Campo da invenção

A presente invenção refere-se a um processo de maturação de células dendriticas autólogas in vitro. As células obtidas pelo processo da presente invenção podem ser utilizadas na terapia de diversos tipos de câncer e doenças infecto-parasitárias .

Em particular, a presente invenção fornece um processo para a maturação de células dendriticas autólogas compreendendo o contato das mesmas com citocinas e interleucinas e posterior tratamento com antxgenos tumorais obtidos do próprio individuo.

Em outras modalidades, a invenção se refere ao uso das células obtidas através do processo de maturação de células dendriticas autólogas para a obtenção de composições farmacêuticas e no tratamento de vários tipos de câncer e doenças infecto-parasitárias .

Fundamentos da invenção

É de conhecimento que o sistema imune é muito complexo, sendo composto por vários mecanismos que incluem uma variedade de mediadores e células atuando em sinergia, mutuamente coordenados e desencadeados por estímulos e células específicas, como por exemplo, as células dendríticas (DCs), que são as mais potentes células apresentadoras de antígenos e conhecidas por ativar linfócitos T. .

Dentro do processo orgânico que _. ocorre naturalmente, as células dendríticas se originam de células precursoras hematopoiéticas na medula óssea e, sob condições fisiológicas, diferenciam-se em células dendríticas imaturas que circulam por via hematológica até os tecidos periféricos, onde continuam o seu processo de maturação. Após o encontro com os antígenos nos tecidos, as DCs finalizam seu processo de maturação e, durante esta fase, aumentam sua capacidade migratória para os linfonodos regionais para ativar e coordenar a resposta imune.

O sistema imune- possui a capacidade de controlar e destruir o tumor, contudo, ele frequentemente falha em conter a .progressão tumoral. Vários trabalhos científicos (ROTH et al., 2001; SOMBROEK ^' et al., 2002; GABRILOVICH et al., 2004) têm demonstrado que o microambiente tumoral é capaz de manipular a resposta imune local por produção de mediadores que possam inibir a função das células imunes sistemicamente ou no próprio sítio tumoral. Além destes mediadores, as células neoplásicas possuem vários mecanismos de escape da resposta imune. Vários tipos de processos nesse sentido (Michelin e Murta, 2008) têm sido desenvolvidos para q possível tratamento destas neoplasias, envolvendo aplicações com drogas imunoestimulantes , anticorpos, citocinas ou até mesmo terapias celulares. Do ponto de vista de aplicação clínica, alguns não passaram de ensaios in vitro, enquanto outros estão em fase experimental em animais, conforme citações de Michelin e Murta, 2008. Somente poucos têm passado para a fase de ensaios clínicos em humanos.

A cirurgia, quimioterapia e radioterapia são tratamentos já bem estabelecidos para neoplasias malignas, no entanto, se um ou todos esses tratamentos convencionais não apresentam resultado satisfatório, o processo de maturação de células dendríticas autólogas, pode ser uma alternativa a ser recomendada.

Pode-se citar, no Estado da Técnica, a tecnologia descrita na publicação de pedido de patente norte-americano US 2007/0020297 Al, de 25 de janeiro de 2007, que apresenta a utilização de células dendríticas, contudo, o mesmo se aplica somente a tumores do sistema nervoso central e em combinação com a quimioterapia. Outra tecnologia também encontrada é a descrita na publicação internacional WO 95/34638, de 21 de dezembro de 1995, que utiliza células dendríticas aplicadas ao linfoma e é baseado principalmente em um método de obtenção de células dendríticas, não no desenvolvimento de um processo que visa o combate às células cancerígenas.

A seguir são relacionadas algumas vantagens das diversas modalidades da presente invenção em relação ao encontrado no estado da técnica:

Pode ser aplicado na terapia de todos os tipos de tumores e, utilizando células do próprio paciente, evita-se a rejeição heteróloga das mesmas.

Pacientes, por questões clínicas ou terapêuticas, que não possuem condições de receberem os tratamentos convencionais de ressecção cirúrgica, quimioterapia ou radioterapia, poderão usufruir do processo de maturação das DCs e da composição farmacêutica de células dendríticas autólogas produzidas pelo mesmo

A composição farmacêutica de células dendríticas autólogas obtidas pelo processo da presente invenção é eficaz no combate a neoplasias, independente do estágio em que a mesma se encontra, e no tratamento de outras doenças, como exemplo as infecto-parasitárias .

