida como proteína ESP (epitioespecífica) que favorece la formación de sulforafano nitrilo (compuesto sin actividad biológica), mejorando el rendimiento del compuesto de interés sulforafano (Matushesky et al. 2004, Rungapamestry et al. 2006). Por otro lado, algunos autores han reportado que las bacterias lácticas poseen enzimas con actividad semejante a la mirosinasa y que pueden intervenir en el proceso de conversión a sulforafano (Tolonen et al. 2002, Fuller et al. 2007). Comparando los tratamientos aplicados no se logró observar lo anterior, posiblemente debido a que los factores que intervienen en mayor medida en la conversión de glucorafanina a sulforafano se atribuye a la actividad de las enzimas mirosinasas, el pH y la presencia de Fe ⁺² (Rungapamestry et al. 2006). En la Figura 4 se presentan los cromatogramas obtenidos en diversos tiempos de fermentación para los tres tratamientos aplicados durante el proceso de fermentación.

En consideración a lo anterior, gracias a este novedoso método es posible obtener mayores concentraciones de sulforafano en residuos de brócoli fermentados, sobre todo en aquellos fermentados escaldados; lo cual constituye una alternativa en el desarrollo de nuevos productos debido a que se mejora la composición nutrimental y el nivel de conservación del vegetal. De igual forma, el método también representa una alternativa para el tratamiento de los residuos agrícolas de brócoli de manera integral para obtener derivados alimenticios con propiedades beneficiosas para la salud y de alto valor agregado, como suplementos con alto contenido de fibra y/o proteína, mejoradores de textura o extractos activos ricos en sulforafano.