Uma das principais deficiências que os processos existentes no Estado da Técnica não são capazes de solucionar é o fato que, os pacientes com carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, bem como os pacientes com tumores metastáticos de mama, pulmão, cérvice, intestino, endométrio e carcinoma renal, possuem o número de células dendriticas no sangue alterado. Da mesma forma, em alguns tumores primários as DCs não são recrutadas para o foco tumoral, impedindo a captação dos antigenos tumorais. Estes dados são clinicamente relevantes, pois estão associados com um pior prognóstico destes pacientes. Tal deficiência é superada pelo processo da presente invenção, que compreende o contato das DCs com os antigenos tumorais in vitro, resultando no direcionamento das DCs ao foco tumoral.

Vários estudos sugerem que a disfunção das DCs na realidade é um processo sistémico, apoiado na noção que fatores solúveis derivados dos tumores caem na corrente linfática e sanguínea e afetam este tipo celular. Estudos recentes (ROTH et al., 2001; SO BROEK et al., 2002; GABRILOVICH et al., 2004) demonstram que a liberação de IL- 10, IL-6, GM-CSF, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) , gangliosídeos e prostanóides pelo tumor podem bloquear a diferenciação e função das DCs in vivo. Esta disfunção e inibição das DCs em pacientes com câncer resultam em uma deficiência na indução da resposta antitumoral, favorecendo desta forma a progressão do tumor. Assim sendo, o uso de DCs tem sido proposto como imunoterapia para tumores. Estas células são maturadas ex vivo como alternativa para evitar a supressão induzida pelo tumor in vivo. A presente invenção revela um processo de maturação de DCs in vitro capaz de fornecer células com capacidade migratória e atividade imunológica aperfeiçoada.

Objetivos da Invenção

Tendo em vista os inconvenientes supracitados e no propósito de superá-los, a presente invenção foi desenvolvida a partir do fato de que, enquanto as células dendriticas dos pacientes são deficientes em apresentar antigenos para ativar- o sistema imune, as que passam pelo processo de maturação in vitro são capazes de estimular e induzir uma resposta imune antitumoral in vitro e in vivo.

Constitui um objetivo da presente invenção um processo compreendendo o isolamento e diferenciação de células dendridicas autólogas e sensibilização das mesmas com antigenos tumorais do próprio individuo.

Outro objetivo da invenção é o fornecimento de células obtidas pelo processo descrito com capacidade migratória e atividade imunológica aperfeiçoada.

Constitui outro objetivo da presente invenção o tratamento do individuo do qual foram retiradas as células, sendo estas, após o processo de maturação, ressuspensas e infundidas no paciente. _;

Portanto, constitui mais um objetivo da presente invenção composições farmacêuticas para infusão das células maturadas através do processo acima descrito.

Outro objetivo da presente invenção é o uso das células obtidas para a fabricação de composições para tratamento de indivíduos com câncer e doenças infecto- parasitárias com as composições da presente invenção.

Outro objetivo da presente invenção é o uso das células obtidas para o tratamento de indivíduos com câncer e doenças infecto-parasitárias com as composições da presente invenção.

Breve descrição das figuras

As figuras a seguir fazem parte do presente relatório e estão aqui incluídas a fim de ilustrar determinados aspectos da invenção. 0 objeto da presente invenção pode ser melhor entendido com referência a uma ou mais dessas figuras, em combinação com a descrição detalhada da modalidade preferida aqui apresentada.

A figura 1 apresenta, expressão de linfócitos totais (CD3+) e IL-2 intracelular em células do sangue periférico de três pacientes submetidos ao tratamento com células dendríticas antes e durante a terapia (antes, após 21 e 45 A figura 2 apresenta Linfócitos T auxiliares (CD4+) e expressão de citocinas intracelulares (IFN-gama, IL-2, TNF- alpha, IL-12 e IL-10) em células do sangue periférico de três pacientes submetidos ao tratamento com células dendriticas antes e durante a terapia (antes, após 21 e 45 dias) .

A figura 3 apresenta Linfócitos T citotóxicos (CD8+) IL-2 intracelular e receptor CD25 em células do sangue periférico de três pacientes submetidos ao tratamento com células dendriticas antes e durante a terapia (antes, após 21 e 45 dias) .

A figura 4 apresenta Células Natural Killer (NK) e expressão de citocinas intracelulares (IL-2 e IL-12) e o receptor CD25 em células do sangue periférico de três pacientes submetidos ao tratamento com células dendriticas antes e durante a terapia (antes, após 21 e 45 dias) .

A figura 5 apresenta expressão de macrofagos (CD19+) e citocinas intracelulares (IFN-γ, IL-2, TNF-α) em células do sangue periférico de três pacientes submetidos ao tratamento com células dendriticas antes e durante a terapia (antes, após 21 e'45 dias).

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção refere-se a um processo de maturação in vitro de células dendridicas de mamífero, particularmente de um humano, compreendendo as etapas de coleta, isolamento, diferenciação e sensibilização das células.

Preferivelmente., no processo da presente invenção, a sensibilização das células é feita em duas etapas: a) colocar as células diferenciadas em contato com citocinas e interleucinas ^' e b) colocar as células diferenciadas em contato com antigenos tumorais.

Mais preferivelmente, as células diferenciadas são colocadas em contato com citocinas e interleucinas em duas etapas que compreedem: a) colocar em contato as células diferenciadas com citocinas e interleucinas e b) adicionar uma ou mais citocinas ^' diferentes, ao meio contendo as células diferenciadas.

Preferencialmente, as duas etapas de sensibilização com citocinas e interleucinas ocorrem com pelo menos vinte e quatro horas de intervalo entre as mesmas.

Preferivelmente, as citocinas e interleucinas usadas na etapa de sensibilização das células são selecionadas do grupo consistindo em GM-CSF, IL-3, IL-4, TNF, IL-12, IL-2 e PGE2.

Preferencialmente _/ a etapa de sensibilização pelo contato das células com antigenos tumorais é feita com antigenos obtidos do mesmo organismo do qual foram coletadas as células.

Mais preferencialmente, o contato das células com os antígenos tumorais pode ser feita por qualquer método de permeabilização celular conhecido na técnica como, por exemplo, mas sem limitação, através de eletroporação.

Preferencialmente as células utilizadas no processo da presente invenção são células mononucleares obtidas do sangue periférico de mamífero.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece células maturadas através do processo acima descrito com capacidade migratória e atividade imunológica aperfeiçoadas, sendo mais eficazes na terapia de tumores.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo as células acima descritas em um veículo farmaceuticamente aceitável.

Preferencialmente, as células obtidas pelo processo da presente invenção podem ser ressuspensas em qualquer veículo farmaceuticamente aceitável conhecido no estado da técnica, por exemplo, mas sem limitar-se a substâncias não- tóxicas, inertes, excipiente líquido, semi-sólido, diluente, formulação auxiliar de qualquer tipo, ou simplesmente um meio aquoso estéril, tal como salina. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis são soluções fisiológicas contendo açúcares, ^" tais como lactose, glicose e sacarose, os amidos, tais como amido de milho e o amido de batata, a celulose e os seus derivados, tais como a carboximetilcelulose de sódio, a etilcelulose e o acetato de celulose, ciclodextrina, óleos, .tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girasol, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de semente de soja; glicóis, tais como propilenoglicol, polióleos, tais como glicerinaglicol , sorbitol, manitol e de polietileno; ésteres, tais como o laurato etílico, oleato etílico, Agar, agentes tamponantes, tais como o hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio, ácido algínico, água livre de pirogênio, salina isotônica, solução de Ringer, soluções tampões, assim como outras substâncias não tóxicas compatíveis usadas em formulações farmacêuticas.

Em outra modalidade, a presente invenção abrange o uso das células obtidas pelo processo acima descrito para a manufatura de medicamentos para o tratamento de indivíduos sofrendo de câncer e doenças infecto-parasitárias . -

Em outra modalidade, a presente invenção abrange o uso das células obtidas pelo processo acima descrito para o tratamento de indivíduos sofrendo de câncer.

Preferencialmente, todos os tipos de câncer podem ser tratados pelas composições farmacêuticas da presente invenção. Como exemplos ilustrativos dos tipos de neoplasias potencialmente tratáveis pelas células e composições farmacêuticas da presente invenção, podem-se citar, sem ^' limitações, adenocarcinoma, câncer anal, angiomiolipoma, câncer de bexiga, carcinoma basocelular, carcinoma de células renais, condrossarcoma, cordoma, coriocarcinoma, câncer de vesícula biliar, câncer vulvar, doença de Paget da mama, estesioneuroblastoma, câncer de estômago, fibroma, câncer de fígado, glioblastomas , hamartoma, hepatocarcinoma, leucemia, linfoma de células T, linfangioma, câncer de mama, melanomas, meningiomas, tumor de Merkel, mesotelioma, mieloma múltiplo, miopericitoma, nefroblastoma, neuroblastomas , câncer de pele, câncer de pênis, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer pancreático, retinoblastoma, sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, seminoma, teratoma, câncer testicular, timoma, tumores benignos, tumor cerebral, tumor de Krukenberg, tumor de Pancoast, tumor de Warthin, tumores localizados, tumores ósseos e câncer de útero.

Em outra modalidade, a presente invenção abrange o uso das células obtidas pelo processo acima descrito para o tratamento de indivíduos sofrendo de doenças infecto- parasitárias .

Preferencialmente, todos os tipos de doenças infecto- parasitárias podem ser tratadas pelas composições farmacêuticas da presente invenção. Como exemplos ilustrativos dos tipos de doenças potencialmente tratáveis pelas células e composições farmacêuticas da presente invenção, podem-se citar, sem limitações, AIDS, amebiase, ancilostomíase, ascaridíase, botulismo, brucelose, cancro mole, candidíase, coccidioidomicose, cólera, coqueluche, criptococose, criptosporidíase, dengue, difteria, doença de Chagas, doenças diarréicas agudas, doença de Lyme, doença meningocócica, donovanose, enterobíase, escabiose, esquistossomose, estrongiloidíase, febre amarela, febre maculosa brasileira, febre purpúrica brasileira (FBP), febre tifóide, febres hemorrágicas pelo vírus ebola, filaríase por Wuchereria bancrofti, giardíase, gonorréia, hanseníase, hantaviroses , hepatite A, hepatite B, hepatite D, hepatite D, hepatite E, herpes simples, histoplasmose, infecção pelo papilomavírus humano (HPV) , leishmaniose tegumentar americana (LTA) , leishmaniose visceral, leptospirose, linfogranuloma venéreo, malária, meningite por Haemophylus influenzae, meningite tuberculosa, meningites virais, mononucleose infecciosa, oncocercose, paracoccidioidomicose, parotidite infecciosa, poliomielite, psitacose, raiva, rubéola, sarampo, shigelose, sífilis, síndrome da rubéola congénita, teníase/cisticercose, tétano acidental, tétano neonatal, toxoplasmose, tracoma, tuberculose, varicela e herpes zoster.

Exemplo

0 exemplo a seguir demonstra uma forma de execução preferida da invenção, servindo apenas para permitir uma melhor compreensão da presente invenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos, sem a intenção de limitar o escopo reivindicado.

Processo de maturação de células dendríticas autólogas Células mononucleares do sangue periférico (PB C) foram coletadas por punção venosa com anticoagulante e separadas por centrifugação em uma centrífuga Ficoll- Hypaque Plus. As células obtidas desta forma foram ressuspensas e mantidas em cultura em meio de IMDM suplementado com 10% de soro bovino fetal. Estas células foram incubadas em estufa a uma temperatura em torno de 37°C, contendo 5% de C0 ₂ por volta de 4 h. As células não aderentes foram removidas do meio. O meio IMDM foi trocado e as células aderentes foram tratadas com GM-CSF e IL-4. Após cinco dias em cultura foi adicionado TNF-α para ativação das células dendríticas diferenciadas. Após mais dois dias, as células foram coletadas e lavadas três vezes por centrifugação com solução salina e as células dendríticas submetidas à eletroporação com os antígenos tumorais obtidos do próprio paciente por biópsia tumoral. Todos estes procedimentos são realizados em condições estéreis .

As células obtidas por processos semelhantes ao descrito acima foram então reifundidas em pacientes para a avaliação da eficácia clinica das composições contendo células obtidas pelo referido processo. O sistema imune dos pacientes foi avaliado antes e durante todo o tratamento através de citometria de fluxo das células do sangue periférico, conforme demonstrado pelos resultados apresentados nas figuras 1 a 5.

Os resultados apresentados nas figuras 1 a 5 demonstram sem sombra de dúvidas a eficácia do tratamento de pacientes com as células obtidas através do processo da presente invenção. A expressão de citocinas e interleucinas intracelulares aumentou progressivamente em células do sangue periférico dos pacientes durante o tratamento com as células obtidas através do processo da presente invenção, o que comprova que os aperfeiçoamentos técnicos feitos na presente invenção são capazes de fornecer células com aplicação terapêutica ampla e melhorada.